CN105400831A - 利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法，包括通过以下步骤获得重组谷氨酸棒杆菌：1)在谷氨酸棒杆菌中引入1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；2)在谷氨酸棒杆菌中引入1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者引入甘油脱水酶及其激活因子的编码基因。本发明所提供的方法采用了谷氨酸棒杆菌为生产菌株，解决了生物安全性的问题，降低了菌体处理的成本。本发明所提供的方法充分耦联谷氨酸和1，3-丙二醇生产过程，使得还原力得到充分利用。在不降低谷氨酸得率的同时，获得极高的1，3-丙二醇对甘油的质量转化率，而且反应的副产物少，分离过程简便。

Description

利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等工艺领域，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。

目前，1，3-丙二醇的生产方法主要包括化学法和生物法。化学法通常是以环氧丙烷或者丙烯为原料通过复杂的催化过程合成1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源等。因此，化学法生产1，3-丙二醇的工艺技术路线目前基本已经淘汰。

现有的生物法生产1，3-丙二醇主要包含两条技术路线：一、以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇；二、以葡萄糖为原料利用重组大肠杆菌生产1，3-丙二醇。具体介绍如下。

工业上利用甘油生产1，3-丙二醇的工艺主要采用克雷伯氏肺炎杆菌(如中国专利CN200810105722.8)。工艺路线的主要缺点是：1、克雷伯氏肺炎杆菌为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；2、大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；3、1，3-丙二醇的得率低，通常1，3-丙二醇对甘油的质量得率低于40％。

针对技术路线二，自然界不存在可以直接转化葡萄糖生成1，3-丙二醇的微生物。杜邦公司通过在大肠杆菌内外源表达来自酿酒酵母的甘油合成途径(甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸酶)和来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子并利用大肠杆菌自身的NADPH依赖的醇脱氢酶YqhD，实现了从葡萄糖到1，3-丙二醇的一步转化(CN200380104657.2)。这一工艺路线的缺点是重组大肠杆菌需要大量的基因工程改造，同时1，3-丙二醇对葡萄糖的质量得率低，通常在25％-40％之间，大肠杆菌的发酵培养需要使用昂贵的原料酵母粉。

因此有必要提供一种新的工艺简便、副产物少、生物安全性高的新的1，3-丙二醇生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种新的利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法，包括通过以下步骤获得重组谷氨酸棒杆菌：1)在谷氨酸棒杆菌中引入1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；2)在谷氨酸棒杆菌中引入1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者引入甘油脱水酶及其激活因子的编码基因。

优选的，为了获得更好的技术效果，进一步提高1，3-丙二醇和谷氨酸的产量，所述方法还包括敲除谷氨酸棒杆菌的內源ldhA基因。

可选的，所述1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因如SEQIDNO.1所示，所述1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQIDNO.2所示，所述甘油脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQIDNO.3所示。

可选的，所述方法包括构建含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒，或者，构建含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和甘油脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒。

可选的，所述重组质粒还含有lac启动子。

可选的，对所述重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵生产1，3-丙二醇和谷氨酸。

可选的，所述好氧发酵的发酵培养基包含糖、甘油、KH₂PO₄、MgSO₄、MnSO₄、FeSO₄、玉米浆、(NH₄)₂SO₄、盐酸硫胺素、和维生素B12。

可选的，所述好氧发酵的发酵培养基中各组分的含量为：糖10-150g/L、甘油10-50g/L、KH₂PO₄0.5-5g/L、MgSO₄0.2-5g/L、MnSO₄0.001-1g/L、FeSO₄0.001-1g/L、玉米浆1-50g/L、(NH₄)₂SO₄1-20g/L、盐酸硫胺素0.001-1g/L、维生素B120.001-1g/L。

可选的，所述好氧发酵的条件包括：

所述谷氨酸棒杆菌的接种量为1-20体积％；发酵温度为28-35℃；通过流加氨水控制pH值在5-8之间；通过改变转数控制溶氧值在10％以上。

其中，发酵到残糖接近于0g/L时结束好氧发酵过程。

可选的，所述方法包括在发酵结束后收集发酵液，对所述发酵液进行硫酸酸化结晶获得谷氨酸晶体和第二处理发酵液，再对所述第二处理发酵液进行浓缩精馏获得1，3-丙二醇。

其中，发酵结束后的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。

本发明还提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，在所述重组谷氨酸棒杆菌中：

1)含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；

2)含有1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者甘油脱水酶及其激活因子的编码基因；

3)内源ldhA基因被敲除。

本发明所提供的方法的有益效果在于：(1)采用了谷氨酸棒杆菌为生产菌株，解决了生物安全性的问题，降低了菌体处理的成本。同时发酵过程中的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。(2)充分耦联谷氨酸和1，3-丙二醇生产过程，使得还原力得到充分利用。在不降低谷氨酸得率的同时，获得极高的1，3-丙二醇对甘油的质量转化率(大于70％，接近理论转化率)。(3)副产物少，分离过程得到简化。

附图说明

图1为质粒pEC-dhaT-pdu的质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

过表达1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组质粒pEC-dhaT-pdu构建。

以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物pdu-F(tgcctgcaggtcgactctagTTAAGCATGGCGATCCCGAAATGG)和pdu-R(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG)为引物进行PCR，获得包括1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的pduCDEGH操纵子片段(pduCDEGH序列如SEQIDNO.2所示)并进行PCR产物纯化(天根生物PCR产物纯化试剂盒)。以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物dhaT-F(ATATCTCCTTttaGCGGGCGGCTTCGTATA)和dhaT-R(ctatgacatgattacgaattAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCAC)为引物进行PCR，获得1，3-丙二醇脱氢酶基因dhaT片段(序列如SEQIDNO.1所示)并进行纯化(天根生物PCR产物纯化试剂盒)。将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-K18mob2(JournalofBiotechnology104(2003)287-299)用EcoRI和XbaI进行双酶切，利用GibsonAssembly试剂盒(NEB)将pduCDEGH操纵子片段和dhaT片段一步连接到pEC-K18mob2上，获得的重组质粒命名为pEC-dhaT-pdu(质粒图谱见附图1).该质粒利用lac为启动子，无需添加外源的诱导剂即可过表达dhaT及pduCDEGH基因。

实施例2

乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，以引物ldhA-up-F(ctatgacatgattacgaattAAAACAGCCAGGTTAGCAGCC)和ldhA-up-R(CGCCAAAGATTTTCGATCCCACTTCCTGATTTCCC)为引物进行PCR，获得ldhA上游约500bp的同源片段ldhA-up并进行PCR产物纯化。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，以引物ldhA-down-F(GGGATCGAAAATCTTTGGCGCCTAGTTGGC)和ldhA-up-R(ccgggtaccgagctcgaattGAGAATTTCGGCGTGCTCG)为引物进行PCR，获得ldhA下游约500bp的同源片段ldhA-down并进行PCR产物纯化。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(JournalofBiotechnology104(2003)287-299)用EcoRI进行单酶切，利用GibsonAssembly试剂盒(NEB)将ldhA-up和ldhA-down片段一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-ldhA。利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ldhA通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选。利用ldhA-up-F和ldhA-down-R为引物进行菌落PCR，敲除ldhA基因的重组子克隆出来的片段为1Kb，该重组菌命名为C.glutamicumΔldhA。

实施例3

表达1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组谷氨酸棒杆菌的构建。

利用电穿孔仪(伯乐)将pEC-dhaT-pdu通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌野生菌ATCC13032以及乳酸脱氢酶ldhA敲除的重组菌C.glutamicumΔldhA中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌株，分别命名为C.glutamicum/pEC-dhaT-pdu和C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-pdu。

实施例4

重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pEC-dhaT-pdu和C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-pdu的发酵培养。

谷氨酸棒杆菌菌株C.glutamicum/pEC-dhaT-pdu和C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-pdu在含有25mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养12小时。

种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖25、(NH₄)₂SO₄5.0、K₂HPO₄1.5、MgSO₄1.0、MnSO₄0.005、FeSO₄0.005、玉米浆30、卡那霉素0.025。

以10％的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐，控制温度为32℃，通气量为1vvm，调整转速使得溶氧水平保持在10％以上，通过流加氨水控制pH值稳定在7.0左右。

发酵培养基配方包括(g/L)：葡萄糖50，甘油15,(NH₄)₂SO₄3.0、K₂HPO₄1.5、MgSO₄1.0、MnSO₄0.010、FeSO₄0.010、玉米浆15、卡那霉素0.025、盐酸硫胺素0.005、维生素B120.005。

发酵72小时结束。谷氨酸棒杆菌菌株C.glutamicum/pEC-dhaT-pdu的OD₆₀₀达到11，谷氨酸产量达到14.0g/L，1,3-丙二醇产量达到8.2g/L，乳酸产量为2.3g/L，没有丁二醇，丁二酸等副产物的产生。谷氨酸棒杆菌菌株C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-pdu的OD₆₀₀达到12，谷氨酸产量达到15.7g/L，1,3-丙二醇产量达到11.7g/L，没有乳酸，丁二醇，丁二酸等副产物的产生。1，3-丙二醇对甘油的质量转化率达到78％，接近理论转化率。说明在谷氨酸棒杆菌里引入1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶可以实现谷氨酸和1，3-丙二醇的联产。敲除ldhA基因有利于进一步提高谷氨酸和1，3-丙二醇的产量。

实施例5

过表达甘油脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组质粒pEC-dhaT-dhaB构建。

以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物dhaB-F(CCGCtaaAAGGAGATATACCatgAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGG)和dhaB-R(CGCATGCTTACCCCCTGTTATTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGCCGC)为引物进行PCR，获得甘油脱水酶dhaB123基因(如SEQIDNO.3所示)并进行PCR产物纯化(天根生物PCR产物纯化试剂盒)。以质粒pEC-dhaT-pdu为模板，以引物pEC-F(GGTATATCTCCTTttaGCGGGCGG)和pEC-R(TAACAGGGGGTAAGCATGCGCT)为引物进行PCR，获得质粒骨架pEC-dhaT片段并进行纯化(天根生物PCR产物纯化试剂盒)。将pEC-dhaT片段和dhaB123用GibsonAssembly一步连接获得的重组质粒，命名为pEC-dhaT-dhaB.。

实施例6

表达甘油脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组谷氨酸棒杆菌的构建。

利用电穿孔仪(伯乐)将pEC-dhaT-dhaB通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌重组菌C.glutamicumΔldhA中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌株，命名为C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-dhaB。

实施例7

重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-dhaB的发酵培养。

谷氨酸棒杆菌菌株C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-dhaB在含有25mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养12小时。

种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖25、(NH₄)₂SO₄5.0、K₂HPO₄1.5、MgSO₄1.0、MnSO₄0.005、FeSO₄0.005、玉米浆30、卡那霉素0.025。

以10％的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐，控制温度为32℃，通气量为1vvm，调整转速使得溶氧水平保持在10％以上，通过流加氨水控制pH值稳定在7.0左右。

发酵培养基配方包括(g/L)：葡萄糖50、甘油15、(NH₄)₂SO₄3.0、K₂HPO₄1.5、MgSO₄1.0、MnSO₄0.010、FeSO₄0.010、玉米浆15、卡那霉素0.025、盐酸硫胺素0.005、维生素B120.005。

发酵72小时结束。谷氨酸棒杆菌菌株C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-dhaB的OD₆₀₀达到12，谷氨酸产量达到14.2g/L，1，3-丙二醇产量达到11.4g/L，没有乳酸，丁二醇，丁二酸等副产物的产生。说明在谷氨酸棒杆菌里引入甘油脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶同样可以实现谷氨酸和1，3-丙二醇的联产。

实施例8

产品的分离纯化。

利用实施例4的方法获得C.glutamicumΔldhA/pEC-dhaT-pdu发酵液2L。发酵液经微滤膜过滤获得菌体和滤液(滤膜截留分子量为300MW，过滤温度为40℃)。菌体可以直接干燥，用做饲料添加剂。滤液用硫酸调节pH值至谷氨酸等电点，待谷氨酸等电析出后经过过滤获得谷氨酸和第二处理液，谷氨酸纯度为95％以上，得率为80％以上。第二处理液经过浓缩、精馏分离获得1，3-丙二醇。1，3-丙二醇的纯度在99％以上，收率在70％以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法，其特征在于，包括通过以下步骤获得重组谷氨酸棒杆菌：

1)在谷氨酸棒杆菌中引入1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；

2)在谷氨酸棒杆菌中引入1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者引入甘油脱水酶及其激活因子的编码基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括敲除谷氨酸棒杆菌的内源ldhA基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因如SEQIDNO.1所示，所述1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQIDNO.2所示，所述甘油脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQIDNO.3所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括构建含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒，或者，构建含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和甘油脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组质粒还含有lac启动子。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，对所述重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵生产1，3-丙二醇和谷氨酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述好氧发酵的发酵培养基中各组分的含量为：糖10-150g/L、甘油10-50g/L、KH₂PO₄0.5-5g/L、MgSO₄0.2-5g/L、MnSO₄0.001-1g/L、FeSO₄0.001-1g/L、玉米浆1-50g/L、(NH₄)₂SO₄1-20g/L、盐酸硫胺素0.001-1g/L、维生素B120.001-1g/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述好氧发酵的条件包括：

所述谷氨酸棒杆菌的接种量为1-20体积％；发酵温度为28-35℃；通过流加氨水控制pH值在5-8；控制溶氧值在10％以上。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵结束后收集发酵液，对所述发酵液进行硫酸酸化结晶获得谷氨酸晶体和第二处理发酵液，再对所述第二处理发酵液进行浓缩精馏获得1，3-丙二醇。

10.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在所述重组谷氨酸棒杆菌中：

1)含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；

2)含有1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者甘油脱水酶及其激活因子的编码基因；

3)内源ldhA基因被敲除。