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CN105331684A - 用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用 - Google Patents

用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用 Download PDF

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CN105331684A
CN105331684A CN201510628184.0A CN201510628184A CN105331684A CN 105331684 A CN105331684 A CN 105331684A CN 201510628184 A CN201510628184 A CN 201510628184A CN 105331684 A CN105331684 A CN 105331684A
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throughput
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高其康
李梅
楼兵干
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开了一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用，复合标签的序列如编号NO.1～NO.48所示。标签的应用方法包括：提取每一个样本的总DNA；对每一个样本，从48对且未被选择过的序列中选择任一一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；对每个样本纯化回收后的产物紫外分光光度计精确定量；将所有样本等量混合后建立一个测序文库；对所建测序文库进行高通量测序。本发明提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中整个微生物种群中的真菌种群，为探明环境中真菌多样性研究提供高通量分析途径。

Description

用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签，用于超高通量基因测序。
背景技术
微生物群落多样性是微生物生态学和环境学研究的重点之一。目前利用宏基因组研究微生物多样性越来越受到科学家们的关注，但由于对于同一个样本来说，宏基因组研究的结果中往往细菌的数量占大多数而使得真菌等微生物种类远少于细菌。这对于某些领域的研究非常不利，如对酿酒过程中各个时期的微生物种群研究，真菌的作用远高于细菌，对酒类品质的影响较大。因此利用真菌独特的内转录间隔区序列为靶序列，用PCR扩增的方法从复杂样本中富集真菌DNA成为非常有效的方法。
Handelman(HandelsmanJ,RondonMR,BradySF.molecularbiologialaccesstothechemistryofunkownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts[J].1998,5(10):R245-R249.)等(1998)首次提出宏基因组的概念，其定义为“thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature”，即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因组总和。本发明所指的宏内间隔序列是指环境中全部真菌内间隔序列的总和，为微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的提供了一条新的思路。
核糖体RNA(rRNA)由于功能上高度保守，序列上不同位置具有不同的变异速率，是目前在微生物分子生态学上应用最广泛的分子标记。真核生物基因组中编码核糖体RNA的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔(匡治州,许杨.核糖体rDNAITS序列在真菌学研究中的应用[J].生命的化学,2004(02):120-122.)。其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守，适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析，其间的间隔区为内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)，包括18S和5.8S之间的内转录间隔区1(ITS1)及5.8S和28S之间的内转录间隔区2(ITS2)两部分，由于ITS不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000bp到小于300bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究(IwenPC,HinrichsSH,RuppME.Utilizationoftheinternaltranscribedspacerregionsasmoleculartargetstodetectandidentifyhumanfungalpathogens[J].MedMycol,2002,40(1):87-109)。
发明内容
本发明提供一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用，提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中整个微生物种群中的真菌种群，为探明环境中真菌多样性研究提供高通量分析途径。
一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签，其序列如如下序列编号NO.1～NO.48所示。
本发明复合标签的每一条序列由左侧8-10个碱基组成具唯一性标签和右侧21个源于真菌内转录间隔区1的序列组成的标签复合而成。
表1
本发明还提供一种真菌高通量基因测序方法，包括如下步骤：
(1)提取每一个样本的总DNA；
(2)对每一个样本，从权利要求1中所示48对且未被选择过的序列中选择任一一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；
(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；
(4)对每个样本纯化回收后的产物紫外分光光度计精确定量；
(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；
(6)对所建测序文库进行高通量测序。
本发明所述真菌宏内转录间隔区序列是指所有落在真菌18S和5.8S之间的内转录间隔区1的总和，复合标签如表1所示；利用表1的真菌宏内转录间隔区序列复合标签可达到在一次超高通量测序中同时对1～48个样本中的真菌宏内间隔序列进行检测。
利用目前超高通量测序自身提供96种测序标签(8-10个碱基)，可做96个样本，但在超高通量测序前先对96个样本分别建96个测序库，然后等量混合成1个再同时测序，而本发明只需建1个测序库就能对48个样本同时测序。如果将测序自带的96个标签和本发明的48个复合标签结合使用，则同时可对96*48个样本的内转录间隔序列进行超高通量测序。
步骤(1)中对每个样本总DNA提取采用通用提取方法。
步骤(2)中对每一个样本从表1所示48对且未被选择过的序列中选择任一一对序列作为引物，其选择原则具体为：确定每一样本的编号，对每一个编号样本，从表1中选择一序列编号所对应的序列1和序列2(NO.1的序列1和序列2为一对，NO.2的序列1和序列2为一对，NO.3的序列1和序列2为一对以此类推)，确定每一个样本的一对序列；每个编号的样本可选表1中48对中的任何一对，但要求不同编号的样本之间从表1选择时不要重合，即不同编号样本不选择同一个复合标签。
步骤(2)中对对应样本的总DNA进行扩增的扩增体系为：
PCR扩增的50μL体系中含：50ng样本总DNA，4μLMg2+，5μL10×Buffer，4μL浓度为5nmoldNTP，1.5UTaq酶，浓度为10pmol引物各1.5μL，补水至50μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，40℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
步骤(3)中对每个样本扩增产物进行纯化回收采用通用的PCR产物回收试剂盒。
本发明所述高通量测序采用基于IonPGM第二代超高通测序仪的测序平台进行。
优选地，步骤(5)中建库所用建库试剂盒为IonPGM第二代超高通测序仪对应的IonXpressTMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation试剂盒。
步骤(6)中测序时扩增所用扩增试剂盒为IonPGM第二代超高通测序仪对应的IonPGMTMTemplateOT2400Kit试剂盒。
步骤(6)中测序时测序所用测序试剂盒为IonPGM第二代超高通测序仪对应的IonPGMSequencing400Kit试剂盒。
所述样本为含真菌的样本。
与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：
环境中(如土壤)栖居着大量的微生物，这些微生物的分布及其活动与土壤营养条件，地上植被密切相关。湿地与森林、海洋并称全球三大生态系统，被称为“地球之肾”，具有丰富的生物多样性。本方法以特定环境中的微生物为研究对象，基于宏基因组学的研究思路，采用本方法所述的序列，建一个库最多可对48个样本同时进行超高通量测序，进行基于宏基因组的环境样本中的真菌种群变化规律研究，为各种环境样本进行同类研究提供方法。
附图说明
图1是本发明其中一个样本电泳检测结果图。
图2是8个样本的超高通量测序结果总览。
具体实施方式
实施例1
环境样本总DNA的提取可以参照Zhou的方法(DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition，Appl.Environ.Microbiol.，1996，62，316-322)，提取后DNA的纯化可参考Jackson的方法(Asimple,efficientmethodfortheseparationofhumicsubstancesandDNAfromenvironmentalsamples，Appl.Environ.Microbiol.，1997，63，4993-4995)。或参照土壤DNA提取试剂盒的方法提取。主要步骤如下：
1.称取环境样品样5g于50mL离心管中,加入15毫升磷酸缓冲液，在涡旋仪上剧烈涡旋5min，然后12500rpm离心10min，弃上清，沉淀用灭菌的石英砂研磨；
2.加入13.5毫升的DNA提取缓冲液，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃，250转/分钟摇30分钟；
3.加入700微升20％SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；
4.6000转/分钟室温离心15分钟,收集中间液相层；向沉淀中加入5毫升DNA提取液，300微升20％SDS，65℃水浴30min，6000转/分钟离心，收集中间液相层，合并；重复二次；
5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次，8000转/分钟离心10min，收集上部液相层；
6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，室温放置1-2h。
7.过夜沉淀物12000转/分钟离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000转/分钟离心5min，弃上清；12000转/分钟离心30sec，
8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。
DNA提取液组成：100mMTris，100mMEDTA，200mMNaCl，2％PVPP，3％CTAB，pH9.0
实施例2
以8个样本为例实施。
(1)将8个样本从1至8编号，从表1中No.1至No.48序列中各自选取一个序列编号(如表2)交相关序列合成公司进行合成；再用无DNA酶的水稀释合成的序列至10pmol；将表1中的序列号关联给相应的样本编号，如表2。
表2样本与复合标签对应表
样本编号 1 2 3 4 5 6 7 8
序列编号 No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 No.8
(2)PCR扩增：取8个200μLPCR管，每管对应一个样本，并用上述样本编号对应的序列编号中的序列1和序列2为PCR扩增的引物。PCR扩增的50μL体系中含：分别依据8个样本的DNA浓度，吸取总量为50ng样本总DNA于对应管中，再在每管中加入4μLMg2+，5μL10×Buffer，4μL浓度为5nmoldNTP，1.5UTaq酶，浓度为10pmol引物各1.5μL，补水至50μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，40℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存；
(3)三角烧瓶中称取琼脂糖2克，加水至100mL,，微波加热至彻底溶解，加入适量荧光显示剂混匀，倒入电泳模具中冷却。吸取上述PCR扩增结束后的液体5μL与电泳缓冲液混匀后加入琼脂糖凝胶的上样孔中，按每厘米5V的电压进行恒压电泳，电泳结束后将琼脂糖凝胶放入紫外观测仪上观察电泳结果，成功的PCR反应经电泳检测可获得分子量分布在200bp至500bp间的扩增产物(如图1所示)。
实施例3
一、利用通用的PCR产物回收试剂盒纯化PCR扩增产物，步骤如下：
(1)在1倍体积的PCR反应物中加入2倍体积的BindingBuffer，翻转充分混匀。
(2)将上述混合液加入DNA纯化柱内，如果溶液体积>700μl，分次转移溶液；室温放置1-2min或更长时间。
(3)13000g离心1分钟，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心,弃废液。
(4)在DNA纯化柱中加入650μLWashBuffer，13,000g离心30秒，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管。重复步骤4。
(5)13,000g离心3min，以去除柱中残余乙醇。
(6)将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60℃下预热的30-50μLElutionBuffer或ddH2O，室温放置1-2min或更长时间。
(7)13,000g离心1min，所得液体即为高纯度DNA。
二、将纯化后的PCR扩增产物用紫外分光光度计精确定量，并用水调整至体积为70μL的溶液内DNA总量为100ng；
(8)用IonPGM第二代超高通测序仪对应的IonXpressTMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation试剂盒进行建库；
(9)用IonPGM第二代超高通测序仪对应的IonPGMTMTemplateOT2400Kit和IonPGMSequencing400Kit试剂盒进行序列扩增和测序、18芯片进行测序，并将8个复合标签序列信息输入高通量测序仪所用的测序方法中，高通量测序仪就会依据输入的序列信息，归类相应的样本数据。按照上述测序方法获得的测序结果(图2)表明，高通量测序仪能依据各样本对应的复合标签序列，将混合在一起的测序数据有效地能归类出8个样本各自的测序结果，达到了复合标签应用的目的。
对于其他任意样本数量的测序方法同实施例2和实施例3。

Claims (4)

1.一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签，其特征在于，其碱基序列如如下序列编号NO.1～NO.48所示：
2.一种利用权利要求1所述复合标签进行超高通量基因测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取每一个样本的总DNA；
(2)对每一个样本，从权利要求1中所示48对且未被选择过的序列中选择任一一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；
(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；
(4)对每个样本纯化回收后的产物紫外分光光度计精确定量；
(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；
(6)对所建测序文库进行高通量测序。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述样本为含有真菌的样本。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，对对应样本的总DNA进行扩增的PCR扩增体系为：
50ng样本总DNA，4μLMg2+，5μL10×Buffer，4μL浓度为5nmoldNTP，1.5UTaq酶，浓度为10pmol引物各1.5μL，补水至50μL。
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