CN105420217A - 一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用。通过非可溶性碳源进行发酵，不仅节约了纤维素酶发酵成本，而且有效地诱导纤维素酶生产；采用还原糖控制措施，降低碳水化合物的阻遏效应，提高了纤维素酶生产能力；此外，本发明通过非可溶性碳源结合补料成分和补料速率工艺，构建了新型补料控制方式，在提升纤维素酶产量(生产能力)的同时，还优化了所生产的纤维素酶混合物各组分的配比，纤维素酶活力提高50％以上。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用。
背景技术
纤维素酶来源广泛、成分复杂，广泛存在于昆虫体、软体动物体以及真菌、细菌与放线菌等微生物的代谢产物中，主要生产途径是微生物发酵，其中以丝状真菌和细菌纤维素酶应用最为广泛，目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶。
在细菌中大多数好氧细菌和厌氧细菌都富含丰富的纤维素酶系，特别是瘤胃中富含多种纤维素降解酶系的厌氧菌。世界纤维素市场中的纤维素酶有20％来自木霉属和曲霉属。主要是由于丝状真菌具有产酶的诸多优点：①产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；②产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；③同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。纤维素酶是一个复合酶系，酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶(EG，Cx酶，又称CMC酶)、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH，C1酶)和β-葡萄糖苷酶(BGL，纤维二糖酶)；大多数编码纤维素酶的基因是染色体基因。纤维素酶系降解原理目前尚无定论，主要有三种作用机理：协同理论、碎片假说和原初反应假说，其中以协同理论被大部分研究学者和专家所认可，其主要观点为内切葡聚糖这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量非还原性末端。然后外切葡聚糖酶逐个切下纤维素的非还原末端水解产生纤维二糖；而β-葡萄糖苷酶则水解纤维二糖生成葡萄糖。三者缺一不可，协同作用，也只有在合适的比例和组成下，才能共同作用快速实现纤维素的完全水解。
我国对纤维素酶的研究和生产也已开展了广泛的研究，但大多采用固体发酵方式，固体发酵虽有许多优越之处，但仍有发酵水平不稳定，不适于大规模生产等弊端，因此对纤维素酶液体深层发酵的研究很有意义。纤维素酶发酵过程容易受到碳水化合物阻遏效应(CCR)对酶发酵合成的影响，即在半纤维素和/或纤维素酶合成过程中，往往由于培养基中存在着葡萄糖、木糖等单糖而通过碳水化合物阻遏效应(CCR)抑制了酶的合成。专利CN200910091968提供了一种高产纤维素酶的方法，通过补料和溶氧对控制发酵过程菌体浓度来实现纤维素酶发酵酶活力的提高发酵，其补料为非常复杂的成分，包括价格昂贵的槐糖、乳糖等及多种微量元素，同时其培养基成本较为昂贵。如何既能解决液体深层发酵后期营养的快速需求和固体基质降解速率慢的问题，又能解决补加葡萄糖容易造成碳水化合物阻遏的问题，属于本领域技术人员面临的难题。
此外，纤维素酶产生真菌产生的纤维素酶实质为多种酶的混合物，其包含多种纤维素酶和半纤维素酶，如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶，还可以包括木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶等。不同的培养和/诱导底物，培养发酵纤维素酶真菌产生的纤维素酶活性和/纤维素酶混合物的活性(如对木质纤维素底物的降解活性)往往不同，如何利用一种纤维素酶产生真菌生产高效的纤维素酶混合物，也属于纤维素酶生产领域技术人员面临的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明通过对现有技术的培养基(产酶培养基和补料培养基)和液体补料工艺进行优化调整，采用价格低廉固体的培养基，通过构建培养基中还原糖含量与补料基质之间的关系，不仅解决了以葡萄糖补料造成的CCR效应，而且提高了纤维素酶生产能力，并且提高了生产的纤维素酶活性(如对木质纤维素底物的降解活性)。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明公开了一种高效纤维素酶混合物的生产方法，所述方法包括：以里氏木霉或草酸青霉为纤维素酶生产菌进行发酵，整个发酵期间pH始终维持在3.5-6.5之间，发酵至48-60h，开始补料，补料后还原糖含量≤2.5mg/mL，每4-5h为一补料速率调整阶段，至结束发酵；
补料的培养基为：葡萄糖母液或木糖母液与硫酸镁、硫酸锌的混合液；
其中葡萄糖母液中，其成分包括：45～60％葡萄糖，15～30％的二糖及5～10％的多糖，其余为水；木糖母液中，其成分包括：45～70％木糖，5～20％葡萄糖，5～15％阿拉伯糖，其余为水；
所述补料培养基中还原糖浓度为20％～40％，硫酸镁浓度为0.5～1％，硫酸锌浓度为0.003～0.008％(上述百分比为质量体积百分比)。
上述二糖优选为麦芽糖。
对于上述方法的获得，发明人通过对发酵工艺的调整和优化，尤其是对补料培养基成分及配比的摸索，发现不同的发酵工艺其获得的纤维素酶生产能力和纤维素酶配比有极大不同，而且补料培养基中碳源的不同，会影响酶活(FPA滤纸酶活)和所制备的纤维素酶混合物的整体催化效率。经试验，上述工艺条件较其他条件可以有效的提高纤维素酶生产能力，并且提高生产的纤维素酶活性。
优选的，补料后，1.5mg/mL≤还原糖含量≤2.5mg/mL。
其中，补料后溶氧降低，通过改变发酵搅拌桨叶或搅拌速度来弥补溶氧的降低；优选的，补料过程通过控制搅拌或更换搅拌桨叶保持溶氧≥10％，更为优选的，保持溶氧≥15％。
优选的，发酵开始pH调整为5.5-6.0，0-20hpH逐渐下降，用氨水控制发酵培养基pH3.5以上，60h后pH回升至5.5-6.0后，开始用磷酸调节pH至6.0以下。
本发明所述的发酵培养基为非可溶碳源——玉米芯、玉米秸秆、小麦秸秆、木糖渣、脱木素渣等，作为菌株发酵的主要碳源，具体培养基配方如下：
2～7％固体非可溶性碳源(比如秸秆、玉米芯、木糖渣)，1～4％麸皮，0.2～1％微晶纤维素，0.5～1.5％豆饼粉，0.1～0.4％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
本发明还涉及上述生产方法得到的纤维素酶混合物。
此外，本发明进一步公开了上述生产方法得到的纤维素酶混合物用于水解纤维素底物的用途。
优选的，所述纤维素底物可为一种预处理的木质纤维素底物，如预处理的秸秆等。
本发明还提供一种水解纤维素底物的方法，包括：将上述生产方法得到的纤维素酶混合物加至纤维素底物以形成反应混合物，其中纤维素酶混合物以每克底物5-10U的浓度添加。
本发明优点在于：
(1)通过非可溶性碳源进行发酵，非可溶性碳源以廉价的农业副产物玉米芯、麸皮等作为碳源和营养元，价格低廉，节约了纤维素酶发酵成本；此外，非可溶性碳源的使用，并未降低纤维素酶的生产性能，而且由于不同的碳源使用可诱导出不同活力的纤维素酶，本发明通过对相应发酵培养基碳源的组成和配比优化，可以有效地诱导生产纤维素酶。
(2)采用还原糖控制措施，不仅有效地降低了纤维素酶生产时的碳水化合物的阻遏效应，而且通过利用纤维素酶生产过程中产生的纤维素酶系、半纤维素酶系将培养基中的固体基质(非可溶性碳源-玉米芯、秸秆、木塘渣等)降解成葡萄糖而提供营养，解决液体深层发酵后期营养的快速需求和固体基质降解速率慢的矛盾，同时克服了补加葡萄糖容易造成碳水化合物阻遏等问题，提高了纤维素酶生产能力。
(3)本发明通过葡萄糖母液和木糖母液补料作为补料原料，不仅有效的解除了葡萄糖造成的碳阻遏效应，而且补料培养基可以有效的诱导纤维素酶的产生，这极大提高了纤维素酶生产能力，发酵时的FPA(滤纸酶活)可达到18.6U/ml，较常规生产提高1倍。
(4)通过本发明所述工艺，在提升纤维素酶产量(生产能力)的同时，还优化了所生产的纤维素酶混合物各组分的配比，最终表现为纤维素酶活性的提高，通过优化工艺，纤维素酶活力提高50％以上。
具体实施方式
测定方法
滤纸酶(FPA)酶活测定方法：发酵液8000rpm离心10min，取上清为粗酶液，用于酶活力及蛋白含量测定。参照轻工业行业标准(QB2583-2003)进行测定，取适当稀释的粗酶液0.5mL，以50mg(1cm×6cm)新华滤纸条为底物，加入pH4.8醋酸缓冲液1.5mL和0.5mL，以不加底物为对照，50℃反应60min，取出，加入3mlDNS溶液，沸水浴中保持10min，水浴冷却，定容至25ml，混匀，在540nm处比色。
还原糖测定方法：采用DNS法测定还原糖含量。
实施例1
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：3％木糖渣，3％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
补料培养基：30％木糖母液，0.5％(w/v)硫酸镁，0.005％(w/v)硫酸锌，木糖母液其成分包括50％(w/v)木糖，10％(w/v)葡萄糖，10％(w/v)阿拉伯糖，其余为水。
将草酸青霉JUA10-1(山东大学赠送)划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养7天，待长出粉红色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养5天作为菌种。接1cm2菌种接种于种子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％～10％的接种量接种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h制成二级种子，然后将二级种子接种于4L产酶培养基中，发酵开始pH调整为5.5-6.0，发酵前期pH逐渐下降，用氨水控制渣4.0以上，中后期pH回升用磷酸调节pH至5.5以下；通气量为每分钟通气量：发酵体积＝1:1；溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在30％以上；整个发酵过程温度保持30℃；50h开始补料，补料速度如下表所述，控制还原糖为1.5mg/mL，100h酶活力为14.3U/mL。
表1实施例1纤维素酶发酵补料控制
实施例2
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：6.5％木糖渣，3％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
补料培养基：30％葡萄糖母液，0.6％(w/v)硫酸镁和0.003％(w/v)硫酸锌；其中葡萄糖母液中葡萄糖含量50％，二糖含量20％，多糖含量为5％。
将里氏木霉(中国微生物菌种保藏中心，保藏编号CICC40932)划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养7天，待长出绿色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养5天作为菌种。接1cm2菌种接种于种子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％～10％的接种量接种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h制成二级种子，然后将二级种子接种于4L产酶培养基中，发酵开始pH调整为5.5—6.0，发酵前期pH逐渐下降，用氨水控制渣4.0以上，中后期pH回升用磷酸调节pH至5.5以下；通气量为每分钟通气量：发酵体积＝1:1；溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在20％以上；整个发酵过程温度保持30℃；50h开始补料，补料为30％葡萄糖母液，0.6％硫酸镁和0.003％硫酸锌，补料速度如下表所述，控制还原糖为2.5mg/mL，100h酶活力为18.6U/mL。
表2实施例2纤维素酶发酵补料控制
对比例1
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：3％木糖渣，3％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
补料：60％(w/v)葡萄糖溶液。
将草酸青霉JUA10-1(山东大学赠送)划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养6天，待长出粉红色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养3天作为菌种。接1cm2菌种接种于50mL种子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％的接种量接种一级种子于400mL种子培养基中，28～32℃200rpm培养42h制成二级种子，然后将二级种子按照10％的接种量接种于产酶培养基中，发酵罐中进行产酶发酵。
产酶发酵具体参数控制如下：pH发酵开始pH调整为5.5，发酵前期pH逐渐下降，用氨水控制pH在4.0以上，中后期pH回升用磷酸维持pH5.0-6.6之间；通气量为每分钟通气量：发酵体积为1:1，将发酵起始溶氧调整至100％，转速控制在200rpm以上，控制还原糖为1.5mg/mL，发酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在10％以上，自然回落。整个发酵过程温度保持30℃，发酵在96h达到最高酶活达10.3U/mL。
对比例2
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：6.5％木糖渣，3％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
补料：60％(w/v)葡萄糖溶液。
将里氏木霉RutC-30划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养7天，待长出绿色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养5天作为菌种。接1cm2菌种接种于种子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％～10％的接种量接种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h制成二级种子，然后将二级种子按10％接种量接种于产酶培养基中，发酵开始pH调整为5.5—6.0，发酵前期pH逐渐下降，用氨水控制渣4.0以上，中后期pH回升用磷酸调节pH至5.5以下；通气量为每分钟通气量：发酵体积＝1:1；溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在30％以上，按2g/L/h速率进行补料，控制还原糖为2.5mg/mL；整个发酵过程温度保持30℃；100h酶活力为9.7U/mL。
实施例3
将秸秆粉碎至1-3cm，固液比1:8，2％的氢氧化钠80℃搅拌处理1.5h，采用水洗至pH7.0，用硫酸调节pH至4.8，以10％的底物进行糖化实验，用实施例和对比例所述的纤维素酶酶液，按照每g渣5、7.5、10U酶活力进行糖化实验，其中实施例2和对比例2，还需按照底物量分别添加β-葡萄糖苷酶3IU/g，测定葡萄糖并计算转化率，结果如表3和表4所示，结果显示采用本发明制备的纤维素酶酶液酶活力不仅明显提高，转化效率也比同等酶加量对碱法预处理秸秆渣转化率提升15％以上，最佳酶加量由10U/g渣降低至7.5U/g渣。
表3糖化实验结果——转化率％
表4糖化实验结果——转化率％
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种高效纤维素酶混合物的生产方法，所述方法包括：以里氏木霉或草酸青霉为纤维素酶生产菌进行发酵，整个发酵期间pH始终维持在3.5-6.5之间，发酵至48-60h，开始补料，补料后控制还原糖含量≤2.5mg/mL，每4-5h为一补料速率调整阶段，至结束发酵；
补料的培养基为：葡萄糖母液或木糖母液与硫酸镁、硫酸锌的混合液；
其中葡萄糖母液成分包括：45～60％葡萄糖，15～30％的二糖及5～10％的多糖，其余为水；木糖母液成分包括：45～70％木糖，5～20％葡萄糖，5～15％阿拉伯糖，其余为水；
所述补料培养基中还原糖浓度为20％～40％，硫酸镁浓度为0.5～1％，硫酸锌浓度为0.003～0.008％。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述二糖为麦芽糖。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵培养基中采用非可溶性碳源玉米芯、玉米秸秆、小麦秸秆、木糖渣、脱木素渣中的一种或多种，作为菌株发酵的主要碳源。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，发酵培养基为：2～7％固体非可溶性碳源，1～4％麸皮，0.2～1％微晶纤维素，0.5～1.5％豆饼粉，0.1～0.4％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，补料后，1.5mg/mL≤还原糖含量≤2.5mg/mL。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，补料后溶氧降低，通过改变发酵搅拌桨叶或搅拌速度来弥补溶氧的降低；优选的，补料过程通过控制搅拌或更换搅拌桨叶保持溶氧≥10％，更为优选的，保持溶氧≥15％。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵开始pH调整为5.5-6.0，0-20hpH逐渐下降，用氨水控制发酵培养基pH3.5以上，60h后pH回升至5.5-6.0后，开始用磷酸调节pH至6.0以下。
8.权利要求1-7任一项所述生产方法得到的纤维素酶混合物。
9.权利要求8所述纤维素酶混合物用于水解纤维素底物的用途，优选的，所述纤维素底物为预处理的木质纤维素底物，如预处理的秸秆。
10.一种水解纤维素底物的方法，包括：将权利要求8所述纤维素酶混合物加至纤维素底物以形成反应混合物，其中纤维素酶混合物以每克底物5-10U纤维素酶混合物的浓度添加。
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