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CN105531291A - 用于生物样品中的具有提高的性能的timp2测定 - Google Patents

用于生物样品中的具有提高的性能的timp2测定 Download PDF

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CN105531291A
CN105531291A CN201480048192.1A CN201480048192A CN105531291A CN 105531291 A CN105531291 A CN 105531291A CN 201480048192 A CN201480048192 A CN 201480048192A CN 105531291 A CN105531291 A CN 105531291A
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CN
China
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antibody
monoclonal antibody
seqidno
separation
people
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CN201480048192.1A
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R·A·维贾延德兰
S·万卡塔苏巴劳
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Astute Medical Inc
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Astute Medical Inc
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Abstract

本发明提供尤其是在用于评价肾损伤时具有提高的临床性能的TIMP2免疫测定。所述免疫测定依赖于当用于复杂的临床样本诸如生物流体时，且尤其是用于快速测定模式诸如侧流测试装置时展现出提高的测定性能的抗体和抗体对的选择和使用。

Description

用于生物样品中的具有提高的性能的TIMP2测定
本申请要求2013年8月7日提交的美国临时专利申请61/863,073的优先权，所述申请整体并入本文，包括所有表格、附图和权利要求。
发明背景
以下发明背景论述仅提供来帮助读者理解本发明，并且并非承认描述或构成本发明的现有技术。
金属蛋白酶抑制剂2(Swiss-ProtP16035，又称为“金属蛋白酶组织抑制剂2”和“TIMP2”)是与金属蛋白酶复合并且通过结合至其催化锌辅助因子而使其不可逆地失活的分泌蛋白。TIMP2已知会对MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16以及MMP-19起作用。TIMP2据报道会压制内皮细胞的增殖。因此，已表明编码蛋白会通过以下方式对组织动态平衡的维持产生一定的作用：响应于血管生成因子而压制静态组织的增殖，并且抑制经受重建的组织的蛋白酶活性。
此外，WO2010/048346和WO2011/075744(各自以引用的方式整体并入本文，包括所有表格、附图和权利要求)描述了将TIMP2单独地且以多标志物组方式用于评价受试者的肾状况。具体而言，通过免疫测定测量的TIMP2水平显示与肾状况的风险分级、诊断、分期、预后、分类以及监控相关。
从特异性结合测定诸如免疫测定获得的信号是一种或多种结合物质(例如，抗体)与靶生物分子(即，分析物)和含有抗体所结合的必要表位的多肽之间形成复合物的直接结果。免疫测定往往能够“检测”分析物；但由于抗体表位大约是8个氨基酸，所以被配置来检测相关标志物的免疫测定还将检测与标志物序列相关的多肽，只要那些多肽含有结合至测定中所使用的一个或多个抗体所需的表位即可。虽然这类测定可以检测全长生物标志物并且将测定结果表述为相关生物标志物的浓度，但是来自测定的信号实际上是源于样品中存在的所有这类“免疫反应性”多肽。这类结合测定还可以检测生物样品中存在的与另外的物质诸如结合蛋白质、受体、肝素、脂质、糖等复合的免疫反应性多肽，前提是那些另外的物质不干扰结合物质与靶生物分子之间的结合。然而，通常，特异性结合测定是使用纯化分析物来配制，而不考虑复杂的形成和断裂模式。这在这类另外的结合物质的身份未知的情况下尤其如此。
发明内容
本发明的目的是提供尤其是在用于评价肾损伤时具有提高的临床性能的TIMP2免疫测定。确切地说，我们描述了当用于复杂的临床样本诸如生物流体时，且尤其是用于快速测定模式时展现出提高的测定性能的抗体和抗体对的选择和使用。
在第一方面，本发明涉及一种或多种特异地结合人TIMP-2的分离的单克隆抗体，其中每一种分离的单克隆抗体以至少108M-1的亲和力结合至多肽，所述多肽的序列由选自由以下组成的组的序列组成：
QAFCNADVVIRAKAVSEKEVD(SEQIDNO:1)、
IYGNPIKRIQYEIKQI(SEQIDNO:2)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQIDNO:3)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAV(SEQIDNO:4)、
EFIYTAPSSAVCGVS(SEQIDNO:5)、
TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQIDNO:6)、
SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQIDNO:7)、
SSPDECLWMDWVTEKNINGHQ(SEQIDNO:8)以及
CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQIDNO:9)。
用于要求保护的方法的抗体可以获自多种物种。例如，本发明的抗体可以包含免疫球蛋白序列，所述免疫球蛋白序列是兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物序列、或这类序列的组合(所谓的嵌合抗体)。这类抗体也可以是单克隆的或多克隆的。用于本发明的抗体可以通过其在免疫测定中的性能来鉴别，并且之后进一步通过表位定位来表征以便理解与所述性能有关的表位。
表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。构型性以及非构型性表位差别在于：在变性溶剂存在下，对构型性表位的结合丧失，而不是非构型性表位。优选地，表位选自SEQIDNO:1-9当中，所述表位各自是获自人TIMP2序列的序列。用于本发明的优选的抗体特异地结合至这些肽中的一个或多个。
这类单克隆抗体可以缀合至信号发生成分(signaldevelopmentelement)或固定在固体支持物上。此外，这类抗体可以用于许多竞争测定和夹心测定模式。
通过举例，在竞争模式中，这些优选抗体中的一种或多种可以缀合至信号发生成分以提供可检测标记抗体。生物样品中的TIMP2可以与固定在测试装置的预定区处的TIMP2竞争结合至所述抗体，并且预定区处获得的信号的量将与样品中的TIMP2的量成反比。可替代地，TIMP2可以缀合至信号发生成分以提供可检测标记分析物。生物样品中的TIMP2可以竞争结合至固定在测试装置的预定区处的抗体，并且预定区处获得的信号的量将再次与样品中的TIMP2的量成反比。
在夹心测定的实例中，第一抗体(可检测标记的)和第二抗体(固定在测试装置的预定区处)在测试装置的预定区处与样品中的TIMP2形成夹心复合物。在夹心测定中，第一抗体和第二抗体可以是相同的(尤其是在使用多克隆抗体时)或不同的。因此，本发明的抗体可以用于夹心对，或可以单独地与非为单克隆抗体诸如多克隆单体或适体的另一种结合实体一起使用。
本发明的抗体可以用作测试试剂盒中用于检测生物样品中的TIMP-2的试剂。这种测试试剂盒可以例如包括一次性测试装置，所述一次性测试装置被配置来产生与生物样品中的人TIMP-2的存在或量有关的可检测信号。可替代地，这种测试试剂盒可以被配制用于在未利用一次性测试装置的临床分析器中执行测定。优选地，测试试剂盒是体外诊断。如本文所使用的术语“体外诊断的”指代无论是单独使用还是组合使用生产商都意图体外使用来检测来源于人体的试样(包括血液和组织捐赠品)的医疗装置，所述医疗装置为试剂、试剂产品、校准器、控制材料、试剂盒、仪器、设备、器材或系统，所述医疗装置仅仅或主要是为了提供与生理学或病理学状态有关的、或与先天性异常有关的信息，或者确定潜在接受体的安全和相容性，或监控治疗性措施。
在某些实施方案中，免疫测定以侧流模式执行。侧流测试是免疫测定的一种形式，其中测试样品以色谱方式沿吸水性或非吸水性多孔固体衬底流动。侧流测试可以操作为竞争或夹心模式测定。优选的侧流装置是一次性的、单次使用测试装置。在涂覆区将样品涂覆到测试装置上并且使所述样品经过衬底，在所述衬底处，所述样品与已用抗体或抗原预处理的线或区接触。如本文所使用的术语“测试区”指代侧流测试条上接受询查以便于产生与相关分析物的存在或量有关的信号的离散位置。可检测信号可以通过将一次性测试装置插入到分析仪器诸如反射计、荧光计或透射光度计中来视觉读取或获得。这个清单并非意味着要限制。样品可以在未预处理的情况下涂覆到涂覆区上，或可以在涂覆之前与一种或多种测定试剂预混合。在后一种情况下，抗体可以提供在与一次性测试装置分开的容器中。
本发明的抗体可以分散性地固定到一次性测试装置内的表面上，以使得抗体在样品接触表面时溶解到所述样品中。在夹心测定模式中，这种分散性结合的抗体可以结合至样品中所述抗体的同源抗原，并且之后在抗原被检测区处非分散性地结合的第二抗体结合时固定在所述检测区处。在竞争模式中，样品中所述抗体的同源抗原可以与提供为测试试剂的标记抗原竞争结合至分散性结合的抗体。
本发明的试剂盒还可以包括用于使可检测信号与TIMP-2的浓度相关的校准。通过举例，校准曲线可以提供在由接收一次性测试装置的分析仪器读取的电子存储器装置上，诸如ROM芯片、闪存驱动器、RFID标签等。可替代地，校准曲线可以提供在编码标记上，所述编码标记被光学(诸如二维条形码)读取，或经由网络连接传输。分析仪器之后可以使用这个校准曲线来使来自测定的可检测信号与TIMP-2浓度相关。
在某一实施方案中，使用本发明的一种或多种抗体执行的测定方法提供与生物样品中的人TIMP-2的存在或量有关的信号，其中测定方法中的TIMP-2的最小可检测浓度是10ng/mL或更小、更优选地1ng/mL或更小以及最优选地0.1ng/mL或更小。
在优选方面，本发明提供用于确定生物样品中的人TIMP2的存在或量的方法，所述方法包括：
用与人TIMP2一起形成夹心复合物的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对所述生物样品执行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述生物样品中结合在所述夹心复合物中的人TIMP2的存在或量有关的可检测信号；以及
使所述可检测信号与所述生物样品中的人TIMP2的所述存在或量相关。优选地，免疫测定中的TIMP-2的最小可检测浓度是10ng/mL或更小、更优选地1ng/mL或更小以及最优选是0.1ng/mL或更小。
在特别优选的实施方案中，第一单克隆抗体和第二单克隆抗体中的一种或两种是特异地结合人TIMP-2的更为分离的单克隆抗体，其中每一种分离的单克隆抗体以至少108M-1的亲和力结合至多肽，所述多肽的序列由选自由以下组成的组的序列组成：
QAFCNADVVIRAKAVSEKEVD(SEQIDNO:1)、
IYGNPIKRIQYEIKQI(SEQIDNO:2)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQIDNO:3)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAV(SEQIDNO:4)、
EFIYTAPSSAVCGVS(SEQIDNO:5)、
TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQIDNO:6)、
SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQIDNO:7)、
SSPDECLWMDWVTEKNINGHQ(SEQIDNO:8)以及
CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQIDNO:9)。
优选的测定方法包括执行检测人TIMP-2的免疫测定。这类免疫测定可以包括将所述体液样品与检测标志物的抗体相接触，并且检测与所述抗体的结合。虽然本发明总体是在免疫测定方面描述，但不基于免疫球蛋白支架的其他结合实体(例如，适体)也可以使用来代替这类方法中的抗体。优选地，体液样品选自由尿液、唾液、血液、血清以及血浆组成的组，并且最优选地是尿液。
本公开的一个或多个实施方案的细节列举在以下附图和描述中。通过描述和附图并且通过权利要求书，本公开的其他特征、目的和优点将显而易见。
发明详述
定义
如本文所使用，术语“金属蛋白酶抑制剂2”和“TIMP-2”指代生物样品中存在的衍生自金属蛋白酶抑制剂2前体(人前体：Swiss-ProtP16035(SEQIDNO:10))的一种或多种多肽。
已鉴别金属蛋白酶抑制剂2中的以下结构域：
残基长度结构域ID
1-2626信号肽
27-220194金属蛋白酶抑制剂2
除非本文另外确切说明，否则所使用的术语的定义是药物科学领域中使用的标准定义。如说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定之外，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提到“药物载体”包括两个或更多个这类载体的混合物等。
如本文所使用的术语“受试者”指代人或非人生物体。因此，本文所描述的方法和组合物可适用于人和兽医疾病。另外，虽然受试者优选地是活生物体，但本文所描述的本发明同样可以用于死后分析。优选的受试者是人，并且最优选地是“患者”，所述患者如本文所使用指代正接收针对疾病或病状的医疗护理的活人。这包括针对病理体征进行研究的未患有所定义疾病的人。
优选地，分析物在样品中进行测量。这种样品可以获自受试者，或可以获自意图被提供给受试者的生物材料。例如，样品可以获自对受试者体内的可能移植正进行评价的肾，并且分析物测量用于评价肾的已经存在的损伤。优选的样品是体液样品。
如本文所使用的术语“体液样品”指代出于对相关受试者诸如患者或移植捐献者的诊断、预后、分类或评价的目的而获得的体液的样品。在某些实施方案中，这种样品可以出于确定正在发生的病状的转归或治疗方案对病状的影响的目的而获得。优选的体液样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰以及胸腔积液。此外，本领域技术人员将认识到某些体液样品在分级分离或纯化程序(例如，将全血分离为血清或血浆组分)之后会更容易分析。
如本文所使用的术语“诊断”指代技术人员可以估计和/或确定患者是患有还是不患有给定疾病或病状的概率(“可能性”)所凭借的方法。在本发明的情况下，“诊断”包括针对本发明的肾损伤标志物，任选地连同其他临床特征，使用测定(最优选地是免疫测定)的结果来得出对从中获得样品并对其评定的受试者的急性肾损伤或ARF的诊断(也就是说，发生或不发生)。“确定”这种诊断并不意味着暗示所述诊断是100％准确的。许多生物标志物指示多种病状。有经验的临床医师在信息真空的情况下不会使用生物标志物结果，而是将测试结果与其他临床指标一起使用以得出诊断。因此，预定诊断阈值一侧上的测量生物标志物水平相对于预定诊断阈值另一侧上的测量水平而言指示受试者体内出现疾病的更大的可能性。
类似地，预后风险信号表示给定过程或转归会发生的概率(“可能性”)。预后指标的水平或水平的变化(其反过来与增加的发病概率(例如，肾功能恶化、将来ARF、或死亡)相关联)被认为是患者的不良转归的“增加的可能性的指示”。
如本文所使用的术语“侧流”指代在纵向方向上穿过基本上平坦的多孔材料的试剂流。如果材料的厚度不超过长度和宽度尺寸的10％，这种多孔材料“基本上是平坦的”。
如本文相对于装置的第一区域所使用的术语“下游区域”指代在流体已到达第一区域之后接收流体流的区域。
如本文所使用的术语“样品涂覆区”指代出于确定其组分的目的而将相关流体样品引入其中的测定装置的一部分。
标志物测定
一般而言，免疫测定包括使含有或怀疑含有相关生物标志物的样品与特异地结合至生物标志物的至少一种抗体相接触。之后产生指示通过使样品中的多肽结合至所述抗体而形成的复合物的存在或量的信号。然后使所述信号与样品中的生物标志物的存在或量相关。用于检测和分析生物标志物的众多方法和装置对于技术人员而言是熟知的。参见，例如，美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792，以及TheImmunoassayHandbook，DavidWild编著，StocktonPress，NewYork，1994，所述文献各自以引用的方式整体并入本文，包括所有表格、附图和权利要求。
本领域中已知的测定装置和方法可以将标记分子用于各种夹心测定、竞争测定或非竞争测定模式中，以产生与相关生物标志物的存在或量有关的信号。合适的测定模式还包括色谱法、质谱法以及蛋白质“印迹”法。另外，某些方法和装置诸如生物传感器和光学免疫测定可以被采用来确定分析物的存在或量，而不需要标记分子。参见，例如，美国专利5,631,171；以及5,955,377，所述专利各自以引用的方式并入本文，包括所有表格、附图和权利要求。本领域技术人员还认识到包括但不限于BeckmanAbbottRocheDadeBehring系统的机器人器械属于能够执行免疫测定的免疫测定分析器。但可以利用任何合适的免疫测定，例如，酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争结合测定等。
抗体或其他多肽可以固定到用于测定的多种固体支持物上。可以用于固定特异性结合成员的固相包括固相结合测定中作为固相开发和/或使用的那些。合适的固相的实例包括膜滤器，纤维素基纸，珠粒(包括聚合颗粒、胶乳颗粒和顺磁颗粒)，玻璃，硅晶片，微粒，纳米颗粒，TentaGels，AgroGels，PEGA凝胶，SPOCC凝胶以及多孔板。可以通过将抗体或多种抗体以阵列方式涂布在固体支持物上来制备测定条。这种条之后可以浸入到测试样品中并随后通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量的信号，如显色的点。抗体或其他多肽可以通过直接缀合至测定装置表面或通过间接结合而结合至测定装置的特定区。在后一种情况的实例中，抗体或其他多肽可以固定在颗粒或其他固体支持物上，并且将所述固体支持物固定到装置表面上。
生物测定需要检测方法，并且用于结果定量的最常见方法之一是将可检测标记缀合至蛋白质或核酸，所述蛋白质或核酸对正在研究的生物系统中的组分之一具有亲和力。可检测标记可以包括本身是可检测的分子(例如，荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)；以及可以通过产生可检测反应产物(例如，酶诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过本身可以是可检测的特异性结合分子(例如，生物素、洋地黄毒苷、麦芽糖、寡组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)而间接检测到的分子。
固相和可检测标记缀合物的制备经常包括使用化学交联剂。交联试剂含有至少两个反应基团，并且总体上分成同功能交联剂(含有相同的反应基团)和异功能交联剂(含有不同的反应基团)。通过胺、硫氢基偶联或非特异性反应的同双功能交联剂可获自许多商业来源。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物、α-酰卤以及吡啶基二硫化物是巯基反应基团。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物以及α-酰卤与硫氢基反应以形成疏基醚键，而吡啶基二硫化物与硫氢基反应以产生混合的硫化物。吡啶基二硫化物产物是可裂解的。亚氨酸酯也对蛋白质-蛋白质交联十分有用。多种异双功能交联剂(每种组合用于成功缀合的不同属性)是可商业获得的。
在某些方面，本发明提供用于分析所描述的标志物的试剂盒。试剂盒包括用于分析至少一种测试样品的试剂，所述至少一种测试样品包含特异地结合至标志物的至少一种抗体。试剂盒还可以包括用于执行本文描述的诊断和/或预后相关性中的一种或多种的装置和说明书。优选的试剂盒将包括针对分析物，用于执行夹心测定的抗体对，或用于执行竞争测定的标记物质。优选地，抗体对包括缀合至固相的第一抗体以及缀合至可检测标记的第二抗体，其中第一抗体和第二抗体各自结合肾损伤标志物。最优选地，抗体各自是单克隆抗体。用于使用试剂盒和执行相关性的说明书可以是呈标记的形式，所述标记指代在试剂盒的制造、运输、销售或使用期间的任何时间与所述试剂盒附接或以其他方式相伴的任何书面或记录的材料。例如，术语标记涵盖广告传单和小册子、包装材料、说明书、录音带或录像带、计算机磁盘以及在试剂盒上直接印刷的文字。
在某些实施方案中，标志物测定是使用单次使用的一次性测试装置来执行。这类测试装置经常呈侧流装置的形式，所述侧流装置现在常见于商购的孕检测试的普遍使用。通常，这些测定装置具有延长的基层，在所述基层上可以区分样品添加区域与评价区域。在典型使用中，将样品涂覆到样品添加区域上，使样品沿平行于基层延伸的液体输送路径流动，并且之后流入到评价区域中。捕获试剂存在于评价区域中，并且捕获的分析物可以通过用于检测与捕获的分析物相关联的可视部分的多种方案来检测。例如，测定可以在指示生物样品中存在或不存在分析物时产生视觉信号，诸如颜色变化、荧光、发光等。
样品添加区域可以例如以下面形式提供：壳体内的开放腔室的形式；吸附垫的形式等。样品添加区域可以是各种构型即圆形、椭圆形、方形等的端口，或所述区域可以是装置中的沟槽。
滤器元件可以放置在样品添加区域之中，之上或附近，以过滤来自样品的微粒，以便于从血液去除血液细胞或阻止来自血液的血液细胞，以使得血浆可以进一步行进穿过所述装置。之后可以将滤液移到多孔膜中，所述多孔膜流体连接到所述滤器上。用于去除或阻止血液中存在的细胞材料的合适的滤器是本领域中熟知的。参见，例如，美国专利4,477,575；5,166,051；6,391,265；以及7,125,493，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。许多合适的材料对于技术人员而言是已知的，并且可以包括玻璃纤维、合成树脂纤维、各种类型的膜(所述膜包括不对称的膜滤器，其中孔径从约65变化至约15μm)以及这类材料的组合。此外，滤器元件可以包含一种或多种化学物质以促进红细胞与血浆的分离。这类化学物质的实例是凝血酶、凝集素、阳离子聚合物、对抗一种或多种红细胞表面抗原的抗体等。促进红细胞与血浆分离的这类化学物质可以通过共价方式、非特异性吸附等而提供在滤器元件中。
在某些实施方案中，标记区定位在样品接收区的下游，并且含有分散性定位的标记试剂，所述标记试剂结合至相关分析物或与相关分析物竞争结合至结合物质。可替代地，如果标记试剂在涂覆到样品接收区之前与样品预混合，可以消除所述标记区。检测区设置在标记区的下游，并且含有结合至相关分析物的固定的捕获试剂。
用于本发明的膜的最佳孔径是约10至约50μm。膜的厚度通常是约1密耳至约15密耳，通常是在5至10密耳的范围内，但可以是至多200密耳以及更厚。所述膜可以衬有大体上不透水的层，诸如聚酯薄膜(DuPontTeijinFilms)。当采用时，背衬通常通过粘附剂(诸如3M444双面胶带)紧固到所述膜上。通常，不透水的背衬用于厚度较小的膜。可以使用各种各样的聚合物，前提是所述聚合物并不非特异性地结合至测定组分并且不干扰样品流。说明性聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等。可替代地，所述膜可以是自支持的。也可以使用其他非吸水性膜，诸如聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。在各种实施方案中，标记区材料可以用包括封闭剂和稳定剂的溶液进行预处理。封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、甲基化BSA、酪蛋白、脱脂奶粉。所述装置还可以包括另外的组分，包括例如缓冲剂，HAMA抑制剂，洗涤剂，盐(例如，钙、镁、钾等的氯化盐和/或硫酸盐)以及蛋白质组分(例如，血清白蛋白、明胶、乳蛋白质等)。这个清单并非意味着要限制。
所述装置还可以包括被读取来确定测试装置已适当运行的各种控制位置。通过举例，可以提供与测定检测区分开的程序控制区，以验证样品流是所期望的。控制区优选地是空间上相异的区域，在所述区域处，可以产生指示适当的试剂流的信号。程序控制区可以含有相关分析物，或其片段，其可以与分析物测定中使用的多余的标记抗体结合。在操作中，标记试剂结合至控制区，甚至是在测试样品不存在相关分析物的情况下。使用对照系的益处在于对照系中出现信号指示可以读取测试结果(甚至是阴性结果)的时间。因此，当期望的信号出现在对照系中时，可以注意到捕获区中信号的存在或不存在。所述装置还可以包括阴性对照区域。这个对照区域的目的是警告用户测试装置未正常工作。当正常工作时，在阴性对照区域中应无法看到信号或标记。
这种测定装置的外壳或壳体可以呈现各种形式。通常，所述外壳或壳体将包括细长外壳，并且可以具有多个互相配合的部件。在一个特别优选的实施方案中，壳体包括顶盖和底部支持物。顶盖含有涂覆孔隙和观察口。在一个优选的实施方案中，壳体由不透水分的固体材料(例如，塑料材料)制成。涵盖的是，各种可商购的塑料可以用于构造壳体，所述塑料包括但不限于乙烯、尼龙、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚硫烷、聚酯、氨基甲酸乙酯以及环氧树脂。壳体可以通过本领域中熟知和使用的常规方法诸如标准模制技术来制备。壳体可以通过模制技术来产生，所述模制技术包括但不限于注塑模制、压缩模制、传递模制、吹塑模制、挤出模制、泡沫模制以及热成型模制。上述模制技术是本领域中熟知的，并且因此未在本文中详细论述。参见例如，ProcessesAndMaterialsOfManufacture，第三版，R.A.Lindsberg(1983)Allyn和Baron，第393-431页。
如果必要，那么所采用的可检测标记的比色强度、发光强度或荧光强度可以用对于标记而言适当的仪器来评价。通过举例，荧光计可以用于检测荧光标记；反射计可以用于检测吸收光的标记等。样品中相关分析物的浓度可以通过使测量的响应与样品流体中的分析物的量相关来确定。
测定相关性
如本文在测定中提及测量生物标志物所使用的术语“相关”和“有关”指代基于从测定获得的信号来确定样品中的生物标志物的存在，或更优选地所述生物标志物的量。这经常呈现以下形式：将从参与测定的一种物质上的可检测标记产生的信号与预定的标准曲线进行比较，所述预定标准曲线可以用于将信号转换成生物标志物的浓度或阈值量。
如本文提及使用生物标志物来诊断或预后所使用的术语“相关”和“有关”指代将患者体内的生物标志物的存在或量与已知患有或已知处于给定病状风险的人，或者已知未患有给定病状的人体内的生物标志物的存在或量进行比较。这经常呈现以下形式：将呈生物标志物浓度形式的测定结果与预定阈值进行比较，所述预定阈值被选择来指示疾病的发生或不发生或者某一将来转归的可能性。
选择诊断阈值尤其包括考虑疾病的概率、不同测试阈值处真假诊断的分布以及基于诊断而进行的治疗的后果(或治疗失败)的估计。例如，当考虑施用高度有效且风险水平降低的特效疗法时，几乎不需要测试，因为临床医师可以接受大部分诊断不确定性。另一方面，在治疗选项不太有效并且更具风险的情况下，临床医师往往需要更高程度的诊断确定性。因此，选择诊断阈值中涉及成本/效益分析。
合适的阈值可以按照各种方式来确定。例如，一种方法建议用于使用心肌肌钙蛋白诊断急性心肌梗死的诊断阈值是正常群体中观察到的浓度的97.5％。另一种方法可以是查看来自同一位患者的系列样品，其中先前的“基线”结果用于监控生物标志物水平的暂时变化。
群体研究也可以用于选择决策阈值。接受者操作特征(“ROC”)来自于第二次世界大战期间开发用于分析雷达图像的信号检测理论的领域，并且ROC分析经常用于选择能够最好地区分“患病”亚群体与“未患病”亚群体的阈值。在这种情况下，当人们检验呈阳性、但实际上并未患病时，出现假阳性。另一方面，当人们检验呈阴性(指示他们是健康的)时，此时他们实际上确实患病，出现假阴性。为了绘制ROC曲线，在决策阈值连续变动时，测定真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)。由于TPR等价于灵敏度并且FPR等同于1-特异性，所以ROC曲线有时称作灵敏度与(1-特异性)曲线。完美测试将具有ROC曲线下面积1.0；随机测试将具有面积0.5。选择阈值以提供可接受水平的特异性和灵敏度。
在此背景下，“患病”意图指代群体具有一种特征(存在某种疾病或病状，或某种转归出现)，而“未患病”意图指代群体缺少所述特征。虽然单一决策阈值是这种方法的最简单应用，但是可以使用多个决策阈值。例如，低于第一阈值时，可以向疾病的不存在赋予相对较高的可信度，并且高于第二阈值时，也可以向疾病的存在赋予相对较高的可信度。在这两个阈值之间可以视为中间状态。这意味着实质上仅是示例性的。
除了阈值比较之外，用于使测定结果与患者分类(发生或不发生疾病、转归的可能性等)相关的其他方法包括决策树、规则集、Bayesian方法以及神经网络方法。这些方法可以产生表示受试者属于多个分类中一个分类的程度的概率值。
测试准确度的量度可以按照Fischer等，IntensiveCareMed.29:1043-51，2003中所描述来获得，并且用于确定给定生物标志物的有效性。这些量度包括灵敏度和特异性、预测值、似然比、诊断差异比以及ROC曲线面积。ROC曲线图的曲线下面积(“AUC”)等于分类器将使随机选择的正案例高于随机选择的负案例的概率。因此，可以认为ROC曲线下面积等同于Mann-WhitneyU检验，所述Mann-WhitneyU检验对所考虑的两个组中获得的评分之间的中位数差异检验(如果所述组具有连续数据的话)，或等同于Wilcoxon秩检验。
如上所述，合适的检验可以显示关于这些多种量度的一个或多个以下结果：大于0.5、优选地至少0.6、更优选地至少0.7、仍然更优选地至少0.8、甚至更优选地至少0.9以及最优选地至少0.95的特异性，伴随大于0.2、优选地大于0.3,更优选地大于0.4、仍然更优选地至少0.5、甚至更优选地0.6、还更优选地大于0.7、仍然更优选地大于0.8、更优选地大于0.9以及最优选地大于0.95的对应灵敏度；大于0.5、优选地至少0.6、更优选地至少0.7、仍然更优选地至少0.8、甚至更优选地至少0.9以及最优选地至少0.95的灵敏度，伴随大于0.2、优选地大于0.3、更优选地大于0.4、仍然更优选地至少0.5、甚至更优选地0.6、还更优选地大于0.7、仍然更优选地大于0.8、更优选地大于0.9以及最优选地大于0.95的对应特异性；至少75％灵敏度，其与至少75％特异性组合；大于0.5、优选地至少0.6、更优选地0.7、仍然更优选地至少0.8、甚至更优选地至少0.9以及最优选地至少0.95的ROC曲线面积；不同于1、优选地至少约2或更大或约0.5或更小、更优选地至少约3或更大或约0.33或更小、仍然更优选地至少约4或更大或约0.25或更小、甚至更优选地至少约5或更大或约0.2或更小以及最优选地至少约10或更大或约0.1或更小的差异比；大于1、至少2、更优选地至少3、仍然更优选地至少5以及最优选地至少10的正似然比(计算为灵敏度/(1-特异性))；和/或小于1、小于或等于0.5、更优选地小于或等于0.3以及最优选地小于或等于0.1的负似然比(计算为(1-灵敏度)/特异性)。
抗体
如本文所使用的术语“抗体”指代由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段衍生、对其进行仿效或基本上由其编码的肽或多肽，所述肽或多肽能够特异性结合抗原或表位。参见，例如，FundamentalImmunology，第3版，W.E.Paul编著，RavenPress,N.Y.(1993)；Wilson(1994)；J.Immunol.Methods175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97。术语抗体包括保持结合抗原的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如、片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含由在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包括于术语“抗体”中供参考。
优选的治疗性抗体是IgG抗体。如本文所使用的术语“IgG”意指属于基本上由识别的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人体内，这种类别包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。在小鼠内，这种类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG类别抗体中已知的Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL以及CL。出于若干实践原因，IgG是治疗性抗体的优选类别。IgG抗体是稳定的、容易纯化的，并且能够在对于药物供应链而言实际的条件下储存。在体内，所述抗体具有长生物半衰期，所述生物半衰期不仅随着所述抗体的大小变化，而且是所述抗体与所谓的Fc受体(或FcRn)相互作用的结果。这种受体似乎保护IgG免于在细胞内分解代谢，并且将所述IgG再循环回到血浆。
抗体是结合特异性抗原的免疫蛋白。在大多数哺乳动物(包括人和小鼠)中，抗体由成对的重多肽链和轻多肽链构建而成。轻链可变区和重链可变区示出抗体之间明显的序列多样性，并且负责结合靶抗原。每条链均由单个免疫球蛋白(Ig)结构域组成，并且因此通用术语免疫球蛋白被用于所述蛋白质。
术语“特异地结合”并不意图指示抗体排他地结合至其期望靶标，因为如上所述，抗体结合至显示出与所述抗体结合的表位的任何多肽。而是，抗体在以下情况下才“特异地结合”：所述抗体对其期望靶标的亲和力比所述抗体对未显示适当表位的非靶分子的亲和力大约5倍以上。优选地，所述抗体对靶分子的亲和力将比其对非靶分子的亲和力大至少约5倍、优选地10倍、更优选地25倍、甚至更优选地50倍以及最优选地100倍或更大。在优选的实施方案中，优选的抗体以至少约107M-1、以及优选地介于约108M-1至约109M-1、约109M-1至约1010M-1或约1010M-1至约1012M-1之间的亲和力结合。
亲和力被计算为Kd＝koff/kon(koff是解离速率常数，Kon是缔合速率常数，并且Kd是平衡常数)。亲和力可以在平衡状态下通过测量各种浓度(c)下的标记配体的结合分率(r)来确定。数据使用斯卡查德(Scatchard)方程来绘制：r/c＝K(n-r)：其中r＝平衡状态下的结合配体的摩尔数/受体的摩尔数；c＝平衡状态下的游离配体浓度；K＝平衡缔合常数；并且n＝每个受体分子的配体结合位点的数目。通过图解分析，r/c相比于X轴上的r来在Y轴上作图，由此产生斯卡查德绘图。通过斯卡查德分析的抗体亲和力测量在本领域中是熟知的。参见，例如，vanErp等，J.Immunoassay12:425-43，1991；Nelson和Griswold，Comput.MethodsProgramsBiomed.27:65-8，1988。
本发明的抗体可以通过表位定位来进一步表征，以使得可以选择在本文描述的免疫测定中具有最大临床效用的抗体和表位。术语“表位”指代能够特异结合至抗体的抗原决定子。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。构型性以及非构型性表位差别在于：在变性溶剂存在下，对构型性表位的结合丧失，而不是非构型性表位。优选地，靶向存在于靶分子上，但部分地或完全地不存在于非靶分子上的表位。
在一些实施方案中，抗体支架可以是来自不同物种的序列的混合物。因此，如果所述抗体是抗体，这个抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般而言，“嵌合抗体”和“人源化抗体”指代组合来自多于一种物种的多个区的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下来自大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常指代可变域框架区已交换成人抗体中存在的序列的非人抗体。一般而言，在人源化抗体中，整个抗体除了CDR之外，是由人来源的多核苷酸编码或者除了其CDR内之外与此抗体相同。部分或全部由来源于非人生物体的核酸编码的CDR被移植入人抗体可变区的β折叠框架中以产生抗体，所述抗体的特异性由所移入的CDR决定。这类抗体的产生描述于例如WO92/11018,Jones,1986,Nature321:522-525,Verhoeyen等,1988,Science239:1534-1536中。将所选的受体框架残基“回复突变”为对应的供体残基往往需要恢复初始移植构建体中丧失的亲和力(美国专利号5,530,101；美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；美国专利号6,180,370；美国专利号5,859,205；美国专利号5,821,337；美国专利号6,054,297；美国专利号6,407,213)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分，并且因此通常将包含人Fc区。人源化抗体也可以使用具有基因工程化的免疫系统的小鼠产生。Roque等，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。用于人源化和重整非人抗体的各种技术与方法在本领域中是熟知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,HumanizationofMonoclonalAntibodies,MolecularBiologyofBCells,533-545,ElsevierScience(USA)，以及其中引证的参考文献)。人源化方法包括但不限于以下描述的方法：Jones等，1986,Nature321:522-525；Riechmann等，1988；Nature332:323-329；Verhoeyen等，1988,Science,239:1534-1536；Queen等，1989,ProcNatlAcadSci,USA86:10029-33；He等，1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等，1992,ProcNatlAcadSciUSA89:4285-9；Presta等，1997,CancerRes.57(20):4593-9；Gorman等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4181-4185；O'Connor等，1998,ProteinEng11:321-8。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化方法或其他方法可以包括表面重整(resurfacing)方法，例如在Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973中所描述。在一个实施方案中，亲本抗体已如本领域中所知加以亲和力成熟。可以采用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如在美国序列号11/004,590中所描述。可以采用基于选择的方法来对抗体可变区进行人源化和/或加以亲和力成熟，包括但不限于以下描述的方法：Wu等，1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等，1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等，1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:8910-8915；Krauss等，2003,ProteinEngineering16(10):753-759。其他人源化方法可以包括仅部分移植CDR，包括但不限于以下描述的方法：美国序列号09/810,502；Tan等，2002,J.Immunol.169:1119-1125；DePascalis等，2002,J.Immunol.169:3076-3084。
在一个实施方案中，抗体是完全人抗体。“完全人抗体”或“完整人抗体”指代具有来源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体。完全人抗体可以例如使用转基因小鼠(Bruggemann等，1997,CurrOpinBiotechnol8:455-458)或人抗体文库结合选择方法(Griffiths等，1998,CurrOpinBiotechnol9:102-108)来获得。
抗体的产生
单克隆抗体制备可以使用本领域中已知的各种各样的技术(包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合)来产生。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域中已知的和以下传授的那些：例如，Harlow等，ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版，1988)；Hammerling等，于：MONOCLONALANTIBODIESANDT-CELLHYBRIDOMAS，第563-681页(Elsevier,N.Y.,1981)(两者均以引用的方式整体并入)。如本文中所使用的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指代来源于单一克隆的抗体，包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆，而不指代产生所述抗体的方法。
来源于除了大鼠和小鼠之外的动物的单克隆抗体提供独特的优势。与信号转导和疾病相关的许多蛋白质靶标在小鼠、大鼠与人之间是高度保守的，并且因此可以被小鼠或大鼠宿主识别为自身抗原，从而使得所述蛋白质靶标免疫原性较低。在将兔子用作宿主动物时，可以避免这个问题。参见，例如，Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。
使用杂交瘤技术产生和筛选特定抗体的方法在本领域中是常规的并且是熟知的。在一个非限制性实例中，可以用相关抗原或表达这种抗原的细胞使小鼠免疫。一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到特异于抗原的抗体，就收获小鼠脾并且分离脾细胞。之后通过熟知的技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞。通过限制稀释法选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域中已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合抗原的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆以腹膜内方式接种小鼠来产生一般含有高水平抗体的腹水。
可以用于抗体产生方法的佐剂包括但不限于蛋白佐剂；细菌佐剂，例如，整个细菌(BCG、短小棒状杆菌、明尼苏达沙门菌)和细菌组分，包括细胞壁骨架、海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰脂质A、结核杆菌的甲醇可提取的残余物(MER)、完全或不完全弗氏佐剂；病毒佐剂；化学佐剂，例如，氢氧化铝、碘乙酸盐和胆甾醇半琥珀酸酯；裸DNA佐剂。可以用于本发明方法的其他佐剂包括霍乱毒素；paropox蛋白；MF-59(ChironCorporation；还参见Bieg等，(1999)“GAD65AndInsulinBChainPeptide(9-23)AreNotPrimaryAutoantigensInTheType1DiabetesSyndromeOfTheBBRat,”Autoimmunity,31(1):15-24，其以引用的方式并入本文)；(CorixaCorporation；还参见Lodmell等，(2000)“DNAVaccinationOfMiceAgainstRabiesVirus:EffectsOfTheRouteOfVaccinationAndTheAdjuvantMonophosphorylLipidA(MPL),”Vaccine,18:1059-1066；Johnson等，(1999)“3-O-DesacylMonophosphorylLipidADerivatives:SynthesisAndImmunostimulantActivities,”JournalofMedicinalChemistry,42:4640-4649；Baldridge等，(1999)“MonophosphorylLipidA(MPL)FormulationsForTheNextGenerationOfVaccines,”Methods,19:103-107，所有文献以引用的方式并入本文)；RC-529佐剂(CorixaCorporation；来自Corixa的氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)化学文库的先导化合物，还参见www.corixa.com)；以及DETOXTM佐剂(CorixaCorporation；DETOXTM佐剂包括佐剂(单磷酰脂质A)和分支杆菌属细胞壁骨架；还参见Eton等，(1998)“ActiveImmunotherapyWithUltravioletB-IrradiatedAutologousWholeMelanomaCellsPlusDETOXInPatientsWithMetastaticMelanoma,”Clin.CancerRes.4(3):619-627；以及Gupta等，(1995)“AdjuvantsForHumanVaccines—CurrentStatus,ProblemsAndFutureProspects,”Vaccine,13(14):1263-1276，两者均以引用的方式并入本文)。
众多出版物论述了使用噬菌体展示技术来产生和筛选用于结合至所选的分析物的多肽的文库。参见，例如，Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,6378-82,1990；Devlin等，Science249,404-6,1990,ScottandSmith,Science249,386-88,1990；以及Ladner等，美国专利号5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是在编码待筛选多肽的DNA与所述多肽之间建立物理联系。这种物理联系由噬菌体颗粒提供，所述噬菌体颗粒将多肽展示为包围噬菌体基因组的衣壳的部分，所述噬菌体基因组编码所述多肽。在多肽与其遗传物质之间建立物理联系允许同时大规模筛选极大数目的携带不同多肽的噬菌体。展示对靶标具有亲和力的多肽的噬菌体结合至所述靶标，并且通过针对所述靶标的亲和力筛选来富集这些噬菌体。从这些噬菌体展示的多肽的身份可以从它们相应的基因组中确定。使用这些方法，被鉴别为对所需靶标具有结合亲和力的多肽之后可以通过常规手段大量合成。参见，例如，美国专利号6,057,098，所述专利整体并入本文，包括所有表格、附图和权利要求。
然后可以通过以下方式选择由这些方法产生的抗体：首先用纯化的相关多肽筛选亲和力和特异性并且(如果需要)，将抗体的亲和力和特异性的结果与需要从结合作用中排除的多肽进行比较。筛选法可以包括在微量滴定板的独立孔中固定纯化的多肽。之后将含有潜在抗体或抗体群组的溶液置于相应的微量滴定孔中并且孵育约30分钟至2小时。然后洗涤微量滴定孔，并且将标记的第二抗体(例如，如果生成的抗体是小鼠抗体，与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)添加至各孔并且孵育约30分钟并且随后洗涤。将底物添加至各孔，并且在针对固定多肽的抗体存在的情况下，将出现颜色反应。
之后可以就所选的测定设计中的亲和力和特异性进一步分析如此鉴别的抗体。在开发针对靶蛋白的免疫测定时，纯化的靶蛋白充当标准，其中针对所述标准，判断使用已经选择的抗体的免疫测定的灵敏度和特异性。由于多种抗体的结合亲和力可以有所不同；某些抗体对(例如，在夹心测定中)可以在空间上彼此干扰等，抗体的测定性能可以是比绝对的抗体亲和力和特异性更重要的量度。
抗体还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞中。可替代地，除了人重链和轻链基因以外，还可以将人可变区、恒定区和多变区引入到小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座而使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时变得没有功能。具体而言，JH区的纯合子缺失防止内源性抗体产生。将修饰过的胚胎干细胞扩增并且显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后培养嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子后代。使用常规方法用所选抗原(例如，本发明多肽的全部或一部分)使转基因小鼠免疫。可以使用常规杂交瘤技术从免疫过的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生在治疗上有用的IgG、IgA、IgM以及IgE抗体。有关用于产生人抗体的这种技术的综述，参见Lonberg等，(1995)“HumanAntibodiesFromTransgenicMice,”Int.Rev.Immunol.13:65-93，所述文献以引用的方式整体并入本文。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及用于产生这类抗体的方案的详细论述，参见，例如，国际公开号WO98/24893、WO96/34096和WO96/33735；以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，这些文献以引用的方式整体并入本文。此外，可以使公司(诸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.))使用类似于上文所述的技术提供针对所选抗原的人抗体。
抗体的重组表达
一旦获得了编码本发明的抗体的核酸序列，就可以使用本领域中熟知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生抗体的载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体编码序列以及适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。(参见，例如，以下描述的技术：Sambrook等，1990,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.和Ausubel等编著，1998,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NY)。
包含抗体的核苷酸序列的表达载体可以通过常规技术(例如，电致孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)转移到宿主细胞，并且之后通过常规技术来培养转染细胞以产生本发明的抗体。在特定的实施方案中，抗体的表达通过组成型启动子、诱导型启动子或组织特异型启动子来调节。
用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞诸如大肠杆菌，或优选地真核细胞，尤其是用于表达整个重组免疫球蛋白分子。具体而言，与载体(诸如来自人巨大细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)联合的哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等，(1986)“PowerfulAndVersatileEnhancer-PromoterUnitForMammalianExpressionVectors.”Gene45:101-105；Cockett等，(1990)“HighLevelExpressionOfTissueInhibitorOfMetalloproteinasesInChineseHamsterOvaryCellsUsingGlutamineSynthetaseGeneAmplification,”Biotechnology8:662-667)。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体。这类宿主表达系统代表可以借以产生并随后纯化抗体的编码序列的媒介物，而且还代表在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的抗体的细胞。这些系统包括但不限于微生物，诸如用含有免疫球蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘质粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草杆菌)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia))；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜嵌纹病毒(CaMV)和烟草嵌纹病毒(TMV))感染或用含有免疫球蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘疮病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利号5,807,715)、PerC.6细胞(由Crucell开发的大鼠视网膜细胞))。
在细菌系统中，根据所表达抗体的预定用途对多种表达载体进行有利的选择。例如，当要产生大量这种蛋白质以供产生抗体的药物组合物时，可能需要指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，(1983)“EasyIdentificationOfcDNAClones,”EMBOJ.2:1791-1794)，其中抗体编码序列可以单独连接到与lacZ编码区同框的载体内，以使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等，(1985)“Up-PromoterMutationsInTheLppGeneOfEscherichiacoli,”NucleicAcidsRes.13:3101-3110；VanHeeke等，(1989)“ExpressionOfHumanAsparagineSynthetaseInEscherichiacoli,”J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等。pGEX载体也可以用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，这类融合蛋白是可溶性的，并且可以容易地通过吸附及结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠粒，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从溶解细胞纯化。pGEX载体经设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，以使得可以从GST部分释放克隆的目标基因产物。
在昆虫系统中，使用加洲苜蓿夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus，AcNPV)作为表达外来基因的载体。病毒生长于草地粘虫(Spodopterafrugiperda)细胞中。可以将抗体编码序列个别地克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中，并且置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，相关抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联前导序列)。之后可以通过体外或体内重组将此嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)中将产生活的且能够在受感染宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒。(参见例如，Logan等，(1984)“AdenovirusTripartiteLeaderSequenceEnhancesTranslationOfmRNAsLateAfterInfection,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81:3655-3659)。也可以需要特定起始信号来有效翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框架同相以确保翻译全部插入物。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然与合成两者均可。可以通过包括适当转录增强子元件、转录终止子等来增强表达效率(参见Bitter等，(1987)“ExpressionAndSecretionVectorsForYeast,”MethodsinEnzymol.153:516-544)。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)就蛋白质功能而言可以是重要的。不同宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特征性及特定机制。可以选择适当细胞系或宿主系统以确保对表达的外来蛋白质进行正确的修饰和加工。为此目的，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030以及Hs578Bst。
对于重组蛋白的长期高产量产生，稳定表达是优选的。例如，可以使稳定表达本发明的抗体的细胞系工程化。可以用受适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标志物转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA后，可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1至2天，并且接着转换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并且生长以形成转化灶(foci)，所述转化灶转而可以进行克隆并扩增成细胞系。这种方法可以有利地用于使表达本发明的抗体的细胞系工程化。这类工程化的细胞系可能特别适用于筛选和评价与本发明的抗体直接或间接相互作用的化合物。
可以使用许多选择系统，包括但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，(1977)“TransferOfPurifiedHerpesVirusThymidineKinaseGeneToCulturedMouseCells,”Cell11:223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等，(1962)“GeneticsOfHumanCessLine.IV.DNA-MediatedHeritableTransformationOfABiochemicalTrait,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48:2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，(1980)“IsolationOfTransformingDNA:CloningTheHamsterAprtGene,”Cell22:817-823)基因。另外，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，对甲氨蝶呤赋予抗性(Wigler等，(1980)“TransformationOfMammalianCellsWithAnAmplfiableDominant-ActingGene,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:3567-3570；O'Hare等，(1981)“TransformationOfMouseFibroblastsToMethotrexateResistanceByARecombinantPlasmidExpressingAProkaryoticDihydrofolateReductase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:1527-1531)；gpt，对霉酚酸赋予抗性(Mulligan等，(1981)“SelectionForAnimalCellsThatExpressTheEscherichiacoliGeneCodingForXanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:2072-2076)；neo，对氨基糖苷G-418赋予抗性(Tachibana等，(1991)“AlteredReactivityOfImmunoglobutinProducedByHuman-HumanHybridomaCellsTransfectedBypSV2-NeoGene,”Cytotechnology6(3):219-226；Tolstoshev(1993)“GeneTherapy,Concepts,CurrentTrialsAndFutureDirections,”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan(1993)“TheBasicScienceOfGeneTherapy,”Science260:926-932；以及Morgan等，(1993)“Humangenetherapy,”Ann.Rev.Biochem.62:191-217)。重组DNA技术领域中普遍已知的可以使用的方法在以下进行描述：Ausubel等(编著)，1993,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NY；Kriegler,1990,GENETRANSFERANDEXPRESSION,ALABORATORYMANUAL,StocktonPress,NY；和Dracopoli等(编著),1994,CURRENTPROTOCOLSINHUMANGENETICS,JohnWiley&Sons,NY.的第12章和第13章；Colbere-Garapin等，(1981)“ANewDominantHybridSelectiveMarkerForHigherEukaryoticCells,”J.Mol.Biol.150:1-14；以及hygro，对潮霉素赋予抗性(Santerre等，(1984)“ExpressionOfProkaryoticGenesForHygromycinBAndG418ResistanceAsDominant-SelectionMarkersInMouseLCells,”Gene30:147-156)。
可通过载体扩增增加本发明的抗体的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel，“TheUseOfVectorsBasedOnGeneAmplificationForTheExpressionOfClonedGenesInMammaianCells,”inDNACLONING,第3卷(AcademicPress,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平增加将使标志物基因的拷贝数增加。由于扩增区域与抗体的核苷酸序列相关联，所以也会提高抗体的产量(Crouse等，(1983)“ExpressionAndAmplificationOfEngineeredMouseDihydrofolateReductaseMinigenes,”Mol.Cell.Biol.3:257-266)。
宿主细胞可以用本发明的两个表达载体共转染，第一载体编码重链来源的多肽而第二载体编码轻链来源的多肽。两个载体可以含有相同的可选择标志物，从而使得重链和轻链多肽能同等地表达。可替代地，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单一载体。在这类情况下，轻链应位于重链前侧，以避免产生过多有毒的游离重链(Proudfoot(1986)“ExpressionAndAmplificationOfEngineeredMouseDihydrofolateReductaseMinigenes,”Nature322:562-565；Kohler(1980)“ImmunoglobulinChainLossInHybridomaLines,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦重组表达了本发明的抗体，那么所述抗体就可以通过本领域中已知用于纯化抗体的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱(尤其是通过特定抗原对蛋白质A的亲和力)和分级柱色谱)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。
实施例
实施例1：兔子体内的单克隆抗体形成
用抗原/佐剂乳液通过皮下注射(SQ)来使雌性新西兰兔免疫。用完全弗氏佐剂进行初次免疫，并且不完全弗氏佐剂用于所有后续增强。以250μg蛋白抗原/兔子每三周对兔子进行SQ注射(两个部位交替，臀部和肩胛骨)。在第二次增强之后七天从耳缘静脉取得测试血液。这种测试血液(免疫血清)通过间接ELISA测定来测试，以确定兔子的免疫应答对于单克隆抗体形成而言是否足够。向有最好反应的兔子给予最终SQ增强，并且四天之后经由放血来使所述兔子安乐死。经由心脏穿刺收集全血。产生相关抗体的B细胞通过对靶抗原进行间接ELISA来鉴别，并且使免疫球蛋白基因分离。将重链和轻链克隆到分开的哺乳动物表达载体中，转染到HEK细胞中(瞬时转染)，并且收获含有兔单克隆抗体的组织培养上清液。
实施例2：小鼠体内的单克隆抗体形成
根据标准操作规程用抗原/佐剂乳液通过腹腔注射(IP)来使雌性BALB/c小鼠(60天大)免疫。用完全弗氏佐剂进行初次免疫，并且不完全弗氏佐剂用于所有后续增强。以25μg抗原/小鼠每3周对小鼠进行IP注射(每只小鼠总容积125μL)。在第二次增强之后7至10天通过隐静脉刺血来获得测试血液。这种测试血液(免疫血清)通过间接ELISA测定来测试，以确定小鼠的免疫应答对于融合而言是否足够。经由侧尾静脉向有最好反应的2只小鼠给予10μg抗原/小鼠的无菌盐水的最终静脉内增强。在第四次增强之后4天，使小鼠安乐死并且收获脾。将与脾分离的淋巴细胞用于融合过程以使用以下方法产生杂交瘤：Kohler,G.；Milstein,C.(1975)."Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity".Nature256(5517):495–497。使用PEG1500融合过程来产生杂交瘤。
实施例3：用患者样品筛选抗体(基于微量滴定的ELISA方法)
材料：
96-孔高结合ELISA板-Costar3590(Corning)
ELISA包被缓冲液：PBS
ELISA洗涤缓冲液：具有0.02％Tween-20的PBS
ELISA封闭缓冲液(ThermoPierce，目录号N502)
ELISA稀释剂：200mMTris、1％BSA(BioFx)、0.05％Tween-20，pH8.1
中性链亲和素-HRP缀合物(ThermoPierce，目录号31001)
1-StepUltraTMB底物(R&Dsystems，目录号34028)
终止液：2N硫酸
捕获抗体
生物素缀合的检测抗体
重组人TIMP2(Peprotech，目录号410-02)
EXLx405洗板机(Biotek)
MultiskanFC读板机(FisherScientific)
测试程序
将纯化的重组TIMP2分析物掺入到稀释剂中并且连续稀释以产生覆盖一定浓度范围的一组标准样品。将冷冻的患者样品的单次使用等分试样在室温水浴中解冻10分钟，并且之后用稀释剂稀释到所需水平。
将在包被缓冲液中制备的100μL的5μg/mL捕获抗体溶液添加到96孔高结合ELISA板上的每个孔中，并且在室温(22℃至25℃)下孵育过夜。吸干每个孔并且使用自动洗涤器用300μL洗涤缓冲液洗涤三次。之后将250μLELISA封闭缓冲液添加到每个孔中。在室温下孵育2小时之后，重复上述吸干/洗涤步骤。
将100μL标准样品或患者样品添加到所制备板的每个孔中，并且在室温下，在水平定轨摇床上孵育。在2小时孵育之后，如上所述洗涤所述板。之后将在稀释剂中制备的100μL的0.1μg/mL检测抗体溶液添加到每个孔中。在室温下孵育1小时之后，再次洗涤所述板。在稀释剂中制备0.1μg/mL中性链亲和素-HRP缀合物溶液，并且将100μL这种溶液添加到每个孔中。在室温下将所述板孵育1小时，并且进行洗涤。将100μL1-stepultraTMB底物添加到每个孔中，在室温下避光孵育10分钟，之后是50μL终止液。用波长设定为450nm的酶标仪测量每个孔中的光密度。
实施例4：用患者样品筛选抗体(侧流条测试方法)
材料：
硝化纤维素膜
背衬卡
样品垫
芯吸垫
膜封闭缓冲液：10mM磷酸钠、0.1％蔗糖、0.1％BSA、0.2％PVP-40，pH8.0
样品垫封闭缓冲液：5mM硼酸、0.1％Tween-20、0.25％PVP-40、0.5％BSA，pH8.5
运行缓冲液J：500mMTris、0.2％10G、0.35％Tween-20、0.25％PVP-40，pH8.5
荧光共轭抗体
测试线抗体
山羊-抗-小鼠阳性对照抗体
重组人TIMP-2
划线涂布组件
使用AD3050抽吸分配系统用测试线抗体来划线涂布硝化纤维素膜，用膜封闭缓冲液进行封闭，并且在37℃下干燥30分钟。在干燥器中固化过夜之后，用芯吸垫和用样品垫封闭缓冲液预处理过的样品垫将成条的且封闭的硝化纤维素膜层压到背衬卡上。将所述卡切割成5mm宽的测试条，之后将所述测试条置于药筒中。
样品制备
将纯化的重组TIMP-2分析物掺入到运行缓冲液J中并且连续稀释以产生覆盖一定浓度范围的一组标准样品。将冷冻的患者样品的单次使用等分试样在室温水浴中解冻10分钟，并且之后用运行缓冲液J稀释到所需水平。
测试程序
将10μL荧光共轭抗体(0.025μg/μL)的PBS添加到100μL样品中。之后将100μL这种溶液装载到药筒上的输入口中。在t＝20分钟时使用荧光读取器和相关联软件来读取结果。
实施例5：表位定位
材料：96孔高结合微量滴定板、中性链亲和素、生物素酰化的肽、未缀合的抗体、小鼠IgG、兔IgG、山羊IgG、HRP缀合至抗小鼠IgG的HRP缀合物、抗兔IgGHRP缀合物、抗山羊IgGHRP缀合物、TMB底物、2N硫酸用于表位定位实验。
将中性链亲和素固定在96孔高结合微量滴定板的各个孔中。洗涤所述板以去除未反应的中性链亲和素，之后是封闭步骤。将生物素酰化的肽在缓冲水溶液中溶解到10μg/mL的浓度。将50μL肽溶液添加到中性链亲和素涂布的微量滴定板的每个孔中。将这些板在室温下孵育一小时，并且之后进行洗涤以去除未结合的肽。将未缀合的小鼠和兔抗体稀释到5μg/mL，并且以100μL/孔添加到板上。将抗小鼠IgG(在小鼠抗TIMP2中)或抗兔IgG(在兔抗TIMP2的情况下)添加到邻近孔中作为阴性对照。在室温下将板孵育1小时，并且进行洗涤。将缀合至抗小鼠IgG的HRP(在小鼠抗TIMP2和小鼠IgG阴性对照的情况下)以及缀合至抗兔IgG的HRP(在兔抗TIMP2和兔IgG阴性对照的情况下)稀释到0.2μg/mL，并且将100μL添加到所述板的每个孔中。在室温下将这些板孵育20分钟，并且进行洗涤。以100μL/孔添加TMB底物，并且将板孵育20分钟，同时避免暴露于光。将50μl/孔终止液(2N硫酸)添加到板的每个孔上以终止反应。在设定为在450nm下测量光密度的分光光度式96孔酶标仪上读取吸光度。
实施例6：丙氨酸扫描肽定位
丙氨酸扫描是广泛使用的诱变方法，其中靶蛋白中的残基在所选位置处通过定点诱变系统性取代为丙氨酸，进行表达并且测定功能。用丙氨酸残基进行取代消除了侧链相互作用，而不需改变主链构象或引入位阻效应或静电效应。使用自动化诱变方案，靶多肽中的每个残基被改变为丙氨酸，并且可以确定包含每个抗体结合结构域的关键残基。
实施例7：结果
使用组合的丙氨酸扫描和肽定位结果，鉴别并选择独特的TIMP-2单克隆抗体。先前在可商购的TIMP-2单克隆抗体中并未观察到这些抗体的结合中涉及的表位。
虽然本发明以使得本领域技术人员能够制得并使用它的足够细节来描述和例示，但是各种替代方案、修改和改进应是显而易见的，而不背离本发明的精神和范围。本文中提供的实施例代表优选实施方案，为示例性的，并且并非意图作为本发明的范围的限制。本领域技术人员将想到本文的修改和其他用途。这些修改都涵盖在由权利要求书的范围所界定的本发明的精神范围内。
除非另外陈述，否则本文“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”是可互换的并且不意图是限制性的。
应进一步理解在各种实施方案的描述使用了术语“包含”的地方，本领域技术人员将理解在一些具体的例子中，实施方案可以使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来替代地描述。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然可以在所公开的方法和组合物的实践中使用类似或等效于本文所描述的那些方法和试剂的任何方法和试剂，但是现在描述了示例性的方法和材料。
出于描述和公开描述于出版物中、可能与本文的描述结合使用的方法学的目的，本文所提及的所有出版物均以引用的方式整体并入本文。说明书中提到的所有专利和出版物指示在本公开的提交日期之前的本发明所属领域中的普通技术人员的水平。在本文中没有任何内容应该解释为承认发明人无权先于因先前发明所作的此类公开。
本领域技术人员将容易显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以对本文中所公开的发明进行可变的替换和修改。
本文中适当地说明性地描述的发明可以在缺少在本文中并未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下实践。因此，例如，在本文中的每一个例子中，术语“包含”、“主要由……组成”和“由……组成”中的任何术语都可以由其他两个术语中的任何一个代替。已采用的术语和措辞是用作描述而非限制的术语，并且在使用这类术语和措辞时并非意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，各种修改可能处在要求保护的本发明范围内。因此，应理解，尽管本发明已由优选实施方案和任选特征具体公开，但是本领域技术人员可以采用本文中公开的概念的修改和变化，并且这类修改和变化被视为处在如由所附权利要求书所界定的本发明的范围内。
在以上权利要求书内阐述其他实施方案。

Claims (26)

1.一种特异地结合人TIMP-2的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体以至少108M-1的亲和力结合至多肽，所述多肽的序列由选自由以下组成的组的序列组成：
QAFCNADVVIRAKAVSEKEVD(SEQIDNO:1)、
IYGNPIKRIQYEIKQI(SEQIDNO:2)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQIDNO:3)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAV(SEQIDNO:4)、
EFIYTAPSSAVCGVS(SEQIDNO:5)、
TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQIDNO:6)、
SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQIDNO:7)、
SSPDECLWMDWVTEKNINGHQ(SEQIDNO:8)以及
CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQIDNO:9)。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体缀合至信号发生成分。
3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体固定在固体支持物上。
4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体被提供为试剂盒中的试剂，所述试剂盒还包括一次性测试装置，所述一次性测试装置被配置来产生与生物样品中的人TIMP-2的存在或量有关的可检测信号。
5.根据权利要求4所述的分离的单克隆抗体，其中所述一次性测试装置是侧流测试装置。
6.根据权利要求4或5中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体固定到所述一次性测试装置内的表面上。
7.根据权利要求4或5中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体提供在与所述一次性测试装置分开的容器中。
8.根据权利要求4-7中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述试剂盒还包括特异地结合人TIMP-2的第二抗体，其中所述分离的单克隆抗体和所述抗体与人TIMP-2形成夹心复合物。
9.根据权利要求8所述的分离的单克隆抗体，其中所述第二抗体是以至少108M-1的亲和力结合至多肽的单克隆抗体，所述多肽的序列由选自由以下组成的组的序列组成：
QAFCNADVVIRAKAVSEKEVD(SEQIDNO:1)、
IYGNPIKRIQYEIKQI(SEQIDNO:2)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQIDNO:3)、
YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAV(SEQIDNO:4)、
EFIYTAPSSAVCGVS(SEQIDNO:5)、
TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQIDNO:6)、
SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQIDNO:7)、
SSPDECLWMDWVTEKNINGHQ(SEQIDNO:8)以及
CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQIDNO:9)。
10.根据权利要求4-9中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述试剂盒还包括用于使所述可检测信号与TIMP-2的浓度相关的校准。
11.根据权利要求10所述的分离的单克隆抗体，其中所述校准是提供在电子存储器装置上的校准曲线。
12.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体被提供为体外诊断中的试剂。
13.根据权利要求4-10中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述试剂盒被配置来执行测定方法，所述测定方法提供与生物样品中的人TIMP-2的存在或量有关的信号，并且其中所述测定方法中的TIMP-2的最小可检测浓度是10ng/mL或更小。
14.根据权利要求1-13中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体是兔、小鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物抗体。
15.根据权利要求1-13中一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体是兔抗体。
16.一种用于确定生物样品中的人TIMP2的存在或量的方法，其包括：
用与人TIMP2一起形成夹心复合物的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对所述生物样品执行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述生物样品中结合在所述夹心复合物中的人TIMP2的存在或量有关的可检测信号；以及
使所述可检测信号与所述生物样品中的人TIMP2的所述存在或量相关。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述免疫测定中TIMP-2的最小可检测浓度是10ng/mL或更小。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的一个或两个是根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体。
19.根据权利要求16-18中一项所述的方法，其中所述免疫测定是以侧流模式执行。
20.根据权利要求16-18中一项所述的方法，其中所述免疫测定是体外诊断。
21.根据权利要求16-20中一项所述的方法，其中所述免疫测定通过将所述人患者样品涂覆到一次性测试装置上来执行，并且所述可检测信号通过将所述一次性测试装置插入到分析仪器中来获得，其中包含所述第一抗体和所述第二抗体的所述夹心复合物被固定用于在所述一次性测试装置的预定区内进行检测，并且其中所述分析仪器检测所述固定的夹心复合物以提供所述可检测信号。
22.根据权利要求16-21中一项所述的方法，其中所述第一抗体缀合至信号发生成分。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一抗体与所述人患者样品形成反应混合物，并且所述人患者样品通过将所述反应混合物涂覆到所述一次性测试装置上来涂覆到所述一次性测试装置上。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述第二抗体固定在固体支持物的预定区处。
25.根据权利要求11-18中一项所述的方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体各自是兔、小鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物抗体。
26.根据权利要求11-18中一项所述的方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体各自是兔抗体。
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