CN105494715B - 一种接种法生产黑茶的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体涉及了一种接种经选育的冠突散囊菌的黑茶生产工艺，包括取分类命名是Eurotium cristatum NHRI‑BC‑1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8730的冠突散囊菌作为发花菌种，在所述拼堆步骤后、汽蒸步骤前，或者所述计量步骤后、二次汽蒸步骤前接种的黑茶生产工艺，制备的黑茶产品不仅黑茶产品品质高和稳定性好，而且还基本实现了黑茶产品的金花数量的可控性，进一步的实现了黑茶产品的标准化控制。

Description

一种接种法生产黑茶的工艺

技术领域

本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体涉及一种接种法生产黑茶的工艺。

背景技术

黑茶是传统六大茶类(绿茶、红茶、白茶、青茶、黑茶和黄茶)之一，也是我国特有的一大茶类。常见黑茶包括安化黑茶、云南普洱茶、广西六堡茶、湖北老青茶等。其中传统安化黑茶主要采用湖南雪峰山脉茶区的大叶种群体品种为原料，经杀青、揉捻、渥堆、干燥等四大工艺加工而成的具有干茶色泽黑褐油润、滋味醇和或微涩、汤色橙黄、略带独特松香的品质特征的黑毛茶和以其为原料精制加工而成的产品总称。因产自中国湖南安化县而得名。安化黑茶中含有茶多酚及其代谢产物、多糖、多种氨基酸、维生素、有机酸等生物活性成分，及部分在安化黑茶中特有的活性成分，研究表明安化黑茶可能具有降三高、减肥、解酒护肝、抗氧化、抗辐射等健康功效，加之其特有的香气滋味，安化黑茶越来越受到人们的欢迎。

安化黑茶中的茯砖茶因为其含有“金花”菌，即冠突散囊菌而备受关注，冠突散囊菌通过其次生代谢产物促进茶叶物质成分转变，形成安化黑茶茯砖茶特有的香气滋味及健康功效，冠突散囊菌也被称作黑茶中的益生菌。传统的安化黑茶茯砖茶产品的生产工艺包括原料初加工(黑毛茶制作：采摘→杀青→揉捻→渥堆发酵→干燥)→初加工验收→筛分整理→拼堆→汽蒸→渥堆发酵→计量→蒸压筑制→发花→干燥→包装等步骤。而其中“发花”步骤是安化黑茶茯砖茶特有的工序，在黑茶生产过程中冠突散囊菌大量生长繁殖，促进黑茶中物质成分的快速转化，形成茯砖茶特有的香气、滋味和功效。如何让花发得好，是安化黑茶茯砖茶生产之核心要素。

目前在工业化茯砖茶生产中，基本采用“自然发花”技术--即在生产过程中冠突散囊菌以环境微生物的形式自然进入黑茶，即“种子”来源于环境。然而上述采用“自然发花”的生产工艺却存在以下问题：1、“发花”质量受环境影响大，由于冠突散囊菌种子来源于环境，在不同生产环节中带入黑茶，种子的数量和活性取决于环境温度、湿度、清洁度、生产频次和原料等因素，且具有场地局限性，由于工厂扩建或迁移，“发花”将会发生大幅度波动甚至无法发花；2、“发花”参数不稳定，由于带入生产线的种子的数量和活性不同，同一产品不同批次发花数量、发花周期均存在差异，存在发花数量无法达到出厂要求，发花周期普遍过长(至少12天)等问题；3、产品品质不稳定，由于冠突散囊菌生长情况决定产品质量(冠突散囊菌分泌的次生代谢产物促进茶叶中的物质成分转变)，因此发花的不稳定导致不同批次产品的香气滋味和口味存在差异，质量安全和健康功效特性存在差异，例如，由于冠突散囊菌的生长会抑制其他真菌的生长，因此如果起初种子活力弱，冠突散囊菌在发花早期未能大量生长，则导致其他真菌滋生，发生污染。

因此，现有技术已逐步开发出采用外源接种的方法进行茶叶特别是黑茶产品的控制。如中国专利文献CN102524442A中公开了一种黑茶发花工艺，具体涉及将黑茶原料经渥堆、蒸茶、喷洒冠突散囊菌孢子粉，再将茶叶压制成砖，密封后高温杀菌，冷却后茶叶发花一段时间后烘干制成黑茶产品，采用该方法具有缩短发酵周期，又能使砖茶内外菌体生长均匀茂盛，并且能长时间保持“金花”不变色且“金花”不消失的优点。又如中国专利文献CN101669559A中公开的一种提高六堡茶品质的方法，采用初蒸后添加冠突散囊孢子悬浮液喷洒接种的方式，复蒸后，将茶叶菌种碾碎成沫再接种的方法来增加发花的效果。但是上述方法存在弊端：第一，缺乏菌株选育步骤，所用菌株无法在发酵过程中通过保持冠突散囊菌对其他菌的生长优势而达到抑菌的目的，其需要进行多次接种或灭菌，才能增强冠突散囊菌的生长优势来抑制其他菌的生长；第二，对菌株生产种子缺乏质控指标，对“种子”的活性、耐热性等没有数据支持；第三，对接种生产环节缺乏系统性研究，没有数据证明接种环节为最优环节，既能保证种子成功接入并具有良好活性，也没有考虑到生产便捷性；第四，对接种效果没有明确的评价，所得产品的“发花”状况也有待进一步提高。

可见，如何通过优化并标准化外源接种工艺，保持冠突散囊菌在茶叶发酵过程中的对其他菌的生长优势，达到提升黑茶产品品质的目的，成为亟待解决的一个问题。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中黑茶产品品质不稳定、金花数量不可控的问题，进而提供一种黑茶产品品质稳定且金花数量可控的一种接种法生产黑茶的工艺，即实现选育好菌种，制备好种子，选择好环节，生产好黑茶。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种接种法生产黑茶的工艺，包括对黑毛茶进行原料加工、拼堆、汽蒸、渥堆发酵、计量、二次汽蒸、压砖、发花、干燥的步骤，在所述拼堆步骤后、汽蒸步骤前，或者所述计量步骤后、二次汽蒸步骤前，以保藏编号为CGMCC No.8730的Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1冠突散囊菌益生菌株进行外源接种干预。

所述接种步骤为接入仅含有所述菌株的固体种子或者将所述菌株经液体培养得到的液体种子。

所述固体种子按照如下方法获得：

取活化后的菌株划线接种至非液体培养基中，于25-30℃条件下，避光培养6-8天，并在无菌条件下，加水洗脱培养基，并收集洗脱液，离心收集菌体，即得。

优选的，所述接种的非液体培养基于28℃条件下，避光培养7天，并在无菌条件下，加无菌水洗脱培养基，并收集洗脱液，加入玻璃珠震荡培养30min。

所述非液体培养基包括PDA固体培养基以及利用茶叶、茶粉、茶膏为生物质的固体培养基。

所述固体种子的接种密度为(3-40)*10⁶个/kg茶叶。优选的，在所述拼堆步骤后、汽蒸步骤前接入的固体种子的密度为10*10⁶个/kg茶叶,或者在所述计量步骤后、二次汽蒸步骤前接入的固体种子的密度为3*10⁶个/kg茶叶。

所述液体种子按照如下方法获得：

取活化后的菌株以无菌水洗脱制得孢子菌悬液，并接种至适宜的液体培养基中，于25-30℃条件下震荡培养3-5天，收集种子液，离心收集菌体即得。

优选的，接种后的液体培养基于28℃条件下,125rpm震荡培养3天，收集种子液即得。

所述液体培养基包括PDA液体培养基，以及适宜的茶汁、茶汤。

所述液体种子的接种密度为(5-60)*10⁶个/kg茶叶。优选的,在所述拼堆步骤后、汽蒸步骤前接入的液体种子的密度为30*10⁶个/kg茶叶,或者在所述计量步骤后、二次汽蒸步骤前接入的液体种子的密度为6*10⁶个/kg茶叶。

所述菌株还包括活化的步骤：无菌条件下将所述菌株接种至PDA固体培养基中静置培养。

控制所述第一、第二次加压汽蒸步骤的条件彼此独立的为：温度90-110℃、压力0.3-0.5MPa、汽蒸时间8-12s。

所述渥堆步骤的渥堆高度为0.8-1.2m，渥堆发酵时间为1.5-2.5h。

所述发花步骤中，控制温度为25-35℃，空气相对湿度为65-85％，恒温恒湿发花9-10天。

在所述的接种法生产黑茶的工艺中，在接种之前还包括验收所述固体种子或所述液体种子的步骤：

所述液体种子验收的步骤如下：

种子密度检测的步骤具体包括：在无菌条件下，取1mL所述液体种子稀释成稀释液，分别取稀释梯度为10^-4、10^-5、10^-6的稀释液各1mL加入无菌培养皿中，然后分别向所述培养皿中加入15-20mL温热的PDA固体培养基，于28℃无菌培养箱中培养3天，然后菌落计数；若所述菌种密度不低于3*10⁷/mL培养基，则该液体种子可用；若未达到上述标准，则该液体种子不可用。

所述固体种子验收的步骤如下：

种子密度检测的步骤具体包括：在无菌条件下，取1g所述固体种子稀释成稀释液，分别取稀释梯度为10^-5、10^-6、10^-7的稀释液各1mL加入无菌培养皿中，然后分别向所述培养皿中加入15-20mL温热的PDA固体培养基，于28℃无菌培养箱中培养3天，然后菌落计数；若所述菌种密度不低于10⁷/克培养基，则该固体种子可用；若未达到上述标准，则该固体种子不可用。

本发明提供了一种由上述的接种法生产黑茶的工艺制备得到的黑茶。

本发明所述的接种法生产黑茶的工艺，通过对传统的黑茶生产工艺进行改良，获得的黑茶产品品质稳定、优秀且实现发花数量基本可控，本发明的工艺的优势具体如下：

(1)具有减少环境干扰的优势：

即使原料发生改变，黑茶发花数量改变波动小：选取不同批次原料，(采摘年份和原料供应商不同)，共3批，分别采用传统工艺和本发明的工艺生产，最终发花数量统计：传统工艺发花范围33*10⁴菌数/g干茶-98*10⁴菌数/g干茶，本发明工艺发花范围95*10⁴菌数/g干茶-114*10⁴菌数/g干茶，本发明工艺制备的黑茶产品发花数量显著提高且稳定(均在发花第12天进行检测)；

即使生产的外界环境的温度发生改变，黑茶的发花数量改变波动小：固定原料，选取环境温度25℃、30℃、34℃进行茶砖发花实验，分别应用传统自然发花工艺和本发明工艺，发花数量统计：传统工艺发花范围30*10⁴-85*10⁴菌数/g干茶，本发明工艺发花范围82*10⁴-101*10⁴菌数/g干茶，本发明工艺制备的黑茶产品发花数量显著提高且稳定(均在发花第12天进行检测)；

即使操作环境改变，发花数量改变波动小：当在北京及广东实验室进行模拟压砖实验，传统发花工艺由于几乎无外源环境微生物带入，发花失败，发花数量低于10⁴菌数/g干茶，本发明工艺发花范围61*10⁴-66*10⁴菌数/g干茶，本发明工艺制备的黑茶产品发花数量显著稳定(均在发花第12天进行检测)；

(2)具有稳定的发花参数的优势

发花周期短，可以显著提高生产效率，节约了成本：经实验，共进行10个批次500块茯砖茶实验，传统工艺发花周期12-13天，本发明工艺发花周期9-10天(周期指从烘房开始控温发花到结束发花开始升温干燥的总时间，标准为达到金花满布，可以用于后续销售)；

黑茶发花数量显著增加：经实验，共进行10个批次500块茯砖茶实验，传统工艺发花范围30*10⁴-115*10⁴菌数/g干茶，平均值52*10⁴菌数/g干茶；本发明工艺发花范围83*10⁴-116*10⁴菌数/g干茶，平均值94*10⁴菌数/g干茶，本发明工艺制备的黑茶产品发花稳定性及数量显著高于现有技术中的黑茶发花数量(均在发花第12天进行检测)；

(3)在产品品质方面得到保证的优势

口味：经实验，共进行10个批次500块茯砖茶实验，经品鉴传统工艺和本发明工艺分别有80％和98％产品可达到湖南地方标准《安化黑茶茯砖茶》中超级茯砖茶审评标准，汤色红黄、菌花香纯正、滋味醇厚；安全指标：经实验，共进行10个批次500块茯砖茶实验，根据湖南地方标准《安化黑茶茯砖茶》水分、总灰分、茶梗含量、非茶类夹杂物、水浸出物、安全卫生指标等全部指标检测，传统工艺和本发明工艺的达标率均超过99％；

杂菌污染：经实验，共进行10个批次500块茯砖茶实验，按照新工艺流程检测标准进行微生物检测，传统工艺和本发明工艺出现霉变概率分别为6‰和0，本发明工艺制备的黑茶产品的霉变率概率显著降低。

(4)通过本发明工艺制备的种子质量高，有助于黑茶的生产

上述(1)、(2)、(3)三点产品特性得益于接种过程的成功控制，即利用菌种制备得到的生产种子质量高，且接种环节合理可行。

本发明的工艺为纯种发酵，所用的种子为最适合安化黑茶茯砖茶生产的中茶冠突散囊菌菌种，从优质中茶百年木仓仓库中分离选育得到，具有生长快、耐高温，抑制杂菌能力强的特征，其他接种技术菌种多为直接从茶叶中分离，未经选育纯化，没有选育的过程；

所使用的种子密度高，液体种和固体种种子密度验收合格标准分别达到3*10⁷个/ml培养基和10⁷个/g培养基，且进行杂菌微生物检测，确保种子密度和纯度，形成生产基础；

经过生产环节遴选，所选取的接种环节简单可行，且种子耐热性能够达到接种要求。所使用的种子耐热性高，由于茯砖茶生产过程中经历了两次高温汽蒸，如果种子耐热性差则无法生产，之前未见现有技术中对外源菌种的耐热性进行明确鉴定，经检测本发明工艺制备的液体种和固体种子耐热性分别达到10％和30％以上，并根据推算计算了接种密度，所有接种量均达到最终产品标准1‰以上，符合微生物学基本接种规律。新工艺既可以提高黑茶产品品质，同时可以用于在非传统黑茶生产地区进行茯砖茶发花，及其他含冠突散囊菌产品的生产。即实现选育好菌种，制备好种子，选择好环节，生产好黑茶。

综上，通过本发明的工艺制备的黑茶不仅产品品质稳定、优良，且本发明提供了一种标准化的黑茶发花工艺，通过在每一个环节都设置关键节点把控，实现了用数字化指标进行检测，在菌种选育标准、种子制备标准和工艺合格标准等都能够具备量化指标，进一步实现黑茶发花工艺的可控，并且本发明工艺制备的黑茶产品的效果评价方面比较完全，从发花稳定性、发花周期、发花数量、成品率和产品品质五个方面同时对本发明工艺的效果进行了评价，并且得到了阳性结果。相比现有的技术中从发花周期、发花数量和汤色等方某一面对黑茶生产工艺进行评价，不能对大批量黑茶的发花稳定性进行检测来看，本发明的黑茶生产工艺可实现在生产环节控制，实现黑茶发花数量的可控性，进一步的提高了黑茶产品品质的稳定性。

具体实施方式

本发明下述实施例中所述的PDA固体平板培养基、PDA试管斜面培养基以及PDA茄形瓶的培养基均按照现有技术中常规方法制备，以本发明下述各实施例而言，所述PDA固体平板培养基、PDA试管斜面培养基以及PDA茄形瓶的培养基组成分别为：

PDA固体平板培养基、试管斜面培养基：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、自来水1000毫升，自然pH；

PDA茄形瓶的培养基：马铃薯300克、葡萄糖20克、自来水1000毫升，自然pH。

下述实施例中所述的试剂与仪器的型号分别为：

KOD：KOD-101Toyobo；

PCR产物回收试剂盒：D6492Omega；

离心机：3K15，Sigma；

电泳槽：JY-SPFT；

电泳仪：JY300C，生产厂家为北京君意东方电泳设备有限公司；

凝胶成像系统：JY04S-3C，生产厂家为北京君意东方电泳设备有限公司；

PCR仪：Life Express，生产厂家为博日科技有限公司。

实施例1菌株的分离纯化

所述黑茶的优势“金花”菌的分离纯化步骤具体如下：

(1)选取茶样

选取湖南安化茶厂木质仓库中茶叶中不同年份的茯砖茶产品以及湖南益阳市生产、市售主流茯砖茶产品，作为原始菌株分离的材料。上述所选取产品的茶样满足GH/T 1070对茶叶包装的规定，满足GH/T1071对茶叶贮存的规定，满足GB 2762—2012对食品中污染物的限量，满足GB2763/GB26130中对农药最大残留的限量，满足GB/T9833.2—2013对《紧压茶》部分的相关标准规定；同时，选取的茶样满足：包装无破损、无污渍；茶叶外形平整、茶砖内部发花均匀；选取的同批次产品，“金花”生长茂盛、内部生长均匀；

(2)对所选取的茶样进行编号

对湖南安化茶厂木质仓库不同年份的产品分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，上述编号依次对应1985年、1997年、2002年、2010年、2013年生产的茶样产品；对选取的市售主流茯砖茶产品编号为A、B、C、D、E；

(3)预处理茶样

茶样收集后，在无菌条件下，选取“金花”生长茂盛、内部生长均匀的茶样Ⅰ，取所述中心带菌的茶样25g，粉碎，过80-100目筛，然后将过筛的茶粉全部转移至225mL的无菌水中，充分震荡混合；

(4)涂布培养含菌茶样液体

取无菌水将上述步骤获得的混合液进行梯度稀释，取1mL稀释梯度为10⁶的含菌液体涂布于PDA固体平板培养基中进行培养；

(5)培养并记录菌落生长情况

将涂布后的PDA固体平板培养基置于恒温培养箱中进行培养，培养温度为28-30℃，培养7天，在培养过程中，按照冠突散囊菌Eurotium cristatum的形态学、生理生化特征对所述菌落的形态特征进行菌落的识别并编号，每12h量取菌落的直径并记录；

(6)挑取纯化单菌落

取上述步骤中生长最快的5株菌的单菌落，挑取菌落并划线接种至所述PDA培养基上，于28-30℃条件下培养7天，每个菌落挑取三个样品进行纯化，传代培养的次数为两次，最终选取纯化培养过程中菌落直径增长最快的5株菌株进行保存；

(7)保存原始菌株

按照常规方法制备PDA试管斜面，挑取上述选用的5株菌分别划线接种至所述PDA试管斜面上，于28-30℃条件下，培养7天后，将试管封存后冷冻备份。

同样的，所述茶样Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、A、B、C、D、E的菌种分离纯化参照上述实验操作，得到多株备选育样品。

结果显示，选育的菌株其菌落平均直径生长的速度超过5mm/d。

其中，不规则菌落直径的折算参考文献Serra J.Image analysis andmathematical morphology[M].Academic Press,Inc.,1983.有关图像处理以及直径折算内容所述方法。

实施例2菌株的选育

选育步骤a.按照发酵时茶叶中含菌特性以及金花生长程度选育菌株茶叶中“金花”的生长程度选育菌株

选育思路：在相同的培养条件下，选用来源于同一产地的同一批次的黑毛茶原料进行菌株接种的发酵试验。如果该菌株可以满足茶叶品质对发酵菌所具有的菌种特性以及“金花”生长程度对菌株的要求，则接种该菌株以后，则在茶产品中该菌株能够快速生长，且在一定时间内其发酵茶叶中能够达到一定的含菌数量，从而成长成为优势菌，抑制杂菌的生长；并且其良好的特性体现为最终茶叶外观以及品质。否则，认为接种该菌株不能满足茶叶对发酵菌的要求，即发酵过程接种使用该菌株对比不能在相同的发酵条件下迅速成长为优势菌株，达不到相应菌含量，产品最终的外观与品质得不到保证，或者其在茶叶中的生长周期过长，甚至烧心，霉变。

所述黑茶的优势“金花”菌的选育步骤具体如下：

1)分别取茶样Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、A、B、C、D、E经过上述步骤分离纯化的备份菌株接种至茄形瓶的PDA固体培养基上，于28℃条件下培养，培养5-15天以后用100mL无菌水冲洗上述固体培养基，然后将冲洗后获得的含有菌体的混合液经无菌纱布过滤获得孢子悬浮液，编号待用；

2)其中，每份菌株接种3个黑茶样品，并按照常规黑茶发花加工方法制作不接种所述分离的菌株的茯砖茶作为实验的对照组；

3)直接挑取上述步骤获得的茶叶内部的符合选育条件的“金花”菌于PDA固体平板培养基上纯化培养，符合选育条件的菌种至少取样一份，纯化培养后的菌株编号为A系列，于PDA试管斜面冻藏，备份，其检测的结果(部分)列出选用的菌株，编号为A。

经过本步骤选育得到的菌株共计31株，在进行黑茶发花时，发花迅速，可以在发花第五天使得茶样中“金花”菌菌落总数能够达到5×10⁴CFU/g绝干茶叶，杂菌含量小于1×10²CFU/g绝干茶叶；且发花结束，能够“金花”满布；产品成品率达到99％；发酵茶产品外表“金花”生长茂盛、内部生长均匀、口感良好；发酵茶产品符合质检标准的菌株。

选育步骤b.采用高温发酵选育耐高温菌株

选育思路：该耐高温实验选育得到的菌株能够使得发酵能够在较高温度下进行，即在茶产品发酵中在较高温度下，保持选育步骤a中菌株发酵茶叶能达到的效果，满足实际生产中温度季节性的变化，在夏季气温较高的条件下进行发花生产。

首先，在PDA培养基中对菌种进行分离纯化，重复挑取单菌落传代培养10代以上，选择能够在38℃条件下稳定传代生长的菌株，优选菌落直径增长速度快的菌株；然后，选取该批菌株重复步骤a一代，并将其发酵温度设置在30-34℃之间，按照步骤a的选育标准进行菌种的选育，从茶叶中分离纯化得到其中生长的优势菌株B，保存，编号进行下一步选育实验。

所述黑茶的优势“金花”菌的选育步骤具体如下：

1)按照前述常规方法制作PDA固体平板培养基，挑取编号为A的原始菌株菌落划线接种至所述PDA固体平板培养基，然后将所述平板置于38℃的恒温培养箱中进行培养，培养7天后，挑取能够生长的菌株单菌落，重复上述步骤10代以上，选取能够在所述38℃温度下生长的菌落，对选取的菌株编号B，用PDA试管斜面冻存备份；

2)将上述选取的菌株重复上述步骤a中的黑茶发花发酵步骤，区别仅是将所述发花步骤中的烘房温度改变为30-34℃，然后在发花进行第五天，用特制的取样刀具取用制备的茶砖中心内部的茶样25g进行检测；

其中，每份菌株的接种3个样品；

对照样品为编号B对应的原始菌株A，其检测的相关结果列出选用的菌株，编号为B。

经过本步骤选育的菌种，可以在夏季环境温度较高时，满足茶叶发花在30-34℃之间生产的需要，即在茶产品发酵中在较高温度下，保持选育步骤a中菌株发酵茶叶能达到的效果，满足实际生产中温度季节性的变化，在夏季气温较高的条件下进行生产。

此步骤获得优良菌株共计17株。

选育步骤c、选育能大量产生闭囊壳的菌株

发明人在实验过程中发现，采用涂布培养法在茄型瓶PDA培养基中培养菌株时，大部分菌株在茄形瓶边缘，生长在培养基之外的少数菌株有规律的生长分化出大量的闭囊壳(子囊果)，且其闭囊壳在自然条件下能够稳定的存在，因此发明人按照下述方法进行选育能大量产生闭囊壳的菌株：

取用步骤b获得的全部菌株，采用涂布培养法在PAD培养基(此处是否应为固体平板培养基)中进行培养，在距培养基边缘2cm处划线标记，挑取超出标记线之外存在的大量闭囊壳的菌株，进行第二代涂布培养；重复步骤c第一代菌株的培养方法直至第五代，得到产生闭囊壳性状优秀的菌株共计14株，对所得的菌株编号C，分别编号NHRI-BC-1.5.1--NHRI-BC-1.5.14，用试管斜面冻存备份。其中编号NHRI-BC-1.5.1的菌株为选育的目标优势菌株，经鉴定其为冠突散囊菌。

实施例3菌种性质鉴定

对上述实施例2获得的冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的形态学、生理生化特征、以及分子生物学特征进行鉴定，具体如下：

A、菌体形态特征

取用编号为NHRI-BC-1.5.1的菌株，采用划线培养法将菌株接种于PDA固体平板培养基上，在28℃恒温培养箱中培养15天，菌体形态观察时挑取培养基菌落上的菌丝体，于光学显微镜下进行观察，放大倍数为物镜10倍，目镜16倍。

观察结果显示，菌体为丝状，有隔，呈浅黄色。

B、菌落形态特征

取用编号为NHRI-BC-1.5.1的菌株，采用点样培养法将菌株接种于PDA固平板体培养基上，在28℃恒温培养箱中培养15天，培养结束以后，置于4℃冰箱冻存，记录菌落的特征。

观察结果显示，所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株菌落干燥，致密，圆形，表面粗糙，凸起或者隆起，边缘粗糙呈菌丝分散状，直径最大可达60mm左右，色调为金黄色和褐色。

所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株菌落存在菌丝体，菌丝体细长，分为基内菌丝、气生菌丝。基内菌丝呈褐色，气生菌丝随着时间的推移与菌落的扩大，中心气生菌丝分别呈现出白色、淡黄色、金黄色、褐色、深褐色的变化。培养前期(1-3天)，菌落边缘为白色或淡黄色，中心为金黄色，直径大小为2-10mm；培养中期(2-5天)，菌落中心出现褐色或者棕褐色菌落，直径大小为5-40mm；培养后期(5-9天以后)，菌落分为3-4层，边缘为白色带淡黄色，边缘内部为金黄色，中心褐色菌落其生菌丝生长出金黄色囊壳；同时培养后期伴随有棕色渗出液，棕色渗出液在培养结束冻存以后更加明显，棕色渗出液呈点状分布在棕色菌落表层，金黄色以及淡黄色菌落层很少或者不存在渗出液。同时，渗出液会渗入培养基中，将培养基染为褐色。其淡黄色或者白色菌落层及金黄色层始终保持2-10mm的菌环大小，褐色菌落层，会随着菌落的增大而变大。

C、生殖及生殖结构形态

取用编号为NHRI-BC-1.5.1的菌株，将菌株划线接种于如文献《利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因[J]》(谭玉梅,王海,刘永翔,等.菌物学报,2013,32(1):56-63)中所述的低渗和高渗固体培养基中，于28℃培养3天，收集菌丝体、子囊孢子以及分生孢子染色制片，在光学显微镜下观察分生孢子以及子囊果情况，收集菌丝以及子囊孢子于液氮中保存，用扫描电镜进行观察各生殖结构的微观形态。

观察结果显示，所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株可在低渗固体培养基中产生子囊孢子与分生孢子，子囊由黄色闭囊壳包裹并最终释放，闭囊壳被菌体生长缠绕；闭囊壳肉眼可见，大小为90～170μm，呈椭圆形；闭囊壳内含大量子囊，粘合在一起，子囊呈不规则球形；释放后的子囊包含8个子囊孢子；子囊孢子直径4-6μm，形似河蚌，瓣形凸状，表面中心粗糙具疣体，边缘光滑，两瓣结合处有明显凹痕；分生孢子呈串生状，按其结构可分为串生孢子头，孢子梗两大部分；其中，多束孢子串生于孢子头，分生孢子结合处存在凹痕；单个分生孢子大小为4～5μm，呈椭球状，表面布满尖疣。

D、菌株的常规生化性质

所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株异生耗氧，耐受干旱、耐受高渗透压，能够利用液体LB培养基进行菌体生长，能够代谢利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，pH耐受性为4.5-6.5，生长温度为24-38℃，发酵茶叶时的适宜生长温度为26-34℃。

E、分子生物学特征

取用编号为Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌株，在PDA斜面培养基上培养生长出菌落。

1)、菌体DNA提取

挑取真菌菌丝大约10mg，加入真菌DNA提取裂解液300μl，涡旋起沉淀。于65℃水浴30min，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，涡旋混匀，13000rpm离心5min。取上清，加入体积异丙醇，混匀；13000rpm，离心5min。弃上清，加入70％乙醇混匀，13000rpm离心1min。弃乙醇，倒置离心管，晾干。加入30μlddH2O，溶解DNA；

2)、18S rDNA/ITS扩增

(1)取上述步骤获得的DNA，稀释作为PCR反应模板，利用引物对所述DNA序列进行PCR反应扩增，向PCR管中依次加入以下列表1的PCR反应体系中的试剂；

表1、PCR反应体系(组分以μL计)：

(2)取上述步骤得到的PCR管按照下表2的PCR的反应程序进行所述DNA序列的PCR反应扩增；

表2、PCR的反应程序

(3)上述步骤反应完毕后，取反应产物用1％的agrose gel进行电泳检测，确定有特异扩增后，取所述反应产物再次按照上述步骤(1)和(2)进行PCR反应扩增，然后回收PCR产物进行电泳检测，所述电泳结果为：其中M：marker2000:2000，1000，750，500，250，100bp，亮带是750bp；

所述PCR产物回收的方法如下：

取4倍体积的的Buffer CP加入到含有PCR反应物体积100μL的1.5mL离心管中，然后剧烈震荡，短暂离心，随后把吸附柱放在收集管里，再把步骤(3)得到的混合物转入吸附柱中(每次750μL，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心)，于13000rpm离心下1min后，弃滤液，然后向所述吸附柱中加入700μL的洗脱液，于13000rpm下离心1min后，弃滤液，再向所述吸附柱中加入500μL洗脱液，于13000rpm离心1min，弃滤液，再次于13000rpm离心2min，甩吸附柱上的乙醇，把所述吸附柱转移到一个新的1.5mL离心管中，然后向所述吸附柱的中心加入30μL的ddH2O，于室温条件下放置1min后再15000rpm条件下离心2min，所得的滤液即为经PCR反应扩增的DNA。

3)、测定序列

上述获得的DNA需要测定的序列，包含18S rDNA/ITS1/5.8S rDNA/ITS2区域，所述序列测定结果见附表1，将所获得的序列进行序列BLAST比对；

结果显示，Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌株属于冠突散囊菌，同源性为99％。

将上述鉴定的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.8730，保藏日期是2014年1月16日。

实施例4

本实施例制备所述固体种子的具体步骤如下：

(1)取分类命名是Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8730的冠突散囊菌冷藏保存，备用；

(2)将上述步骤(1)中的菌种于无菌操作条件下接种到新鲜的PDA斜面培养基上，并置于洁净环境下培养2.5天，待用；

(3)取活化的菌株划线接种至试管PDA固体培养基中，于25℃条件下，避光培养8天，并在无菌条件下，取无菌水洗脱上述试管PDA培养基，并收集洗脱液，离心收集菌体，即得固体种子，备用。

利用上述步骤制备的固体种子进行接种法生产黑茶的工艺的具体步骤如下：

(a)取按照传统工艺(采摘→杀青→揉捻→渥堆发酵→干燥)处理的黑茶原料进行初加工，将初加工的黑茶原料进行验收，依据黑茶标准样进行定级归堆，选取特级、一级和二级的黑毛茶进行拼堆；

(b)向上述拼堆后黑毛茶接入上述固体种子，所述固体种子的接种密度为10*10⁶个/kg茶叶，并控制黑茶原料的含水量为15％，采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.4MPa，温度为102℃，汽蒸时间为9s；

(c)将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆发酵，渥堆高度为0.8m，渥堆时间为1.5h，按照产品的要求进行计量；

(d)将计量后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.3MPa，温度为110℃，汽蒸时间8秒；

(e)将汽蒸后的原料按照1kg的规格进行人工压砖；

(f)将制得茯砖半成品转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于65％，温度为25℃，进行发花发酵，发花9天，随后在不超过50℃条件下对产品进行干燥处理，即得。

实施例5

本实施例制备所述固体种子的具体步骤如下：

(1)取分类命名是Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8730的冠突散囊菌冷藏保存，备用；

(2)将上述步骤(1)中的菌种于无菌操作条件下接种到新鲜的PDA斜面培养基上，并置于洁净环境下培养2.5天，待用；

(3)将上述步骤(2)中活化的菌种划线接种至茶叶固体培养基中，于30℃条件下，避光培养6天，并在无菌条件下，取无菌水洗脱上述茶叶固体培养基，并收集洗脱液，离心收集菌体，即得固体种子，备用；

将所述固体种子按照以下步骤验收：

种子密度检测的步骤具体包括：在无菌条件下，取1g所述固体种子稀释成稀释液，分别取稀释梯度为10^-5、10^-6、10^-7的稀释液各1mL加入无菌培养皿中，然后分别向所述培养皿中加入15-20mL温热的PDA固体培养基，于28℃无菌培养箱中培养3天，然后菌落计数；若所述菌种密度不低于10⁷/克培养基，则该固体种子可用；若未达到上述标准，则该固体种子不可用。

利用上述步骤制备的固体种子进行接种法生产黑茶的工艺的具体步骤如下：

(a)取按照传统工艺(采摘→杀青→揉捻→渥堆发酵→干燥)处理的黑茶原料进行初加工，将初加工的黑茶原料进行验收，依据黑茶标准样进行定级归堆，选取特级、一级和二级的黑毛茶进行拼堆；

(b)采用高温蒸汽对上述拼堆后的黑茶原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.5MPa，温度为90℃，汽蒸时间为12s；

(c)将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为1.2m，渥堆时间为2.5h，按照产品的要求进行计量；

(d)计量后，将上述固体种子接入上述黑茶原料中，所述固体种子的接种密度为3*10⁶个/kg茶叶，并控制黑茶原料的含水量为30％，采用高温蒸汽对上述原料进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.5MPa，温度为110℃，汽蒸时间8秒；

(e)将上述汽蒸后的原料按照1kg的规格进行人工压砖；

(f)将上述制得的茯砖半成品转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于75％，温度为30℃，进行发花发酵，发花10天，随后在不超过50℃条件下对产品进行干燥处理，即得。

实施例6

本实施例制备所述液体种子的具体步骤如下：

(1)取分类命名是Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8730的冠突散囊菌冷藏保存，备用；

(2)将上述步骤(1)中的菌种于无菌操作条件下接种到新鲜的PDA斜面培养基上，并置于洁净环境下培养2天，待用；

(3)取活化后的菌株以无菌水洗脱制得孢子菌悬液，并接种至PDA液体培养基中，于25℃条件下震荡培养3天，收集种子液，离心收集菌体，即得。

利用上述步骤制备的液体种子进行接种法生产黑茶的工艺的具体步骤如下：

(a)取按照传统工艺(采摘→杀青→揉捻→渥堆发酵→干燥)处理的黑茶原料进行初加工，将初加工的黑茶原料进行验收，依据黑茶标准样进行定级归堆，选取特级、一级和二级的黑毛茶进行拼堆；

(b)将上述液体种子随茶汁接入上述拼堆后的黑茶原料中，所述液体种子的接种密度为30*10⁶个/kg茶叶，并控制黑茶原料的含水量为25％，采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.3MPa，温度为100℃，汽蒸时间为10s；

(c)将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为1m，渥堆时间为2h，按照产品的要求进行计量；

(d)将计量后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.4MPa，温度为90℃，汽蒸时间9秒；

(e)将上述汽蒸后的原料按照1kg的规格进行人工压砖；

(f)将上述制得的茯砖半成品转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于70％，温度为27℃，进行发花发酵，发花10天，随后在不超过50℃条件下对产品进行干燥处理，即得。

实施例7

本实施例制备所述液体种子的具体步骤如下：

(1)取分类命名是Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8730的冠突散囊菌冷藏保存，备用；

(2)将上述步骤(1)中的菌种于无菌操作条件下接种到新鲜的PDA斜面培养基上，并置于洁净环境下培养2天，待用；

(3)取活化后的菌株以无菌水洗脱制得孢子菌悬液，并接种茶汤的液体培养基中，于30℃条件下震荡培养5天，收集种子液，离心收集菌体，即得；

所述液体种子按照以下步骤验收：

种子密度检测的步骤具体包括：在无菌条件下，取1mL所述液体种子稀释成稀释液，分别取稀释梯度为10^-4、10^-5、10^-6的稀释液各1mL加入无菌培养皿中，然后分别向所述培养皿中加入15-20mL温热的PDA固体培养基，于28℃无菌培养箱中培养3天，然后菌落计数；若所述菌种密度不低于3*10⁷/mL培养基，则该液体种子可用；若未达到上述标准，则该液体种子不可用。

利用上述步骤制备的液体种子进行接种法生产黑茶的工艺的具体步骤如下：

(a)取按照传统工艺(采摘→杀青→揉捻→渥堆发酵→干燥)处理的黑茶原料进行初加工，将初加工的黑茶原料进行验收，依据黑茶标准样进行定级归堆，选取特级、一级和二级的黑毛茶进行拼堆；

(b)采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.5MPa，温度为110℃，汽蒸时间为8s；

(c)将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为1.2m，渥堆时间为2.5h，按照产品的要求进行计量；

(d)计量后，将上述液体种子接入黑茶中，所述液体种子的接种密度为6*10⁶个/kg茶叶，并控制黑茶原料的含水量为25％，将渥堆后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.3MPa，温度为100℃，汽蒸时间8秒；

(e)将上述汽蒸后的原料按照1kg的规格进行人工压砖；

(f)将上述制得的茯砖半成品转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于85％，温度为35℃，进行发花发酵，发花10天，随后在不超过50℃条件下对产品进行干燥处理，即得。

实施例8-11

实施例8-11分别与实施例4-7的所述黑茶的生产工艺相同，其区别仅在于，不接入自行制备的液体或固体种子，而接入现有技术中市售的冠突散囊菌Eurotium cristatum的孢子粉，其他生产工艺与参数保持不变。所述的冠突散囊菌孢子粉购自长沙湘资生物科技有限公司。

实施例12-14

实施例12-14均与实施例4的所述黑茶的生产工艺相同，其区别仅在于所述固体种子的接种量分别为1*10⁶个/kg茶叶、5*10⁶个/kg茶叶以及4*10⁷个/kg茶叶，其他生产工艺与参数保持不变。

实施例15-18

实施例15-18分别与实施例4-7的所述黑茶的生产工艺相同，其区别仅在于，制备所述固体/液体种子所使用的固体/液体培养基分别为含茶叶为生物质的固体培养基、含茶膏为生物质的固体培养基、茶汁及茶汤，其他生产工艺与参数保持不变。其中，以茶叶为生物质的固体培养基指采用与当批生产原料相同的黑毛茶经灭菌处理后制成的散茶培养基，同样所述含茶膏、茶汁及茶汤等其他生物质培养基也采用与当批生产原料相同的黑毛茶经灭菌处理后，进一步精加工制成。

效果例

统计实施例4-18制备的黑茶的感官评价、金花数量以及霉变率等指标，其中，感官评价的标准参照《安化黑茶茯砖茶》中的超级茯砖茶感官审评标准评价产品的香气、滋味、汤色和口味的达标率，金花数量的统计按照常规方法统计制备的黑茶产品中冠突散囊菌的个数，霉变率按照常规方法检测。所得的统计结果如下表：

表3所述黑茶产品的各项指标(发花12天)

由上表可知，通过本发明的生产工艺方法制备得到的黑茶产品不仅品质和稳定性均显著提高，感官评价达标率达到了100％，冠突散囊菌数量高且稳定，多批次可超过100*10⁴菌数/克干茶，霉变率几乎为0，解决了由于“发花种子”均来源于自然环境而不可控的问题，在产品感官品质和安全方面提升稳定了产品品质。同时，由实施例12-14可知，本发明基本实现对生产的黑茶产品中的发花数量的控制，而这是传统黑茶生产工艺中所不能实现的，本发明进一步的实现了黑茶产品的标准化控制，获得了显著的技术效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种接种法生产黑茶的工艺，包括对黑毛茶进行原料加工、拼堆、汽蒸、渥堆发酵、计量、二次汽蒸、压砖、发花、干燥的步骤，其特征在于，在所述拼堆步骤后、汽蒸步骤前，或者所述计量步骤后、二次汽蒸步骤前，以保藏编号为CGMCC No.8730的Eurotium cristatumNHRI-BC-1.5.1冠突散囊菌菌株进行外源接种。

2.根据权利要求1所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述接种步骤为接入仅含有所述菌株的固体种子或者将所述菌株经液体培养得到的液体种子。

3.根据权利要求2所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述固体种子按照如下方法获得：

取活化后的菌株划线接种至非液体培养基中，于25-30℃条件下，避光培养6-8天，并在无菌条件下，加水洗脱培养基，并收集洗脱液离心收集菌体，即得。

4.根据权利要求3所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述非液体培养基包括PDA固体培养基以及利用茶叶、茶粉、茶膏为生物质的固体培养基。

5.根据权利要求3或4所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述固体种子的接种密度为(3-40)×10⁶个/kg茶叶。

6.根据权利要求2所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述液体种子按照如下方法获得：

取活化后的菌株以无菌水洗脱制得孢子菌悬液，并接种至适宜的液体培养基中，于25-30℃条件下震荡培养3-5天，收集种子液，离心收集菌体即得。

7.根据权利要求6所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述液体培养基包括PDA液体培养基，以及茶汁、茶汤。

8.根据权利要求6或7所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述液体种子的接种密度为(5-60)×10⁶个/kg茶叶。

9.根据权利要求1-4或6-7任一所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，控制所述汽蒸、二次汽蒸步骤的条件为：温度90-110℃、压力0.3-0.5MPa、汽蒸时间8-12s。

10.根据权利要求1-4或6-7任一所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述渥堆发酵步骤的渥堆高度为0.8-1.2m，渥堆发酵时间为1.5-2.5h。

11.根据权利要求1-4或6-7任一所述的接种法生产黑茶的工艺，其特征在于，所述发花步骤中，控制温度为25-35℃，空气相对湿度为65-85％，恒温恒湿发花9-10天。

12.一种由权利要求1-11任一所述的生产工艺制备得到的益生菌黑茶。