CN105331731B - 一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的snp分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385。该标记在芝麻SNP遗传图谱中位于第9连锁群，195.48‑197.79cM，对种皮色的解释率为87.5%~90%（Vg/Vp），该标记包含103bp，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明针对芝麻育种技术进行创新，与目前应用的常规育种技术方法相比，检测方法简单高效，结果可靠；所提供分子标记SiSCC2385，用于芝麻分子辅助育种时可以显著提高育种效率，节约科研成本和时间，并为完善芝麻分子育种技术平台奠定坚实基础。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385。
背景技术
芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26），属胡麻科胡麻属，是世界上最古老的特色优质油料作物之一。我国是芝麻四大主产国之一，年种植面积1200万亩左右，总产量约75万吨。根据种皮颜色，芝麻又被分为白芝麻和黑芝麻。在我国，白芝麻主产区主要分布于河南、安徽和湖北三省，黑芝麻主产区主要位于江西省。因颜色纯正，外观及内在品质优良，我国白芝麻和黑芝麻生产均在国际芝麻生产和贸易中享有盛誉。
芝麻种皮颜色是芝麻重要的农艺性状之一。在自然界中，芝麻籽粒颜色多样，如白色、黄色、褐色、灰色、黑色等。通常情况下，白芝麻籽粒中的油分、蛋白及水分含量等均比黑芝麻的要高，而矿物质和碳水化合物含量却低于黑芝麻（Kanu, 2011）。此外，芝麻种皮颜色还与种子中抗氧化物质的活性、含量以及芝麻的抗性水平有关（Budowski and Markley，The chemical and physiological properties of sesame oil，1951，Chem Rev， 48(1): 125–151；Nakimi，The chemistry and physiological functions of sesame，1995，Food Rev Int 11(2): 281–329；Kanu，Biochemical analysis of black and whiteSesame seeds from China，2011，Am J Biochem Mol Biol 1: 145–157；Shahidi et al.，Antioxidant activity of white and black sesame seeds and their hullfractions，2006，Food Chem 99: 478–483；El-Bramawy et al.，Assessing thesuitability of morphological and phenological traits to screen Sesamegenotypes forFusarium wiltand charcoal rot disease resistance，2008，J PlantProtect Res 48: 397–410； Zhang et al.，Analysis of Sesame karyotype andresemblance-near coefficient，2012 ，Chin Bull Bot. 47 (6): 602–614）。
研究表明，芝麻种皮颜色与芝麻物种进化有一定的关系。芝麻物种的进化方向应为野生→黑色→褐色→黄→白色的进化趋势（何凤发等, 1994, 西南农业大学学报, 芝麻的核型与系统演化；张海洋等，2012，植物学报，芝麻染色体核型及似近系数分析）。芝麻种皮色性状为数量性状，受两对加性-显性-上位性主基因以及多基因控制（Zhang et al.,2013, PLoS ONE, Genetic analysis and QTL mapping of seed coat color in sesame(Sesamum incium L.); Baydar and Turgut, 2000, Studies on genetics andbreeding of sesame (Sesamum indicum L.) I. Inheritance of the charactersdetermining the plant type. Turkish Journal of Biology）。2013年，我国芝麻科研人员采用RGB颜色模型，分析了种皮色性状在黑、白芝麻六世代群体中的遗传变化，并利用遗传图谱确定了4个与芝麻种皮颜色紧密连锁的QTL（Zhang et al., 2013, PLoS ONE,Genetic analysis and QTL mapping of seed coat color in sesame (Sesamum inciumL.)）。该研究为进一步推动芝麻分子辅助育种技术的发展奠定了基础。
但是，由于芝麻籽粒种皮颜色多样，性状研究易受籽粒发育、成熟度等影响，芝麻籽粒种皮色基因相关研究仍有待深入。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385，同时提供了一种利用PCR技术检测该分子标记的检测方法，通过检测该分子标记，从而对种皮颜色做出预判，从而为芝麻新品种培育提供参考。
本发明所采取的详细技术方案如下。
一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385，该标记在芝麻SNP遗传图谱中位于第9连锁群，195.48-197.79cM，对种皮色的解释率为87.5%~90%（Vg/Vp），该标记包含103bp，其序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTTTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTCAACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
需要说明的是，上述SNP位点序列中第25个碱基T，当T变为C时，芝麻种皮色往往发生显著变化，多表现为由浅色（白色）变为深色（黑色）；
换言之，本申请SiSCC2385等位位点序列为：
GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTCTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTCAACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
所述SNP分子标记SiSCC2385在芝麻新品种培育中的应用，包括以下步骤：
（1）提取待测芝麻种质资源的基因组DNA；
（2）利用Primer premier 5.0软件设计引物对，引物设计时，需要注意的是，为区分被检测基因组DNA中不同SNP等位位点，研究人员通常需要完成以下2方面工作：
第一，将SNP引物对设计成3条，并需在特异引物的3’末端第3位的碱基引入错配以增加扩增产物的特异性；引入错配的原则为：引物3’端-3位错配碱基与3’末端的SNP错配碱基形成稳定性互补的错配结构；即强错配型(C／T或G／A)与弱错配型(C／A或G／T)搭配，中等错配型(A／A、C／C、G／G或T／T)与中等错配型搭配；
第二，在含有SNP位点的2个正向或反向引物中，将其中1条引物序列的5’端随机增加5个碱基，其主要目的是为了不同位点的PCR产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷地区分开来；
具体引物序列设计如下：
正向引物1F序列为：5' GCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTT 3'；
正向引物2F序列为：5' TATAAGCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTC 3'；
反向引物R 序列为：5' GAAAAAACACAGTGGGCTATCGT 3'
以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；
在用正向引物1F、反向引物R进行芝麻基因组DNA扩增时，PCR扩增产物大小为103bp；在用正向引物2F、反向引物R扩增时，PCR产物大小为108bp；
（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行凝胶电泳，判断待测芝麻种质资源的基因组DNA中所含的SNP分子标记SiSCC2385中第25个碱基是T或C；
如果为C碱基，则表明待测芝麻材料基因组中含有与芝麻深色种皮性状紧密连锁的分子标记，则其后代种皮色为深色或黑色的可能性极大，可用于培育非白粒芝麻新品种；
反之，如果含有T碱基，则该芝麻材料含有与芝麻浅色种皮性状紧密连锁的分子标记，则其后代种皮为浅色或白色的可能性极大，可以用于选育白芝麻新品种。
总体而言，本发明创新点主要体现在以下几个方面：
（1）本发明通过对黑、白种皮色芝麻种质的遗传图谱构建、QTL定位以及自然群体间的关联验证，提供了一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP标记SiSCC2385，同时提供了一种鉴定芝麻种质资源中是否含有控制芝麻种皮深浅颜色标记位点的PCR鉴定方法，该方法可以较为便捷和快速地初步预测待测芝麻品种的种皮色，为新品种培育提供参考；
（2）本发明所获得的种皮色基因紧密关联标记位点明确，检测结果稳定；由于本发明所提供的标记SiSCC2385筛选时所用的亲本之一是芝麻育种中常用的优异亲本，与我国大部分芝麻品种和现有常用芝麻育种亲本均有直接或间接亲缘关系，因而该标记位点SiSCC2385具有较好地应用基础；
（3）本发明所提供的芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP标记的检测方法，技术成熟，检测结果稳定性好，对提高芝麻遗传育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水平具有重要意义。
与现有芝麻育种方法相比，本发明优点可以概括为：（1）本发明针对芝麻育种技术进行创新，与目前应用的常规育种技术方法相比，检测方法简单高效，结果可靠；（2）本发明所提供分子标记SiSCC2385，用于芝麻分子辅助育种时可以显著提高育种效率，节约科研成本和时间，并为完善芝麻分子育种技术平台奠定坚实基础。
附图说明
图1为本发明利用F2群体建立的芝麻SNP高密度遗传图谱；
图2为本发明的遗传图谱F2部分群体（含亲本）种皮颜色的L值测定结果；
图3为本发明的遗传图谱F2部分群体（含亲本）种皮颜色的A值测定结果；
图4为本发明的遗传图谱F2部分群体（含亲本）种皮颜色的B值测定结果；
图5为本发明的L值在芝麻SNP遗传图谱中的定位结果；
图6为本发明的A值在芝麻SNP遗传图谱中的定位结果；
图7为本发明的B值在芝麻SNP遗传图谱中的定位结果；
图8为本发明的SNP标记SiSCC2385引物对SiSCC2385 1F、SiSCC2385 2F和SiSCC2385 R在F2群体部分材料中的PCR扩增结果，其中各泳道为：M为DL, 2000 Marker，泳道1为F2群体白芝麻亲本（豫芝DS899）的PCR扩增结果（可靠度100%）；泳道2为F2群体黑芝麻亲本（JS012）的PCR扩增结果；泳道3-10为8份白粒F2单株材料的PCR扩增结果（SiSCC2385序列中第25个碱基为T，可靠度为87.50%）；泳道11~20为F2群体中10份黑粒F2单株材料的PCR扩增结果（SiSCC2385序列中第25个碱基为C，可靠度为90%）；
图9为本发明的遗传图谱F2群体50个单株种皮颜色的L值分布；
图10为本发明的遗传图谱F2群体50个单株种皮颜色的A值分布；
图11为本发明的遗传图谱F2群体50个单株种皮颜色的B值分布；
图12为本发明的SNP标记SiSCC2385引物对SiSCC2385 1F、SiSCC2385 2F和SiSCC2385 R在F2群体材料中的PCR扩增结果，其中各泳道为：M为DL, 2000 Marker，泳道1为F2群体中10份白芝麻材料DNA的混合池PCR扩增结果（SiSCC2385序列中第25个碱基为T，可靠度为100%）；泳道2为F2群体中10份黑芝麻材料DNA的混合池PCR扩增结果（SiSCC2385序列中第25个碱基为C，可靠度为100%）；泳道3-22为20份为白芝麻品种资源的PCR扩增结果（大部分SiSCC2385序列中地第25个碱基为T，可靠度为80%）；泳道23-42为20份黑芝麻品种资源的PCR扩增结果（大部分SiSCC2385序列中地第25个碱基为C，可靠度为95%）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步解释说明。介绍具体实施例前，首先对本发明中所用主要芝麻种质资源计品种简要介绍如下。
现有技术中，常用的芝麻品种豫芝11号是我国重要的芝麻育种优异亲本材料，目前我国育成品种中约有40%以上都与之有较近的亲缘关系。因而理论而言，利用与该品系有直接亲缘关系的亲本开展芝麻高抗病新品种选育，将会加速芝麻育种研究进程。
本申请中所采用的芝麻品种豫芝DS899，是由河南省农业科学院芝麻研究中心从豫芝11号经EMS诱变选出的新品系（2015年已进行国家新品种权保护申请，正在进行芝麻新品种区试鉴定），其主要特征为：白粒；每叶腋3花，花序有限，单杆，蒴果四棱，高抗枯萎病。
本申请中所采用的芝麻资源JS012，来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库，主要特征为：黑粒；每叶腋单花，分枝，蒴果四棱，高感枯萎病。
本申请所涉及的40份黑、白芝麻品种资源均可从公开渠道获得（或者均可直接从河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库获得）并种植应用。
实施例1
本实施例简要介绍一下对于芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385的筛选过程，具体过程如下。
一、黑、白芝麻F2遗传群体构建
2013年7月，利用白芝麻品系豫芝DS899、黑芝麻种质JS012配置杂交组合，获得F1。
2013年11月，将F1种子采用营养钵点播，种植在河南省农业科学院芝麻研究中心三亚基地，2对真叶后，适时移栽各植株，确保株系数量大于300个。
二、F2群体的SNP遗传图谱构建及QTL定位
（1）F2群体亲本及122个F2单株基因组重测序
从F2群体中随机挑选120个株系，采集120个株系单株和2个亲本单株的幼嫩叶片，参照魏利斌等（2008）中的改良CTAB法提取各植株DNA（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），采用Illumina测序方法对122份材料进行基因组重测序，测序覆盖度≥30×。
（2）参考豫芝11基因组数据（Zhang et al.，Genome sequencing of theimportant oilseed crop Sesamum indicum L.，2013，Genome Biology；Miao and Zhang，The sesame genome project and genome sequencing. XXII International Plant andAnimal Genome Conference (San Diego, USA). 2014 (Conference posterabstract)），选用BWA（Burrows- Wheeler Aligner）软件将各株系的测序数据进行拼接。
（3）利用Joinmap_linkage map软件构建芝麻F2群体SNP高密度遗传图谱
所构建遗传连锁图谱如图1所示。
图谱共有13个连锁群，包含3101个Bin区段，12.4万个标记，图谱全长1872.2 cM，平均144.0 cM/连锁群，0.015 cM/标记区间。
（4）采用LAB色彩模型检测F2群体籽粒种皮色
选取2个亲本，并随机从F2群体挑选了120个株系，采用Colorflex EZ 分光光度计（美国Hunter Associates实验室生产）对单株种子的种皮色进行测定，L、A、B值分布频率见图2、图3和图4。
LAB色彩模型是由亮度(L)和有关色彩的A、B三个要素组成。L表示亮度（Luminosity），A表示从深绿色到洋红色的范围，B表示从亮蓝色到黄色的范围。
结果表明：亲本豫芝DS899的L、A和B值分别为62.26、5.48和20.66；亲本JS012的L、A和B值分别为21.85、1.47和2.72。F2群体后代植株的L、A和B值范围分别为16.23-55.25、1.2-10.54和1.42-15.59。
（5）芝麻籽粒种皮色性状的QTL定位
结合上述SNP高密度遗传图谱，采用WinQTL cart软件精确定位了3个（QTL9-184，QTL3-460和QTL5-121）与芝麻粒色相关的QTL位点（图5，图6和图7）。其中QTL9-184同时与L、A和B三个色彩要素相连锁，且该位点对L、A和B值的解释率均大于65%。
深入分析发现该QTL位于第9连锁群的189.4cM与225.7cM之间，且在该区间内，两亲本间存在有25个SNP多态位点。
三、与籽粒种皮色紧密连锁分子标记的获得
根据上述区间的序列和25个候选SNP标记位点（25个SNP标记位点信息略），设计25个SNP引物对。具体SNP引物设计方法参考Wei等（Development of SNP and InDel markersvia de novo transcriptome assembly in Sesamum indicum L. Molecular Breeding,2014, 34:2205–2217.）进行。其中，利用Primer Premier 5.0软件，设计的SiSCC2385标记的AS-PCR（allele-specific PCR）引物序列如下：
正向引物1F序列为：5' GCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTT 3'；
正向引物2F序列为：5' TATAAGCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTC 3'；
反向引物R 序列为：5' GAAAAAACACAGTGGGCTATCGT 3'；
需要说明的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，同时为了不同位点的PCR产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷的区分开来，正向引物2F的5’端前5个碱基为随机增加；
利用SiSCC2385标记引物对和其他24个SNP引物对，以上述120个F2群体中的10个黑芝麻单株、8个白芝麻单株以及2个亲本的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR结果显示，SNP标记SiSCC2385引物对（SiSCC2385 1F、SiSCC2385 2F和SiSCC2385 R）在F2群体部分材料中的结果稳定，与芝麻黑、白种皮色的关联度较好（参见图8及附图说明）。
在F2群体的白芝麻亲本（豫芝DS899）中（泳道1），SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为T；黑芝麻亲本（JS012）中（泳道2），SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为C，标记可靠度为100%；
在8份F2白色种皮的单株材料（泳道3-10），7份材料中SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为T，有1份材料中既含有T位点，又含有C位点；标记可靠度为87.5%。
在10份黑芝麻材料中（泳道11-20），有9份材料中SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为C，1份材料既含有T位点，又含有C位点；标记可靠度为90%。
综合统计，采用SNP分子标记SiSCC2385在上述20个F2芝麻群体材料中的检测可靠度为90%。
通过上述分析确定，SiSCC2385标记与芝麻种皮色性状紧密连锁，该标记在SNP高密度遗传图谱中的位置为195.48-197.79cM，位于第9连锁群。该标记包含103bp，其序列如SEQ IDNo.1所示，具体为：
GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTTTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTCAACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
需要说明的是，上述SNP位点序列中第25个碱基T，当T变为C时，芝麻种皮色往往发生显著变化，多表现为由浅色（白色）变为深色（黑色）。
实施例2
本实施例主要介绍对于与芝麻种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385的验证，即该分子标记的检测方法，具体过程如下。
（1）提取待测芝麻种质资源的基因组DNA
本实施例以重新构建的种皮色相关F2群体为基础，对该SNP分子标记SiSCC2385进行了检测，所述F2群体的构建过程如下：
2014年7月，在河南省农业科学院芝麻研究中心原阳基地利用白芝麻品系豫芝DS899、黑芝麻种质JS012配置杂交组合，获得F1；
2014年11月，在三亚基地种植F1代种子，单株罩网自交，随后获得F2代种子，群体大于200株；
为确定该群体构建的质量，2015年2月收获时期，随机挑选50个F2单株，收集上述50 个F2单株的饱满种子，同时采用Colorflex EZ 分光光度计（美国Hunter Associates实验室生产）对单株种子的种皮颜色进行测定，采集F2后代种皮色表型数据（图9，图10和图11）。结果显示，该组材料种皮颜色多样，数据可反映该群体后代种皮色数值的变化范围，群体构建质量较好，可用于SNP分子标记SiSCC2385的验证。
为了验证获得的分子标记SiSCC2385，发明人准备了2组验证材料：
1）黑色、白色F2群体混合池材料：在上述重建的F2群体中，随机选取种皮色为白色的10个单株和种皮色为黑色的10个单株，参照魏利斌等（2008）中的改良CTAB法提取上述20个单株的DNA（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），分别构建F2群体黑芝麻和白芝麻植株DNA的BSA混合池，备用；
2）40份黑色、白色芝麻品种资源材料：为进一步判定该标记在其他芝麻种质中的适用性和稳定性，2015年1月，发明人从芝麻品种库库中随机选取已纯化的20份黑芝麻品种材料以及20份白芝麻品种材料，作为自然群体（即是否可用于特定种皮颜色育种的的待测群体）进行验证。种质资源信息见下表1。取适量上述40份品种资源的种子，种植于培养箱（25℃,16小时光照）中，采集嫩叶，参照魏利斌等（2008）中的改良CTAB法（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），提取上述40份芝麻种质材料的基因组DNA，备用。
40份品种资源的种子的基本信息如下表所示：
（2）芝麻种皮色基因紧密连锁的SNP标记验证
根据实施例1中的SiSCC2385标记与和引物序列，合成SiSCC2385标记的AS-PCR（allele-specific PCR）引物序列如下：
正向引物1F序列为：5' GCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTT 3'；
正向引物2F序列为：5' TATAAGCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTC 3'；
反向引物R 序列为：5' GAAAAAACACAGTGGGCTATCGT 3'；
需要说明的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，同时为了不同位点的PCR产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷的区分开来，正向引物2F的5’端前5个碱基为随机增加；
上述引物序列由华大基因公司合成提供。
利用上述引物对步骤（1）中F2群体的两个BSA池进行标记的准确性检测；随后对40份芝麻自然群体DNA分别进行PCR扩增检测，从而评价SNP标记的可靠性。
需要解释的是，以正向引物1和反向引物扩增的PCR产物大小为103bp；以正向引物2和反向引物扩增的PCR产物大小为108bp。
PCR扩增时分别以上述F2群体的2个黑、白DNA混合池和40个自然群体个体的DNA为模板。
PCR反应采用10 µL反应体系，设置如下：
模板DNA (50ng/µL)，1.0µL；
10×PCR Buffer (Mg2+)，1.0µL；
Taqase酶 (5U/µL)，0.2µL；
dNTP (10mmol/L)，0.2µL；
Forward Primer 1 (10µM)，0.5µL；
Forward Primer 2 (10µM)，0.5µL；
Reverse Primer (10µM)，1.0µL；
加入超纯水5.6µL。
上述相关试剂均购自于上海生工试剂公司。
PCR反应在PTC-100 (MJ research公司产品)热循环仪上进行，反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30 sec，72℃复性1min，30个循环；72℃延伸6min；14℃保温1min。
（3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离。
对步骤（2）中PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶浓度为8~10%，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒压交流电电泳1.5~2小时。电泳结束后，在凝胶加入浓度为0.1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染10min；再加入2%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。
部分电泳图谱如图12所示。
（4）SNP分子标记检测与被检测样品表型的一致性分析
从SiSCC2385位点筛选过程我们可以知晓，理论上，SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为T（条带大小103bp）的芝麻材料，种皮色多表现为浅颜色或白颜色；第25位碱基的等位位点为C（条带大小108bp）的芝麻材料，种皮色多表现为深颜色或黑颜色。
从图12的检测结果中可以看出，在F2群体BSA混合池中，白芝麻混合池含有SiSCC2385等位位点T（泳道1），而黑芝麻混合池含有SiSCC2385等位位点C（泳道2），可靠度为100%。
在20份白芝麻材料中（泳道3-22），有16份材料中SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为T，有3份材料中SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为C，剩余的1份材料中既含有T位点，又含有C位点；标记可靠度为80%。
在20份黑芝麻材料中（泳道23-42），有19份材料中SNP分子标记SiSCC2385的第25位碱基的等位位点为C，1份材料既含有T位点，又含有C位点；标记可靠度为95%。
综合统计，采用SNP分子标记SiSCC2385在上述40份芝麻种质资源中的检测可靠度为87.5%。
综上，我们认为SNP分子标记SiSCC2385与芝麻籽粒种皮色性状紧密连锁，具有较好地可靠性和稳定性，可以用于预测芝麻品种的粒色，即可以用于优质芝麻新品种培育。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心
<120> 一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 103
<212> DNA
<213> Sesamum indicum
<400> 1
gctctctcta cacacctctc tgttttattc tgttctttgc atttttggtg ggtttttttt 60
tgccgttttc ctcaacatac acgatagccc actgtgtttt ttc 103
Claims (3)
1.一种与芝麻籽粒种皮色基因紧密连锁的SNP分子标记SiSCC2385，其特征在于，该标记在芝麻SNP遗传图谱中位于第9连锁群，195.48-197.79cM，对种皮色的解释率为87.5%~90%（Vg/Vp），该标记序列包含103bp，其序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTTTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTCAACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
2.权利要求1所述SNP分子标记SiSCC2385的等位位点的序列，其特征在于，碱基序列为：
GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTCTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTCAACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
3.权利要求1所述SNP分子标记SiSCC2385在芝麻新品种培育中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测芝麻种质资源的基因组DNA；
（2）采用如下引物序列，以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；
正向引物1F序列为：5'–GCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTT-3'；
正向引物2F序列为：5' -TATAAGCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTC-3'；
反向引物R 序列为：5' –GAAAAAACACAGTGGGCTATCGT-3'；
在用正向引物1F、反向引物R进行芝麻基因组DNA扩增时，PCR扩增产物大小为103bp；在用正向引物2F、反向引物R扩增时，PCR产物大小为108bp；
（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行凝胶电泳，判断待测芝麻种质资源的基因组DNA中所含的SNP分子标记SiSCC2385中第25个碱基是T或C；
如果为C碱基，则表明待测芝麻材料基因组中含有与芝麻深色种皮性状紧密连锁的分子标记，可用于培育非白粒芝麻新品种；
反之，如果含有T碱基，则该芝麻材料含有与芝麻浅色种皮性状紧密连锁的分子标记，可以用于选育白芝麻新品种。
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