CN105506119A - 大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，包括：两组大鼠均分笼喂养，对照组饲以基础饲料，实验组饲以高脂饲料；用已高压的手术器械采集大鼠网膜脂肪组织，3cm×3cm置于5ml冻存管内，标记时间、编号及分组信息，置于液氮速冻，-80℃保存；称取100mg左右实验脂肪组织样品，并至于液氮预冷的研钵中低温下研磨至粉状，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，检测KLF4、KLF7及NF-кB炎症信号通路关键因子mRNA表达水平。

Description

大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法。

背景技术

肪组织不仅是能量储备场所，还是活跃的内分泌器官。近年来的研究已经阐明，脂肪组织可以分泌多种炎症因子，参与原发性炎症。因此阐明脂肪组织在炎症发生中的作用，将有助于重新认识一些疾病的发病机制，为疾病的防治提供新的思路。

但是KLF4在脂肪组织中的抗炎作用和KLF7在脂肪组织中的促炎作用属于技术空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，旨在解决KLF4在脂肪组织中的抗炎作用和KLF7在脂肪组织中的促炎作用属于技术空白的问题。

本发明是这样实现的，一种大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法肥胖状态下，高水平的FFA与TLR4结合上调KLF7表达，促进炎症因子表达，导致释放组织发生炎症；同时，抑制TLR9水平而下调KLF4表达，减弱KLF4对炎症信号通路关键因子的抑制作用，促进炎症反应。

进一步，所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法包括：高脂喂养4周后，实验组大鼠体重开始显著高于对照组，第10周实验组大鼠体重进入平台期，但仍高于对照组；高脂喂养第4及第10周，实验组大鼠血浆FFA、Glu、TG、TC、LDL、TNF-α水平高于对照组，LPT、APN水平低于对照组；网膜脂肪组织中，实验组TLR9、KLF4mRNA表达水平低于对照组，KLF7、SRC和IL-6mRNA表达水平高于对照组；TLR9与血浆FFA负相关，与KLF4正相关；KLF4与SRC、NF-κB负相关；KLF7与TLR4、SRC、NF-κB和IL-6正相关，与KLF4负相关。

进一步，所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法具体包括：

两组大鼠均分笼喂养，对照组饲以米、豆粕、鱼粉、面粉、麸皮、食盐、磷酸氨钙、石粉、多种维生素、多种微量元素、氨基酸的基础饲料，实验组饲以高脂饲料；实验大鼠每笼8只，每天更换饮水，隔日清理粪便，每周进行动物房消毒，每两周测量体重1次；

用已高压的手术器械采集大鼠网膜脂肪组织，3cm×3cm置于5ml冻存管内，标记时间、编号及分组信息，置于液氮速冻，-80℃保存；

称取100mg左右实验脂肪组织样品，并至于液氮预冷的研钵中低温下研磨至粉状，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR法检测KLF4、KLF7及NF-кB炎症信号通路关键因子(TLR4,TLR9,NF-кB,SRC,IL-6)mRNA表达水平。

进一步，所述RNA浓度为20ng/μl-1500ng/μl，A260/280的比值介于1.8-2.1。

进一步，所述PCR反应体系为20μl：RNase-free水7μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，SYBRSelectMasterMix10μl，cDNA2μl。

进一步，所述PCR反应条件为：经94℃30s预变性后，95℃变性5s，60℃34s，40个循环。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法中TLR4与KLF7的脂肪组织抗炎作用靶点。

本发明提供的大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，通过本发明发现网膜脂肪组织中，肥胖组大鼠TLR9、KLF4mRNA表达水平低于正常体重组，KLF7、SRC和IL-6mRNA表达水平高于正常体重组；TLR9与血浆FFA负相关，与KLF4正相关；KLF4与SRC、NF-κB负相关；KLF7与TLR4、SRC、NF-κB和IL-6正相关，与KLF4负相关(P<0.05)。以上结果表明肥胖状态下，高水平的FFA一方面可与TLR4结合上调KLF7表达，促进炎症因子表达，导致释放组织发生炎症；同时，可抑制TLR9水平而下调KLF4表达，减弱KLF4对炎症信号通路关键因子的抑制作用，从而促进炎症反应。本研究结果将为肥胖导致炎症的具体机制提供理论依据，同时TLR9，KLF7及KLF4可作为治疗肥胖、肥胖导致炎症性疾病以及相关慢性代谢性疾病(如2型糖尿病)药物作用靶点。

附图说明

图1是本发明实施例提供的大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的对照组大鼠与实验组大鼠体重比较示意图。

图3是本发明实施例提供的KLF7与炎症信号通路关键基因相关性示意图(Spearman相关性分析法，*P<0.05两组间差异具有统计学意义)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例的大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法包括以下步骤：

S101：两组大鼠均分笼喂养，对照组饲以米、豆粕、鱼粉、面粉、麸皮、食盐、磷酸氨钙、石粉、多种维生素、多种微量元素、氨基酸的基础饲料，实验组饲以高脂饲料；实验大鼠每笼8只，每天更换饮水，隔日清理粪便，每周进行动物房消毒，每两周测量体重1次；

S102：用已高压的手术器械采集大鼠网膜脂肪组织，约3cm×3cm置于5ml冻存管内，标记时间、编号及分组信息，置于液氮速冻，-80℃保存；

S103：称取100mg左右实验脂肪组织样品，并立刻至于液氮预冷的研钵中低温下研磨至粉状，Trizol法提取总RNA，RNA浓度为20ng/μl至1500ng/μl之间，A260/280的比值介于1.8-2.1之间，立即反转录为cDNA，qRT-PCR法检测KLF4、KLF7及NF-кB炎症信号通路关键因子(TLR4,TLR9,NF-кB,SRC,IL-6)mRNA表达水平。

下面结合实验对本发明的应用效果作进一步的说明。

1、大鼠肥胖模型的建立

两组大鼠均分笼喂养，对照组饲以基础饲料(北京科澳协力饲料有限公司提供，原料组成：玉米、豆粕、鱼粉、面粉、麸皮、食盐、磷酸氨钙、石粉、多种维生素、多种微量元素、氨基酸等)，实验组饲以高脂饲料(40％脂肪比)。实验大鼠每笼8只，每天更换饮水，隔日清理粪便，每周进行动物房消毒，每两周测量体重1次。

2、大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法

网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平测定

用已高压的手术器械采集大鼠网膜脂肪组织，约3cm×3cm置于5ml冻存管内，标记时间、编号及分组信息，置于液氮速冻，-80℃保存。称取100mg左右实验脂肪组织样品，并立刻至于液氮预冷的研钵中低温下研磨至粉状，Trizol法提取总RNA，RNA浓度为20ng/μl至1500ng/μl之间，A260/280的比值介于1.8-2.1之间，立即反转录为cDNA，qRT-PCR法检测KLF4、KLF7及NF-кB炎症信号通路关键因子(TLR4,TLR9,NF-кB,SRC,IL-6)mRNA表达水平。实时定量PCR仪购自美国ABI公司，型号ABI7500fast。PCR反应体系为20μl：RNase-free水7μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，SYBRSelectMasterMix10μl，cDNA2μl。反应条件为：经94℃30s预变性后，95℃变性5s，60℃34s，40个循环。使用以下引物，见表1。

表1各种引物序列表

3、结果

3.1大鼠体重比较

高脂喂养4周后，实验组大鼠体重开始显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，至第10周实验组大鼠体重进入平台期，但仍高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。至第10周实验组大鼠体重(403.00±50.38)g已经超过对照组大鼠(318.50±38.07)g的20％；且实验组大鼠Lee’s指数(337.10±4.72)显著高于对照组大鼠(323.42±4.72)(P<0.01)。

3.2两组大鼠血糖、血脂、脂肪细胞因子及炎症因子水平比较

高脂喂养第4周，实验组FFA、TG、TC、LDL水平显著高于对照组；高脂喂养第10周，实验组Glu、TG、FFA、TNF-α水平显著高于对照组，LPT、APN水平显著低于对照组，以上差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2各时间点大鼠血糖、血脂、脂肪细胞因子及炎症因子水平比较

t检验,各时间点实验组大鼠与对照组相比差异有统计学意义,*P<0.05.

网膜脂肪组织炎症信号通路关键基因相关性

KLF7mRNA表达水平与TLR4表达正相关，与SRC、NF-κB、IL-6表达显著正相关(P<0.05)，与KLF4表达显著负相关(P<0.05)；并且TLR4mRNA表达水平与NF-κB显著正相关(P<0.05)，见图3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，其特征在于，所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法肥胖状态下，高水平的FFA与TLR4结合上调KLF7表达，促进炎症因子表达，导致释放组织发生炎症；同时，抑制TLR9水平而下调KLF4表达，减弱KLF4对炎症信号通路关键因子的抑制作用，促进炎症反应。

2.如权利要求1所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，其特征在于，所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法包括：高脂喂养4周后，实验组大鼠体重开始显著高于对照组，第10周实验组大鼠体重进入平台期，但仍高于对照组；高脂喂养第4及第10周，实验组大鼠血浆FFA、Glu、TG、TC、LDL、TNF-α水平高于对照组，LPT、APN水平低于对照组；网膜脂肪组织中，实验组TLR9、KLF4mRNA表达水平低于对照组，KLF7、SRC和IL-6mRNA表达水平高于对照组；TLR9与血浆FFA负相关，与KLF4正相关；KLF4与SRC、NF-κB负相关；KLF7与TLR4、SRC、NF-κB和IL-6正相关，与KLF4负相关。

3.如权利要求1所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，其特征在于，所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法具体包括：

两组大鼠均分笼喂养，对照组饲以米、豆粕、鱼粉、面粉、麸皮、食盐、磷酸氨钙、石粉、多种维生素、多种微量元素、氨基酸的基础饲料，实验组饲以高脂饲料；实验大鼠每笼8只，每天更换饮水，隔日清理粪便，每周进行动物房消毒，每两周测量体重1次；

用已高压的手术器械采集大鼠网膜脂肪组织，3cm×3cm置于5ml冻存管内，标记时间、编号及分组信息，置于液氮速冻，-80℃保存；

称取100mg左右实验脂肪组织样品，并至于液氮预冷的研钵中低温下研磨至粉状，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR法检测KLF4、KLF7及NF-кB炎症信号通路关键因子mRNA表达水平，关键因子为TLR4,TLR9,NF-кB,SRC,IL-6。

4.如权利要求3所述的大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，其特征在于，所述RNA浓度为20ng/μl-1500ng/μl，A260/280的比值介于1.8-2.1。

5.如权利要求3所述的大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，其特征在于，所述PCR反应体系为20μl：RNase-free水7μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，SYBRSelectMasterMix10μl，cDNA2μl。

6.如权利要求3所述的大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：经94℃30s预变性后，95℃变性5s，60℃34s，40个循环。

7.一种使用权利要求1-6任意一项所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法中TLR4与KLF7的脂肪组织抗炎作用靶点。

8.一种使用权利要求1-6任意一项所述大鼠网膜脂肪组织炎症通路关键因子表达水平的测定方法在肥胖导致炎症过程中的作用。