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CN105307687A - 多模态的基于二氧化硅的纳米粒子 - Google Patents

多模态的基于二氧化硅的纳米粒子 Download PDF

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CN105307687A CN201480016246.6A CN201480016246A CN105307687A CN 105307687 A CN105307687 A CN 105307687A CN 201480016246 A CN201480016246 A CN 201480016246A CN 105307687 A CN105307687 A CN 105307687A
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米歇尔·布拉德伯里
乌尔里克·威斯纳
库拉·佩纳特·梅迪娜
安德鲁·伯恩斯
贾森·刘易斯
史蒂文·拉森
汤姆·奎因
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Cornell University
University of Missouri System
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Cornell University
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Abstract

本发明提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其用于如癌症的疾病的精确检测、表征、监测以及治疗。所述纳米粒子具有一系列直径；具有安置在所述纳米粒子内的荧光化合物并且具有与游离荧光化合物相比更大的亮度和荧光量子产率；展现高生物稳定性和生物相容性；可用有机聚合物涂布，如聚(乙二醇)PEG。所述纳米粒子的小尺寸、二氧化硅基底以及所述有机聚合物涂层使所述纳米粒子在体内投予时毒性降到最低。所述纳米粒子可以进一步与配体结合。可以将治疗剂附接到所述纳米粒子上。此外，可以将磁共振成像MRI、放射性核素/无线电金属或顺磁离子与所述纳米粒子结合。

Description

多模态的基于二氧化硅的纳米粒子
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请第61/794,414号和2014年3月17日申请的美国专利申请第14/215,879号的优先权。以上所鉴别的申请中的每一者的公开内容都以全文引用的方式并入。
关于联邦赞助研究或开发的声明
本发明是在政府支持下在NIH-NRRA，临床与转化科学中心拨款；NIH-NCIR01CA161280-01A1，NSFSTC项目协议第ECS-9876771号；ICMICP50CA86438：NIHSAIRP拨款第R24CA83084号；以及NIH中心拨款第P30CA08748号下做出。
技术领域
本发明涉及荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，以及使用所述纳米粒子来检测诊断或治疗疾病(如癌症)的方法。
背景技术
早期肿瘤检测和治疗选择对实现治疗成功和长期存活率是至关重要的。在其早期阶段，许多癌症是局部的并且可以以手术方式治疗。然而，在外科配置中，对转移性疾病扩散和肿瘤边缘(确切地说在复杂解剖学领域中)的评估受到缺乏成像技术的限制。这已经导致不相称数量的侵入性活组织检查。早期成像检测正常与肿瘤细胞之间的分子差异需要并有产生造影(即，光学，PET)标记并且提供改进特异性的分子靶向探针，所述分子差异如受体表达水平的癌症特异性变化。当与更高敏感性和更高分辨率成像工具组合时，特异性分子靶向探针将大大改进癌症的检测敏感性、分期以及监测和/或治疗。
当前荧光成像探针典型地由单个常规荧光团(例如，有机染料、荧光蛋白)、荧光蛋白(例如，GFP)以及半导体量子点(Q点(Q-dot))组成。单个荧光团通常不稳定并且具有有限的成像亮度。类似于染料，荧光蛋白倾向于展现激发态相互作用，其可以导致随机闪烁、淬灭以及光褪色。Q点通常是由重金属离子(如Pb2+或Cd2+)制成，并且因此呈毒性。伯恩斯(Burns)等人“荧光核-壳二氧化硅纳米粒子：关于纳米生物技术的“粒子上实验室”结构(Fluorescentcore-shellsilicananoparticles：towards″LabonaParticle″architecturesfornanobiotechnology)”，化学会评论(Chem.Soc.Rev.)2006，35，1028-1042。
已知具有导电外壳和二氧化硅核心的荧光纳米粒子并且其用于治疗剂的经调制递送。美国专利第6,344,272号和第6,428,811号。现存荧光纳米粒子的缺点是其作为分散系统中的荧光探针的有限亮度和低检测能力。
本发明的多功能荧光的基于二氧化硅的纳米粒子提供许多优于其它典型直径较大的粒子探针的优势。纳米粒子是无毒的、展现极好的光物理特性(包括荧光效率和光稳定性)并且展现增强的结合亲和力、效能以及独特的药物动力学特征，在所述特征中，主体肾清除占主导而无显著网状内皮系统(RES)吸收。其相对较小的尺寸和表面PEG涂层促进极好的肾清除。本发明的荧光纳米粒子含有荧光核心和二氧化硅外壳。纳米粒子的核-壳结构、极大的表面积以及不同的表面化学反应准许多个官能团被同时递送到标靶细胞。举例来说，纳米粒子可以用靶向部分、用于医学成像的造影剂、治疗剂或其它试剂官能化。在纳米粒子表面上的靶向部分可以是肿瘤配体，其在与结合纳米粒子的治疗剂组合时使得所述纳米粒子成为用于靶向的理想媒剂并且潜在地治疗癌症。韦伯斯特(Webster)等人光学钙传感器：研发使用经结合的细胞穿透肽将其引入到细胞中的通用方法(Opticalcalciumsensors：developmentofagenericmethodfortheirintroductiontothecellusingconjugatedcellpenetratingpeptides).分析师(Analyst)2005；130：163-70。基于二氧化硅的纳米粒子可以用造影剂标记以用于PET、SPECT、CT、MRI以及光学成像。
发明内容
本申请提供一种用于检测肿瘤细胞的方法，其包含以下步骤：(a)以在约0.01纳摩尔/千克体重到约1纳摩尔/千克体重范围内的剂量向患者投予多个荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，所述纳米粒子包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到所述纳米粒子上的有机聚合物；附接到所述纳米粒子上并且能够结合肿瘤标记的配体；以及至少一种治疗剂；以及(b)检测所述纳米粒子。
纳米粒子可以经真皮下、瘤周、经口、静脉内、经鼻、皮下、肌内或经皮投予。一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含：
本发明还提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到所述纳米粒子上的有机聚合物；以及附接到所述纳米粒子上的配体，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约15nm之间，并且在向受试者投予纳米粒子之后，所述纳米粒子的肾清除率在约24小时内在约80％ID(初始剂量)到约100％ID范围内，或在约24小时内在约90％ID到约100％ID范围内。
本发明提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含基于二氧化硅的核心，所述核心具有安置在基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到所述纳米粒子上的有机聚合物；附接到所述纳米粒子上的约1到约30个配体，或约1到约20个配体；以及附接到所述纳米粒子上的造影剂或螯合物。
纳米粒子的直径在约1nm到约25nm，或约1nm到约8nm范围内。可以附接到纳米粒子上的有机聚合物包括聚(乙二醇)(PEG)、聚乳酸酯、聚乳酸、糖、脂质、聚谷氨酸(PGA)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙酸乙烯酯(PVA)或其组合。
配体可能能够结合到至少一种细胞组分，如肿瘤标记上。附接到纳米粒子上的配体的数量也可以在约1到约30、约1到约25或约1到约10范围内。配体的实例包括肽、蛋白质、生物聚合物、合成聚合物、抗原、抗体、微生物、病毒、受体、半抗原、酶、激素、化合物、病原体、毒素、表面改性剂或其组合。本发明涵盖肽，如三肽RGD、环肽cRGD、环肽cRGDYC、奥曲酯(octreotate)、EPPT1以及α-MSH的肽类似物。任何含有RGD或α-MSH序列的直链、环状或支链肽都在本发明的范围内；
可以将造影剂，如包括89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I以及177Lu的放射性核素附接到纳米粒子上。纳米粒子可以附接到经调适以结合放射性核素的螯合物，例如DFO、DOTA、TETA以及DTPA上。
本发明的纳米粒子可以通过正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、光学成像(如荧光成像，包括近红外荧光(NIRF)成像)、生物发光成像或其组合。
可以将治疗剂附接到纳米粒子上。治疗剂包括抗生素、抗微生物剂、抗增殖剂、抗肿瘤药、抗氧化剂、内皮细胞生长因子、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、抗血小板凝集剂、胶原蛋白合成抑制剂、治疗性抗体、一氧化氮供体、反义寡核苷酸、创伤愈合剂、治疗性基因转移构筑体、细胞外基质组分、血管扩张剂、溶解血栓剂、抗代谢物、生长因子激动剂、抗有丝分裂剂、他汀(statin)、类固醇、类固醇和非类固醇消炎剂、血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂、自由基清除剂、PPAR-γ激动剂、小干扰RNA(siRNA)、微RNA以及抗癌化学治疗剂。本发明所涵盖的治疗剂还包括放射性核素，例如90Y、131I以及177Lu。治疗剂可以经放射性标记，如通过结合到放射氟18F经标记。
在向受试者投予纳米粒子之后，纳米粒子的血液滞留半衰期可以在约2小时到约25小时、约3小时到约15小时或约4小时到约10小时范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期可以在约5小时到约5天、约10小时到约4天或约15小时到约3.5天范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期与血液滞留半衰期的比率可以在约2到约30、约3到约20或约4到约15范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肾清除率可以在以下范围内：在约24小时内约10％ID(初始剂量)到约100％ID、在约24小时内约30％ID到约80％ID或在约24小时内约40％ID到约70％ID。在一个实施例中，在将纳米粒子投予受试者之后，纳米粒子的血液滞留半衰期在约2小时到约25小时范围内，纳米粒子的肿瘤滞留半衰期在约5小时到约5天范围内，并且纳米粒子的肾清除率在约24小时内在约30％ID到约80％ID范围内。
当以人类剂量当量约100倍的量向受试者投予纳米粒子时，在约10天到约14天内在所述受试者中实质上未观察到贫血、体重降低、躁动、呼吸加快、G1紊乱、行为异常、神经功能障碍、血液异常、临床化学异常、器官病理学上与药物相关的病变、死亡或其组合。
本发明还提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到所述纳米粒子上的有机聚合物；以及附接到所述纳米粒子上的配体，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约15nm之间。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的血液滞留半衰期可以在约2小时到约25小时或约2小时到约15小时范围内；所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期可以在约5小时到约2天范围内；并且所述纳米粒子的肾清除率可以在约24小时内在约30％ID到约80％ID范围内。附接到纳米粒子上的配体的数量可以在约1到约20或约1到约10范围内。纳米粒子的直径可以在约1nm与约8nm之间。可以将造影剂，如放射性核素附接到纳米粒子上。或者，可以将螯合物附接到纳米粒子上。纳米粒子可以通过PET、SPECT、CT、MRI、光学成像、生物发光成像或其组合来检测。可以将治疗剂附接到纳米粒子上。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的血液滞留半衰期也可以在约3小时到约15小时或约4小时到约10小时范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期也可以在约10小时到约4天或约15小时到约3.5天范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期与血液滞留半衰期的比率可以在约2到约30、约3到约20或约4到约15范围内。纳米粒子的肾清除率也可以在将所述纳米粒子投予受试者之后约24小时内在约45％ID到约90％ID范围内。
本发明还提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；以及附接到纳米粒子上的配体，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约8nm之间。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期与血液滞留半衰期的比率在约2到约30范围内，并且所述纳米粒子的肾清除率在约24小时内在约30％ID到约80％ID范围内。
本发明进一步提供一种用于检测细胞组分的方法，其包含以下步骤：(a)使所述细胞与荧光的基于二氧化硅的纳米粒子接触，所述纳米粒子包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；附接到纳米粒子上的约1到约30个配体；以及附接到纳米粒子上的造影剂或螯合物；以及(b)通过至少一种成像技术监测纳米粒子与细胞或细胞组分的结合。
本发明进一步提供一种用于靶向肿瘤细胞的方法，其包含向癌症患者投予有效量的荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，所述纳米粒子包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；附接到纳米粒子上并且能够结合肿瘤标记的配体；以及至少一种治疗剂。纳米粒子可以经放射性标记。纳米粒子可以通过(但不限于)以下途径向患者投予：经口、静脉内、经鼻、皮下、局部、肌肉内或经皮。
附图说明
所述专利或申请文件含有至少一个彩制图式。具有彩色图式的这一专利或专利申请公开案的复本将在请求和支付必需费用之后由专利局提供。
图1a显示裸二氧化硅(灰色)和经PEG涂布(黑色)的含Cy5的二氧化硅纳米粒子的粒径的动态光散射(DLS)曲线图(数均)。
图1b显示覆盖在用裸二氧化硅纳米粒子注射后45min的裸小鼠可见光成像上的、在光谱上分离的Cy5粒子荧光(假色)的体内成像。
图1c显示覆盖在用聚乙二醇化Cy5纳米粒子注射后45min的裸小鼠可见光成像上的、在光谱上分离的Cy5粒子荧光(假色)的体内成像。
图1d显示使用共记录PET-CT的体内生物分布研究。上行为在注射经124I标记的经PEG涂布的纳米粒子后24小时的系列共记录PET-CT图像，侧边为独立获取的显微CT和显微PET扫描。下行为系列显微PET成像。
图2a显示Cy5染料(浅灰)、3.3±0.06nm直径(深灰，平均值±标准差，n＝9)以及6.0±0.1nm直径(黑色，平均值±标准差，n＝6)含Cy5的经PEG涂布的纳米粒子的荧光相关性光谱法(FCS)数据和单指数拟合，其显示由不同物质的不同流体动力学尺寸导致的扩散时间的差异。
图2b显示Cy5染料(浅灰)、3.3nm直径(深灰)和6.0nm直径(黑色)的经PEG涂布的纳米粒子的吸收和发射光谱。
图2c显示由FCS曲线测定的以每分子/粒子的计数率测量的游离染料(浅灰)、3.3nm直径(深灰)和6.0nm直径(黑色)的纳米粒子的相对亮度比较。
图2d显示Cy5染料(浅灰)、3.3nm直径(深灰)和6.0nm直径(黑色)的经PEG涂布的纳米粒子在约3.5mW激光激发下的光褪色数据。
图3a显示6.0nm直径的纳米粒子在注射后10min到48h的不同时间点由血液(黑色)和组织：肝脏(浅灰)、肺(中低灰)、脾脏(中灰)和肾脏(中高灰)保留的初始粒子剂量的百分比(％ID)(n＝3只小鼠，平均值±标准差)。
图3b显示3.3nm(浅灰)和6.0nm(黑色)直径的纳米粒子的保留粒子浓度的曲线图和相关对数衰变拟合以及半衰期。
图3c显示3.3nm(浅灰)和6.0nm(黑色)直径纳米粒子的估计粒子排泄的曲线图以及相关对数拟合和半衰期(平均值±标准差，n＝9(每个时间点三只小鼠))。
图4显示纳米粒子在非荷瘤小鼠和具有皮下C6异种移植物的荷瘤小鼠中的体内生物分布。(A)裸二氧化硅粒子；(B)聚乙二醇化RGD粒子。
图5显示使用流式细胞术在Cy5通道中随时间(a)和粒子浓度(b)变化而测定的cRGD化点和聚乙二醇化点(即纳米粒子)的总特异性结合数据。
图6显示用于αvβ3整合素靶向和表征的多模态C点设计。
图6a.表面携带的放射性标记和肽以及含有核心的反应性染料分子(插图)的124I-cRGDY-聚乙二醇化核-壳二氧化硅纳米粒子的示意图。
图6b.溶液中的Cy5染料(黑色)、经PEG涂布的点(PEG点，红色)以及经PEG涂布的经cRGDY标记的点(蓝色，在红色数据组下方)的测量值的FCS结果和单指数拟合，其显示由不同流体动力学尺寸导致的扩散时间差异。
图6c.游离染料以及源自FCS曲线的经PEG涂布的点和cRGDY-PEG点的流体动力学尺寸(平均值±标准差(s.d.)，n＝15)和相对亮度比较，以及对应的染料和粒子浓度。
图7显示使用尺寸排阻柱色谱的124I-RGDY-PEG-点的纯化和质量控制。在每一洗脱份中通过γ-计数检测的124I-RGD点和124I-PEG-点的放射性(右列)以及124I-RGDY-PEG-点和124I-PEG-点的对应荧光信号强度(Cy5，左列)。
图8显示使用两种细胞类型的124I-cRGDY-PEG-点、cRGDY肽以及抗αvβ3抗体的竞争性整合素受体结合研究。
图8a.通过γ-计数测定的124I-cRGDY-PEG-点和M21细胞的高亲和力并且特异性的结合。插图显示结合数据的史卡查(Scatchard)分析，其描绘相对于结合受体的浓度B，结合受体的放射性配体(B)与未结合受体的放射性配体(或游离的放射性配体F)的浓度比，或结合与游离比(B/F)；斜率对应于解离常数Kd。
图8b.在用cRGDY-PEG-点培育前使用流式细胞术和过量未经放射性标记的cRGD或抗αvβ3抗体测定的M21细胞的αvβ3整合素受体阻断。
图8c.使用流式细胞术测定的与缺乏表面整合素表达的M21L细胞相比，cRGDY-PEG-点与M21的特异性结合。
图8d.通过流式细胞术测定的cRGDY-PEG-点与HUVEC细胞的特异性结合。每一条柱都表示三次重复的平均值±标准差。
图9显示靶向和非靶向粒子探针的药物动力学和排泄图。
图9a.124I-cRGDY-PEG-点在注射后(p.i.)4h到168h的多个时间在M21荷瘤小鼠中的生物分布。插图显示测定血液滞留半衰期(T1/2)的这些数据的代表性曲线图。
图9b.注射后4h到96h的124I-PEG-点的生物分布。
图9c.在注射后高达168小时收集的尿液样品中未经放射性标记的cRGDY-PEG-点的清除率图(n＝3只小鼠，平均值±标准差)。
图9d.在注射后高达168小时的间隔的粪便对应累积％ID/g(n＝4只小鼠)。对于生物分布研究，条柱表示平均值±标准差。
图10显示急性毒性检验结果。
图10a.经H&E染色的肝脏的400x代表图(上图)和经H&E染色的肾脏的200x代表图(下图)。经由静脉内注射用单剂量未经放射性标记的127I-RGDY-PEG-点或经127I-PEG涂布的点(对照媒剂)处理小鼠，并且在14天后收集器官。
图10b.毒性研究中每一处理组的平均日体重。图10a中的比例尺对应于100μm。
图11显示肿瘤选择性靶向的系列体内PET成像。
图11a.注射后4小时的代表性全身冠状面显微PET图像，其表明M21(左，箭头)和M21L(中间，箭头)肿瘤吸收分别为3.6％ID/g和0.7％ID/g，以及在24小时(右)的增强M21肿瘤造影。
图11b.124I-cRGDY-PEG-点在过度表达αvβ3整合素的M21肿瘤(黑色，n＝7只小鼠)和不表达αvβ3整合素的M21L肿瘤(浅灰色，n＝5只小鼠)以及124I-PEG-点在M21肿瘤(深灰色，n＝5只小鼠)中的体内吸收。
图11c.124I-cRGDY-PEG-点(黑色)和124I-PEG-点(灰色)的M21肿瘤与肌肉比。
图11d.经cRGDY标记的探针和未经标记的探针在体内和离体M21肿瘤吸收的相关性。每一条柱都表示平均值±标准差。
图12显示使用多规模近红外光学荧光成像的结点定位。
图12a.在以手术方式暴露的活动物中注射后1小时时，肿瘤位点(T)和引流腹股沟结点(ILN)和腋窝结点(ALN)以及交通淋巴通道(条柱，LC)的全身荧光成像。
图12b.对应的共记录白光和高分辨率荧光图像(上行)以及仅有荧光的图像(下行)，其揭露包括高内皮微静脉(HEV)在内的局部结点和远端结点的结点下部构造。(b)中的较大比例尺对应于500μm。
图13a显示使用自发性小型猪黑色素瘤模型用于对引流已知的原发性黑色素瘤位点的淋巴结盆和区域性淋巴管进行定位的实验设备。
图13b显示在肿瘤位点周围皮下注射多模态粒子(124I-RGD-PEG-点)后5分钟的小视野PET图像。
图14a显示全身动态18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)PET扫描，其展现通过颈内结点疾病位点的径向、冠状面以及轴向图像。
图14b显示融合的18F-FDGPET-CT扫描，其展现通过颈内结点疾病位点的径向、冠状面以及轴向的图像。
图14c显示全身小型猪图像。
图15显示与图14相同的图像组，但是在与上背部上的脊椎相邻的原发性黑色素瘤病变的水平上。
图16a显示在肿瘤位点周围皮下4象限注射124I-RGD-PEG-点后1小时时间段后的高分辨率动态PET图像。
图16b显示在肿瘤位点周围皮下4象限注射124I-RGD-PEG-点后1小时时间段后的融合PET-CT图像。
图16c显示Cy5成像(上图)、切除的结点(上第二幅图)以及H&E染色(下两幅图)。
图17显示具有在核心内的荧光染料和PEG表面涂层的纳米粒子的图。用三键装饰所述纳米粒子以用于随后与DFO和用叠氮基功能化的Tyr3-奥曲酯两者的“点击化学(clickchemistry)”。
图18显示PEG衍生物的结构。使用标准化学反应用于产生具有三键的功能化PEG，接着经由硅烷基团使其与纳米粒子共价连接。
图19显示DFO衍生物的结构。
图20a显示Tyr3-奥曲酯的结构。
图20b显示用于并入到Tyr3-奥曲酯中的含叠氮基的酸的合成。
图21a显示具有核心内的NIR荧光染料、PEG表面涂层、DFO螯合物以及Tyr3-奥曲酯的功能化纳米粒子的产生流程图。
图21b显示用Tyr3-奥曲酯装饰的多模态经89Zr标记的纳米粒子(PET和荧光)的产生流程图。
图21c显示四嗪-降冰片烯接合。
图21d显示使用四嗪-降冰片烯接合产生经放射性标记的核-壳纳米粒子的策略流程图。
图21e显示使用四嗪-降冰片烯接合产生肽靶向经放射性标记的核-壳纳米粒子的策略流程图。显示了一步(其中预金属化螯合剂-降冰片烯复合物与粒子反应)与两步(其中螯合剂在结合之后被金属化)途径两者。
图22显示了展现cRGF-PEG-纳米粒子与溶酶示踪红之间的在内吞途径中的共定位的显微图像。
图23a到23i图像引导SLN(前哨淋巴结)定位：手术前PET成像。(a、b)轴向CT图像揭露左骨盆软组织块(a，箭头)和左侧SLN(b，箭头)。(c、d)轴向18F-FDGPET图像显示在静脉示踪剂注射之后在肿瘤(c，箭头)和左侧SLN(d，箭头)内的局部活性。(e)轴向和(f)冠状面124I-cRGDY-PEG-C点共记录PET-CT图像显示骨盆病变周围的局部注射位点(e，箭头)。(g)对应轴向和(h)冠状面共记录PET-CT图像定位SLN的活性(g，箭头)。(i)原发性肿瘤、SLN(体内、体外)以及远离原发性肿瘤的位点(即，背景)的放射性水平，其是使用手持式γ探针获得。
图24a到24q图像引导SLN定位：用相关组织学的实时手术中光学成像。在图23a到23i中所示的动物上进行手术中SLN定位。(a到i)暴露结点盆的双通道NIR光学成像。在双通道模型(a)RGB颜色和(b)NIR荧光通道(白色)中显示的并入Cy5.5粒子的局部注射。(c到f)远离注射位点的引流淋巴管。在朝向SLN(′N′)延伸的淋巴通道(箭头)近端(c、d)、中间(e)以及远端(f)的主要引流内的荧光信号。还显示了更小口径的通道(箭头)。以(g)颜色和(h)NIR通道显示的SLN图像。(i)暴露SLN的图像。(j到m)在切除期间(j、k)和切除之后(l、m)分别以颜色和NIR通道显示的SLN图像。(n)经H&E染色的SLN显示着色细胞簇(黑框)的低功率视图(条柱＝1mm)。(o)(n)的更高倍放大揭露圆形着色黑色素瘤细胞和噬黑素细胞(条柱＝50μm)。(p)经HMB45染色的SLN的低功率视图确认存在转移(黑框，条柱＝500μm)。(q)(p)中的更高倍放大揭露表达HMB45+的黑色素瘤细胞簇(条柱＝100μm)。
图25a到25k辨别发炎与转移性疾病：比较18F-FDG与124I-cRGDY-PEGC点示踪剂。(a到d)使用18F-FDG-PET用组织相关性成像发炎性变化。(a)18F-FDGPET研究的轴向CT扫描显示在左后颈(箭头)内的钙化。(b)融合轴向18F-FDGPET-CT揭露在这一相同位点(箭头)处的代谢亢进活性。还在代谢活性骨结构(星号)中看到增加的PET信号。(c)经H&E染色的钙化组织的低功率和(d)高功率视图展现发炎性细胞的广泛浸润。(e到k)在肿瘤位点周围注射124I-cRGDY-PEGC点之后的转移性疾病检测。(e)124I-cRGDY-PEG-C点的注射前轴向CT扫描显示在后颈(箭头)内的钙化软组织。(f)共记录的PET-CT显示无对应于钙化区域(箭头)的明显活性，但表明在右侧的代谢亢进结点(箭头)。(g)在更优良水平下的轴向CT显示结点(两侧)(箭头)和钙化焦点(箭头)。(h)融合PET-CT表明PET亲合结点(N)和淋巴引流(弯曲箭头)。钙化显示无活性(箭头)。(i)低功率和(j)高功率视图确认结点转移的存在。(k)来自三维(3D)PET图像重构的单框显示多个双侧转移性结点(箭头)和淋巴通道(箭头)。在无肝脏中的显著示踪剂积聚的情况下看到膀胱活性。比例尺：500μm(c、d)；100μm(i、j)。
图26a到26c显示3D积分18F-FDG和124I-cRGDY-PEG-C点PET-CT。(a到c)3D体积呈现由图7a到7k中所示的CT和PET成像数据产生的图像。(a)PET-CT融合图像(冠状面视图)显示无明显的结点转移(星号)。鉴别了在骨结构内的增加的活性。(b、c)高分辨率PET-CT融合图像显示在局部粒子示踪剂注射之后，在颈部内的双侧转移性结点(开箭头)和淋巴通道(弯曲箭头)的冠状面(b)和优良视图(c)。
图27a到27o在射频消融(RFA)之后使用124I-cRGDY-PEG-C点评估治疗反应。(a到c)SLN的单剂量粒子放射性示踪剂定位。在瘤周注射之后的(a)基线冠状面CT(白色箭头)、(b)PET(黑色箭头)以及(c)融合PET-CT图像(白色箭头)。(b到d)肿瘤粒子示踪剂活性。(b)PET亲合外生左骨盆胞块(黑色箭头)。(c、d)组合的PET-CT图像显示代谢亢进病变和在引流淋巴通道(星号)内的朝向SLN(弯曲箭头)的粒子示踪剂流(白色箭头)。(e、f)在将RFA电极放置(f，箭头)到结点(下十字标线)中之前，消融前轴向CT图像定位SLN(e，白色箭头)。(g)消融前融合PET-CT揭露增加的SLN活性(十字标线后)。(h)消融后PET-CT扫描显示在SLN位点处、针尖前的轻度轻度减小的活性。(i)来自SLN的核心生检组织的对应消融前H&E染色确认着色肿瘤浸润(条柱＝200μm)。(j)(i)中的框内区域的高倍放大揭露黑色素瘤细胞的较大圆形着色簇(条柱＝50μm)。(k)消融后H&E染色显示在部分肿瘤浸润结点(框)内的坏死变化和多焦出血(条柱＝500μm)。(l)(k)的高倍放大揭露在转移性结点内的显著组织坏死(箭头)，以及淋巴组织(条柱＝500μm)。(m)在消融之前的转移性SLN的TUNEL染色(条柱＝20μm)。(n)消融后TUNEL染色展现坏死的局部区域以及相邻散射肿瘤病灶和正常结点组织(NT)(条柱＝500μm)。(o)(n)中的框内区域的高倍放大显示阳性TUNEL染色，与坏死一致(条柱＝20μm)。
图28A到28C.核-壳混合二氧化硅纳米粒子平台(124I-cRGDY-PEG-C点)和研究设计概述。(A)混合(PET-光学)无机成像探针(右)的示意图，其显示含有核心的深红色染料和表面附接的聚乙二醇(PEG)链，所述链携带cRGDY肽配体和放射性标记用于检测人类表达αvβ3整合素的肿瘤(左)。(B)游离(蓝色曲线)和封装(绿色曲线)染料的吸收匹配光谱(左：红色，黑色曲线)和发射光谱(右)，其揭露封装荧光团的增加的荧光。(C)临床试验事件的时间表。生物样本(Biolspecs)，生物样本(血液、尿液)。
图28D到28E。124I-cRGDY-PEG-C点的全身分布和药物动力学。(D)在124I-cRGDY-PEG-C点注射后2小时(左)、24小时(中间)以及72小时(右)的最大强度投影(MIP)PET图像揭露在膀胱(*)、心脏(黄色箭头)以及肠道(白色箭头)中的活性。(E)在注射粒子之后约30min、4h、24h以及72h收集的尿液和血浆的注射剂量衰变校正百分比每克(％ID/g)是通过γ-计数测定；对每一患者产生单独的曲线图。在主要器官上抽取ROI用于每一患者的PET扫描以用于每一患者推导规范化吸收值和％ID/g。
图29生物样本的代谢分析。(A、B)分别在血浆和尿液中的时间依赖性活性浓度(％ID/g×1.00)，其衰变校正到注射的时间。(C-H)血浆和尿液样本的放射性TLC(4∶1乙酸甲醇作为移动相)(衰变校正的每分钟计数，cpm)。(C到E)血浆的色谱图显示在注射后0.5小时(C)、3小时(D)以及24小时(E)的单峰(F-H)。尿液样本的色谱图揭露在注射后0.5小时(F)、3小时(G)、24小时(H)的两个峰。插图(G、H)显示按比例调整到最大50cpm的各别数据。(I-K)标准色谱图：注射液(I)、辐射碘化(131I)肽(J)以及游离131I(K)。垂直线区分对应于粒子示踪剂的峰(长虚线；Rf＝0.04)、131I-cRGDY(短虚线；Rf＝0.2)以及131I(点线；Rf＝0.7)。
图30在全身性注射142I-cRGDY-PEG-C点之后的粒子生物分布和优先肿瘤吸收的全身PET-CT成像。(A)重排冠状面CT表明界限分明的低密度左肝叶转移(箭头)。(B)注射后4小时的冠状面PET图像表明沿着肿瘤周围侧面，以及膀胱、胃肠道(胃、肠)、胆囊以及心脏的增加的活性(箭头)。(C)共记录的PET-CT定位肿瘤边缘的活性。
图31在垂体病变中的粒子吸收的多模态成像。(A到B)注射后72小时的多平面造影增强MR轴向(A)和径向(B)图像展现在垂体前叶腺体右侧面内的亚厘米囊性焦点(箭头)。(C到D)共记录的轴向(C)和径向(D)MRI-PET图像揭露局部化到病变位点的增加的聚焦活性(红色)。(E到F)轴向(E)和径向(F)PET-CT图像将活性定位到鞍的右侧面。(G到I)注射后3小时(G)、24小时(H)以及72小时(I)的轴向PET图像展现在鞍区域内的活性的逐渐积聚(SUVmax)以及在病变周围的背景活性的对应降低。(J)随注射后时间变化而增加的肿瘤与脑(T/B)和肿瘤与肝脏(T/L)活性比。
图32.用于纳米粒子结合的N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH(或αMSH)肽的结构。
图33.原始ReCCMSH靶向分子的结构。
图34A和34B.使用黑皮质素-1受体激动剂(124I-NDP)进行的竞争性结合研究。结合N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH(或α-MSH)的粒子(图34A)具有与所述分子的零乱序列型式相比更强的对经培养B16/F1黑色素瘤细胞的亲和力(图34B)。
图35A和35B.对于B16F10和M21黑色素瘤两种细胞系，获得剂量反应数据作为靶向粒子浓度(图35A)和培育时间(图35B)的函数。
图36.在一系列粒子浓度上进行的48小时固定培育时间的人类M21细胞存活研究表明细胞活力未显著丧失。
图37A和37B.在B16F10与M21两种鼠类异种移植物模型中，结合经125I放射性标记的α-MSH的纳米粒子在24小时时间段内展现大量肾排泄。
图38A和38B.B16F10或M21异种移植物模型均未显示在网状内皮系统(即，不是RES药剂)或肾脏中的靶向粒子探针显著积聚。
图39.对于2种细胞类型，使用cRGDY-PEG-C点和抗αvβ3抗体测定的竞争性整合素受体结合和温度依赖性吸收。A.cRGDY-PEG-C点在M21细胞中随温度(4℃、25℃、37℃)和浓度(25nM、100nM)变化的特异性结合和吸收，其是使用抗αvβ3整合素受体抗体和流式细胞术测定。抗αvβ3整合素受体抗体浓度是粒子浓度的250倍(即，250x)。B.通过流式细胞术测定的相对于缺乏正常表面整合素表达的M21L细胞，cRGDY-PEG-C点在M21细胞中的吸收。C.使用抗αvβ3整合素受体抗体和流式细胞术测定的在HUVEC中的选择性粒子吸收。D.在4h粒子培育之后，使用M21细胞进行的用细胞内吞(铁传递蛋白-Alexa-488、FITC-聚葡萄糖，绿色)和溶酶体标记物(LysoTracker红)的cRGDY-PEG-C点(1μM，红色)共定位分析。共定位小泡(黄色)，赫斯特(Hoechst)对比染色(蓝色)。比例尺＝15μm。每一数据点(A到C)都表示3次重复的平均值±标准差。
图40.磷酸化FAK、Src、MEK、Erk1/2以及Akt在M21细胞中的表达水平。A.FAK/Src复合物经由下游信号传导路径(PI3K-Akt、Ras-MAPK)的活化转导来自整合素细胞表面受体的信号以引发一系列生物反应(框指示经分析的蛋白质中间物)。B.在使G0/G1期同步M21细胞暴露(2h，37℃)于100nMcRGDY-PEG-C-点之后，关键路径中间物相对于在缺乏血清(0.2％FBS)的培养基中的细胞(即，对照)的磷酸化和总蛋白质表达水平。在胰蛋白酶化细胞并且使丸粒再悬浮于溶解缓冲液中之后，通过4％到12％梯度SDS-PAGE溶解蛋白质并且通过抗FAK397、pFAK576/577、p-Src、pMEK、pErk1/2以及Akt抗体来分析。针对FAK、Src、MEK、Erk以及Akt的抗体还用于检测总蛋白质的量。C.对于经粒子暴露与缺乏血清的细胞，磷酸化到总蛋白质(AdobePhotoshopCS2；参见方法)中的信号强度变化百分比的图形概述。GF，生长因子；EC，内皮细胞；ECM，细胞外基质。
图41.在M21细胞中使用FAK抑制剂PF-573228(PF-228)进行的信号传导诱发和抑制研究。A.磷酸化和总蛋白质表达水平的蛋白质印迹，其是使用图2的前述过程，并且在粒子暴露之前向细胞添加250nM或500nMPF-228(0.5h，37℃)。B.在暴露于粒子的细胞与对照细胞(具有和不具有PF-228)中的磷酸化到总蛋白质表达水平的强度变化百分比的概述。
图42.使用延时成像获得的cRGDY-PEG-C点对M21细胞迁移的作用。A.针对一系列粒子浓度(0到400nM；37℃)，相对于单独的经补充培养基(对照)，在补充有0.2％FBS的RPMI1640培养基中使用ORISTM胶原涂布板获得的细胞迁移的时间依赖性变化。图像是在时间t＝0(迁移前)和去除塞子之后随后以24h间隔通过蔡司(Zeiss)Axiovert200M倒置式显微镜(5x/.25NA物镜)和扫描载玻片模块(显微镜自动化和图像分析软件(MicroscopyAutomation&ImageAnalysisSoftware))持续总共96小时来捕捉。B.使用ImageJ软件制成的随浓度变化的平均闭合面积(％)变化的图表。平均闭合面积表示在任意时间点和在去除塞子(t＝0)之后由前进细胞的边界所划分的面积的差值除以后一面积。对于每一组使用以下一尾t检验在统计学上检验重复四份样品：*，p＝0.011；**，p＝0.049；***，p＝0.036，比例尺＝100μm和33μm(x和xv的放大图像)。
图43.cRGDY-PEG-C点对HUVEC细胞迁移的作用。A.连续HUVEC迁移是使用图4中的相同过程以24小时时间间隔来分析。所显示的图像和所指示的闭合面积值代表单个实验。B.针对一系列粒子浓度(0到400nM)使用ImageJ软件以这一时间间隔测定平均闭合面积(％)。对于每一浓度和时间点进行重复三次分析。一尾t检验*，p＜0.05。比例尺＝76μm。
图44.使用PF-228抑制HUVEC细胞迁移。A.如图5中的相同过程，除了细胞在粒子暴露或在补充有0.2％FCS的培养基中培育之前暴露于250nM和500nMPF-228(0.5h，37℃)。B.在前述条件下培育的细胞的平均闭合面积(％)。C.使用一尾t检验测定的每一暴露条件的列表p值。对于每一抑制剂浓度操作重复四份样品。比例尺＝50μm。
图45.使用cRGDY-PEG-C点调节M21细胞扩散和附着。A.延时成像，其显示细胞附接和扩散。细胞在补充有0.2％FBS的RPMI(0.5h，25℃)中在不具有和具有粒子(400nM)下预培育，接着在(5μg/ml)纤维结合蛋白涂布的96孔培养盘中接种。图像是在t＝0、0.5h、1h以及2h时使用蔡司Axiovert200M倒置式显微镜(20x/.4NA物镜)和中的扫描载玻片模块来捕捉。B.显示在两个组中随时间变化的圆形和伸长细胞的平均数量的图表：未暴露于粒子(伸长，图1号)和暴露于粒子的(圆形，图2号)。在96孔培养盘的三个孔中的每一者中的细胞都在最少三个高功率场(x200放大率)中手动计数并且平均化。C.暴露于培养基或400nMcRGDY-PEGC-点并且用亚甲基蓝试剂(1ml；1h，37℃)处理的经4％多聚甲醛固定的细胞的吸光度(λ＝650nm；斯派克光谱仪(SpectroMax)M5微板读取器)值，其作为细胞附接的量度。比例尺＝30μm。对于每一组操作重复四份样品。
图46.cRGDY-PEG-C点对细胞周期的影响。A.随添加到经培育总共96小时的G0/G1期同步M21细胞中的粒子浓度(0、100nM、300nM)变化的在细胞周期的G1、S以及G2期中的活细胞百分比(％)。在每一条柱上方的斜体数字表示在S、G1以及G2期中的细胞百分比(经粒子培育、对照)，其是通过流式细胞术测定。B.对于在对照(即，无粒子)条件下和在用100nM和300nM粒子培育之后的细胞显示代表性细胞周期直方图。单向方差分析：*，p＜0.05；**，p＜0.005，相对于S期对照。插图：每一细胞周期期的组平均值(n＝3)±标准差。实验重复三次进行。
图47.使用cRGDY-PEG-C点和表达αvβ3整合素的细胞测定的剂量反应作用和饱和结合动力学。A、B.通过流式细胞术测定的随粒子浓度(A)和培育时间(B)而变的细胞结合/吸收。用增加浓度的粒子(5nM到600nM)并且在3个培育时间范围(0、5h到4h；100nM)内培育(4h，25℃)单层M21和HUVEC细胞，并且通过荧光激活细胞分选(FACS)分析来分析。显示所检测到的总事件的百分比。每一数据点都表示3次重复的平均值±标准差。
图48.在两种细胞类型中与124I-cRGDY-PEG-C点和cRGDY肽的竞争性整合素受体结合。A.在用过量cRGDY肽培育之后使用γ计数获得的124I-cRGDY-PEG-点与M21和HUVEC细胞的特异性结合。用25nM124I-cRODY-PEG-点在存在和缺乏cRGDY肽(85nM、170nM)下培育(4h，25℃)单层M21和HUVEC细胞。结合表示为对照(即，经放射性碘标记的cRGDY-PEG-点)的百分比。B.未经放射性标记的cRGDY-PEG-C点的肿瘤定向结合。在25℃下以两种靶向粒子浓度(25nM、100nM)或粒子对照(PEG-C点)培育M21和HUVEC细胞4h，并且通过流式细胞术分析。
图49.M21和HUVEC细胞随粒子浓度和培育时间变化的活力和增殖。A、B.使用仅分别补充有10％或2％FBS或添加有粒子(25nM到200nM)的培养基在24小时时间段内测定的G0/G1期同步M21(A)和HUVEC(B)细胞的作为活力量度的吸光度(λex＝440nm)。C、D.如A、B中所规定，使用单独的培养基或含有粒子的培养基以93h时间间隔测定的M21(C)和HUVEC(D)中的细胞增殖活性。
图50.随粒子培育时间变化的在M21细胞中的细胞信号传导变化。在8h时间段内的所选磷酸化和总蛋白质中间物的蛋白质印迹。以图形方式说明标准化强度比率(即，磷酸化蛋白质与总蛋白质的差值除以总蛋白质)。
图51.随粒子浓度变化的在M21细胞中的细胞信号传导调节。在一系列粒子浓度(即，0到400nM)内的所选磷酸化和总蛋白质中间物的蛋白质印迹。
图52.在M21细胞中的细胞信号传导抑制研究。A.所选磷酸化和总蛋白质中间物(缺乏血清的培养基、仅有100nM粒子或在添加250nM或500nM抑制剂之后的100nM粒子)的蛋白质印迹。B.A中的磷酸化蛋白质和β-肌动蛋白印迹相对于对照细胞(0.2％FBS)的相对强度。
具体实施方式
本发明提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其允许对如癌症的疾病的精确检测、表征、监测以及治疗。本发明还提供一种用于检测肿瘤细胞的方法。所述方法可以含有以下步骤：(a)以在以下范围内的剂量向患者投予多个荧光的基于二氧化硅的纳米粒子：约0.01纳摩尔/千克体重到约1纳摩尔/千克体重、约0.05纳摩尔/千克体重到约0.9纳摩尔/千克体重、约0.1纳摩尔/千克体重到约0.9纳摩尔/千克体重、约0.2纳摩尔/千克体重到约0.8纳摩尔/千克体重、约0.3纳摩尔/千克体重到约0.7纳摩尔/千克体重、约0.4纳摩尔/千克体重到约0.6纳摩尔/千克体重或约0.2纳摩尔/千克体重到约0.5纳摩尔/千克体重，以及(b)检测所述纳米粒子。在一个实施例中，纳米粒子包含：基于二氧化硅的核心，其具有安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；附接到纳米粒子上并且能够结合肿瘤标记的配体；以及至少一种治疗剂。
纳米粒子具有一系列直径，其包括约0.1nm与约100nm之间、约0.5nm与约50nm之间、约1nm与约25nm之间、约1nm与约15nm之间或约1nm与约8nm之间。纳米粒子具有安置在所述纳米粒子内的荧光化合物，并且具有与游离荧光化合物相比更大的亮度和荧光量子产率。纳米粒子还展现高生物稳定性和生物相容性。为了促进纳米粒子的有效尿排泄，其可以用有机聚合物(如聚(乙二醇)(PEG))涂布。纳米粒子的小尺寸、二氧化硅基底以及有机聚合物涂层使纳米粒子在体内投予时毒性降到最低。为了靶向特异性细胞类型，纳米粒子可以进一步与配体结合，所述配体能够结合到与特异性细胞类型相关联的细胞组分(例如，细胞膜或其它细胞内组分)，如肿瘤标记或信号传导路径中间体。在一个实施例中，可以将治疗剂附接到纳米粒子上。为了准许纳米粒子不仅可被光学成像(如荧光成像)检测，并且可被其它成像技术，如正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断层扫描(CT)以及磁共振成像(MRI)检测，所述纳米粒子还可以与造影剂(如放射性核素)结合。
纳米粒子的特性导致通过肾脏的大量排泄、相对于原生肽配体的增加的效能、增强的吸收以及与正常组织相比在肿瘤中的优先积聚。这连同缺乏体内毒性一起已经导致独特的产物，导致其转化到临床。
本发明的粒子可以用于优先地检测并且定位肿瘤。举例来说，以微剂量疗法投予的纳摩尔粒子示踪剂量在疾病位点积聚并且优先地定位，尽管其不是针对靶向检测最佳化的。
本发明的纳米粒子可以展现独特并且可重现的人类药物动力学特征，其中肾清除占主导(例如，在向受试者投予纳米粒子之后，所述纳米粒子的肾清除率在约24小时内大于约90％ID)而不产生显著RES吸收(例如，小于约10％)。
本发明的纳米粒子是极好的诊断探针，其在使其能够在相对较短时间间隔(例如，数小时、数天等)内“靶向并且清洁”身体的人类中展现最佳的物理化学特性。
携带多个主动被靶向的配体(例如，cRGDY和α-MSH)的本发明粒子与单独的配体亲和力相比展现对细胞标靶的增强的结合亲和力。在一些实施例中，本发明粒子以比单独的配体大约2到约20倍、约3到约15倍、约5到约10倍结合到细胞标靶。
在某些实施例中，双模态、靶向粒子在转移性黑色素瘤的大型动物模型中特异性地评估肿瘤负荷并且可以辨别转移性肿瘤与慢性炎症性疾病。
靶向粒子可以增强受体结合亲和力和亲合力；增加血浆滞留时间、生物可用性以及肿瘤固持力和/或促进经由内在化的细胞内递送。在外科(或医学)肿瘤学配置中利用此类靶向探针可以实现荷癌症组织的高选择性治疗，从而潜在地减小伴随的并发症比率。本发明粒子可以是有利的过于被动经靶向的纳米载体，因为后者通过增强的渗透和固持(EPR)效应穿透并且非特异性地在肿瘤间质内积聚。
用于癌症诊断学的基于粒子的成像系统应该是无毒的，并且选择性检测原发性和转移性疾病的位点同时展现相对快速的肾清除。在这些条件下，鉴于较小的血浆浓度-时间曲线下面积，潜在毒性的可能性将会减小。在一个实施例中，这些肾清除特性可以通过满足10nm或更低的有效肾小球过滤尺寸截止值的基于超小粒子的平台或大分子系统来实现。单剂量急性毒性的缺乏和此类风险的最小化也将是重要的。平台设计应该通过快速全身清除和选择最小化网状内皮系统(RES)中的非特异性吸收的生物动力学概况来最大化安全性，因此减小潜在的不良暴露。
在一个实施例中，本发明粒子在体内是安全并且稳定的。所述粒子展现由肾排泄所定义的明显地独特并且可重现的PK特征。与探针在疾病位点处的优先吸收和定位偶合，这些粒子可以用于癌症诊断学。
纳米粒子可以具有配体与造影剂两者。配体允许纳米粒子通过配体与细胞组分之间的特异性结合而靶向特异性细胞类型。与多模态成像组合，这一靶向具有多种用途。举例来说，纳米粒子可以用于定位转移性疾病，如定位前哨淋巴结(SLN)，以及鉴别肿瘤边缘或神经结构，从而使外科医生能够在直接目测下切除恶性病变并且在外科程序期间排除并发症。配体也可以促进纳米粒子进入到细胞中或屏障传输，例如以用于分析细胞内环境。
纳米粒子可以与配体和具有或不具有放射性标记的治疗剂偶合。放射性标记可以另外充当用于建立治疗诊断学平台的治疗剂。这一偶合允许治疗性粒子通过配体与细胞组分之间的特异性结合递送到特异性细胞类型。治疗剂的这一特异性结合确保在副作用最小的情况下选择性治疗疾病位点。
纳米粒子结构
本发明的荧光纳米粒子包括基于二氧化硅的核心，所述核心包含安置在所述核心内的荧光化合物和在所述核心上的二氧化硅外壳。二氧化硅外壳可以围绕核心的至少一部分。或者，纳米粒子可以仅具有核心而不具有外壳。纳米粒子的核心可以含有反应性荧光化合物与共反应性有机硅烷化合物的反应产物。在另一个实施例中，纳米粒子的核心可以含有反应性荧光化合物与共反应性有机硅烷化合物的反应产物以及二氧化硅。核心的直径可以是约0.05nm到约100nm、约0.1nm到约50nm、约0.5nm到约25nm、约0.8nm到约15nm或约1nm到约8nm。纳米粒子的外壳可以是形成二氧化硅的化合物的反应产物。纳米粒子的外壳可以具有一系列层。举例来说，二氧化硅外壳可以是约1到约20层、约1到约15层、约1到约10层或约1到约5层。外壳的厚度可以在约0.01nm到约90nm、约0.02nm到约40nm、约0.05nm到约20nm、约0.05nm到约10nm或约0.05nm到约5nm范围内。
纳米粒子的二氧化硅外壳可以覆盖纳米粒子的仅一部分或整个粒子。举例来说，二氧化硅外壳可以覆盖纳米粒子的约1％到约100％、约10％到约80％、约20％到约60％或约30％到约50％。二氧化硅外壳可以是实心(即，实质上无孔、介孔(如半多孔))或多孔的。
纳米粒子的合成
本发明荧光纳米粒子可以通过以下步骤合成：使荧光化合物，如反应性荧光染料(反应性部分包括(但不限于)马来酰亚胺、碘乙酰胺、硫代硫酸盐、胺、N-羟基丁二酰亚胺酯、4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基(STP)酯、磺基丁二酰亚胺酯、磺基二氯苯酚酯、磺酰氯、羟基、异硫氰酸酯、羧基)与有机硅烷化合物(如共反应性有机硅烷化合物)共价结合以形成荧光二氧化硅前体，并且使所述荧光二氧化硅前体反应以形成荧光核心；使荧光化合物(如反应性荧光染料)与有机硅烷化合物(如共反应性有机硅烷化合物)共价结合以形成荧光二氧化硅前体，并且使所述荧光二氧化硅前体与形成二氧化硅的化合物(如四烷氧基硅烷)反应以形成荧光核心；以及使所得核心与形成二氧化硅的化合物(如四烷氧基硅烷)反应以在所述核心上形成二氧化硅外壳，来提供荧光纳米粒子。
荧光单分散核-壳纳米粒子的合成是基于两步法。首先，使近红外有机染料分子(例如四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC))与二氧化硅前体共价结合并且缩合以形成富含染料的核心。第二，添加硅胶单体以形成围绕荧光核心材料的更致密的二氧化硅网络，从而提供针对溶剂相互作用的屏蔽，所述溶剂相互作用可能对光稳定性有害。制备途径的变通性允许并入不同的荧光化合物，如荧光有机化合物或染料，其是取决于预期纳米粒子应用。可以并入在富含染料的核心中的荧光化合物可以覆盖整个UV-可见到近红外吸收和发射光谱。美国专利申请第10/306,614号、第10/536,569号以及第11/119,969号。维斯纳(Wiesner)，PEG涂布的核-壳二氧化硅纳米粒子以及制造和使用方法(PEG-coatedCore-shellSilicaNanoparticlesandMethodsofManufactureandUse)，PCT/US2008/74894。
为了合成密实核-壳纳米粒子，将染料前体添加到含有适当量的氨、水以及溶剂的反应容器中并且允许其反应过夜。染料前体是通过摩尔比为1∶50的所关注特定近红外染料与3-氨基丙基三乙氧基硅烷之间的加成反应(在排除水分的情况下)来合成。在富含染料的密实核心的合成完成之后，接着添加正硅酸四乙酯(TEOS)以生长围绕所述核心的二氧化硅外壳。
膨胀核-壳纳米粒子的合成是通过使TEOS与染料前体共缩合并且允许混合物反应过夜来完成。在膨胀核心的合成完成之后，添加额外的TEOS以生长围绕所述核心的二氧化硅外壳。
均质纳米粒子的合成是通过使所有试剂、染料前体以及TEOS共缩合并且允许混合物反应过夜来完成。
荧光化合物
纳米粒子可以并有任何已知荧光化合物，如荧光有机化合物、染料、颜料或其组合。已知广泛多种合适的化学反应性荧光染料，参见例如荧光探针与研究化合物分子探针手册(MOLECULARPROBESHANDBOOKOFFLUORESCENTPROBESANDRESEARCHCHEMICALS)，第6版，R.P.豪格兰(R.P.Haugland)编(1996)。典型荧光团是例如荧光芳香族或杂芳香族化合物，如芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻嗪或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)、花青、羰花青、羰苯乙烯基(carbostyryl)、卟啉、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、薁、苝、吡啶、喹啉、香豆素(包括羟基香豆素和氨基香豆素以及其氟化衍生物)以及类似化合物，参见例如美国专利第5,830,912号、第4,774,339号、第5,187,288号、第5,248,782号、第5,274,113号、第5,433,896号、第4,810,636号以及第4,812,409号。在一个实施例中，近红外荧光(NIRF)染料Cy5被安置在本发明纳米粒子的二氧化硅核心内。近红外发射探针展现减轻的组织衰减和自身荧光。伯恩斯等人“用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子(Fluorescentsilicananoparticleswithefficienturinaryexcretionfornanomedicine)”，纳 米快报(NanoLetters)，2009，9(1)，442-448。
可以用于本发明的非限制性荧光化合物包括：Cy5、Cy5.5(也称为Cy5++)、Cy2、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、藻红蛋白、Cy7、萤光素(FAM)、Cy3、Cy3.5(也称为Cy3++)、德克萨斯红(TexasRed)、光循环剂红(LightCycler-Red)640、光循环剂红705、四甲基罗丹明(TMR)、罗丹明、罗丹明衍生物(ROX)、六氯荧光素(HEX)、罗丹明6G(R6G)、罗丹明衍生物JA133、阿莱克萨(Alexa)荧光染料(如阿莱克萨荧光剂488、阿莱克萨荧光剂546、阿莱克萨荧光剂633、阿莱克萨荧光剂555以及阿莱克萨荧光剂647)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶、AMCA、光谱绿(SpectrumGreen)、光谱橙(SpectrumOrange)、光谱水(SpectrumAqua)、丽丝胺(Lissamine)以及荧光过渡金属络合物(如铕)。可以使用的荧光化合物还包括荧光蛋白，如GFP(绿色荧光蛋白)、增强GFP(EGFP)、蓝色荧光蛋白和衍生物(BFP、EBFP、EBFP2、蓝铜矿(Azurite)、卡拉马(mKalama)1)、蓝绿色荧光蛋白和衍生物(CFP、ECFP、蔚蓝(Cerulean)、CyPet)以及黄色荧光蛋白和衍生物(YFP、柠檬色(Citrine)、金星(Venus)、YPet)。WO2008142571、WO2009056282、W09922026。
纳米粒子的二氧化硅外壳表面可以通过使用已知交联剂以引入表面官能团来改性。交联剂包括(但不限于)二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N，N′-亚甲基-双-丙烯酰胺、烷基醚、糖、肽、DNA片段或其它已知功能上等效的试剂。配体可以通过例如通过使用以下各者的偶合反应与本发明的纳米粒子结合：碳化二亚胺、羧酸酯、酯、醇、尿素、醛、胺、硫氧化物、氮氧化物、卤化物或所属领域中已知的任何其它合适的化合物。美国专利第6,268,222号。
有机聚合物
可以将有机聚合物附接到本发明纳米粒子上，例如，附接到所述纳米粒子的表面上。可以将有机聚合物附接到本发明纳米粒子的二氧化硅外壳上。可以用于本发明的有机聚合物包括PEG、聚乳酸酯、聚乳酸、糖、脂质、聚谷氨酸(PGA)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙酸乙烯酯(PVA)以及其组合。将有机聚合物附接到纳米粒子上可以通过共价键或非共价键，如通过离子键、氢键、疏水键、配位、粘着剂以及物理吸收来完成。在一个实施例中，纳米粒子与PEG共价结合，其防止血清蛋白吸附、促进有效尿排泄并且降低纳米粒子聚集。伯恩斯等人“用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子”，纳米快报，2009，9(1)，442-448。
纳米粒子的表面可以经改性以并有至少一个官能团。附接到纳米粒子上的有机聚合物(例如PEG)可以经改性以并有至少一个官能团。举例来说，所述官能团可以是马来酰亚胺或N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯。并入官能团使得有可能将各种配体、造影剂和/或治疗剂附接到纳米粒子上。
配体
可以将配体附接到本发明纳米粒子上。所述配体能够结合到至少一种细胞组分上。细胞组分可以与特异性细胞类型相关联或在特异性细胞类型(如癌细胞或特定组织和器官所特有的细胞)中具有升高的水平。因此，纳米粒子可以靶向特异性细胞类型和/或为治疗和诊断疾病提供靶向递送。如本文所用，术语“配体”是指可以用于鉴定、检测、靶向、监测或改变身体状态或状况，如疾病状态或状况的分子或实体。举例来说，配体可以用于检测特定受体的存在或不存在、特定受体的表达水平或特定受体的代谢水平。所述配体可以是例如肽、蛋白质、蛋白质片段、肽激素、糖(即，凝集素)、生物聚合物、合成聚合物、抗原、抗体、抗体片段(例如，Fab、纳米抗体)、适体、病毒或病毒组分、受体、半抗原、酶、激素、化合物、病原体、微生物或其组分、毒素、表面改性剂(如改变纳米粒子或分析物(当纳米粒子与其缔合时)的表面特性或组织相容性的表面活性剂)以及其组合。在一个实施例中，配体是抗体，如单克隆或多克隆抗体。在另一个实施例中，配体是受体配体。在再一实施例中，配体是聚-L-赖氨酸(pLysine)。
可以将抗原附接到纳米粒子上。附接有抗原的纳米粒子可以用于接种疫苗。
术语“细胞的组分”或“细胞组分”是指例如受体、抗体、半抗原、酶、激素、生物聚合物、抗原、核酸(DNA或RNA)、微生物、病毒、病原体、毒素、其组合以及类似组分。细胞的组分可以安置在细胞上(例如，跨膜受体)或在细胞内部。在一个实施例中，细胞的组分是肿瘤标记。如本文所用，术语“肿瘤标记”是指在癌细胞但不在正常细胞中表达或过度表达的分子、实体或物质。举例来说，某些受体的过度表达与多种类型的癌症相关联。可以使能够结合到肿瘤标记上的配体与本发明纳米粒子的表面结合，以使得所述纳米粒子可以特异性地靶向肿瘤细胞。
配体可以直接地或通过连接子附接到本发明纳米粒子上。将配体附接到纳米粒子上可以通过共价键或非共价键，如通过离子键、氢键、疏水键、配位、粘着剂以及物理吸收来完成。配体可以涂布到纳米粒子的表面上。配体可以经吸收到纳米粒子表面中。可以将配体附接到荧光纳米粒子的表面上，或当外壳是多孔的或覆盖核心的一部分时可以将其附接到核心上。当配体是通过连接子附接到纳米粒子上时，所述连接子可以是任何合适的分子，如官能化PEG。PEG可以具有多个用于附接到纳米粒子和配体上的官能团。粒子可以具有不同类型的官能化PEG，其携带可以附接到多种配体上的不同的官能团。这可以在目标位点处增强多价效应和/或造影，其允许以改进的体内靶向检测治疗和感测设计和最佳化复杂的多模态平台。
可以将多种不同的配体附接到纳米粒子上。举例来说，可以将三肽Arg-Gly-Asp(RGD)附接到纳米粒子上。或者，可以将环肽cRGD(其可以含有其它氨基酸，例如cRGDY)附接到纳米粒子上。任何含有RGD序列的直链、环状或支链肽都在本发明的范围内。RGD与αvβ3整合素结合，所述αvβ3整合素在血管生成期间在活化内皮细胞表面处并且在各种类型的肿瘤细胞中过度表达。αvβ3整合素的表达水平已经显示与肿瘤的侵袭性密切相关。鲁奥斯拉蒂(Ruoslahti)细胞附着中的新视角：RGD与整合素(Newperspectivesincelladhesion：RGDandintegrins).科学(Science)1987；238：491。格拉森(Gladson)等人玻璃连结蛋白以及αvβ3整合素的成胶质细胞瘤表达.转化神经胶质细胞的附着机制(Glioblastomaexpressionofvitronectinandalphavbeta3integrin.Adhesionmechanismfortransformedglialcells).临床研究杂志(J.Clin.Invest.)1991；88：1924-1932。塞夫特(Seftor)等人，αvβ3整合素在人类黑色素瘤细胞侵入中的作用(Roleofthealphavbeta3integrininhumanmelanomacellinvasion).美国国家科学协会公报(Proc.Natl. Acad.Sci.)1992；89：1557-1561。
合成肽EPPT1可以是附接到纳米粒子上的配体。衍生自单克隆抗体(ASM2)结合位点的EPPT1靶向低糖基化MUC1(uMUC1)。跨膜受体MUC1在正常组织中在很大程度上经糖基化；然而，其在几乎所有的人类上皮细胞腺癌中过度表达并且异常地经低糖基化，并且与肿瘤发病机理有关。穆尔(Moore)等人使用多模态成像探针体内靶向低糖基化MUC-1肿瘤抗原(InvivotargetingofunderglycosylatedMUC-1tumorantigenusingamultimodalimagingprobe).癌症研究(CancerRes.)2004；64：1821-7。帕特尔(Patel)MUC1在侵袭性甲状腺癌瘤的肿瘤维持中起作用(MUC1playsaroleintumormaintenanceinaggressivethyroidcarcinomas).外科学(Surgery)，2005；138：994-1001。包括针对uMUC1的单克隆抗体的特异性抗体可以替代性地与纳米粒子结合以便靶向uMUC1。
在一个实施例中，α-促黑素刺激激素(α-MSH)的肽类似物是附接到纳米粒子上的配体。α-MSH的肽类似物能够结合到黑皮质素-1受体(MC1R)上，所述受体为在黑色素瘤细胞中过度表达的G蛋白偶合受体家族。卢瓦尔(Loir)等人细胞分子生物学(CellMol. Biol.)(大诺瓦西(Noisy-le-grand))1999，45：1083-1092。
在另一个实施例中，14-氨基酸生长抑素的肽类似物奥曲酯是附接到纳米粒子上的配体。具有与生长抑素相比较长的半衰期的奥曲肽能够结合到生长抑素受体(SSTR)上。G蛋白偶合受体家族的成员SSTR在若干人类肿瘤的表面上过度表达。鲁比(Reubi)等人生长抑素受体在正常和肿瘤组织中的分布(DistributionofSomatostatinReceptorsinNormalandTumor-Tissue).临床代谢实验(Metab.Clin.Exp.)1990；39：78-81。鲁比等人在人类肿瘤和瘤周血管中的生长抑素受体和其亚型(Somatostatinreceptorsandtheirsubtypesinhumantumorsandinperitumoralvessels).临床代谢实验1996；45：39-41。其它生长抑素类似物可以替代性地与纳米粒子结合以靶向SSTR，如Tyr3-奥曲肽(Y3-OC)、奥曲酯(TATE)、Tyr3-奥曲酯(Y3-TATE)以及111In-DTPA-OC。这些生长抑素类似物可以用于癌症的PET诊断成像与靶向放射线疗法两者。德容(deJong)等人经放射性标记的[DTPA0]奥曲肽和[DOTA0，Tyr3]奥曲肽：用于生长抑素受体靶向闪烁扫描术和放射性核素疗法的肽的内化(Internalizationofradiolabelled[DTPA0]octreotideand[DOTA0，Tyr3]octreotide：peptidesforsomatostatinreceptortargetedscintigraphyandradionuclidetherapy).核医学快 讯(Nucl.Med.Commun.)1998；19：283-8。德容等人比较经111In标记的生长抑素类似物用于肿瘤闪烁扫描术和放射性核素疗法(Comparisonof111In-LabeledSomatostatinAnaloguesforTumorScintigraphyandRadionuclideTherapy).癌症研究1998；58：437-41。路易斯(Lewis)等人在体外以及在荷瘤大鼠模型中比较四个经64Cu标记的生长抑素类似物：评估用于PET成像和靶向放射线疗法的新型衍生物(Comparisonoffour64Cu-labeledsomatostatinanalogsinvitroandinatumor-bearingratmodel：evaluationofnewderivativesforPETimagingandtargetedradiotherapy).药物化学杂志(JMedChem)1999；42：1341-7。克莱宁(Krenning)等人在人类中用铟-111-DTPA-D-Phe-1-奥曲肽进行的生长抑素受体闪烁扫描术：用碘-123-Tyr-3-奥曲肽进行的代谢、放射量测定以及比较(SomatostatinReceptorScintigraphywithIndium-111-DTPA-D-Phe-1-OctreotideinMan：Metabolism，DosimetryandComparisonwithIodine-123-Tyr-3-Octreotide).核医学杂志(JNuclMed.)1992；33：652-8。
各种配体可以用于定位前哨淋巴结(SLN)。SLN定位可以用于诊断、分期以及治疗癌症。J591是一种抗前列腺特异性膜抗原(即抗PSMA)的单克隆抗体。J591先前已经用于检测和分期前列腺癌。田川(Tagawa)等人，用于前列腺癌的基于抗前列腺特异性膜抗原的放射免疫疗法(Anti-prostate-specificmembraneantigen-basedradioimmuotherapyforprostatecancer)，癌症(Cancer)，2010，116(增刊4)：1075-83。班德尔(Bander)等人，用经放射性标记的单克隆抗体J591向前列腺特异性膜抗原的细胞外域靶向转移性前列腺癌(TargetingMetastaticProstateCancerwithRadiolabeledMonoclonalAntibodyJ591totheExtracellularDomainofProstateSpecificMembraneAntigen)，泌尿学杂志(TheJournal.of Urology)170(5)，1717-1721(2003)。韦尼克(Wernicke)等人，(2011)作为治疗多形性成胶质细胞瘤的潜在新颖血管标靶的前列腺特异性膜抗原(Prostate-SpecificMembraneAntigenasaPotentialNovelVascularTargetforTreatmentofGlioblastomaMultiforme).病理学和 实验室医学文献(ArchPatholLabMed.)2011；135：1486-1489。J591的F(ab′)2片段可以用作附接到本发明纳米粒子上的配体。纳米粒子还可以经放射性标记以产生双模态探针。在一个实施例中，携带J591的F(ab′)2片段(例如，HuJ591-F(ab′)2片段或人类化J591-F(ab′)2片段)的纳米粒子用于诊断前列腺癌或子宫内膜癌(例如，子宫内膜样腺癌)。在另一个实施例中，携带J591的F(ab′)2片段的纳米粒子可以用于靶向脑肿瘤新生血管以用于治疗、疾病进展监测。已经发现脑肿瘤新生血管过度表达PSMA，如由经切除的高级神经胶质瘤样本的先前免疫组织化学评估所示。
含有序列HWGF的环肽是MMP-2和MMP-9但不是若干其它MMP家族成员的有效并且选择性的抑制剂。肽CTTHWGFTLC抑制人类内皮细胞和肿瘤细胞的迁移。此外，其防止动物模型中的肿瘤生长和侵入并且改进携带人类肿瘤的小鼠的存活率。展示CTTHWGFTLC的噬菌体特异性地在体内靶向血管生成血管。这一肽和其延伸物GRENYGHCTTHWGFTLC或GRENYGHCTTHWGFTLS可以用作附接到本发明纳米粒子上的配体。肽也可以经放射性标记，例如经放射性碘标记。克维恩(Koivunen)等人，用选择性明胶酶抑制剂进行的肿瘤靶向(Tumortargetingwithaselectivegelatinaseinhibitor)，自然生物技术(NatureBiotechnology)17，768-774(1999)。佩纳特麦地那(PenateMedina)等人，利用MMP-2-结合配体和MMP-9-结合配体进行的在药物递送中的脂质体肿瘤靶向(LiposomaltumortargetingindrugdeliveryutilizingMMP-2-andMMP-9-bindingligands)，药物递送杂志(J.DrugDelivery.)第2011卷(2011)，文章编号160515.抗癌研 究(AnticancerResearch)21：4101-4106(2005)。在一个实施例中，附接有经124I标记的基质金属蛋白酶肽抑制剂(MMPI)的纳米粒子用于SLN定位以分期子宫内膜样癌。
附接到纳米粒子上的配体的数量可以在约1到约30、约1到约20、约2到约15、约3到约10、约1到约10或约1到约6范围内。附接到纳米粒子上的配体的较小数量帮助维持本发明纳米粒子的流体动力学直径，所述直径满足肾清除率截止大小范围。希尔德布兰德(Hilderbrand)等人，近红外荧光：在体内分子成像中应用(Near-infraredfluorescence：applicationtoinvivomolecularimaging)，化学生物学新见(Curr.Opin.Chem. Biol.)，14：71-9，2010。所测量的配体的数量可以是附接到一种以上纳米粒子上的配体的平均数。或者，可以测量一个纳米粒子以确定所附接的配体的数量。附接到纳米粒子上的配体的数量可以通过任何合适的方法测量，所述方法可以涉及或可以不涉及配体的特性。举例来说，与粒子结合的cRGD肽的数量可以使用对cRGD肽的绝对粒子浓度和试剂的起始浓度的基于FCS的测量来评估。每一纳米粒子的RGD肽平均数和RGD与官能化PEG基团的偶合效率可以在碱性条件和缩二脲(Biuret)分光光度法下以色度方式评估。附接到纳米粒子上的配体的数量还可以通过其它合适的方法来测量。
造影剂
可以将造影剂附接到本发明纳米粒子上以用于医学或生物成像。如本文所用，术语“造影剂”是指在医学或生物成像中用于增强结构或流体的可视性的物质、分子或化合物。术语“造影剂”也是指产生造影的分子。本发明所涵盖的成像技术包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、光学生物发光成像、光学荧光成像以及其组合。本发明所涵盖的造影剂可以是所属领域中已知用于PET、SPECT、CT、MRI以及光学成像的任何分子、物质或化合物。造影剂可以是放射性核素、无线电金属、正电子发射体、β发射体、γ发射体、α发射体、顺磁金属离子以及超顺磁金属离子。造影剂包括(但不限于)硫酸碘、硫酸氟、硫酸铜、硫酸锆、硫酸镥、硫酸砹、硫酸钇、硫酸镓、硫酸铟、硫酸锝、硫酸钆、硫酸镝、硫酸铁、硫酸锰、硫酸钡以及硫酸钡。可以用作附接到本发明的纳米粒子上的造影剂的放射性核素包括(但不限于)89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I以及177Lu。
造影剂可以直接与纳米粒子结合。或者，造影剂可以通过附接到连接子或螯合物上来间接地与纳米粒子结合。螯合物可以经调适以结合放射性核素。可以附接到本发明纳米粒子上的螯合物可以包括(但不限于)1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁敏(DFO)以及三亚乙基四胺(TETA)。
用于成像、检测、记录或测量本发明纳米粒子的合适的装置还可以包括例如流式细胞仪、激光扫描细胞仪、荧光微板读取器、荧光显微镜、共焦显微镜、亮场显微镜、高内容扫描系统以及类似装置。可以同时或连续使用一种以上成像技术来检测本发明的纳米粒子。在一个实施例中，光学成像用作敏感、高吞吐量的筛选工具以在相同受试者中获得多个时间点，从而准许对肿瘤标记水平的半定量评估。这补偿了用PET所获得的相对降低的时间分辨率，尽管需要PET以实现用于获取体数据的足够深度穿透，以及检测、定量并且监测受体和/或其它细胞标记水平的变化(作为评估疾病进展或改进的手段)，以及将患者分层到合适的治疗方案。
治疗剂
可以将治疗剂附接到荧光纳米粒子上例如用于疾病的靶向治疗。可以以高度特异性或局部化的方式将治疗剂递送到患病位点，治疗剂在疾病位点中释放。或者，治疗剂可能不被释放。与配体结合的荧光纳米粒子可以用于治疗剂向多个系统中的所需位置的靶向递送，如在细胞或细胞组分上或在细胞或细胞组分内、在有机体(如人类)的身体内或跨越血脑屏障。
治疗剂可以直接或间接地附接到纳米粒子上。治疗剂可以经吸收到二氧化硅外壳的间隙或孔隙中，或经涂布到荧光纳米粒子的二氧化硅外壳上。在二氧化硅外壳不覆盖整个表面的其它实施例中，治疗剂可以与荧光核心缔合，如通过物理吸收或通过结合相互作用。治疗剂可以与附接到荧光纳米粒子上的配体缔合。治疗剂还可以与有机聚合物或造影剂缔合。举例来说，治疗剂可以通过PEG附接到纳米粒子上。PEG可以具有多个用于附接到纳米粒子和治疗剂上的官能团。粒子可以具有不同类型的官能化PEG，其携带可以附接到多种治疗剂上的不同的官能团。治疗剂可以共价或非共价地附接到纳米粒子上。
如本文所用，术语“治疗剂”是指可以用于在人类或另一种动物中诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病的物质。此类治疗剂包括在官方美国药典(UnitedStatesPharmacopeia)、官方美国顺势疗法药典(HomeopathicPharmacopeiaoftheUnitedStates)、官方国家处方集(NationalFormulary)或其任何增刊中所认可的物质。
可以并入本发明的荧光纳米粒子或连接荧光纳米粒子的治疗剂包括核苷、核苷类似物、小干扰RNA(siRNA)、微RNA、寡肽、多肽、抗体、COX-2抑制剂、凋亡启动子、尿道药剂、阴道药剂、血管扩张剂神经变性药剂(例如，帕金森氏病(Parkinson′sdisease))、肥胖症药剂、眼用药剂、骨质疏松症药剂、副交感神经阻断药、副拟交感神经药、抗麻醉药、前列腺素、精神治疗药剂、呼吸道药剂、镇静剂、安眠药、皮肤和粘膜药剂、抗细菌药、抗真菌药、抗肿瘤药、心脏保护药剂、心血管药剂、抗血栓形成药、中枢神经系统兴奋剂、胆碱酯酶抑制剂、避孕药、多巴胺受体激动剂、勃起功能障碍药剂、生育药、胃肠道药剂、痛风药剂、激素、免疫调节剂、经适当功能化的止痛药或全身或局部麻醉剂、抗惊厥剂、抗糖尿病药剂、抗纤维化药剂、抗感染药物、动晕症药剂、肌肉松弛剂、免疫抑制药剂、偏头痛药剂、非类固醇抗炎性药物(NSAID)、戒烟药剂或抗交感神经药(参见医师案头参考(Physicians’DeskReference)，第55版，2001，新泽西州蒙特威尔市医疗经济公司(MedicalEconomicsCompany，Inc，Montvale，N.J.)，第201到202页)。
可以附接到本发明纳米粒子上的治疗剂包括(但不限于)DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应力诱发剂、铂化合物、抗代谢物、藤生物碱(vincalkaloid)、紫杉烷、埃博霉素(epothilone)、酶抑制剂、受体拮抗剂、治疗性抗体、酪氨酸激酶抑制剂、硼辐射敏化剂(即万珂(velcade))以及化学治疗组合疗法。
DNA烷基化剂的非限制性实例是氮芥，如二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)(异环磷酰胺(Ifosfamide)、曲磷胺(Trofosfamide))、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)(美法仑(Melphalan)、泼尼氮芥(Prednimustine))、苯达莫司汀(Bendamustine)、乌拉莫司汀(Uramustine)以及雌氮芥(Estramustine)；亚硝基脲，如卡莫司汀(Carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(Lomustine)(司莫司汀(Semustine))、福莫司汀(Fotemustine)、尼莫司汀(Nimustine)、雷莫司汀(Ranimustine)以及链脲霉素；烷基磺酸盐，如白消安(Busulfan)(甘露舒凡(Mannosulfan)、曲奥舒凡(Treosulfan))；氮丙啶，如卡波醌(Carboquone)、噻替派(ThioTEPA)、三亚胺醌(Triaziquone)、曲他胺(Triethylenemelamine)；肼(甲基苄肼(Procarbazine))；三氮烯，如达卡巴嗪(Dacarbazine)和替莫唑胺(Temozolomide)；六甲蜜胺以及二溴甘露醇。
拓扑异构酶I抑制剂的非限制性实例包括喜树碱衍生物，包括CPT-11(伊立替康(irinotecan))、SN-38、APC、NPC、喜树碱、拓朴替康(topotecan)、甲磺酸依沙替康(exatecanmesylate)、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、勒托替康(lurtotecan)、鲁比替康(rubitecan)、昔拉替康(silatecan)、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、艾克他替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f以及MAG-CPT，如在波米耶Y.(PommierY.)(2006)自 然癌症综述(Nat.Rev.Cancer)6(10)：789-802和美国专利公开案第200510250854号中所描述；原小蘖碱生物碱和其衍生物，包括小檗红碱和甲氧檗因，如李等人(2000)生物化 学(Biochemistry)39(24)：7107-7116和加托(Gatto)等人(1996)癌症研究15(12)：2795-2800中所描述。邻二氮杂菲(Phenanthroline)衍生物，包括苯并[i]啡啶、两面针碱以及花椒宁碱，如马克(Makhey)等人(2003)生物有机医学化学(Bioorg.Med.Chem.)11(8)：1809-1820中所描述；三苯并咪唑和其衍生物，如许(Xu)(1998)生物化学37(10)：3558-3566中所描述；以及蒽环霉素(Anthracycline)衍生物，包括小红莓(Doxorubicin)、道诺霉素(Daunorubicin)以及米托蒽醌(Mitoxantrone)，如弗格森(Foglesong)等人(1992)癌症化学疗法药理学(CancerChemother.Pharmacol.)30(2)：123-]25；克罗(Crow)等人(1994)药物化学杂志37(19)：31913194；以及克雷斯皮(Crespi)等人(1986)生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)136(2)：521-8中所描述。拓扑异构酶II抑制剂包括(但不限于)依托泊苷(Etoposide)和替尼泊苷(Teniposide)。双重拓扑异构酶I和II抑制剂包括(但不限于)散特平(Saintopin)和其它四并苯醌(Naphthecenediones)、DACA和其它吖啶-4-甲酰胺、茚托利辛(Intoplicine)和其它苯并吡啶吲哚、TAS-I03以及其它7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮、吡唑啉吖啶、XR11576和其它苯并吩嗪、XR5944和其它二聚化合物、7-氧代-7H-二苯并[f，ij]异喹啉和7-氧代-7H-苯并[e]呸啶(Perimidine)以及蒽基-氨基酸结合物，如丹尼(Denny)和巴古雷(Baguley)(2003)当前药物化学主题(Curr.Top.Med.Chem.)3(3)：339-353中所描述。一些药剂抑制拓扑异构酶II并且具有DNA嵌入活性，如(但不限于)蒽环霉素(阿克拉霉素(Aclarubicin)、道诺霉素、小红莓、表阿霉素(Epirubicin)、艾达霉素(Idarubicin)、氨柔比星(Amrubicin)、吡柔比星(Pirarubicin)、戊柔比星(Valrubicin)、左柔比星(Zorubicin))和蒽二酮(米托蒽醌和匹杉琼(Pixantrone))。
内质网应力诱发剂的实例包括(但不限于)二甲基-塞来昔布(dimethyl-celecoxib，DMC)、奈非那韦(nelfinavir)、塞内昔布以及硼辐射敏化剂(即万珂(硼替佐米(Bortezomib))。
基于铂的化合物的非限制性实例包括卡铂(Carboplatin)、顺铂(Cisplatin)、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、四硝酸特瑞铂(Triplatintetranitrate)、赛特铂(Satraplatin)、阿罗铂(Aroplatin)、洛铂(Lobaplatin)以及JM-216。(参见麦克基(McKeage)等人(1997)临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)201：1232-1237，和一般来说，在肿瘤基础与临床(SeriesBasicandClinicalOncology)，安杰奥利(Angioli)等人编，2004中的用于妇科肿瘤的化学疗法，当前疗法和新颖途径(CHEMOTHERAPYFORGYNECOLOGICALNEOPLASM，CURRENTTHERAPYANDNOVELAPPROACHES))。
抗代谢物试剂的非限制性实例包括：基于叶酸的试剂，即二氢叶酸还原酶抑制剂，如氨基喋呤(Aminopterin)、甲氨蝶呤(Methotrexate)以及培美曲塞(Pemetrexed)；胸苷酸合成酶抑制剂，如雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞；基于嘌呤的试剂，即腺苷脱氨酶抑制剂，如喷司他汀(Pentostatin)、硫嘌呤(如硫鸟嘌呤(Thioguanine)和巯基嘌呤(Mercaptopurine))；卤化/核糖核苷酸还原酶抑制剂，如克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟达拉滨(Fludarabine)或鸟嘌呤/鸟苷：硫嘌呤，如硫鸟嘌呤；或基于嘧啶的试剂，即胞嘧啶/胞嘧啶核苷：去甲基化剂，如阿扎胞苷(Azacitidine)和地西他滨(Decitabine)，DNA聚合酶抑制剂，如阿糖胞苷(Cytarabine)，核糖核苷酸还原酶抑制剂，如吉西他滨(Gemcitabine)，或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合成酶抑制剂，如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU的等效物包括其前药、类似物以及衍生物，如5′-脱氧-5-氟尿苷(去氧氟尿苷(doxifluroidine))、1-四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶(替加氟(ftorafur))、卡培他滨(Capecitabine)(希罗达(Xeloda))、S-I(MBMS-247616，由喃氟啶(tegafur)和两种调节剂5-氯-2，4-二羟基吡啶和氧嗪酸钾(potassiumoxonate)组成)、雷替曲噻(ralititrexed，tomudex)、诺拉曲塞(nolatrexed)(Thymitaq，AG337)、LY231514以及ZD9331，如例如帕帕麦克(Papamicheal)(1999)肿瘤学家(TheOncologist)4：478-487中所描述的。
藤生物碱的实例包括(但不限于)长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春氟宁(Vinflunine)、长春地辛(Vindesine)以及长春瑞宾(Vinorelbine)。
紫杉烷的实例包括(但不限于)多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(Larotaxel)、奥他赛(Ortataxel)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)以及替司他赛(Tesetaxel)。埃博霉素的一个实例是伊沙匹隆(ixabepilone)。
酶抑制剂的实例包括(但不限于)法尼基转移酶(farnesyltransferase)抑制剂(替吡法尼(Tipifamib))；CDK抑制剂(阿韦昔第(Alvocidib)、昔里克里博(Seliciclib))；蛋白酶体抑制剂(硼替佐米(Bortezomib))；磷酸二酯酶抑制剂(阿那格雷(Anagrelide)、咯利普兰(rolipram))；IMP脱氢酶抑制剂(噻唑呋林(Tiazofurine))；以及脂氧合酶抑制剂(马索罗酚(Masoprocol))。受体拮抗剂的实例包括(但不限于)ERA(阿曲森坦(Atrasentan))；维甲酸X受体(蓓萨罗丁(Bexarotene))和性类固醇(睾内酯(Testolactone))。
治疗性抗体的实例包括(但不限于)抗HER1/EGFR抗体(西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab))；抗HER2/neu(erbB2)受体抗体(曲妥珠单抗(Trastuzumab))；抗EpCAM抗体(卡妥索单抗(Catumaxomab)、依决洛单抗(Edrecolomab))；抗VEGF-A抗体(贝伐单抗(Bevacizumab))；抗CD20抗体(利妥昔单抗(Rituximab)、托西莫单抗(Tositumomab)、替伊莫单抗(Ibritumomab)；抗CD52抗体(阿仑单抗(Alemtuzumab))；以及抗CD33抗体(吉妥单抗(Gemtuzumab))。美国专利第5,776,427号和第7,601,355号。
酪氨酸激酶抑制剂的实例包括(但不限于)对以下的抑制剂：ErbB：HER1/EGFR(埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、来那替尼(Neratinib))；HER2/neu(拉帕替尼、来那替尼)；III类RTK：C-kit(阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib))、FLT3(来他替尼(Lestaurtinib))、PDGFR(阿西替尼、舒尼替尼、索拉非尼)以及VEGFR(凡德他尼(Vandetanib)、司马沙尼(Semaxanib)、西地尼布(Cediranib)、阿西替尼、索拉非尼)；bcr-abl(伊马替尼(Imatinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、达沙替尼(Dasatinib))；Src(博舒替尼(Bosutinib))和Janus激酶2(来他替尼)。
可以附接到本发明纳米粒子上的化学治疗剂还可以包括安吖啶(amsacrine)、曲贝替定(Trabectedin)、维甲类(阿利维甲酸(Alitretinoin)、维甲酸(Tretinoin))、三氧化二砷、天冬酰胺消耗剂(asparaginedepleter)、天门冬酰胺酶/培门冬酶(Pegaspargase)、塞来昔布、脱羰秋水仙碱(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依托格鲁(Etoglucid)、氯尼达明(Lonidamine)、硫蒽酮(Lucanthone)、米托胍腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、奥利默森(Oblimersen)、坦罗莫司(Temsirolimus)以及伏立诺他(Vorinostat)。
可以与本发明的荧光纳米粒子连接、接合或缔合的特定治疗剂的实例为氟氧头孢(flomoxef)；福提霉素(fortimicin)；庆大霉素(gentamicin)；葡氨苯砜苯丙砜(glucosulfonesolasulfone)；短杆菌肽S(gramicidinS))；短杆菌肽(gramicidin)；格帕沙星(grepafloxacin)；胍甲四环素(guamecycline)；海他西林(hetacillin)；异帕米星(isepamicin))；交沙霉素(josamycin)；卡那霉素(kanamycin)；氟氧头孢；福提霉素；庆大霉素；葡氨苯砜苯丙砜；短杆菌肽S；短杆菌肽；格帕沙星；胍甲四环素；海他西林；异帕米星；交沙霉素；卡那霉素；杆菌肽(bacitracin)；班贝霉素(bambermycin)；比阿培南(biapenem)；溴莫普林(brodimoprim)；丁胺菌素(butirosin)；卷曲霉素(capreomycin)；羧苄青霉素(carbenicillin)；碳霉素(carbomycin)；卡芦莫南(carumonam)；头孢羟氨苄(cefadroxil)；头孢孟多(cefamandole)；头孢曲嗪(cefatrizine)；头孢拉宗(cefbuperazone)；头孢克定(cefclidin)；头孢地尼(cefdinir)；头孢妥仑(cefditoren)；头孢吡肟(cefepime)；头孢他美(cefetamet)；头孢克肟(cefixime)；头孢甲肟(cefinenoxime)；头孢米诺(cefininox)；克拉屈滨；阿帕西林(apalcillin)；阿哌环素(apicycline)；安普霉素(apramycin)；阿贝卡星(arbekacin)；阿扑西林(aspoxicillin)；叠氮氯霉素(azidamfenicol)；氨曲南(aztreonam)；头孢地嗪(cefodizime)；头孢尼西(cefonicid)；头孢哌酮(cefoperazone)；头孢雷特(ceforamide)；头孢噻肟(cefotaxime)；头孢替坦(cefotetan)；头孢替安(cefotiam)；头孢唑兰(cefozopran)；头孢咪唑(cefpimizole)；头孢匹胺(cefpiramide)；头孢匹罗(cefpirome)；头孢丙烯(cefprozil)；头孢沙定(cefroxadine)；头孢特仑(cefteram)；头孢布烯(ceftibuten)；头孢唑喃(cefuzonam)；头孢氨苄(cephalexin)；头孢来星(cephaloglycin)；头孢菌素C(cephalosporinC)；头孢拉定(cephradine)；氯霉素(chloramphenicol)；金霉素(chlortetracycline)；克林沙星(clinafloxacin)；克林霉素(clindamycin)；羟甲金霉素(clomocycline)；多粘菌素(colistin)；环青霉素(cyclacillin)；氨苯砜(dapsone)；去甲金霉素(demeclocycline)；地百里砜(diathymosulfone)；地贝卡星(dibekacin)；双氢链霉素(dihydrostreptomycin)；6-巯基嘌呤；硫鸟嘌呤；卡培他滨；多西紫杉醇(docetaxel)；依托泊苷；吉西他滨；拓扑替康；长春瑞滨；长春新碱；长春碱；替尼泊苷；美法仑；甲氨蝶呤；2-对硫烷基苯胺基乙醇(2-p-sulfanilyanilinoethanol)；4，4′-氨苯亚砜(4，4′-sulfinyldianiline)；4-对氨苯磺酰氨基水杨酸(4-sulfanilamidosalicylicacid)；布托啡诺(butorphanol)；纳布啡(nalbuphine)；链脲霉素；小红莓；道诺霉素；普卡霉素；艾达霉素；丝裂霉素C(mitomycinC)；喷司他汀；米托蒽醌；阿糖胞苷；磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)；布托啡诺；纳布啡；链脲霉素；小红莓；道诺霉素；普卡霉素；艾达霉素；丝裂霉素C；喷司他汀；米托蒽醌；阿糖胞苷；磷酸氟达拉滨；醋地砜(acediasulfone)；乙酰砜(acetosulfone)；阿米卡星(amikacin)；两性霉素B(amphotericinB)；氨苄青霉素(ampicillin)；阿托伐他汀(atorvastatin)；依那普利(enalapril)；雷尼替丁(ranitidine)；环丙沙星(ciprofloxacin)；普伐他汀(pravastatin)；克拉霉素(clarithromycin)；环孢素(cyclosporin)；法莫替丁(famotidine)；亮丙瑞林(leuprolide)；阿昔洛韦(acyclovir)；太平洋紫杉醇；阿奇霉素(azithromycin)；拉米夫定(lamivudine)；布地奈德(budesonide)；沙丁胺醇(albuterol)；茚地那韦(indinavir)；二甲双胍(metformin)；阿仑膦酸盐(alendronate)；尼扎替丁(nizatidine)；齐多夫定(zidovudine)；卡铂(carboplatin)；美托洛尔(metoprolol)；阿莫西林；双氯芬酸(diclofenac)；赖诺普利(lisinopril)；头孢曲松(ceftriaxone)；卡托普利(captopril)；沙美特罗(salmeterol)；昔萘酸酯(xinafoate)；亚胺培南(imipenem)；西司他汀(cilastatin)；贝那普利(benazepril)；头孢克洛(cefaclor)；头孢他啶(ceftazidime)；吗啡(morphine)；多巴胺(dopamine)；卡马风(bialamicol)；氟伐他汀(fluvastatin)；非那米丁(phenamidine)；鬼臼酸2-乙肼(podophyllinicacid2-ethylhydrazine)；吖啶黄(acriflavine)；氯阿唑丁(chloroazodin)；砷凡纳明(arsphenamine)；双脒苯脲(amicarbilide)；氨喹脲(aminoquinuride)；喹那普利(quinapril)；羟吗啡酮(oxymorphone)；丁丙诺啡(buprenorphine)；氟尿苷(floxuridine)；地红霉素(dirithromycin)；强力霉素(doxycycline)；依诺沙星(enoxacin)；恩维霉素(enviomycin)；依匹西林(epicillin)；红霉素(erythromycin)；白霉素(leucomycin)；林可霉素(lincomycin)；洛美沙星(lomefloxacin)；鲁斯霉素(lucensomycin)；赖甲环素(lymecycline)；甲氯环素(meclocycline)；美罗培南(meropenem)；美他环素(methacycline)；小诺霉素(micronomicin)；麦迪霉素(midecamycin)；米诺环素(minocycline)；拉氧头孢(moxalactam)；莫匹罗星(mupirocin)；那氟沙星(nadifloxacin)；纳他霉素(natamycin)；新霉素(neomycin)；奈替米星(netilmicin)；诺氟沙星(norfloxacin)；竹桃霉素(oleandomycin)；土霉素(oxytetracycline)；对磺胺酰基苄胺(p-sulfanilylbenzylamine)；帕尼培南(panipenem)；巴龙霉素(paromomycin)；帕珠沙星(pazufloxacin)；青霉素N(penicillinN)；匹哌环素(pipacycline)；吡哌酸(pipemidicacid)；多粘菌素(polymyxin)；伯霉素(primycin)；喹那西林(quinacillin)；核糖霉素(ribostamycin)；利福酰胺(rifamide)；利福平(rifampin)；利福霉素SV(rifamycinSV)；利福喷丁(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；瑞斯托霉素(ristocetin)；利替培南(ritipenem)；罗他霉素(rokitamycin)；吡咯烷甲基四环素(rolitetracycline)；罗沙米星(rosaramycin)；罗红霉素(roxithromycin)；柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidine)；山环素(sancycline)；西索米星(sisomicin)；司帕沙星(sparfloxacin)；大观霉素(spectinomycin)；螺旋霉素(spiramycin)；链霉素(streptomycin)；琥珀氨苯砜(succisulfone)；磺胺柯定(sulfachrysoidine)；磺胺洛西酸(sulfaloxicacid)；磺胺柯衣定(sulfamidochrysoidine)；对氨基苯磺酸(sulfanilicacid)；索发克松(sulfoxone)；替考拉宁(teicoplanin)；替马沙星(temafloxacin)；替莫西林(temocillin)；四氧普林(tetroxoprim)；甲砜霉素(thiamphenicol)；噻唑砜(thiazolsulfone)；硫链丝菌素(thiostrepton)；替卡西林(ticarcillin)；替吉莫南(tigemonam)；妥布霉素(tobramycin)；妥舒沙星(tosufloxacin)；甲氧苄啶(trimethoprim)；妥布霉素(trospectomycin)；曲伐沙星(trovafloxacin)；结核放线菌素(tuberactinomycin)；万古霉素(vancomycin)；重氮丝氨酸(azaserine)；克念菌素(candicidin)；氯苯甘醚(chlorphenesin)；制皮菌素(dermostatin)；非律平(filipin)；制霉色基素(fungichromin)；甲帕霉素(mepartricin)；制霉菌素(nystatin)；寡霉素(oligomycin)；培里霉素A(perimycinA)；杀结核菌素(tubercidin)；6-氮杂尿苷；6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸；阿克拉霉素(aclacinomycin)；安西他宾(ancitabine)；安曲霉素(anthramycin)；阿扎胞苷(azacitadine)；重氮丝氨酸(azaserine)；博莱霉素(bleomycin)；双香豆素乙酯(ethylbiscoumacetate)；亚乙基双香豆素(ethylidenedicoumarol)；伊洛前列素(iloprost)；拉米非班(lamifiban)；他前列烯(taprostene)；噻氯香豆素(tioclomarol)；替罗非班(tirofiban)；氨普立糖(amiprilose)；布西拉明(bucillamine)；胍立莫司(gusperimus)；龙胆酸(gentisicacid)；葡美辛(glucamethacin)；乙二醇水杨酸(glycolsalicylate)；甲氯芬那酸(meclofenamicacid)；甲芬那酸(mefenamicacid)；美沙拉嗪(mesalamine)；尼氟灭酸(niflumicacid)；奥沙拉嗪(olsalazine)；奥沙西罗(oxaceprol)；S-腺苷基甲硫氨酸(S-enosylmethionine)；水杨酸(salicylicacid)；双水杨酸酯(salsalate)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；托芬那酸(tolfenamicacid)；洋红霉素(carubicin)；嗜癌菌素A(carzinophillinA)；氯脲霉素(chlorozotocin)；色霉素(chromomycin)；二甲叶酸(denopterin)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；依达曲沙(edatrexate)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；甲基羟基玫瑰树碱(elliptinium)；依诺他滨(enocitabine)；表阿霉素(epirubicin)；甘露醇芥(mannomustine)；美诺立尔(menogaril)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；莫哌达醇(mopidamol)；麦考酚酸(mycophenolicacid)；诺拉霉素(nogalamycin)；橄榄霉素(olivomycin)；培洛霉素(peplomycin)；吡柔比星；吡曲克辛(piritrexim)；泼尼氮芥(prednimustine)；甲基苄肼；蝶罗呤(pteropterin)；嘌呤霉素(puromycin)；雷莫司汀(ranimustine)；链黑菌素(streptonigrin)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；霉酚酸(mycophenolicacid)；丙考达唑(procodazole)；罗莫肽(romurtide)；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))；他克莫司(tacrolimus)；丁胺卡因(butethamine)；苯醇胺(fenalcomine)；羟丁卡因(hydroxytetracaine)；纳依卡因(naepaine)；奥索卡因(orthocaine)；匹多卡因(piridocaine)；水杨醇(salicylalcohol)；3-氨基-4-羟丁酸；醋氯芬酸(aceclofenac)；阿明洛芬(alminoprofen)；氨芬酸(amfenac)；溴芬酸(bromfenac)；溴柳氯苯胺(bromosaligenin)；布马地宗(bumadizon)；卡洛芬(carprofen)；双氯芬酸(diclofenac)；二氟尼柳(diflunisal)；地他唑(ditazol)；恩芬那酸(enfenamicacid)；依托度酸(etodolac)；依托芬那酯(etofenamate)；芬度柳(fendosal)；非普地醇(fepradinol)；氟灭酸(flufenamicacid)；(N-[[5-[[(1，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)甲基]甲基氨基]-2-噻吩基]羰基]-L-谷氨酸，三甲曲(trimetrexate)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，长春地辛(vindesine)，佐柔比星(zorubicin)；阿加曲班(argatroban)；双香豆素醚(coumetarol)或双香豆素(dicoumarol)。
额外治疗剂的列表可以例如在以下中发现：医师案头参考，第55版，2001，新泽西州蒙特威尔市医疗经济公司；USAN的USPN词典和国际药物名称，2000，马里兰州罗克维尔市美国药典委员会公司(TheUnitedStatesPharmacopeialConvention，Inc.，Rockville，Md.)；以及默克索引(TheMerckIndex)，第12版，1996，新泽西州怀特豪斯站默克集团公司(Merck&Co.，Inc.，WhitehouseStation，N.J.)。
当本发明纳米粒子用于靶向放射线疗法时，治疗剂还可以包括放射性核素。在一个实施例中，低能β-发射放射性核素(如177Lu-螯合构筑体)与纳米粒子缔合并且用于治疗相对较小的肿瘤负荷或微转移疾病。在另一个实施例中，较高能β发射体(如钇-90(90Y))可以用于治疗较大的肿瘤负荷。碘-131(131I)还可以用于放射线疗法。
纳米粒子的表面可以经改性以并有至少一个官能团。附接到纳米粒子上的有机聚合物(例如PEG)可以经改性以并有至少一个官能团。举例来说，所述官能团可以是马来酰亚胺或N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯。并入官能团使得有可能将各种配体、造影剂和/或治疗剂附接到纳米粒子上。
在一个实施例中，治疗剂是经由NHS酯官能团附接到纳米粒子上(表面或有机聚合物涂层)。举例来说，酪氨酸激酶抑制剂(如达沙替尼(dasatinib)(BMS)或化学治疗剂(例如紫杉醇))可以经由酯键偶合到纳米粒子上。这一酯键可以接着在酸性环境中或在体内以酶促方式分解。这一途径可以用于向受试者递送前药，其中所述药物在体内从粒子释放。
我们已经通过将小分子抑制剂达沙替尼与纳米粒子的PEG分子偶合来检验前药途径。基于生物分布结果和人类药物给药计算，已经发现纳米粒子具有独特的生物特性，包括与肿瘤相比从血液的相对快速的清除率和治疗剂的后续肿瘤组织积聚，其表明前药途径是可行的。功能化的纳米粒子准许药物经多次给药，从而确保肿瘤中的药物浓度大于肿瘤组织中的IC-50所规定的浓度，但又不会限制其它器官组织(如心脏、肝脏或肾脏)的剂量。治疗剂和纳米粒子可以独立地经放射性标记或光学标记，从而允许独立监测治疗剂和纳米粒子。在一个实施例中，放射性氟化(即，18F)达沙替尼与经由NHS酯键附接到纳米粒子上的PEG-3400部分偶合。放射氟对于能够独立地监测药物从放射性碘标记(124I)的荧光(Cy5)纳米粒子的分布和释放的时间依赖性变化是至关重要的。以此方式，我们可以独立地监测前药(达沙替尼)和纳米粒子。这准许与先前技术中的方法(其中不使用双重标记途径)相比最佳化前药设计。在另一个实施例中，放射性治疗性碘分子(即，I-131)或其它治疗性γ或α发射体经由马来酰亚胺官能团与PEG结合，其中所述治疗剂可能不在体内从PEG解离。
下文描述本文中称为“点击化学(clickchemistry)”的可泛化途径。为了使本发明纳米粒子易于容纳大范围配体、造影剂或螯合物，纳米粒子的表面可以经改性以并入官能团。纳米粒子还可以用可以并入官能团的有机聚合物(例如，PEG)或螯合物改性。同时，配体、造影剂或治疗剂经改性以并入能够在合适的条件下与纳米粒子上或附接到纳米粒子上的PEG或螯合剂上的官能团反应的官能团。因此，具有反应性官能团的任何配体、造影剂或治疗剂都能够容易地与纳米粒子结合。这一可泛化途径在本文中称为“点击化学”，其将允许大量变通性以探索多模态性应用。在“点击化学”的化学反应中，两种分子组分可以经由选择性、快速、清洁的生物正交和/或生物相容反应结合。科勃(Kolb)等人，(2001)点击化学：来自若干良好反应的不同化学功能(ClickChemistry：DiverseChemicalFunctionfromaFewGoodReactions).应用化学国际版(AngewandteChemieInternationalEdition)40，2004-2021。利姆(Lim)等人，(2010)生物正交化学反应：当前进展和未来方向(Bioorthogonalchemistry：recentprogressandfuturedirections).化学通讯(ChemicalCommunications)46，1589-1600。斯莱滕(Sletten)等人，(2009)生物正交化学反应：在功能性海洋中寻找选择性(Bioorthogonalchemistry：fishingforselectivityinaseaoffunctionality).应用化学国际版48，6973-6998。
任何合适的反应机制都可以在本发明中经调适用于“点击化学”，只要可以实现配体、造影剂或螯合物到纳米粒子上的便捷并且受控制的附接即可。在一个实施例中，将游离三键引入到PEG上，所述PEG已经与纳米粒子的外壳共价结合。同时，叠氮键经引入到所需配体(或造影剂、螯合物)上。当聚乙二醇化纳米粒子与配体(或造影剂、螯合物)在铜催化剂存在下混合时，将发生叠氮化物到三键的环加成，从而导致配体与纳米粒子结合。点击化学的一个实例是在叠氮化物与炔之间的Cu(I)-催化[3+2]胡伊斯根(Huisgen)环加成。摩西(Moses)等人，(2007)点击化学的日益增长的应用(Thegrowingapplicationsofclickchemistry).化学会评论(ChemicalSocietyReviews)36，1249-1262。格拉泽(Glaser)等人，(2009)PET放射化学中的‘点击化学’(‘Clicklabelling’inPETradiochemistry).标记化合物与放射性药物杂志(JournalofLabelledCompounds&Radiopharmaceuticals)52，407-414。明迪(Mindt)等人，(2009)有效合成衍生自单个前体的多个成像探针的“点击化学”途径(A″ClickChemistry″ApproachtotheEfficientSynthesisofMultipleImagingProbesDerivedfromaSinglePrecursor).生物结合物化学(BioconjugateChemistry)20，1940-1949。纽(New)等人，(2009)当代生物医学研究中“点击化学”用于生物结合的日益增长的应用(Growingapplicationsof″clickchemistry″forbioconjugationincontemporarybiomedicalresearch).癌症生物疗法和放射性药物(CancerBiotherapyandRadiopharmaceuticals)24，289-301。王(Wang)等人，(2010)“点击化学”在放射性药物合成中的应用(Applicationof″ClickChemistry″inSynthesisofRadiopharmaceuticals).化学进展(ProgressinChemistry)22，1591-1602。舒尔茨(Schultz)等人，(2010)合成DOTA-生物素结合物用于经由Cu-游离点击化学的放射性核素螯合(SynthesisofaDOTA-BiotinConjugateforRadionuclideChelationviaCu-FreeClickChemistry).有机快报(OrganicLetters)12，2398-2401。马丁(Martin)等人，(2010)通过铜游离点击化学产生的DOTA-肽结合物(ADOTA-peptideconjugatebycopper-freeclickchemistry).生物有机与药物化学快报(Bioorganic&MedicinalChemistryLetters)20，4805-4807。列别杰夫(Lebedev)等人，(2009)用于肽标记的可点击双官能放射金属螯合物(Clickablebifunctionalradiometalchelatesforpeptidelabeling).化学通讯46，1706-1708。诺尔(Knor)等人，(2007)合成用于化学选择性附接到未受保护的多官能化化合物的新颖1，4，7，10-四氮杂环癸烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)衍生物(Synthesisofnovel1，4，7，10-tetraazacyclodecane-1，4，7，10-tetraaceticacid(DOTA)derivativesforchemoselectiveattachmenttounprotectedpolyfunctionalizedcompounds).欧洲化学杂志(Chemistry-aEuropeanJournal)13，6082-6090。在第二实施例中，马来酰亚胺官能团和硫醇基可以经引入到纳米粒子和所需配体(或造影剂、螯合物)上，其中纳米粒子具有马来酰亚胺官能团，配体(或造影剂、螯合物)具有硫醇基，或反之亦然。马来酰亚胺的双键易于与硫醇基反应以形成稳定的碳-硫键。在第三实施例中，活性酯官能团(例如丁二酰亚胺酯基团)和胺基可以经引入到纳米粒子和所需配体、造影剂或螯合物上。活性酯基团易于与胺基反应以形成稳定的碳-氮酰胺键。在第四实施例中，点击化学涉及在四嗪部分与应变烯烃之间的反电子需求狄尔斯-阿尔德尔反应(Diels-Alderreaction)(图21c)。戴瓦拉吉(Devaraj)等人，(2009)通过四嗪/反式环辛烯环加成进行的癌细胞快速并且敏感的预靶向标记(FastandSensitivePretargetedLabelingofCancerCellsthroughaTetrazine/trans-CycloocteneCycloaddition)，应用化学国际版48，7013-7016。戴瓦拉吉等人，(2008)基于四嗪的环加成：应用到预靶向活细胞成像(Tetrazine-BasedCycloadditions：ApplicationtoPretargetedLiveCellImaging).生物结合物化学19，2297-2299。布莱克曼(Blackman)等人，(2008)四嗪接合：基于反电子需求狄尔斯-阿尔德尔反应性的快速生物结合(Tetrazineligation：fastbioconjugationbasedoninverseelectrondemandDieis-Alderreactivity).美国化学学会杂志(JournaloftheAmericanChemicalSociety)130，13518-13519。接合可以是选择性、快速、生物相容和/或生物正交的。不同于许多狄尔斯-阿尔德尔反应，偶合是不可逆的，其在从反应中间体逆狄尔斯-阿尔德尔释放二氮之后形成稳定的哒嗪产物。四嗪部分和应变烯烃可以经引入到纳米粒子和所需配体(或造影剂、螯合物)上，其中纳米粒子具有四嗪部分，配体(或造影剂、螯合物)具有应变烯烃，或反之亦然。多种不同的四嗪-应变烯烃对可以用于反应，包括例如3-(4-苄基胺基)-1，2，4，5-四嗪(Tz)与降冰片烯-环辛烯衍生物或反式环辛烯衍生物的组合。肖赫(Schoch)等人，(2010)通过反电子需求狄尔斯-阿尔德尔反应进行的DNA合成后修饰(Post-SyntheticModificationofDNAbyInverse-Electron-DemandDiels-AlderReaction).美国化学学会杂志132，8846-8847。戴瓦拉吉等人，(2010)用于成像活细胞内部的小分子的生物正交开启探针(BioorthogonalTurn-OnProbesforImagingSmallMoleculesInsideLivingCells).应用化学国际版49。豪恩(Haun)等人，(2010)生物正交化学反应扩增纳米粒子结合并且增强细胞检测的敏感性(Bioorthogonalchemistryamplifiesnanoparticlebindingandenhancesthesensitivityofcelldetection).自然纳米技术(NatureNanotechnology)5，660-665。罗森(Rossin)等人，(2010)用于活小鼠中的预靶向肿瘤成像的体内化学(Invivochemistryforpretargetedtumorimaginginlivemice).应用化学国际版49，3375-3378。李(Li)等人，(2010)用于快速构筑18-F标记探针的四嗪-反式-环辛烯接合(Tetrazine-trans-cycloocteneligationfortherapidconstructionof18-Flabeledprobes).化学通讯46，8043-8045。赖纳(Reiner)等人，(2011)使用化学正交清除剂辅助的高性能方法的经18F标记PARP1抑制剂的合成和体内成像(Synthesisandinvivoimagingofa18F-labeledPARP1inhibitorusingachemicallyorthogonalscavenger-assistedhigh-performancemethod).应用化学国际版50，1922-1925。举例来说，纳米粒子的表面可以用四嗪部分装饰，其可以接着与降冰片烯改性的配体(或造影剂或螯合物)结合(图21d和21e)。在一个方面中，纳米粒子用四嗪涂布，其可以接着使用四嗪-降冰片烯接合用DOTA螯合物改性，并且经64Cu放射性标记。
体内滞留/清除时间
在将本发明纳米粒子投予受试者之后，纳米粒子的血液滞留半衰期可以在约2小时到约25小时、约3小时到约20小时、约3小时到约15小时、约4小时到约10小时或约5小时到约6小时范围内。更长的血液滞留半衰期意味着更长的循环，其允许更多的纳米粒子在体内在目标位点处积聚。可以如下评估血液滞留半衰期。首先向受试者(例如，小鼠、小型猪或人类)投予纳米粒子。在投予后的各个时间点，取得血液样品以通过合适的方法测量纳米粒子浓度。
在一个实施例中，在将聚乙二醇化(或对照)纳米粒子投予受试者之后，纳米粒子的血液滞留半衰期可以在约2小时到约15小时或约4小时到约10小时范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期可以在约5小时到约2天、约10小时到约4天或约15小时到约3.5天范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期与血液滞留半衰期的比率可以在约2到约30、约3到约20或约4到约15范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肾清除率可以在以下范围内：在约24小时内约10％ID(初始剂量)到约100％ID、在约24小时内约30％ID到约80％ID或在约24小时内约40％ID到约70％ID。在一个实施例中，在将纳米粒子投予受试者之后，纳米粒子的血液滞留半衰期在约2小时到约25小时范围内，纳米粒子的肿瘤滞留半衰期在约5小时到约5天范围内，并且纳米粒子的肾清除率在约24小时内在约30％ID到约80％ID范围内。
在将本发明纳米粒子投予受试者之后，本发明纳米粒子的肿瘤滞留半衰期可以在约5小时到约5天、约10小时到约4天、约15小时到约3.5天、约20小时到约3天、约2.5天到约3.1天、约1天到3天或约73.5小时范围内。
纳米粒子的肿瘤滞留半衰期与血液滞留半衰期的比率可以在约2到约30、约3到约20、约4到约15、约4到约10、约10到约15或约13范围内。
在一个实施例中，本发明提供一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；以及附接到纳米粒子上配体，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约15nm之间。在将聚乙二醇化(对照)纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的血液滞留半衰期可以在约2小时到约25小时或约2小时到约15小时范围内；纳米粒子的肿瘤滞留半衰期可以在约5小时到约2天范围内；并且纳米粒子的肾清除率可以在约24小时内在约30％ID到约80％ID范围内。附接到纳米粒子上的配体的数量可以在约1到约30或约1到约10范围内。纳米粒子的直径可以在约1nm与约8nm之间。可以将造影剂，如放射性核素附接到纳米粒子上。或者，可以将螯合物附接到纳米粒子上。纳米粒子可以通过PET、SPECT、CT、MRI、光学成像、生物发光成像或其组合来检测。可以将治疗剂附接到纳米粒子上。在将经放射性标记的靶向纳米粒子投予受试者之后，纳米粒子的血液滞留半衰期也可以在约3小时到约15小时或约4小时到约10小时范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子的肿瘤滞留半衰期也可以在约10小时到约4天或约15小时到约3.5天范围内。在将纳米粒子投予受试者之后，所述经靶向纳米粒子的肿瘤滞留半衰期与血液滞留半衰期的比率可以在约2到约30、约3到约20或约4到约15范围内。纳米粒子的肾清除率也可以在将所述纳米粒子投予受试者之后约24小时内在约45％ID到约90％ID范围内。
在一个实施例中，为了评估经放射性标记的纳米粒子在血液、肿瘤以及其它主要器官/组织中的滞留(或清除)半衰期值(T1/2)，通过在投予纳米粒子之后的指定时间处死数组小鼠来测量注射剂量百分比每克(％ID/g)值。血液、肿瘤以及器官经收集、称重并且在闪烁γ-计数器中计数。％ID/g值相对于注射时间针对放射性衰变校正。使每一组织的所得时间-活性浓度数据拟合减小的单指数函数以评估组织/器官T1/2值。
在将本发明纳米粒子投予受试者之后，本发明纳米粒子的肾清除率可以在以下范围内：在约24小时内约45％ID(初始剂量)到大于90％ID、在约24小时内约20％ID到约90％ID、在约24小时内约30％ID到约80％ID、在约24小时内约40％ID到约70％ID、在约24小时内约40％ID到约60％ID、在约24小时内约40％ID到约50％ID、在约24小时内约43％ID、在约24小时内约10％ID到约100％ID、在约24小时内约40％ID到约100％ID、在约24小时内约80％ID到约100％ID、在约24小时内约90％ID到约95％ID、在约24小时内约90％ID到约100％ID或在约24小时内约80％ID到约95％ID。肾清除率可以如下评估。首先向受试者(例如，小鼠、小型猪或人类)投予纳米粒子。在投予后的各个时间点，取得尿液样品以通过合适的方法测量纳米粒子浓度。
在一个实施例中，如下分析肾清除率(例如，随时间推移在尿液中经排泄的纳米粒子的百分率)。将本发明纳米粒子和在特定时间段(例如，168小时)内收集的尿液样品投予受试者。使用荧光分析和由以已知粒子浓度(％ID)混合的尿液样品的背景校正荧光信号测量值产生的连续稀释校准曲线来确定在每一时间点的粒子浓度。浓度值连同平均每日小鼠尿液体积的估计值用于计算所排泄的累积％ID/g尿液。在另一个实施例中，经放射性标记的纳米粒子的肾清除率是通过以类似时间间隔使用例如γ-计数并且在纳米粒子投予之后以计算累积尿液排泄来测量尿液样本活性(每分钟计数)来分析。
在第三实施例中，为了评估累积粪便排泄，在投予纳米粒子之后在代谢笼中以类似时间间隔收集粪便并且使用γ-计数器测定样本活性。
当以人类剂量当量约100倍的量向受试者投予纳米粒子时，在约10天到约14天内在所述受试者中实质上未观察到贫血、体重降低、躁动、呼吸加快、G1紊乱、行为异常、神经功能障碍、血液异常、临床化学异常、器官病理学上与药物相关的病变、死亡或其组合。
当本发明纳米粒子含有至少一种经附接的配体时，纳米粒子的多价强化(例如，与单独的配体相比)可以在约1.5倍到约10倍、约2倍到约8倍、约2倍到约6倍、约2倍到约4倍或约2倍范围内。
鉴于先前技术，本发明的纳米粒子显示出人意料的体外和体内物理化学和生物参数。举例来说，对于经配体附接的纳米粒子所评估的血液滞留半衰期(例如，经cRGD附接的纳米粒子为约5.5小时)实质上长于对应配体(例如，cRGD为约13分钟)的血液滞留半衰期。蒙泰(Montet)等人，通过纳米粒子显示获得的RGD肽的多价效应(MultivalenteffectsofRGDpeptidesobtainedbynanoparticledisplay)，《药物化学杂志》49，6087-6093(2006)。扩展的血液滞留半衰期可以增强探针生物可用性、促进肿瘤靶向并且在更长的时间段内产生更高的肿瘤吸收。在一个实施例中，靶向纳米粒子(即，经配体附接的纳米粒子)的肿瘤滞留半衰期比血液滞留半衰期大约13倍，而非靶向纳米粒子(即，未经配体附接的对应纳米粒子)的肿瘤滞留半衰期仅比血液滞留半衰期大约5倍。此差异表明靶向纳米粒子与非靶向纳米粒子相比实质上更大的肿瘤组织积聚。在某些实施例中，考虑到附接到纳米粒子上的配体的数量，本发明纳米粒子显示出人意料的高亲和力结合(例如，经cRGD附接的纳米粒子的Kd为0.51nM并且IC50为1.2nM)、多价强化(例如，经cRGD附接的纳米粒子与单独的cRGD肽相比超过2倍的强化)、显著差异肿瘤吸收(例如，在投予后72小时内，经cRGD附接的PEG-纳米粒子显示相对于PEG涂布纳米粒子的约3到4倍的差异肿瘤吸收增加)以及相对于正常肌肉的显著肿瘤造影(例如，在投予后72小时内约3到5倍)(基于肿瘤与肌肉吸收比率)。
在一个实施例中，在最大肿瘤吸收(在纳米粒子注射后约4小时)时，对于表达整合素的肿瘤中的经配体附接的纳米粒子发现超过对照(例如，在不表现整合素的肿瘤中的经配体附接的纳米粒子，或在表达整合素的肿瘤中的未经配体附接的纳米粒子)的三倍活性-浓度增加。另外，与非靶向纳米粒子(即，未经配体附接的对应纳米粒子)的降低的相对于正常肌肉的肿瘤组织造影相比，靶向纳米粒子(即，经配体附接的纳米粒子)的肿瘤与肌肉吸收比率展现相对于正常肌肉增强的肿瘤组织造影，其表明靶向纳米粒子是肿瘤选择性的。
在另一个实施例中，靶向和非靶向纳米粒子都在相同时间段内显示有效肾排泄。注射剂量的几乎一半在注射后前24小时内排泄并且到96小时为止排泄约72％，其表明大量排泄在注射后第一天发生。相比之下，靶向纳米粒子的粪便排泄概况指示，平均地，注射剂量的7％和15％分别在24小时和96小时内消除。
无毒纳米粒子的物理化学和生物参数，连同其多模态成像能力(例如，PET和光学成像)扩展其潜在的生物医学应用范围。所述应用包括(a)长期监测：纳米粒子的扩展血液循环时间和对应生物可用性突出其用于早期与长期监测疾病管理的各个阶段(如诊断性筛选、治疗前评估、治疗性干预以及治疗后监测)的变通性而不具有由毒性考虑施加的限制；(b)改进的肿瘤穿透：靶向纳米粒子的清除特性(例如，其肾清除率比先前技术中的分子探针慢)将适用于各种类型的生物应用。举例来说，纳米粒子将尤其适用于不良血管化和相对不可接近的实体肿瘤(其中在全身性投予之后，药剂的定位典型地较慢)的情况；(c)多模态成像能力：这些模态可以以多种规模(即，全身到细胞水平)组合用于获取互补的深度敏感生物信息。举例来说，在SLN定位中，较深的结可以通过PET就其分布和数量来定位，而表面结的更精确和详细定位可以通过荧光成像获得；并且(d)靶向治疗剂：靶向纳米粒子从肿瘤的较长清除期(与靶向纳米粒子从血液的清除期相比)可以用于组合的诊断性/治疗性应用，其中纳米粒子可以充当放射性治疗性或药物递送媒剂。
药物组合物
本发明进一步提供一种包含本发明纳米粒子的药物组合物。本发明的药物组合物可以以合适的药物单位剂型的形式经口投予。本发明的药物组合物可以以许多形式制备，包括片剂、硬或软明胶胶囊、水溶液、悬浮液和脂质体以及其它缓慢释放配制品，如成形聚合凝胶。
本发明纳米粒子或组合物的合适投予模式包括(但不限于)经口、静脉内、经直肠、舌下、经粘膜、经鼻、经眼、皮下、肌肉内、经皮、皮内、皮下、瘤周、脊椎、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管以及淋巴投予，以及其它用于活性成分的全身递送的剂型。本发明药物组合物可以通过所属领域中已知的任何方法投予，所述方法包括(但不限于)经皮(经由贴片、凝胶、乳膏、软膏或离子导入疗法)；静脉内(药团、输注)；皮下(输注、积存)；经粘膜(颊内和舌下，例如，口腔分散片剂、糯米纸囊剂、膜以及泡腾配制品；经结膜(滴眼剂)；经直肠(栓剂、灌肠剂))；或皮内(药团、输注、积存)。组合物可以局部递送。
经口液体药物组合物可以呈例如水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酏剂形式，或可以以在使用之前用水或其它合适的媒剂复原的无水产品的形式呈现。此类液体药物组合物可以含有常规添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水性媒剂(其可以包括食用油)或防腐剂。
本发明的纳米粒子药物组合物还可以经配制以用于肠胃外投予(例如，通过注射，例如快速注射或连续输注)，并且可以以在安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或多剂量容器中的具有添加防腐剂的单位剂型形式呈现。药物组合物可以采用如在油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，本发明的药物组合物可以呈粉末形式，其是通过无菌分离无菌固体或通过从溶液冻干获得，用于在使用之前用合适的媒剂(例如无菌、不含热原质的水)复原。
对于局部投予到表皮，药物组合物可以配制为软膏、乳膏或洗剂，或经皮贴片的活性成分。例如在A.费舍尔(A.Fisher)等人(美国专利第4,788,603号)或R.巴瓦(R.Bawa)等人(美国专利第4,931,279号；第4,668,506号；以及第4,713,224号)中公开了合适的经皮递送系统。软膏和乳膏可以例如用水性或油性基底在添加合适的增稠剂和/或胶凝剂的情况下配制。洗剂可以用水性或油性基底配制，并且一般来说还将含有一或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。药物组合物也可以经由离子电泳作用递送，例如，如美国专利第4,140,122号；第4,383,529号或第4,051,842号中所公开。
适用于在口腔中局部投予的药物组合物包括单位剂型，如在调味基底(通常为蔗糖和阿卡迪亚(acadia)或黄蓍胶)中包含本发明的药物组合物的口含片；在惰性基底(如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中包含药物组合物的片剂；粘膜附着凝胶，以及在合适的液体载剂中包含药物组合物的漱口剂。
对于局部投予到眼睛，药物组合物可以以滴剂、凝胶(S.克莱(S.Chrai)等人，美国专利第4,255,415号)、胶(S.L林(S.LLin)等人，美国专利第4,136,177号)或经由缓释眼部植入物(A.S.麦克(A.S.Michaels)，美国专利第3,867,519号和H.M.哈达(H.M.Haddad)等人，美国专利第3,870,791号)投予。
需要时，上文所描述的药物组合物可以例如通过与某些亲水性聚合物基质(例如，包含天然凝胶、合成聚合物凝胶或其混合物)组合而经调适以提供所用治疗性化合物的持续释放。
适用于经直肠投予的药物组合物(其中载剂是固体)最优选地以单位剂量栓剂形式呈现。合适的载剂包括可可油和其它所属领域中常用的物质，并且栓剂可以通过将药物组合物与软化或熔融的载剂掺合接着冷却并且在模具中成形而便利地形成。
适用于经阴道投予的药物组合物可以以除了纳米粒子和治疗剂之外还含有所属领域中熟知的载剂的阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式呈现。
对于通过吸入投予，根据本发明的药物组合物便利地从吹入器、喷雾器或加压包或其它递送气雾喷雾剂的便利装置递送。加压包可以包含合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供用以递送计量数量的阀门来确定剂量单位。
或者，对于通过吸入或吹入投予，本发明的药物组合物可以呈干燥粉末组合物形式，例如药物组合物与合适的粉末基底(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以在例如胶囊或药筒或例如明胶或泡壳包装(粉末可以自其借助于吸入器或吹入器投予)中的单位剂型形式呈现。
对于鼻内投予，本发明的药物组合物可以经由液体喷雾剂，如经由塑料瓶雾化器投予。这些中典型的是(异丙肾上腺素吸入剂-温罗普(Wintrop))和(异丙肾上腺素吸入剂-莱克(Riker))。
本发明的药物组合物也可以含有其它佐剂，如调味剂、着色剂、抗微生物剂或防腐剂。
将进一步了解，供治疗使用所需的药物组合物的量将不仅随着所选治疗剂变化并且还随着投予途径、所治疗的病况的性质以及患者的年龄和状况变化并且最终将由护理医师或临床医师酌情处理。为了评估这些因素，参见J.F.布赖恩(J.F.Brien)等人，欧洲临床药理学杂志(Europ.J.Clin.Pharmacol.)，14，133(1978)；和医师案头参考，查尔斯E.(CharlesE.)小贝克(Baker，Jr.)，新泽西州奥拉德尔公共医疗经济公司(Pub.，Medical.EconomicsCo.，Oradell，N.J.)(第41版，1987)。一般来说，治疗剂在与本发明的荧光纳米粒子组合使用时的剂量可以小于治疗剂单独或在常规药物剂型中投予时的剂量。荧光纳米粒子对于目标位点(如位于细胞表面上的受体)的高特异性可以提供治疗剂的相对高度局部化的浓度，或者，治疗剂在扩展时间段内的持续释放。
本发明纳米粒子或组合物可以投予受试者。受试者可以是哺乳动物，优选地是人类。哺乳动物包括(但不限于)鼠科动物、大鼠、兔、猿猴、牛科动物、绵羊科动物、猪、犬科动物、猫科动物、农畜、运动动物、宠物、马科动物以及灵长类动物。
纳米粒子的用途
本发明进一步提供一种用于检测细胞的组分的方法，其包含以下步骤：(a)使细胞与荧光的基于二氧化硅的纳米粒子接触，所述纳米粒子包含基于二氧化硅的核心，所述基于二氧化硅的核心包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；附接到纳米粒子上的约1到约25个配体(约1到约20个配体或约1到约10个配体，或其它范围；参见本文中的论述)；以及附接到纳米粒子上的造影剂或螯合物；以及(b)通过至少一种成像技术监测纳米粒子与细胞或细胞组分的结合(和/或其潜在的细胞内吸收)。成像技术可以是PET、SPECT、CT、MRI、光学生物发光或荧光成像以及其组合。
可以在代谢活性全细胞内部、在全细胞溶解产物中、在经渗透细胞中、在固定细胞中或用部分纯化的细胞组分在无细胞环境中检测并且确定细胞组分的位置。接触的量和持续时间可以取决于例如治疗方法的诊断性或治疗性目标(如上调的信号传导路径中间物(即，Akt、NF-KB)的荧光或抗体介导的检测)、疾病病况或条件、治疗剂的递送，或以上两者。接触的量和持续时间也可以取决于荧光纳米粒子相对于标靶分析物的相对浓度、粒子培育时间以及所治疗的细胞的状态。
本发明进一步提供一种用于靶向肿瘤细胞的方法，其包含向癌症患者投予有效量的荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，所述纳米粒子包含：基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；附接到纳米粒子上的有机聚合物；附接到纳米粒子上并且能够结合肿瘤标记的配体；以及至少一种治疗剂。
纳米粒子可以经放射性标记。纳米粒子可以使用任何合适的技术经放射性标记。放射性标记可以是自动化的。在一个实施例中，纳米粒子是使用FASTlab放射化学合成平台(通用电气医疗集团(GEHealthcare))。合成参数可以经精细调节以实现高再现性、放射化学产率/纯度、标记效率以及相对较短的合成时间。新的粒子示踪剂可以容纳在同一FASTlab模块上。
纳米粒子可以通过(但不限于)以下途径向患者投予：经口、静脉内、经鼻、皮下、局部、肌肉内或经皮。
在某些实施例中，可能需要使用两种或两种以上类型的具有不同特性的荧光纳米粒子的混合物来评估不同的组织类型。
本发明的方法和组合物可以用于帮助医师或外科医生鉴别和表征疾病的区域，所述疾病如癌症和发炎性/感染性过程，包括(但不限于)皮肤癌(黑色素瘤)、头颈癌、前列腺癌、脑癌以及肠癌，以区分患病和正常组织，如检测难以使用普通操作显微镜检测的肿瘤边缘(例如在脑手术中)；帮助指示治疗性或外科干预，例如通过判定病变是癌性的并且应该被去除还是非癌性的并且被保留；或用于以手术方式分期疾病，例如手术中淋巴结分期、前哨淋巴结(SLN)定位，例如用于保存至关重要的神经结构(腮腺内神经)的神经保留程序。
本发明的方法和组合物可以用于转移性疾病检测、治疗反应监测、SLN定位/靶向、神经保留程序、残留疾病检测、治疗剂的靶向递送(组合的诊断性/治疗性平台)、非靶向的携带药物的纳米粒子的局部递送(导管递送)、血脑屏障治疗学、发炎性/缺血性疾病(即，脑、心脏、尿道、膀胱)的治疗、疾病的组合治疗与感测(例如，比率计量pH感测、氧气感测)等。
本发明的方法和组合物也可以用于检测、表征和/或确定疾病(尤其是早期疾病)的定位、疾病或与疾病相关联的病况的严重程度、疾病的分期和/或监测疾病。发射信号的存在、不存在或水平可以指示疾病状态。本发明的方法和组合物也可以用于监测和/或引导各种治疗性干预，如外科和基于导管的程序，以及监测药物疗法，包括基于细胞的疗法。本发明的方法也可以用于疾病或疾病病况的预后。滞留在疾病位点内或在疾病位点边缘的细胞亚群，如类干细胞(“癌症干细胞”)和/或发言性/吞噬细胞，可以使用本发明的方法和组合物来鉴别和表征。关于前述中的每一者，此类可以经检测或监测(在治疗之前、在其期间或在其之后)的疾病或疾病病况的实例包括癌症(例如，黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、子宫颈癌、皮肤癌、脑癌、胃肠道癌、口腔癌、肾癌、食道癌、骨癌)，其可以用于鉴定具有罹患癌症和/或恶性肿瘤的增加的易感性的受试者，即其易患癌症和/或恶性肿瘤、发炎(例如，由癌性病变的存在诱发的发炎性病况)、心血管疾病(例如，血管的动脉粥样硬化和发炎性病况、缺血、中风、血栓形成)、皮肤病(例如，卡波西氏肉瘤(Kaposi′sSarcoma)、牛皮癣)、眼科疾病(例如，黄斑变性、糖尿病性视网膜病变)、传染病(例如，细菌、病毒、真菌以及寄生虫感染，包括获得性免疫缺陷综合征(AcquiredImmunodeficiencySyndrome)、免疫疾病(例如，自身免疫病症、淋巴瘤、多发性硬化症、类风湿性关节炎、糖尿病)、中枢神经系统疾病(例如，神经变性疾病，如帕金森氏病或阿尔茨海默氏病(Alzheimer′sdisease))、遗传性疾病、代谢疾病、环境疾病(例如，铅、汞以及放射性中毒、皮肤癌)、骨骼相关疾病(例如，骨质疏松症、原发性和转移性骨肿瘤、骨关节炎)以及神经变性疾病。
因此，本发明的方法和组合物可以用于例如确定肿瘤和/或共滞留类干细胞(“癌症干细胞”)的存在和/或定位；发炎性细胞的存在和/或定位，包括活化巨噬细胞的存在(例如在瘤周区域中)；血管疾病的存在和定位，包括在冠状和周边动脉、扩展动脉瘤的区域、颈动脉中的不稳定斑块以及缺血区域中的处于急性闭塞风险下的区域(即，易受损的斑块)。本发明的方法和组合物也可以用于鉴别和评估细胞死亡、损伤、凋亡、坏死、缺氧以及血管生成。PCT/US2006/049222。
以下实例仅出于说明的目的呈现并且不限制本发明。
实例1PEG涂布的纳米粒子的制备和表征
根据如PCT/US2008/074894和施托贝尔(Stober)等人微米尺寸范围的单分散二氧化硅球体的受控生长(Controlledgrowthofmonodispersedsilicaspheresinthemicronsizerange).胶体界面科学(ColloidInterfaceSci.)1968；26：62-69中所公开的公认方案合成含有NIR发射染料(Cy-5)的纳米粒子并且通过聚乙二醇化将其功能化。大西(Ohnishi)等人分子成像杂志(J.Mol.Imaging)2005，4：172-181。Cy5马来酰亚胺与共反应性有机硅烷化合物(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷反应以形成荧光二氧化硅前体。这一荧光二氧化硅前体与正硅酸四乙酯共缩合以形成荧光的基于二氧化硅的核心。将PEG-硅烷化合物与甲氧基封端聚(乙二醇)链(PEG，约0.5kDa)甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]-三甲氧基硅烷添加到荧光的基于二氧化硅的核心以在所述核心上形成PEG涂层。通过3500MWCO蛇皮透析膜将PEG涂布的纳米粒子透析到生理盐水(含0.15MNaCl的H2O)中并且无菌过滤。在注射之前，所有样品都在其峰值吸收波长(640nm)下进行光密度匹配。通过动态光散射(DLS)和荧光相关性光谱法(FCS)实现流体动力学尺寸测量。简单来说，在布鲁克海文工具公司(BrookhavenInstrumentsCompany)200SM静态/DLS系统上使用氦氖激光(λ＝632.8nm)测量透析到水中的粒子。由于染料吸收与激发源的重叠，使用15min积分时间以实现可接受的信噪比。对于FCS，将粒子透析到水中，稀释到0.15MNaCl中并且在蔡司(Zeiss)LSM510共焦器2FCS(氦氖633nm激发)上测量。在所有测量之前校准仪器的尺寸。由FCS曲线确定聚乙二醇化纳米粒子与游离染料的相对亮度的比较，其测量为每一分子/粒子的计数率。
实例2PEG涂布的纳米粒子的肾清除率
合成流体动力学半径为约3nm的荧光核-壳二氧化硅纳米粒子。发现这些纳米粒子在6nm到10nm直径范围内，如动态光散射(DLS)结果所示(图1a)。在裸小鼠中的约6nm和3.3nm的裸(无PEG涂层)二氧化硅纳米粒子的体内全身NIR荧光成像在注射后45min显示可观的肾清除率，其中在肝脏中残留显著积聚(图1b)。最终排泄到肠肝循环中在随后的24h期间发生。基于这些结果，根据PCT/US2008/074894中的方案用甲氧基封端的聚(乙二醇)链(PEG，约0.5kDa)共价涂布粒子，以预防调理作用并且进一步增强粒子清除，同时维持较小的流体动力学尺寸。这一治疗在注射后45分钟降低肝脏固持力并且导致增加的到膀胱中的肾过滤(通过NIR荧光成像)(图1c)，其中膀胱荧光到24h时突出可见。探针经良好耐受，在研究过程中未观察到不良作用或动物死亡。在注射经124I标记的PEG涂布的纳米粒子24小时之后的连续共记录PET-CT成像(图1d，上行)展现少量残留的膀胱活性，以及覆盖肝脏/胃肠道上方(中心)的活性，侧边为独立获取的显微CT和显微PET扫描。连续显微PET图像确认了在NIR荧光成像上的发现。发现经124I标记的聚乙二醇化纳米粒子基于在96小时时间段内的血液活性的时间依赖性变化的血液滞留半衰期是7.3小时。对于经124I标记的结合RGD的纳米粒子，发现血液滞留半衰期是5.6小时。
基于这些体内数据，在两组聚乙二醇化的含有Cy5的粒子上进行经涂布纳米粒子的更详细的生物分布和清除率研究以评估探针尺寸对生物分布的影响。产生流体动力学直径为3.3±0.06nm和6.0±0.1nm(如通过荧光相关性光谱法(FCS)测量)的纳米粒子(图2a)。在体内研究之前，研究粒子光物理特性以相对于游离染料建立其性能水平。尽管粒径极小，但二氧化硅封装的染料分子展现优于游离染料(其粒径经按比例缩放)的光物理强化，包括显著的亮度增加，如通过吸收和发射光谱(图2b)和FCS(图2c)所测定。当用高功率635nm激光照射时，与游离染料相比，3.3nm和6.0nm直径的纳米粒子分别展现光褪色半衰期的2倍和3倍增加(图2d)。因此，发现这些纳米粒子探针与其游离染料对应物相比更亮并且更具光稳定性。
除了由全身成像半定量评估体内纳米粒子行为之外，还使用荧光板读取器进行组织匀浆和流体的离体分析，所述荧光盘读取器允许校准定量在NIR荧光成像中观察到的变化。将样品分组为粒子荧光的“保留”(肝脏、肾脏、肺、脾脏匀浆以及血液)和“排泄”(尿液)源，进行背景校正，并且基于校准曲线将其转化成每一动物的初始剂量(％ID)的百分比。组织分析显示在主要器官中的最小粒子固持力，大部分荧光是归因于循环血液(图3a)。使净粒子固持力，其计算为“保留”组分的总和，与指数衰变曲线拟合以确定排泄的动力学(图3b)。较大粒子展现较长组织半衰期(t1/2(3.3nm)＝190min，t1/2(6.0nm)＝350min)和较大初始器官固持力。在48h之后，6nm粒子展现在身体中的最小固持力(R总计(6.0nm)＝2.4±0.6％ID)。使用在处死时收集的尿液样品结合连续稀释校准数据以基于对每单位时间排泄的平均尿液体积的保守评估来评估总肾清除率。通过这一方法，评估了两种粒径随时间推移经排泄的％ID(图3c)。
实例3与αvβ3整合素-靶向肽结合的荧光二氧化硅纳米粒子(黑色素瘤模型)
为了合成具有对于肿瘤标记αvβ3整合素的高亲和力的多模态(光学PET)纳米粒子，使环状RGD五肽(RGDYC)经由Cys-马来酰亚胺键与纳米粒子结合。接着，酪氨酸连接子Y用于附接放射性标记。雄性无胸腺裸小鼠在其侧腹中经皮下注射C6大鼠神经胶质瘤细胞。在直径为约0.5cm时，小鼠经IV注射裸二氧化硅纳米粒子(图4A)或聚乙二醇化RGD纳米粒子(图4B，约500nm/kg)。图4显示使用全身光学成像获得的在非荷瘤和荷瘤小鼠中的体内生物分布。
使用流式细胞术研究靶向(结合RGD)和非靶向(经PEG涂布)的纳米粒子与αvβ3-整合素-阳性人类黑色素瘤细胞系(M21)的体外结合作为剂量反应研究的一部分(图5A、5B)。随时间(图5A)和浓度(图5B)而变评估粒子结合/吸收。
实例4与αvβ3整合素-靶向肽结合的荧光二氧化硅纳米粒子和结点定位(黑色素瘤模型)
我们利用了生物相容性物质二氧化硅，其具有可以精确定时到针对肾清除率优化的粒径的架构。我们将较小靶向肽和放射性标记附接到粒子表面以用于在充分表征的体内人类黑色素瘤模型和经定位引流淋巴结和淋巴通道中使用封装的近红外(MR)染料和多规模光学荧光成像方法进行连续PET成像测量。巴卢(Ballou)等人，在小鼠肿瘤模型中使用量子点的前哨淋巴结成像(Sentinellymphnodeimagingusingquantumdotsinmousetumormodels).生物结合物化学18，389-396(2007)。金(Kim)等人，用于前哨淋巴结定位的近红外萤光型II量子点(Near-infraredfluorescenttypeIIquantumdotsforsentinellymphnodemapping).自然生物技术22，93-97(2003)。田中(Tanaka)等人，使用不可见光的图像引导肿瘤手术：前哨淋巴结定位的完成临床前研发(Image-guidedoncologicsurgeryusinginvisiblelight：completedpre-clinicaldevelopmentforsentinellymphnodemapping).外科肿瘤学杂志(J.Surg.Oncol.)13，1671-1681(2006)。还进行了毒性检验并且推导出了人类正常器官辐射剂量。确切地说，我们合成了约7nm直径的近红外(NIR)染料封装核-壳二氧化硅纳米粒子，其用PEG链涂布，并且用少量(约6到7种)靶向肽和放射性标记表面功能化。
我们表明了这些探针同时是无毒的、展现高亲和力/亲合力结合、有效排泄以及在肿瘤和正常组织之间的显著差异吸收和造影(通过使用多模态分子成像途径)。由NIR染料荧光实现的对淋巴结和淋巴通道的敏感检测、定位以及询问突显了这一多模态平台用于在临床配置中检测和分期转移性疾病的独特的潜在优势，同时扩展可以检测到的结点尺寸的下限。
材料和方法
cRGDY-PEG-纳米粒子和PEG-纳米粒子的合成
通过如先前所描述的经修改的史托伯型(-type)二氧化硅缩合制备粒子。维斯纳等人，经PEG涂布的核-壳二氧化硅纳米粒子以及制造和使用方法(PEG-coatedCore-shellSilicaNanoparticlesandMethodsofManufactureandUse)，PCT/US2008/74894。拉松(Larson)等人，二氧化硅纳米粒子架构决定封装发色团的辐射特性(Silicananoparticlearchitecturedeterminesradiativepropertiesofencapsulatedchromophores).化学材料 (Chem.Mater.)20，2677-2684(2008)。博古什(Bogush)等人，制备单分散二氧化硅粒子：控制尺寸和质量分数(PreparationofMonodisperseSilicaParticles：ControlofSizeandMassFraction).非晶体物质杂志(J.Non-Crvst.Solids).104，95-106(1988)。萨达西文(Sadasivan)二氧化硅合成的醇溶剂影响-NMR和DLS研究(AlcoholicSolventEffectonSilicaSynthesis-NMRandDLSInvestigation).溶胶凝胶科学技术杂志(J.Sol-GelSci.Technol.)12，5-14(1998)。赫茨(Herz)，具有优于游离染料的增强发射用于单激发多路复用的大斯托克斯位移荧光二氧化硅纳米粒子(LargeStokes-ShiftFluorescentSilicaNanoparticleswithEnhancedEmissionoverFreeDyeforSingleExcitationMultiplexing)，大分子快讯(MacromolRapidCommun)30，1907-1910(2009)。酪氨酸残基与PEG链结合用于附接放射性碘或稳定碘部分。赫曼森(Hermanson)，生物结合物技术(Bioconiugate Techniques).(学术出版社(AcademicPress)，伦敦(London)第2版，2008)。所有样品都在放射性标记之前在其峰值吸收波长(640nm)下经光密度匹配。使cRGD肽经由半胱胺酸-马来酰亚胺键附接到功能化PEG链上，并且使用对cRGD肽的绝对粒子浓度和试剂的起始浓度的基于FCS的测量来评估与粒子结合的cRGD肽的数量。
通过荧光相关性光谱法(FCS)的流体动力学尺寸和相对亮度比较测量.
将透析到水中的粒子稀释到生理盐水(含0.15MNaCl的H2O)中并且在蔡司LSM510共焦器2FCS上使用氦氖633nm激发来测量。在所有测量之前校准仪器的尺寸。扩散时间差用于评估染料和粒子物质的流体动力学尺寸的变化。游离染料与PEG-纳米粒子和RGDY-PEG纳米粒子的相对亮度比较是使用每一分子/粒子的计数率进行。
C点结合物的放射性标记
cRGDY-PEG和PEG-纳米粒子的放射性标记是使用非水溶性碘化试剂法(IODOGENmethod)(伊利诺伊州罗克福德皮尔斯(Pierce，Rockford，IL))进行。派提赛克(Piatyszek)等人，非水溶性碘化试剂介导的核酸的放射性碘化(Iodo-genmediatedradioiodinationofnucleicacids).分析生物化学(J.Anal.Biochem.)172，356-359(1988)。通过γ(γ)计数测量活性，并且使用瓦里安(Varian)荧光计(激发650nm/发射680)测量荧光。
细胞和细胞培养
人类黑色素瘤M21和M21变体(M21-L，αv阴性)细胞系维持在RPMI1640介质/10％胎BSA、2mML-谷氨酰胺青霉素以及链霉素(纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心核心培养基制备设施(CoreMediaPreparationFacility，MemorialSloanKetteringCancerCenter，NewYork))中。在M199培养基/10％胎牛血清、20μg/ml内皮细胞生长因子、50μg/ml肝素、青霉素以及链霉素中培养人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
124I-cRGD-PEG-纳米粒子的体外细胞结合和分子特异性
为了分析粒子对M21细胞的结合和特异性，用含10μg/mlI型胶原蛋白(马萨诸塞州贝德福贝迪生物科学公司(BDBiosciences，Bedford，MA))的磷酸盐缓冲盐水(PBS)涂布24孔平板，并进行培育(37℃，30min)。将M21细胞(3.0×105到4.0×105个细胞/孔)生长到汇合并且用RPMI1640培养基/0.5％牛血清白蛋白(BSA)洗涤。向孔中添加124I-cRGD-PEG-纳米粒子(0ng/ml到4.0ng/ml)并且培育细胞(25℃，4小时)，用RPMI1640培养基/0.5％BSA洗涤，并且溶解在0.2MNaOH中。使用针对碘-124校准的1480自动γ计数器(珀金埃尔默(PerkinElmer))分析放射性。在1000倍过量的cRGD(肯塔基州路易斯维尔肽国际公司(PeptidesInternational，Louisville，KY))存在下测定非特异性结合。产生结合数据的标准曲线，并且使用线性回归分析(微软优越试算表(MicrosoftExcel)2007)进行分析以推导受体-结合参数(Kd、Bmax、IC50)。
使用光学检测方法的体外细胞结合研究
针对一系列培育时间和粒子浓度，使用流式细胞术测定cRGDY-PEG-纳米粒子和PEG-纳米粒子与M21细胞的最大差异结合，并将最佳值用于竞争性结合和特异性研究中。用RPMI1640培养基/0.5％BSA洗涤细胞(3.0×105个细胞/孔)，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA分离，并且在微量离心管中集结(在1400rpm、25℃下5min)。使集结粒再悬浮于BDFACSFlow溶液(加利福尼亚州圣何塞贝迪生物科学公司(BDBiosciences，SanJose，CA))中，并且在Cy5通道中分析以测定与粒子结合的探针的百分比(加利福尼亚州山景城百克顿-迪金森公司流式细胞仪(FACSCalibur，BectonDickinson，MountainView，CA))。在过量cRGD和/或小鼠单克隆抗人整合素αvβ3荧光素结合抗体(加利福尼亚州蒂梅丘拉密理博(Millipore，Temecula，CA))存在下使cRGDY-PEG-纳米粒子(2.5ng/ml)与M21、M21L以及HUVEC细胞一起培育之后，另外进行竞争性结合研究，并且通过流式细胞术进行分析。为了评估RGDY-PEG纳米粒子相对于cRGD肽的效能，进行抗附着分析。用含玻连蛋白的PBS(5μg/ml)，接着用200μlRPMI/0.5％BSA(1h，37℃)涂布96孔微滴定板。用含各种浓度的cRGDY-PEG-纳米粒子或cRGD肽的RPMI/0.1％BSA重复四份培育细胞(3×104/100μl/孔)(30min，25℃)，并且添加到涂布有玻连蛋白的板中(30mm，37℃)。用RPMI/0.1％BSA轻轻地冲洗孔以去除未附着的细胞，用4％PFA固定附着的细胞(20min，25℃)，并且用亚甲基蓝染色(1h，37℃)以用于光密度测定，所述光密度是使用帝肯萨菲尔(TecanSatire)板读取器(λex＝650nm，λem＝680nm，12nm带宽)来计算。多价强化因数计算为cRGD肽与cRGDY-PEG-点IC50值的比率。蒙泰等人，通过纳米粒子显示获得的RGD肽的多价效应.药物化学杂志49，6087-6093(2006)。
动物模型和肿瘤接种
根据纪念斯隆-凯特琳癌症中心的机构动物照护与使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofMemorialSloan-KetteringCancerCenter)批准的方案并且遵循美国国家卫生研究院动物福利指南(NationalInstitutesofHealthguidelinesforanimalwelfare)进行所有动物实验。向雄性无胸腺nu/nu小鼠(6到8周龄，纽约哈德逊泰克里克农场公司(TaconicFarmsInc，Hudson，NY))提供含碘化钾的水溶液以在体内阻断甲状腺对任何游离放射性碘的吸收，并且如在别处10详述的，使动物随意维持哈兰特克拉公司饮食2016(HarlanTekladGlobalDiet2016)。为了产生M21或M21L异种移植物，将等体积的细胞(约5×106/100μl)和基质胶皮下共注射到不同小鼠的后肢中。用卡尺规则地测定肿瘤尺寸，产生200mm3的平均肿瘤体积。
体内药物动力学和滞留半衰期(T1/2)测定
通过在静脉内注射124I-cRGDY-PEG-纳米粒子或124I-PEG-纳米粒子(约20μCi/小鼠)后的规定时间处死小鼠组，并且收集、称重血液、肿瘤以及器官并且在针对124I校准的闪烁γ-计数器中对其进行计数，来计算针对注射时间的放射性衰变校正的时间依赖性活性浓度(％ID/g)。将每一组织的所得时间-活性浓度数据与减小的单指数函数拟合，以分别测定所述函数的T1/2和A的值、组织/器官滞留半衰期以及零时截距。
使用先前描述的方法评估随时间推移在尿液中排泄的粒子百分率。伯恩斯等人，用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子”，纳米快报9，442-8(2009)。简单来说，向小鼠静脉内注射200μl未标记的cRGDY-PEG-纳米粒子或PEG-纳米粒子，在168小时时间段内收集尿液样品(每个时间点小鼠为n＝3)。使用荧光分析和连续稀释校准曲线测定各个时间点的粒子浓度，其中所述校准曲线是由混合有已知浓度粒子(％ID)的尿液样品的背景校正荧光信号测量产生。接着，使用浓度值连同小鼠日平均尿液体积的估计值以计算随时间推移所排泄的累积尿液％ID/g。为了评估累积粪便排泄，在静脉内注射200μl124I-cRGDY-PEG-纳米粒子(每个时间点小鼠为n＝4)之后，使用代谢笼以类似时间间隔收集粪便。使用针对124I校准的γ-计数器测量样本活性。
放射量测定
以分析方式积分对每一组织推导的时间-活性函数(同时包括放射性衰变的影响)，以产生对应的累积活性(即放射性衰变的总数)。接着，假定此类辐射的完全局部吸收并忽略穿透性辐射(即γ-射线)的作用，通过使累积活性和非穿透性辐射(正电子)的124I平衡剂量常数相乘来计算小鼠器官吸收的124I剂量。艾克曼(Eckerman)等人，放射性核素数据和 衰变方案(RadionuclideDataandDecaySchemes)，第2版弗吉尼亚州雷斯顿：核医学协会(Reston，VA：SocietyofNuclearMedicine)；1989。通过对小鼠和人类(70kg标准男性)之间的总体重和器官质量的差异的调节，将小鼠正常器官累积活性转化为人正常器官累积活性。克里斯蒂(Cristy)等人，在各个年龄的从内部光子源(I-VII)的能量的特定吸收百分率(Specificabsorbedfractionsofenergyatvariousagesfrominternalphotonsources(I-VII)).橡树岭国家实验室报告(OakRidgeNationalLaboratoryReport) ORNL/TM-8381/V1-7.弗吉尼亚州斯普林菲尔德：国家技术信息服务部商务部(Springfield，VA：NationalTechnicalInformationService，DeptofCommerce)；1987。将所计算的人类正常器官累积活性输入到OLINDA放射量测定计算机程序中以使用核医学学会医用内放射剂量测定委员会(MedicalInternalDosimetry(MIRD)CommitteeoftheSocietyofNuclearMedicine)的形式计算标准男性的器官吸收剂量。洛文杰(Loevinger)等人，用于吸收剂量计算的MIRD引物(MIRDPrimerforAbsorbedDoseCalculations)(纽约核医学学会(SocietyofNuclearMedicine，NewYork)1991)。斯塔滨(Stabin)等人，OLINDA/EXM：在核医学中用于内剂量评估的第二代个人计算机软件(OLINDA/EXM：thesecond-generationpersonalcomputersoftwareforinternaldoseassessmentinnuclearmedicine).核医学杂志46，1023-1027(2005)。
急性毒性研究和组织病理学
在6组雄性和雌性B6D2F1小鼠(7周龄，缅因州巴尔港杰克逊实验室(JacksonLaboratories，BarHarbor，ME))中进行急性毒性检验。在单次静脉内注射(200μl)中，处理组(n＝6只雄性，n＝6只雌性)接受未标记的靶向探针(127I-RGDY-PEG-纳米粒子)，并且对照组(n＝6只雄性，n＝6只雌性)接受未标记的碘化PEG-纳米粒子(媒剂，127I-RGDY-PEG-纳米粒子)。对未处理的对照(n＝2只雄性，n＝2只雌性)进行额外测定。在注射后14天内每天观察小鼠发病/死亡和体重变化的征象，并且进行大体尸体剖检(grossnecropsy)、组织病理学，并且在注射后第7和第14天采血用于进行血液和血清化学评估(图10和表3)。
肿瘤特异性靶向的连续PET成像
使用专门的小动物PET扫描仪(福克斯(Focus)120显微PET；田纳西州那什维尔康科德公司(ConcordeMicrosystems，Nashville，TN))进行成像。在整个扫描期间，将携带M21或M21L后肢肿瘤的小鼠维持在2L/min下的含2％异氟烷麻醉的氧气中。在向所有小鼠静脉内注射200μCi124I-cRGDY-PEG-纳米粒子或124I-PEG-纳米粒子时起始一小时的列表模式获取(list-modeacquisition)，接着是在96小时间隔内的连续30min静态图像。针对扫描仪响应的不均匀性、死亡时间计数损失(deadtimecountloss)、随机计数以及注射时间的物理衰变校正图像数据。通过使用所测量的系统校准因子将所重构的图像中的体素(Voxel)计数率转化为活性浓度(％ID/g)。通过使用ASIPro软件(田纳西州那什维尔康科德显微系统公司)进行所重构的图像的三维相关区域(ROI)分析，以测定在肿瘤中探针吸收的平均值、最大值以及标准差(SD)。通过源自图像的肿瘤％ID/g值除以γ-计数器肌肉％ID/g值获得肿瘤与肌肉活性浓度比。
使用组合的NIR荧光成像和显微术的结点定位
通过4象限瘤周投予向携带后肢肿瘤的裸小鼠注射等体积的50μlcRGDY-PEG-点样品并且允许其自由行动。在30min到1小时间隔之后，用2％异氟烷/98％氧气混合物麻醉小鼠，并且沿着小鼠的腹面垂直进行表面旁中线切割以通过手术方式暴露从后肢到与肿瘤处于身体同侧的腋窝的区域。使用装配有650±20nmNIR激发和710nm长通发射滤光片的目测荧光显微镜进行局部区域淋巴结(例如腹股沟、腋窝)和引流淋巴管(包括腋区)的原位光学成像。如先前所报告，另外获得全身光学图像(剑桥研究工具大师成像器(CambridgeResearchInstrumentsMaestroimager))，并且进行光谱展开。伯恩斯等人，用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子，纳米快报9，442-8(2009)。
统计分析
使用单尾曼-惠特尼U(Mann-WhitneyU)检验(P＜0.05被认为具有统计学显著性)进行比较接受靶向/非靶向探针或携带M21/M21L肿瘤的肿瘤小鼠组的统计分析。对于生物分布研究，在每一时间点比较124I-cRGDY-PEG-纳米粒子(n＝7只小鼠)和124I-PEG-纳米粒子(对照，n＝5只小鼠)的组织特异性平均％ID/g值，同时血液、肿瘤以及主要器官在注射后4小时和96小时并且肿瘤和其它组织在注射后24小时都观察到了示踪剂活性的统计学显著差异(表1)。对于肿瘤靶向研究，发现M21肿瘤小鼠(n＝7)与M21L肿瘤小鼠(n＝5)以及接受对照探针的小鼠(n＝5)之间的平均％ID/g值的差异在注射后4小时(对于两个对照，p＝0.0015)最大，在24小时(分别为p＝0.0015和p＝0.004)、48小时(分别为p＝0.001和p＝0.003)、72小时(分别为p＝0.015和0.005)以及96小时(对于M21到M21L，p＝0.005)保持显著提高。发现124I-cRGDY-PEG-纳米粒子(n＝7)与124I-PEG-纳米粒子(n＝5)的肿瘤与肌肉比在注射后24小时(p＝0.001)和注射后72小时(p＝0.006)具有统计学显著性，但在注射后4小时(p＝35)不具有统计学显著性。使用非线性回归分析(SigmaPlot，Systat，版本11.0)测定尿液校准曲线(R2＝0.973，p＝0.01)以及尿液(R2＞0.95，p＝0.047)和粪便(R2＞0.995，p＜0.002)累积％ID排泄曲线的拟合度值(R2)以及其相关p值。
结果
纳米粒子设计和表征
根据先前公开的方法制备涂布有甲氧基封端的聚乙二醇(PEG)链(PEG约0.5kDa)的Cy5染料封装的核-壳二氧化硅纳米粒子(发射最大值＞650nm)。伯恩斯等人，用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子，纳米快报9，442-8(2009)。欧瓦(Ow)等人，明亮和稳定的核-壳荧光二氧化硅纳米粒子(Brightandstablecore-shellfluorescentsilicananoparticles).纳米快报5，113-117(2005)。中性PEG涂布防止网状内皮系统的非特异性吸收(调理作用)。双功能PEG的使用能够实现少量(每个粒子约6到7)αvβ3整合素靶向的环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGDY)肽配体的连接以维持促进有效肾清除率的较小流体动力学尺寸。通过使用酪氨酸连接子使肽配体额外经124标记，以提供能够通过PET三维定量成像的信号(124I-cRGDY-PEG-点，图6A)；当已经很大程度上清除背景活性并且使肿瘤与背景造影最大化时，寿命相对长的124I(物理半衰期：4.2天)的重要实际优势在于足量信号持续足够长的时间以允许投予后至少数天的放射性检测。通过放射性薄层色谱法，经放射性标记的靶向纳米粒子的纯度为＞95％。通过FCS测定，未经放射性标记的靶向纳米粒子的稳定性为约1年。通过FCS分析，粒子在尿液中被完整排泄。如本文所用，“点”与“纳米粒子”可以互换使用。含有用于124I标记的酪氨酸残基的经PEG涂布的粒子充当对照探针(124I-PEG-点)。通过尺寸排阻色谱对经放射性标记的样品的纯化(图7)产生＞95％的放射化学产率。通过荧光相关性色谱(FCS)测量非放射性cRGDY-PEG-点和PEG-点的流体动力学直径为约7nm(图6B和6C)。测定cRGDY-PEG-点的相对亮度平均比游离染料高200％(图6C)，这与之前的结果一致。伯恩斯等人，用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子，纳米快报9，442-8(2009)。拉松等人，二氧化硅纳米粒子架构决定封装发色团的辐射特性.化学材料20，2677-2684(2008)。基于这些物理化学特性，我们预期在靶向粒子的选择性肿瘤吸收和固持力与肾清除率之间实现有利平衡，由此使靶向组织定位最大化同时使正常组织毒性和辐射剂量最小化。
体外受体结合研究
为了检查124I-cRGDY-PEG-点和124I-PEG点对肿瘤和血管内皮表面的体外结合亲和力和特异性，使用了过度表达αvβ3整合素(M21)和不表达αvβ3整合素(M21L)的黑色素瘤和人脐静脉内皮(HUVEC)细胞系。使用流式细胞术，在一系列粒子浓度(0ng/ml到8ng/ml)和培育时间(高达5小时)内观察到了cRGDY-PEG-点的高度特异的线性并且可饱和的结合，在4小时和约2.0ng/ml粒子浓度时具有最大差异结合(数据未展示)。在用过量的未经放射性标记的cRGD初始培育M21细胞并且接着添加各种浓度的经放射性标记的靶向探针之后，使用γ-计数法检验124I-cRGDY-PEG点的受体结合特异性(图8A)。对结合数据的史卡查分析产生解离平衡常数Kd为0.51nM(图8A，插图)和受体浓度Bmax为2.5pM。基于Bmax值，估计αvβ3整合素受体密度为1.0×104/M21细胞，其合理地与先前公开的这一细胞系的估计值5.6×104一致。克雷斯曼(Cressman)等人，含RGD配体对细胞αvβ3整合素的结合和吸收(BindinganduptakeofRGD-containingligandstocellularαvβ3integrins).国际肽研究疗法杂志(INTJPeptResTher.)15，49-59(2009)。在4℃到37℃的温度范围内还观察到了整合素特异性M21细胞吸收的递增性增加，表明受体介导的细胞内化有助于总吸收(数据未展示)。通过流式细胞术，使用靶向探针的额外竞争性结合研究显示了受体介导的与抗αvβ3整合素抗体的结合被完全阻断(图8B)。使用过量的cRGDY或抗αvβ3整合素抗体都没有观察到受体与M21L细胞结合的量级(M21为约10％)的显著降低(图8C)。通过额外的γ-计数研究确认了这些结果，并且124I-cRGDY-PEG-点的50％结合抑制浓度IC50测定为1.2nM。使用抗附着分析和M21细胞，发现cRGDY-PEG-点相对于单体cRGD肽的关联多价强化因素大于2.0(数据未展示)。蒙泰等人，通过纳米粒子显示获得的RGD肽的多价效应.药物化学杂志49，6087-6093(2006)。李等人，用于肿瘤αvβ3整合素表达的小动物PET的经64Cu标记的四聚和八聚RGD肽(64Cu-labeledtetramericandoctomericRGDpeptidesforsmall-animalPEToftumorαvβ3integrinexpression.)核医学杂志48，1162-1171(2007)。类似于M21细胞，过量抗体有效地阻断cRGDY-PEG-点受体与HUVEC细胞结合(通过流式细胞术)(图8D)。
生物分布和清除率研究
通过向M21肿瘤异种移植物小鼠模型静脉内投予示踪剂剂量(约0.2纳摩尔)的124I-cRGDY-PEG点和124I-PEG-点评估时间依赖性生物分布以及肾脏和肝胆管的清除率(图9)。虽然在注射后(p.i.)196小时时间间隔内测量了靶向探针的组织活性浓度(每克注射剂量的百分比(％ID/g))，但124I-cRGDY-PEG点(图9A)和124I-PEG-点示踪剂(图9B)的比较被限定于96小时范围，因为第1周没有获得后者的数据。在注射后4小时和96小时观察到了血液、肿瘤以及主要器官以及在注射后24小时观察到了肿瘤和若干其它组织的示踪剂活性的统计学显著(p＜0.05)差异(表1)。靶向探针在注射后1周几乎被完全从躯体清除(约3％ID)。这些示踪剂的血液、肿瘤以及主要器官滞留半衰期(T1/2)示于表2中(第2和第5列)。代表性数据组(血液滞留)示于图9A的插图中。测定124I-PEG-点的相对长的血液T1/2值为7.3±1.2小时。在附接cRGDY肽以合成124I-cRGDY-PEG-点后，T1/2值略降低到5.6±0.15小时，但伴随有较高的探针生物可用性(表2，第3列)。发现124I-cRGDY-PEG-点的肿瘤T1/2值是血液的约13倍，相比之下124I-PEG-点仅有5倍差异(表2，第2和第5列)。
表1
比较124I-cRGDY-PEG-点与124I-PEG-点的生物分布研究p值
表2
70kg标准男性，U(上)，L(下)，§小鼠黑色素瘤模型，ξ远低于其它组织的骨骼活性(未报告)
通过将前述生物分布数据适当质量调节转化为男性，推导出人类正常器官辐射剂量并且发现其与其它常用诊断性放射性示踪剂的辐射剂量相当(表2，第8、9列)。与靶向探针无毒并且不导致组织特异性病理影响(即非急性毒性)的发现(图10和表3)一起，计划了用这些试剂首先在男性中的靶向和非靶向分子成像应用。
表3
N：正常，U：不可获得，NP：不存在，1：最小，2：中度，F：有焦点，MF：多焦点
在确认127I-RGD-PEG点在静脉内投予小鼠后无毒的另一个研究中，使用约100倍人类剂量当量的127I-RGD-PEG点在2周的过程内进行正式单剂量毒性测试。127I-PEG点充当对照粒子。总体而言，程序如以下所述。在急性毒性研究中使用了二十八只8周龄B6D2F1小鼠，并且将其分成处理组和对照组。处理组(n＝6只雄性+6只雌性)静脉内接受剂量为1×10-9摩尔/小鼠的一个剂量的127I-聚乙二醇化RGD二氧化硅纳米粒子，并且对照组(n＝6只雄性+6只雌性)接受相同量的媒剂。在给药和临床化学后第7天处死两只小鼠/组(1只雄性和1只雌性/组)，在尸体解剖时进行血液学和组织特异性组织病理学检查。所有剩余的动物(n＝5只雄性+5只雌性/组)都在处理后观察14天。将四只未经处理的小鼠(两只雄性和两只雌性)用作对照。研究的结论是在给药过程中或者之后的14天观察期没有观察到不良事件。没有观察到死亡或发病。临床观察包括无以下情况：贫血、体重降低、躁动、呼吸加快、GI紊乱、行为异常、神经功能障碍、血液异常、临床化学异常、器官病理学上与药物相关的病变。因此，以1×10-9摩尔/小鼠单次注射127I-聚乙二醇化RGD二氧化硅纳米粒子(等同于阶段0成像研究所需的聚乙二醇化RGD二氧化硅纳米粒子剂量的100倍过量的剂量)在B6D2F1小鼠中是安全并且无毒的。
通过尿液样品的荧光测定分析，发现直径约7nm的靶向和非靶向探针在168小时时间段内的有效肾排泄。基于连续稀释校准方案，对荧光信号进行背景校正并转化为粒子浓度(％ID/μl)(图9C，插图；表4，第2列)。伯恩斯等人，用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子，纳米快报9，442-8(2009)。浓度值以及平均尿液排泄率的年龄依赖性保守估计准许计算所排泄的累积％ID(表4，第4列)。德里卡默(Drickamer)，家鼠的尿液排泄率(家鼷鼠(musdomesticus))：年龄、性别、社会地位以及繁殖条件所造成的差异(Ratesofurineexcretionbyhousemouse(musdomesticus)：differencesbyage，sex，socialstatus，andreproductivecondition).化学生态杂志(J.Chem.Ecol.)21，1481-1493(1995)。观察到几乎一半的注射剂量(约43％ID)在注射后的前24小时都被排泄并且到96小时时约72％ID被排泄(图9C)，这表明在注射后第1天已经发生了大量排泄。在注射后168小时时，在尿液中未能检测到显著的粒子荧光。124I-cRGDY-PEG-点的粪便排泄图指示，在24小时和96小时内分别清除了平均7％ID和15％ID注射剂量(图9D)。在注射靶向探针后的多个时间点获得的尿液样品的FCS分析揭露，粒子被完整地排泄并且没有释放出封装的染料(数据未展示)。
表4
尿液浓度和累积排泄数据
连续全身PET研究
在静脉内注射124I-cRGDY-PEG-点或124I-PEG-点(对照)后的多个时间点对M21和M21L皮下后肢异种移植物小鼠模型中的整合素表达进行PET成像。在注射后4小时(左：M21肿瘤；中间：M21L肿瘤)和24小时(右：M21肿瘤)的代表性全身冠状面显微PET图像示于图11A中。从这些图像清楚可见过度表达αvβ3整合素的M21肿瘤的特异性靶向。显示了接受靶向124I-cRGDY-PEG-点的M21(n＝7)和M21L(对照)肿瘤(n＝5)组以及接受非靶向124I-PEG-点示踪剂的M21肿瘤小鼠(n＝5)的平均肿瘤％ID/g和标准差(图11B)。在最大肿瘤吸收时(注射后约4小时)，在M21肿瘤中看到活性-浓度比对照高三倍。除1小时(p＝0.27)外，在注射后所有时间点(p＜0.05)的差异都具有统计学显著性。
源自图像的124I-cRGDY-PEG-点的肿瘤与肌肉吸收(％ID/g)比揭露在随后的时间(注射后约24到72小时)的增强的肿瘤造影，而124I-PEG-点的肿瘤造影则变弱(图11C)。这一发现表明124I-cRGDY-PEG-点实际上是肿瘤选择性的，其由于血液活性在起始的24小时期间被清除而变得较明显(比较图11C与图9A的插图)。在124I-cRGDY-PEG-点与124I-PEG点两者的源自PET的肿瘤组织％ID/g值与对应的离体γ-计数肿瘤％ID/g值之间发现统计学显著的相关性(相关系数r＝0.94，P＜0.0016；图11D)，这证明了PET用于非侵入性推导的定量生物分布数据的精确度。
体内NIR荧光成像和显微术
我们使用我们的用于定位局部/区域性结点和淋巴通道的小靶向纳米粒子进行了体内荧光成像研究，由此克服了前述限制。重要的是，我们的靶向粒子探针的多模态性质和小尺寸可以被开发以在4象限瘤周投予之后使得在我们的黑色素瘤模型中的一系列结点尺寸和淋巴分支可视化，从而模拟手术中人类前哨淋巴结定位程序。最初，在4小时时间段内使用靶向或非靶向粒子探针在完整的小鼠中进行连续NIR荧光显微术。靶向探针的瘤周投予揭露以这一间隔向相邻腹股沟和腘结点的引流和所述相邻腹股沟和腘结点的持续可视化，其中较小和/或较远的结点和淋巴管较难以可视。相比之下，非靶向探针产生局部结点的较短期(约1小时)可视化，观察到其逐渐减弱的荧光信号(数据未展示)。在手术暴露之后，发现这一观察结果是由来自肿瘤位点的与用靶向探针所观察到的延长滞留相比较快速的粒子扩散所造成的。
我们接着使用活动物的全身光学成像(图12A)和NIR荧光显微术(图12B)在多个空间尺度上进行了代表性淋巴结定位，以使以手术方式暴露的活动物中的从瘤周区域到腹股沟和腋窝结点的淋巴引流可视化。此外，较高分辨率的荧光图像(图12B，下行)准许包括高内皮微静脉在内的更详细的结内结构可视化，这促进了循环原生性淋巴细胞向结点内的流通，并且这可能对结点分期和在疾病较早期阶段检测微转移的能力具有重要意义。通过在腋窝区域中的荧光显微术还使较小、较不强的淋巴分支可视化(数据未展示)。因此，靶向探针的小尺寸不仅准许靠近肿瘤的初始引流(或前哨淋巴结)可视化，还能够使较远的结点和待可视化的淋巴引流模式可视化。
讨论
我们报告了无毒、高亲和力并且被有效清除的二氧化硅纳米粒子用于肿瘤选择性靶向和结点定位，从而成功解决了与其它粒子技术相关联的多个当前难题。这是基于其有利性质而可以被称为在临床上可转化为组合的光学PET探针的首个靶向纳米粒子。与其小尺寸(直径约7nm)偶合的这一多模态探针的互补性质可以通过使得在不同空间、时间和灵敏度规模下获取的成像数据能够无缝整合而有利于临床评估，从而潜在地为支配肿瘤生物学的基础分子过程提供新思路。
我们的活体外结果显示了约7nm的靶向粒子探针与M21和HUVEC细胞的受体结合特异性。使用相同细胞类型但用肽的单价形式的受体结合分析已经报告了类似发现。克雷斯曼等人，含RGD配体对细胞αvβ3整合素的结合和吸收.国际肽研究疗法杂志15，49-59(2009)。重要的是，结合cRGDY的粒子探针的多价强化连同扩展的血液和肿瘤滞留时间T1/2值是与粒子平台相关联的重要特性，在用肽的单价形式时没有发现所述特性。
所估计的124I-PEG-点示踪剂的相对长的血液T1/2值(7.3±1.2小时)可能与涂布有在化学上为中性的PEG的表面有关，其使得探针在生物学上呈惰性并且显著较不易于被网状内皮组织系统吞噬。发现124I-cRGDY-PEG-点示踪剂的T1/2值降低到5.6±0.15小时，这极有可能是被靶向整合素和/或更具活性的巨噬细胞活性识别的结果。然而，这实质上长于现有cRGDY肽示踪剂的已公开的血液T1/2值(约13分钟)，并且在更长的时间段内产生更大的探针生物可用性，从而促进肿瘤靶向并且产生更高的肿瘤吸收。蒙泰等人，通过纳米粒子显示获得的RGD肽的多价效应.药物化学杂志49，6087-6093(2006)。此外，124I-cRGDY-PEG-点的肿瘤T1/2值是血液的肿瘤T1/2值的约13倍，相比之下，124I-PEG-点的肿瘤T1/2值与血液的肿瘤T1/2值差异仅为5倍，这表明前者的靶向组织定位实质上大于后者。体内数据的此类机制性解释可以被开发以优化临床诊断、治疗规划以及治疗监测方法。
本研究的结果强调了由强大的可定量并且高度灵敏的成像工具PET提供的用于非侵入性地提取与受体表达水平、结合亲和力以及特异性有关的分子信息的明显优势。与周围的正常结构相比，在M21肿瘤中的较大积聚和从M21肿瘤的较慢清除允许辨别特异性肿瘤吸收机制与正常组织中的非特异性机制(即组织灌注、渗漏)。然而，推测小部分的M21肿瘤吸收可归因于血管渗透率变化(即，增强的渗透率和固持作用)。西摩(Seymour)，可溶性大分子和药物结合物的被动肿瘤靶向(Passivetumortargetingofsolublemacromoleculesanddrugconjugates).医疗药物传送系统评论(Crit.Rev.Ther. DrugCarrierSyst.)9，135-187(1992)。基于所观察到的％ID/g在接受对照示踪剂的小鼠中的提高，这一非特异性吸收模式反映了在注射后较早时间点的相对较小部分的总肿瘤吸收(124I-PEG-点，图11B)。在注射后1小时，在M21肿瘤中没有看到优于对照的显著的％ID/g提高。这一观察结果可以反映在第一个小时中差异灌注的影响，在随后的注射后时间(即24小时)主要看到肿瘤积聚和固持。此外，与临床上批准的肽示踪剂18F-半乳糖RGD相比，发现124I-cRGDY-PEG-点34在M21肿瘤中的吸收几乎比其大两倍，同时额外提供多价结合、扩展的血液循环时间以及更大肾清除率的优势。
组合的光学-PET探针的一个优势是评估尺寸为PET扫描仪的分辨率界限(即所谓的部分容积效应)或远低于PET扫描仪的分辨率界限的解剖结构的能力，其可能破坏病变中的活性检测和定量。举例来说，在小动物模型中，考虑到所观察的结点尺寸典型地约为系统空间分辨率(1mm到2mm)，PET成像可能不充分解决小局部/区域性结点中的转移性疾病的评估，而这种评估在临床上对黑色素瘤分期和治疗至关重要。通过利用第二互补并且灵敏的成像模态，可以获得近红外(NIR)荧光成像、揭露结点病变的功能图和淋巴引流模式。巴卢等人，在小鼠肿瘤模型中使用量子点的前哨淋巴结成像.生物结合 物化学18，389-396(2007)。虽然需要其它的研究与转移性病灶有关的结点内cRGDY-PEG-点荧光分布的研究从而确定是否能够实现所述病灶的灵敏定位，但这些结果清楚地展现用所述组合的光学-PET探针工作的优势。
在临床中，不能夸大所述组合的平台用于肿瘤分期和治疗的益处。这一纳米探针的扩展的血液循环时间和所得生物可用性凸显了其在不受毒性考虑因素所施加的限制的情况下作为用于早期与长期监测疾病管理的不同阶段(诊断性筛选、治疗前评估、治疗性干预以及治疗后监测)的通用工具的用途。另一个重要优势是，虽然快速清除的探针可以适用于标靶组织定位本身较快的某些应用，但许多试剂在全身性投予后在血管化通常较弱并且另外相对难以接近的实体肿瘤中的定位将可能是缓慢的。因此，由于标靶组织定位的动力学不再受限，当前的纳米粒子平台扩展了此类试剂的应用范围。此外，通过PET可以在其分布和数量方面对深结点进行定位，同时可以通过NIR荧光成像获得表面结点的更准确、详细的定位。最后，除了其多价强化外，来自肿瘤的靶向探针相对于来自血液的相对延长的滞留可以作为放射性治疗或药物递送媒剂用于未来的治疗诊断应用。
实例5.与αvβ3整合素靶向肽和/或uMUC1靶向肽结合的荧光二氧化硅纳米粒子(甲状腺癌和鳞状细胞癌(SCC)模型)
将经由巯基-马来酰亚胺键使具有半胱氨酸末端官能团的cRGD肽(肽国际(PeptidesInternational))附接到聚乙二醇化纳米粒子上。所述纳米粒子可以任选地由合成肽配体EPPT1进一步功能化。将在粒径、尺寸分布以及光褪色的基础上表征所述纳米粒子。
纳米粒子-肽结合物的表征
为了在每个粒子基础上评估光物理特性，将使用分光光度法、光谱荧光分光光度法以及多光子荧光相关性光谱(FCS)来测定粒径、亮度以及尺寸分布。将通过扫描电子显微术和动态光散射(DLS)测量值来确证尺寸数据。欧瓦等人，明亮和稳定的核-壳荧光二氧化硅纳米粒子.纳米快报2005；5，113。将在碱性条件和缩二脲分光光度法下在比色学上评估每一纳米粒子的RGD肽平均数量和RGD与功能化PEG基团的偶合效率(λ＝450nm，最大吸光度)。
将通过使用非水溶性碘化试剂(Iodogen)(伊利诺伊州罗克福德皮尔斯(Pierce，Rockford，IL))经由酪氨酸连接子对纳米粒子结合物进行碘化以产生经放射性标记(124I)(T1/2约4天)和稳定(127I)形式。将通过使用尺寸排阻色谱法来纯化最终产物。
评估RGD-纳米粒子和RGD-EPPT-纳米粒子的体外靶向特异性和生物分布模式
将使用抗整合素和抗uMUC1抗体，相对于已知αvβ3整合素阴性和αvβ3整合素阳性(分别为M21-L和M21人类黑色素瘤细胞系)以及uMUC1-阴性和uMUC1-阳性(分别为U8728、H-29细胞系)对照，对甲状腺和鳞状细胞癌(SCC)细胞系中的αvβ3整合素和uMUC1表达谱进行评估。将选择高度表达αvβ3整合素和/或MUC1的细胞系用于与RGD-纳米粒子和RGD-EPPT-纳米粒子的差异结合研究，以及用于体内成像。
定量细胞结合分析将评估肿瘤细胞的标记效率，并且将使用放射性碘标记纳米粒子结合物(124I-RGD-纳米粒子、124I-RGD-EPPT-纳米粒子)进行分析在肿瘤、器官以及流体中的吸收的生物分布研究。为了将纳米粒子结合物的PET吸收数据与使用光学NIRF成像最初观察到的PET吸收数据相比较，还将对每一纳米粒子结合物进行碘化以产生经放射性标记(124I)和稳定(127I)的形式。
使用RGD-点和RGD-EPPT-C-点的荧光显微术.将通过荧光显微术使RGD-纳米粒子和RGD-EPPT-纳米粒子与高度表达αvβ3整合素和/或MUC1的甲状腺癌瘤/SCC细胞系(相对于对照细胞系)的差异结合可视化。
动物模型.将根据机构动物照护与使用委员会批准的方案并且遵循NIH动物福利指南进行所有动物实验。
体内生物分布：将向雄性无胸腺裸小鼠(6到8周龄，每种肿瘤n＝5)的两侧腹皮下(s.c.)注射不同组织来源的整合素-阴性/整合素-阳性或uMUC1-阴性/uMUC1-阳性肿瘤(每种肿瘤n＝3)。在直径(i.d.)为0.5cm时，将向小鼠静脉内注射(IV)经124I-标记的纳米粒子结合物(约500nm/kg)。在0.5、1以及24小时后处死动物，去除肿瘤、器官以及流体用于称重和计数(γ计数器)。生物分布结果将表示为每克组织所注射的剂量的百分比。
定量细胞结合分析.将通过在潮湿的CO2气氛下于37℃下将高度表达αvβ3整合素和/或MUC1的固定数量的癌瘤细胞与浓度预先选定的经124I标记的纳米粒子结合物一起培育1小时来评估标记效率。充分洗涤细胞，用0.1％曲拉通(Triton)X溶解，在γ计数器中对其进行计数。
使用体内多模态(PET-NIRF)成像评估肿瘤特异性靶向的相对差异
作为高通量诊断筛选工具，光学NIRF成像可以用于以增加的灵敏度和瞬时分辨率来评估逐渐功能化的纳米粒子结合物在体内的生物分布的相对差异。还可以推导肿瘤特异性靶向的半定量数据。这些初步研究促进强表达所关注的标记物的细胞系的选择，所述标记物用于使用PET对生物分布和肿瘤特异性靶向进行更详细的定量。
将在1周时间段内进行全身microPETTM和NIRF光学成像以评估侧腹肿瘤中的差异吸收。将用离体肿瘤的荧光显微术来证实这些研究的结果。
连续体内NIFR成像.将向小鼠两侧注射αvβ3整合素-阴性和αvβ3整合素-阳性细胞或uMUC1-阴性和uMUC1-阳性细胞(n＝5/肿瘤)。在肿瘤达到直径约0.5cm时，将静脉内注射稳定的碘化和未碘化的纳米粒子结合物(RGD、127I-RGD、RDG-EPPT、127I-RGD-EPPT)。将在0、0.5、1、2、4、6、12以及24小时使用MaestroTM体内荧光成像系统(马萨诸塞州沃本的CRI(CRI，Woburn，MA))进行连续成像。在24小时，安乐死小鼠，并且解剖主要组织/器官、将其称重并且放置在6孔板中用于离体成像。将使用光谱解混算法使用相关区域(ROI)在肿瘤、所选组织以及参考注射液上分析荧光发射以消除自身荧光。用组织的平均荧光强度除以注射液值将准许在各种组织/器官之间对每一经注射的纳米粒子结合物进行比较。
动态显微PET成像获取和分析.将向两组荷瘤小鼠(n＝5/肿瘤)注射经放射性标记的124I-纳米粒子结合物(放射性示踪剂)，并且使用福克斯120microPETTM(田纳西州那什维尔康科德公司)持续1小时进行动态PET成像。在静脉内注射约25.9MBq(700μCi)放射性示踪剂时起始一小时列表模式获取。通过滤波反投影在128×128×96矩阵中重构所得的列表模式数据。使用ASIProTM软件(田纳西州康科德显微系统公司(ConcordeMicrosystems，TN))进行重构图像的ROI分析以确定肿瘤、其它器官/组织以及左心室(LV)中的放射性示踪剂吸收(％ID/g)的平均值和标准差。将从注射后24小时、48小时以及72小时的静态图像获得额外数据。将使用三区间、四参数动力学模型表征示踪剂的体内行为。为了这一分析，使用放置在LV上的ROI来测量动脉输入。
实例6-在小型猪中的结点定位
目前实际上还不能实现结点盆的实时手术中扫描，这是因为这些系统通常过于繁琐并且在操作组中使用时较为昂贵，或可能不能提供必要的视场或组织造影。此外，也不能获得在临床上有希望的含有生物稳定荧光团的试剂，其提供优于母体染料的改进光物理特征和更长的循环寿命、可用于增强组织造影以用于扩展的结点定位/切除程序。使用这一动物研究，我们将展示多模态粒子探针与实时分子成像装置技术两者的优势可以被容易地转化为多种未来的人类临床试验。此类转化型技术可以通过以下来显著影响标准手术中癌症护理：提供目前先进技术的靶向可视化工具以促进转移性SLN的检测并且允许与相邻解剖结构的精确结点定界从而使损伤重要结构的风险最小化。益处包括头和颈中的结点疾病传播和肿瘤程度的扩展的实时体内手术中定位。可以通过PET对深结点进行定位，同时可以通过NIR荧光成像获得表面结点的精确并且详细的定位。粒子探针的小尺寸还可以扩展可被灵敏检测的结点尺寸的下限。所提出的无毒多模态平台连同组合的诊断/治疗程序的应用的净效应对于这种高致死性疾病的疾病分期、预后以及临床结果具有重要意义。
疾病靶向.除了黑色素瘤之外，多种其它肿瘤(即乳房、肺以及脑)也过度表达αvβ3整合素受体并且可以充当疾病标靶。转移性黑色素瘤的预后极差，并且存活中值小于1年。成功控制依赖于早期鉴别以及癌症的适当手术切除。在美国，原发性疾病的手术去除、筛选以及治疗区域性淋巴结扩散是精确对疾病分期和量身治疗(tailortreatment)的护理标准。最近修订的分期指南认识到用显微镜可见的结点转移的存在是导致存活率大幅降低的晚期疾病的标志。对病理性结点状况的了解对早期风险分层、结果预测的改进以及患者子群的选择至关重要，这可能受益于辅助治疗(治疗性结点解剖、化学疗法)或临床试验。
前哨淋巴结(SLN)定位.在分期黑色素瘤中常规使用的SLN定位技术，其鉴定处于最高的肿瘤转移风险下的具体结点。这一程序鉴别患有转移性疾病的患者以用于进一步治疗。标准护理技术依赖于在原发性肿瘤周围注射用于SLN定位的放射性锝(99mTc)胶体硫染料，接着是手术中使用γ探针以测量在暴露结点盆内的淋巴结构中的放射性。在原发性肿瘤周围注射的蓝色染料可以帮助从相邻组织定界小SLN，但所述技术不可靠并且易于产生并发症。当前的SLN定位和生检技术具有局限性，并且与其它解剖位点相比，SLN在头和颈中的非定位占较高比率。头和颈区域以其不可预测的转移性疾病模式而为人所知。在这一区域中原发性疾病与结点转移的紧密相接使得由于来自注射位点的干扰而难以在手术中使用γ探针。重要的是，目前的技术不允许外科医生看到前哨结点并且可靠地将其与相邻脂肪或其它组织区分，从而使得重要结构(即神经)在解剖以鉴定和收集这一结点期间处于受损伤的风险下。结点的小尺寸和在引流模式中的宽变化带来了额外的挑战，从而导致约10％的非定位率。
纳米粒子.大部分临床前研究都已经使用RGD肽或肽-结合物放射性示踪剂作为用于使αvβ3整合素表达成像的靶向配体。18F-半乳糖-RGD和99mTc-NC100692是已经成功用于患者中以用于诊断疾病的肽示踪剂。肽示踪剂快速清除，这可以导致受体结合降低和来自非特异性组织分散的背景信号增加。这些特性限制了肽示踪剂用于长期监测的潜能。相比之下，也已经用于使沿肿瘤新生血管的整合素表达成像的纳米粒子探针(约10nm到100nm)已经扩展了循环半衰期以用于进行较长期监测(即，数天)。纳米粒子典型地大于抗体和放射性药物(＜10kDa)，并且由于变化的肿瘤血管渗透率而与较慢的跨膜转运、增加的网状内皮组织系统(RES)吸收以及增强的非特异性吸收有关。用于这一SLN定位研究的直径7nm的靶向纳米粒子大致与白蛋白分子的平均直径类似并且比典型抗体的平均直径小2到3倍。相对于肽示踪剂，靶向粒子探针较不易于溢出并且与增强肿瘤靶向的扩展的循环半衰期有关。重要的是，124I-cRGDY-PEG-点展现了临床转化所必需的在M21肿瘤中的重要的体外和体内特性。
材料和方法.
向自发性黑色素瘤辛克莱小型猪(Sinclairminiatureswine)(10kg到12kg，密苏里州辛克莱研究中心(SinclairResearchCenter，MO))静脉内注射5mCi18F-氟-脱氧葡萄糖(18F-FDG)以用于结点和/或器官转移的全身筛选。使用临床PET扫描仪使小型猪在注射后40分钟接受1小时动态18F-FDGPET全身PET扫描，以筛检转移性疾病，接着是用于解剖定位的CT扫描获取。接着，在18F-FDGPET后48小时在肿瘤位点的周围以4象限模式向小型猪皮下注射多模态124I-RGD-PEG-点，并且进行第二动态PET-CT扫描以评估额外的结点转移。
将小型猪带到操作室中用于鉴定结点。使用大视野近红外荧光相机系统、较小视野的改良内窥镜以及改良的立体显微镜进行光学荧光成像，以在暴露的手术床内获得较高分辨率的荧光图像。
使用临床批准的手持式PET装置通过γ计数在操作床内在手术中进行荧光信号验证，以对在手术中从皮肤和在结点盆内的结点获得的靶向点进行经皮定位。
切除原发性黑色素瘤皮肤病变并且进行切割以允许接近前哨结点。使用手持式PET和多规模光学成像系统确认结点鉴定，并且切除所讨论的结点。样本送于对转移的组织学评估和光学共聚焦显微术以确认恶性肿瘤与纳米粒子荧光两者的存在。
出于相关目的，在收集前哨结点之后，切除整个淋巴结盆，并且使用组织学方法(视需要，用于黑色素瘤的免疫组织化学标记物)、荧光显微术和手持式PET探针进行进一步评估。通过在成像上的出现，这一步骤有助于鉴定在结点盆内的任何其它恶性结点和在相邻结点内存在的124I-RGD-PEG-点的数量。
依次向动物的四肢皮下投予124I-RGD-PEG-点。使用光学成像系统和手持式PET探针跟踪124I-RGD-PEG-点到腹股沟/腋窝结点的传输，以确认沿着淋巴通路的传输的持续时间。以手术方式暴露引流结点盆并且观察淋巴结引流的模式。从每一位点收集前哨淋巴结以确认组织的淋巴性质。安乐死动物，并且在动物设施的尸检房切除在成像上注意到的任何进一步病变。
讨论
全身18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)PET-CT扫描揭露了与上背部上的脊椎相邻的原发性黑色素瘤病变以及在动物右侧后部的颈内的单个结点，两者都是FDG亲合的，并且怀疑其为转移性疾病。在肿瘤位点周围皮下4象限注射124I-RGD-PEG-点(其额外鉴定出另外两个高代谢亢进结点以及引流淋巴管)后，确认了这一发现。最终扫描解释指向3个潜在的转移性结点。在手持式PET探针在前哨结点的位置处鉴定并且确认了升高的计数率之后，从两侧进行对来自颈部的其它结点盆的原发性病变、代谢亢进结点以及组织的手术切除。通过病理学分析使在所切除的右后方前哨结点组织中所测量的补缀荧光信号与黑色素瘤转移瘤的位点相关联。所有代谢亢进结点样本都被着色成黑色，并且发现其与独特的黑色素瘤细胞簇的存在相关。因此，被提交到病理学以用于H&E和其它已知黑色素瘤标记物染色的手术切除组织的结果证明了多模态成像发现。
图13a显示了使用自发性小型猪黑色素瘤模型用于对淋巴结盆和引流已知原发性黑色素瘤肿瘤位点的区域性淋巴管进行定位的实验装置。需要这种中等尺寸的小型猪模型以模拟人类体内的前哨淋巴结(SLN)生检程序的应用，并且更准确地概括人类疾病。图13b显示了在肿瘤位点周围皮下注射多模态粒子(124I-RGD-PEG-点)后5分钟的小视野PET图像。肿瘤区域、淋巴结以及引流肿瘤位点的淋巴管视为活性增加的区域(黑色)。
图14显示了全身动态18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)PET扫描(图14a)和融合18F-FDGPET-CT扫描(图14b)，其展现通过颈内结点的疾病位点的径向、冠状面以及轴向图像。进行18F-FDGPET扫描以对静脉内投予经放射性标记的纳米粒子探针之后和投予所述纳米粒子探针之前的转移性疾病的位点进行定位。在动物右侧的颈后观察到了单个代谢亢进结点(箭头，轴向图像，上图/下图)，还在全身小型猪图像上进行了鉴定(图14c)。
图15显示了与图14相同的图像组，但是在与上背部上的脊椎相邻的原发性黑色素瘤病变的水平上。鉴定了PET亲合病变(箭头，轴向图像，上图/下图)，并且在全身小型猪图像上进行了鉴定(图15c)。
图16显示了模拟临床方案，在1小时时间段内，在肿瘤位点周围皮下4象限注射124I-RGD-PEG-点后的高分辨率动态PET(图16a)和融合PET-CT图像(图16b)。在颈内发现三个代谢亢进淋巴结(箭头)，这表明转移性疾病。切除右后SLN并且进行全身近红外(NIR)荧光成像。在全身光学成像上，在所切除的结点内可检测到Cy5荧光信号(图16c，上，Cy5成像)。在通过H&E染色获得的结点的低功率(箭头)和高功率截面图(下方两幅图)上，这一黑色着色的结点(箭头，SLN)的病理学分析展现了侵袭性黑色素瘤细胞簇，并且我们预期黑色素瘤特异性，所述特异性待使用特殊染色剂(MelanA、HMB45、PNL2以及“黑色素瘤相关抗原”拜力纯系NKI/C3(“melanomaassociatedantigen”biogenexcloneNKI/C3))进一步证明。另外，我们还根据共聚焦荧光显微术和高分辨率数字放射自显影术预期粒子与这些转移性细胞簇的共定位，从而确认转移性疾病检测。
实例7与MC1R靶向肽结合的荧光二氧化硅纳米粒子(黑色素瘤模型)
对于多模态(PET-NIRF)诊断性成像实验，将替换纳米粒子表面上的靶向肽和放射性标记以测定靶向特异性、结合亲和力/亲合力以及检测灵敏度。随后还将使用用于靶向杀死表达MC1R的黑色素瘤细胞的治疗性放射性标记(镥-177，177Lu，t1/2＝6.65天)来合成治疗性粒子。组合的定量PET与光学成像发现将与肿瘤组织放射自显影和跨越空间尺度的光学成像相关。对于细胞显微术，将使用用于组合的反射比与荧光成像的体内共焦荧光扫描仪。
实例8用于靶向放射线疗法的荧光纳米粒子
将进行用131I-RGD纳米粒子进行的剂量扩大研究，并且将使用18F-FDGPET在六周的过程内每周对治疗反应进行监测。将使用平面γ相机成像来进行纳米粒子平台的时间依赖性肿瘤吸收和放射量测定。体内成像数据将与所切除的肿瘤样本的γ计数相关。
将使用雄性裸小鼠(6到8周龄，马萨诸塞州查尔斯河实验室(CharlesRiverLabs，MA))以在注射M21人类黑色素瘤细胞(含5×105个细胞的PBS)后产生后腿异种移植物模型。将允许肿瘤生长10到14天直到尺寸为0.5cm3到0.9cm3。
基于131I-的靶向放射线疗法研究.将使用治疗性放射性核素131I作为用于靶向放射线疗法的放射性标记。在对不导致动物死亡并且体重降低小于20％(MTD)的131I最高可能剂量的评估中，将在荷瘤裸小鼠中进行剂量扩大研究。为了向血液54投予200拉德(rad)剂量，需要10MBq的投予活性，其将会将270拉德的剂量递送到肿瘤。使用经设计以允许修复和节约骨髓的剂量分割，将投予10MBq的4个剂量以实现大于1000拉德的肿瘤剂量。131I允许使用针孔瞄准仪的平面γ相机成像以测量纳米粒子的时间依赖性肿瘤吸收和放射量测定。18F-FDGPET允许定量监测肿瘤反应，因此提供互补信息。
基于这一数据和荷载有太平洋紫杉醇的纳米粒子的体内作用数据，将进行用131I-RGD-纳米粒子结合物进行的疗法研究。两组荷瘤小鼠(n＝10/组)将接受四个以每周一次共4周静脉内投予的131I-RGD-纳米粒子结合物的10.4MBq活性或盐水媒剂(对照，n＝10))，并且将在6周时间段内进行监测。将基于肿瘤体积(经由卡尺测量)对治疗反应/进展进行定量。还将通过SPECT成像(伽玛医药(GammaMedica))在6周时间段内对来自治疗组的所有小鼠每周成像一次(约1小时时间)。
18F-FDGPET成像获取和分析.两组荷瘤小鼠(n＝10/组)将在治疗前并且接着以每周为基础在治疗后以6周间隔经历初始PET扫描。将向小鼠静脉内(i.v.)注射500μCi18F-FDG，并且将在治疗前和治疗后使用福克斯120microPETTM(田纳西州康科德显微系统公司)获取静态10分钟PET图像。将通过滤波反投影在128×128×96矩阵中重构所获取的数据。将使用ASIProTM软件(田纳西州康科德显微系统公司)进行所重构的图像的相关区域(ROI)分析以确定肿瘤中的放射性示踪剂吸收(％ID/g)的平均值和标准差。将在研究结束时处死动物并且切除肿瘤用于γ计数。
实例9与放射性核素螯合剂和MC1R靶向肽结合的荧光纳米粒子
聚乙二醇化的纳米粒子将与靶向肽和结合高度比活性的放射性标记的单环螯合物结合
使用标准程序，使经NHS酯或马来酰亚胺衍生的高纯度的双臂活化的市售PEG附接到纳米粒子的二氧化硅外壳。两个官能化的PEG基团(NHS酯或顺丁烯二酰亚胺)中的任一者将可用于与肽-螯合剂构筑体，环肽Re-[Cys3，4，10，D-Phe7]α-MSH3-13(ReCCMSH(Arg11))，或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)连接子螯合剂进一步结合。衍生的PEG共价附接到纳米粒子表面将以使用于键联DOTA和肽-螯合剂构筑体的不同官能团暴露的方式进行，如下文所论述。
官能化的纳米粒子的合成和物理化学表征
官能化的纳米粒子将通过建立以下部分与衍生的PEG基团的共价键来合成：
(A)DOTA螯合物，其用于随后用正电子发射放射性金属(即64Cu)进行高比活性放射性标记以允许用PET成像进行诊断检测。使用标准Fmoc化学将DOTA结合于官能化的PEG，并将通过色谱法进行螯合的纳米粒子的纯化。64Cu和177Lu将通过反应混合物在60℃下培育30分钟来附接到DOTA，接着进行凝胶过滤或高压液相色谱纯化。或者，例如124I、86Y、68Ga和89Zr等PET核素可以经由DOTA-官能化的PEG(放射性金属)或酪氨酸-官能化的PEG(124I)结合于纳米粒子。呈177LuCl3形式获得的单一光子发射体177Lu将与DOTA复合以用于放射线疗法。
(B)αMSH黑色素瘤靶向肽类似物(ReCCMSH(Arg11))通过铼进行环化。需要证实聚乙二醇化的纳米粒子表面上DOTA螯合物与ReCCMSH(Arg11)部分的比率。
官能化的纳米粒子制剂的表征将如下进行：
(A)每一纳米粒子的DOTA螯合物平均数将通过使用64Cu的标准同位素稀释分析来确定。简单来说，将64Cu添加到含有已知量的ReCCMSM(Arg11)-纳米粒子的溶液中。将培育溶液点在硅胶涂布的玻璃板上，在1∶110％乙酸铵与甲醇(具有EDTA)中显影，并通过放射性-TLC分析。当64Cu标记的ReCCMSH(Arg11)-纳米粒子保持在起点时，结合于EDTA的64Cu将迁移。标记效率百分比将相对于添加到反应混合物的64Cu的总纳摩尔数绘图。可以从此曲线的拐点确定每一纳米粒子附接的螯合物数目。
(B)将使用分光光度法(λ＝435nm，最大吸光度)和已知的ReCCMSH(Arg11)消光系数评估每一纳米粒子的ReCCMSH(Arg11)肽的平均数目和ReCCMSH(Arg11)与官能化的PEG基团的偶合效率。铼的并入提供了可以在小的产物样品上进行铼浓度的高度灵敏吸光度测量的优点。
黑色素瘤模型中多官能纳米粒子的体外和体内光学-PET成像以评估肿瘤特异性靶 向和治疗反应
64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)-纳米粒子将与天然64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)构筑体相比较以测试纳米粒子的靶向能力。
竞争性结合分析.使用MC1R受体阳性B16/F1鼠类黑色素瘤株系。使用125I-(Tyr2)-NDP7(对MC1R具有皮摩尔亲和力的一种放射性碘化α-MSH类似物)确定ReCCMSH(Arg11)肽的IC50值，即抑制放射性配体结合50％所需的肽浓度。将单一孔在25℃下与近似50,000cpm的125I-(Tyr2)-NDP在0.5ml具有25mmol/LN-(2-羟乙基)-哌嗪-N-(2-乙磺酸)、0.2％BSA和0.3mmol/L1，10-啡啉的结合培养基中培育3小时，其中(Arg11)CCMSH的浓度在10-13到10-5mol/L范围内。细胞和培养基中的放射性将分开收集和测量，并处理数据，以用凯尔(Kell)软件包(密苏里州拜索夫特(Biosoft，MO))计算Re(Arg11)CCMSH肽的IC50值。
受体定量分析.将5×105B16/F1细胞的等分试样添加到孔中，在200μLRPMI培养基中培养，并在37℃下在递增浓度的125I-(Tyr2)-NDP(2.5到100nCi)存在下在0.5mL结合培养基(具有25mMHEPES的MEM，pH7.4)中培育1.5小时。将细胞用0.5mL冰冷的pH7.4的0.2％BSA/0.01MPBS洗涤两次，并在γ-计数器中测量与细胞部分相关的活性水平。非特异性结合将通过将细胞和125I-(Tyr2)-NDP与非放射性NDP在10μM最终浓度下培育来确定。通过绘制特异性结合于游离125I-(Tyr2)-NDP的比率相对于特异性结合的浓度(飞摩尔/百万个细胞)的曲线，获得史卡查曲线图(Scatchardplot)；Bmax，结合位点的最大数目，是线性回归线的截距X。
将B16/F1鼠类黑色素瘤株系(PBS中5×105)皮下注射到雄性裸小鼠(6-8周龄)的后腿中。使肿瘤生长10-14天，直到尺寸达0.5-0.9cm3。
生物分布：将少量的64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)-纳米粒子结合物(约10μCi，0.20μg)经静脉内注射到负载可触知的B16/F1肿瘤的每一小鼠中。在选择的注射后时间点(2、4、24、48、72小时；n＝4-5/时间点)处死动物并去除所需组织，称量，并且针对累积的放射性计数。注射天然放射性标记的构筑体64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)(约10μCi，0.20μg)的额外小鼠(n＝5)将充当对照组，并在注射后1小时评估。为了检查体内吸收特异性，在即将注射64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)纳米粒子结合物时，将额外一组小鼠(2小时时间点)预先注射20μgNDP以用作受体阻断。称量主要器官和组织并进行γ计数，并且确定每公克的注射剂量百分比(％ID/g)。
连续体内NIRF成像.与以下PET研究同时，使用可调的680nm扫描NIR激光束和CCD，在静脉内注射负载肿瘤的动物(n＝10)前和后进行NIR(荧光断层摄影成像，FMT225，马萨诸塞州沃本市维森(Visen，Woburn，MA))。将小鼠保存在连续异氟醚麻醉下，并放入便携式多模态成像盒(与我们的FMT2500与Focus120microPET相容)中以在注射前和后(1、2、4、6、12、24、48和72小时)进行FMT扫描。使用维森所有的软件重构NIR荧光图像，在1-10分钟时期内测量，并叠合到小鼠的正常相片上。成像数据是定量的，因为测量的强度与NIR荧光团浓度直接相关，使得能够产生绝对荧光团浓度的参数图以与所获得的PET成像数据一起共记录。
动态PET成像获取和分析.将两组负载肿瘤的小鼠(n＝5/组)放入成像盒中以共记录连续PET-光学研究。小鼠经静脉内(i.v.)注射；一者注射放射性标记的64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)纳米粒子结合物，并且第二者注射天然64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)构筑体。注射后，使用Focus120microPETTM(田纳西州康可德显微系统公司(ConcordeMicrosystems，TN))获取动态1小时PET图像。在IV注射放射性标记探针(约1mCi)时开始一小时列表模式获取。所得列表模式数据将在128×128×96矩阵中通过过滤的反投射来重构。使用ASIProTM软件(田纳西州康可德显微系统公司)进行重构图像的相关区域(ROI)分析以确定肿瘤、其它器官/组织和左心室(LV)中放射性示踪剂吸收(％ID/g)的平均数和SD。数据的示踪剂动力学模型化将允许估计药物动力学参数，包括传递、清除率和分布体积。如所提到，使用置于LV上的ROI测量动脉血液输入(作为血液活性的量度)。在注射后24小时、48小时、72小时的时间点，从静态图像获得额外数据。
组织的荧光显微法和自动射线照相术.显示渐小空间比例的光学成像技术的组合(即，全身荧光成像、荧光肉眼检查和体内荧光共焦激光扫描显微法)将用于使注射后72小时活的完整动物中的肿瘤成像。将小鼠维持在连续异氟烷麻醉下，因此实现从整个动物/器官水平到细胞水平在一系列放大率下对荧光信号的检测和定位。整个动物/宏观成像将用装有Cy5荧光过滤器组和CCD相机的荧光立体显微镜(维森；尼康(Nikon)SMZ1500)进行。将发展荧光共焦激光扫描显微法能力。随后针对自动射线照相术，处死小鼠，以在高分辨率下在整个肿瘤体积中定位示踪剂的生物分布。将肿瘤切除，速冻，连续切片(1□0μ切片)并安装载玻片，其中在不透光的盒子中使替代切片与磷光板接触(长达1周)。在剩余的连续切片上进行H&E染色。自动射线照相术的发现将与PET成像数据和组织学结果相关。
或者治疗性放射性核素177Lu或90Y可以用于靶向放射线疗法。在评估不会引起动物死亡和重量减轻小于20％的最高可能的177Lu剂量(MTD)时，将在负载肿瘤的裸小鼠中进行剂量递增研究。将评估基于177Lu的文献值，怀疑为(或靠近)MTD的放射性药物的剂量。
实例10经官能化以与配体和造影剂经由“点击化学”结合的荧光纳米粒子
合成含有用于随后结合配体(例如肽)和造影剂(例如放射性核素)的通用官能团的纳 米粒子
为了合成适合于高比活性放射性标记的大量纳米粒子-肽-螯合剂构筑体，“点击化学”方法可以用于官能化纳米粒子表面(图17)。此方法是基于铜催化的叠氮化物到三键的环加成。此类方法将允许大量通用性来探究多模态应用。
纳米粒子合成和表征.根据图14中的方案，产生将共价附接的PEG基团。PEG将经由硅烷基共价附接到纳米粒子。标准化学途径将用于产生具有三键的官能化的PEG。
用三键将纳米粒子官能化.为了合成双官能化的PEG，第一步将采用活化羧酸酯与脂族胺的充分研究的反应(图18)。或者，可以使用另一适合的具有三键的胺，例如对氨基苯基乙炔。合成的第二步还依赖于众所周知的结合反应。
与模型肽和螯合物结合的官能化的纳米粒子的合成和物理化学表征.
官能化的纳米粒子含有(A)用于随后用正电子发射体锆-89(89Zr)进行高比活性放射性标记的去铁敏B(desferrioxamineB，DFO)和(B)SSTR靶向肽，奥曲酯(octreotate)。
具有叠氮键的DFO的合成.通过DFO-B与叠氮基苯甲酸反应(图19)产生具有叠氮基的DFO并纯化。“点击化学”反应是在室温下的1，3-偶极环加成并且条件常常称为“汇森条件(HuigsenCondition)”。虽然反应一般可以在室温下在乙醇中完成，但适当地，可以加热反应。催化剂常常是Cu(I)Br，但替代物包括Cu(I)I或Cu(II)SO4(具有还原剂)。诺尔等人合成用于化学选择性附接到未保护的多官能化化合物的新颖1，4，7，10-四氮杂环癸烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)衍生物.化学.2007：13：6082-90(Knoretal.Synthesisofnovel1，4，7，10-tetraazacyclodecane-1，4，7，10-tetraaceticacid(DOTA)derivativesforchemoselectiveattachmenttounprotectedpolyfunctionalizedcompounds.Chemistry.2007：13：6082-90)。点击反应也可以在不存在任何催化剂下进行。或者，DFO-B中的NH3+基团可以直接转化成叠氮基。
合成具有叠氮基的Tyr3-奥曲酯.在肽合成器上进行Tyr3-奥曲酯的固相肽合成(SPPS)(图20A)。简单来说，合成将包括如先前针对此肽所述的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)方法。简单来说，仪器方案需要25μmol随后经Fmoc保护的氨基酸，所述氨基酸通过1-羟基苯并三唑(HOBt)与六氟磷酸2-(1H苯并三唑-1-基)-1，1，3-四甲基脲鎓(HBTU)的组合活化。除非另有说明，否则将购买经Fmoc保护的氨基酸；预填充的氨基酸将从珀金-埃尔默(Perkin-Elmer)(康涅狄格州诺沃克(Norwalk，CT))获得，而例如D氨基酸和Fmoc-Cys(Acm)等以预填充形式无法获得的氨基酸将由贝坎姆生物科学公司(BACHEMBioscience，Inc.)(宾夕法尼亚州普鲁士王村(KingofPrussia，PA))或诺瓦生物化学(Novabiochem)(加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego，CA))供应。叠氮基(用于“点击”化学)将经由含叠氮基的酸与肽的N端的偶合而引入到肽主链中，而肽仍然被保护并附接到树脂(图20B)。
合成官能化的纳米粒子。下一步将为具有叠氮键的DFO与具有叠氮键的Tyr3-奥曲酯两者(图21A和21B)结合于纳米粒子。“点击化学”是高度选择性的，定量并可以极快地并使用温和条件进行。将控制从DFO和Tyr3-奥曲酯组合的叠氮基的数目以决不超过可获得的三键的数目；三键将始终＜5％过量。
官能化的纳米粒子的表征.通过用89Zr(或68Ga)进行标准同位素稀释分析，确定每一纳米粒子的DFO螯合物肽的平均数目。89Zr将在回旋加速器上产生并纯化。简单来说，10种浓度的89Zr-乙二酸酯将添加到含有已知量的DFO衍生的纳米粒子的溶液中。室温培育30分钟后，将溶液点在硅胶涂布的玻璃板上，在1∶110％乙酸铵与甲醇(具有EDTA)中显影，并通过放射性-TLC分析。当89Zr-DFO衍生的纳米粒子将保持在起点时，结合于EDTA的非特异性结合的89Zr将迁移。标记效率百分比将作为添加到反应混合物的89Zr的总纳摩尔数的函数绘图。然后可以从此曲线的拐点确定附接到纳米粒子的螯合物的数目。
通过分析Tyr3-奥曲酯的二硫桥键，确定每一纳米粒子的Tyr3-奥曲酯肽的平均数目。简单来说，Tyr3-奥曲酯的二硫键可以在pH9.5和室温下被过量的亚硫酸钠定量裂解。DTNB或伊尔曼试剂(Elman′sreagent)可以通过吸收测量来用于定量蛋白质中的硫醇。其容易与硫醇形成混合的二硫化物，释放发色团5-巯基-2-硝基苯甲酸(吸收最大值410nm)。仅仅此水溶性试剂可接近的蛋白质硫醇被修饰。或者，可以使用来自英杰公司(Invitrogen)的Measure-iTTM硫醇分析试剂盒。
适合肿瘤模型中的体内测试.
将产生使用AR42J肿瘤负载雌性SCID小鼠的皮下异种移植模型。简单来说，将AR42J细胞(1×107个)皮下注射到雌性SCID小鼠的侧腹中。使肿瘤生长10-12天，直到尺寸达0.5-0.9cm3。
预期89Zr对DFO-纳米粒子的放射性标记在室温下在＜15分钟内进行。通过添加EDTA，接着凝胶过滤步骤，去除非特异性结合的89Zr。
受体结合分析.受体结合分析将使用89Zr-DFO-纳米粒子在从AR42J肿瘤获得的膜上进行。分别通过高纯度天然乙二酸锆与DFO-奥曲酯和DFO纳米粒子反应制备竞争配体natZr-DFO-纳米粒子和natZr-DFO-奥曲酯。最终产物的纯度将通过HPLC证实。IC50值将根据先去公开的方法，使用密理博多筛选分析系统(马萨诸塞州贝德福(Bedford，MA))确定。使用程序GraFit(英国翠鸟软件(ErithacusSoftware，U.K.))、LIGAND(马里兰州贝塞斯达的NIH(NIH，Bethesda，MD))和GraphPadPRISMTM(加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego，CA))进行数据分析。
体外分析.用细胞分解溶液(密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO))从单层收获AR42J细胞，并再悬浮于新鲜DMEM培养基中，浓度为2×106个细胞/毫升。将约0.3pmol的89Zr-DFO-纳米粒子的等分试样添加到10mL细胞中，在37℃下在连续搅动下培育。在1、5、15、30、45、60和120分钟，去除一式三份的200μL等分试样并放入冰中。细胞立刻通过离心分离，并计算化合物吸收到细胞的％。
生物分布.将少量89Zr-DFO-纳米粒子(约10μCi，0.20μg)经静脉内注射到负载可触知的AR42J阳性肿瘤的每一小鼠中。在选择的注射后时间点(1、4、24、48、72小时；n＝4-5)处死动物并去除所需组织，称量，并且针对放射性累积计数。在注射后1小时，研究两个额外的对照组：(A)注射天然放射性标记肽89Zr-DFO-奥曲酯(约10μCi，0.20μg)的小鼠；和(B)预先注射Tyr3-奥曲酯(150pg)阻断物的小鼠以证实89Zr-DFO-纳米粒子的受体介导的累积。将计数包括血液、肺、肝、脾、肾、肾上腺(STTR阳性)肌肉、皮肤、脂肪、心脏、脑、骨骼、胰腺(STTR阳性)小肠、大肠和AR42J肿瘤的组织。每公克的注射剂量百分比(％ID/g)和每一器官的注射剂量百分比(％ID/器官)将通过与称量的计数的标准溶液比较来计算。
体内NIRF成像.在0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72小时使用MaestroTM体内荧光成像系统(马萨诸塞州沃本的CRI(CRI，Woburn，MA))进行连续成像。在72小时，处死小鼠，并解剖主要组织/器官，称量并放入6孔板中供离体成像。使用相关区域(ROI)，在肿瘤、所选组织和参考注射液上，采用光谱解混算法除去自身荧光，来分析荧光发射。对于5只动物的组，将荧光强度和标准偏差(SD)求平均值。组织的平均荧光强度除以注射液值将允许在各种组织/器官中针对每一注射的纳米粒子结合物进行比较。
体内小动物PET成像.在-FOCUSTM系统(田纳西州诺克斯维尔的康可德显微系统公司(ConcordeMicrosystemsInc，KnoxvilleTN))上进行小动物PET成像。负载AR42J肿瘤的小鼠(每组n＝5)用1-2％异氟醚麻醉，置于仰卧位置中，并固定在定制底座中。小鼠经由尾静脉接收200μCi89Zr-DFO-奥曲酯-纳米粒子复合物并并列成像。最初通过在1小时时间范围内从注射时间连续获取多个连续的10分钟扫描，接着在注射后2、4、24、48和72小时获取10分钟静态数据，来使动物成像。从在肿瘤和其它相关器官上绘出的相关区域(ROI)产生标准吸收值(SUV)。与microCAT-II相机(田纳西州诺克斯维尔的伊姆泰克公司(ImtekInc.，Knoxville，TN))组合，实现PET图像的共同记录，其提供了高分辨率的X射线CT解剖学图像。microCT与PET图像之间的图像记录通过使用标志记录技术和阿米拉图像显示软件(加利福尼亚州圣地亚哥的阿米拉TGS公司((AMIRA，TGSInc，SanDiego，CA))实现。记录方法通过来自由直接附接到动物床的基准物提供的标志的microCT图像的刚性变换进行。
药物动力学测量.生物分布和动态PET数据将提供组织中89Zr-DFO-奥曲酯-纳米粒子的瞬时浓度，此将允许表征药剂的药物动力学参数。
离体组织的荧光显微法和自动射线照相术.组织中纳米粒子结合物的定位将在冷冻切片上进行。通过microPET成像将允许完全评估肿瘤和其它非标靶组织中的整体分布。成像试验的急性期后，还在肿瘤上进行自动射线照相术，并且此数据将与PET成像和组织学结果相关。获取连续切片(约10μm)，替代切片用于自动射线照相术和用于组织学分析。还通过多通道荧光显微法在NIR通道中分析这些切片。
实例11粒子内化研究
本研究的目标是评估本发明纳米粒子的结合和内化以评估其在亚细胞细胞器中的定位和胞外分泌。此将有助于研究具有不同靶向部分和附接疗法的官能化粒子的归宿。举例来说，诊断性纳米粒子(例如非靶向PEG涂布的纳米粒子对比cRGD-PEG涂布的纳米粒子)与治疗性纳米粒子(例如附接到用于放射线疗法的碘、附接到酪氨酸激酶抑制剂或附接到例如紫杉醇等化学治疗药物的cRGD-PEG-纳米粒子)。
材料和方法
内化/吸收研究.进行内化分析和共定位研究以鉴别特定吸收途径。
将包括人类M21和小鼠B16细胞(约2×105个细胞/孔)在内的黑色素瘤细胞涂铺在具有12mm圆形盖片的8孔腔式载玻片(1.7平方厘米/孔)或24孔板(1.9平方厘米/孔)中并在37℃下培育过夜。为了监测靶向的纳米粒子的内化，将细胞与cRGD-PEG点(0.075mg/ml)一起在37℃下培育3小时。为了去除培养基中的未结合粒子，将细胞用PBS冲洗两次。在装备有HCXPLAPO：63x1.2NAWaterDICD物镜的徕卡(Leica)倒置式共焦显微镜(徕卡TCSSP2AOBS)上进行共聚焦显微镜法以评估具有细胞器特定的污渍或抗体的cRGD-PEG-点的共定位。使用ImageJ软件1.37版(NIH图像；http://rsbweb.nih.gov/ij/)分析图像。
共定位分析/染料结合标记物.为了鉴别参与C点内化的细胞内吞囊泡，使用染料结合的标记物进行活细胞中的共定位分析。将细胞与纳米粒子和不同染料共同培育。染料包括：100nMLysotracker红30分钟，以沿着内体通路标记酸性细胞器；2μg/mL铁传递蛋白Alexa488结合物以标记再循环和分选内体(网格蛋白依赖性通路)；1mg/mL70kDa聚葡萄糖-FITC结合物在37℃下30分钟，以标记巨胞饮小体。
共定位/细胞器特异性抗体.使用针对高尔基体和溶酶体的已知标记物进行免疫细胞化学。对于高尔基体，盖恩素(Giantin)(阿布凯姆(Abcam)，兔多克隆，1∶2000)将用于人类细胞；GM-130(碧迪医药(BDpharmingen)，1μg/ml)将用于小鼠细胞。对于溶酶体，将使用LC3B(赛信通公司(CellSignaling)，兔多克隆，0.5μg/ml)。
对于盖恩素或LC3B染色，将细胞在含10％正常山羊血清/0.2％BSA的PBS中阻断30分钟。初级抗体培育(兔多克隆抗-盖恩素抗体(阿布凯姆目录号ab24586，1∶2000稀释)或LC3B(赛信通公司，目录号2775，0.5μg/ml)进行3小时，接着与1∶200稀释的生物素标记的山羊抗兔IgG(维克特实验室(Vectorlabs)，目录号：PK6101)一起培育60分钟。使用二级抗体阻断剂、阻断剂D、抗生蛋白链菌素-HRPD(本塔纳医学系统(VentanaMedicalSystems))和DAB检测试剂盒(本塔纳医学系统)，根据制造商说明书，进行检测。
对于GM-130染色，在小鼠IgG阻断试剂(维克特实验室，目录号：MKB-2213)中在PBS中将细胞阻断30分钟。初级抗体培育(单克隆抗-GM130，来自碧迪医药；目录号610822，浓度1μg/mL)进行3小时，接着，1∶200稀释的生物素标记的小鼠二级抗体(维克特实验室，MOM试剂盒BMK-2202)培育60分钟。使用二级抗体阻断剂、阻断剂D、抗生蛋白链菌素-HRPD(本塔纳医学系统(VentanaMedicalSystems))和DAB检测试剂盒(本塔纳医学系统)，根据制造商说明书，进行检测。
针对温度依赖性研究，将纳米粒子与cRGD-PEG-纳米粒子在4℃、25℃和37℃下一起培育以评估表面结合对比内化粒子的分率。
对于胞外分泌研究，将纳米粒子(0.075mg/ml)培育4小时并用PBS洗涤腔式载玻片，接着添加新鲜培养基。以0.5、1.0、1.5、2.5、4.5、8.0小时的时间间隔，将细胞洗涤、胰蛋白酶消化，并通过荧光测定法测量细胞和培养基的荧光信号。在剂量-反应研究中，将细胞在一系列浓度和培育时间下培育，并使用流动式细胞测量术分析。在活力研究中，在培育前和后使用锥虫蓝拒染分析测量细胞活力，以评估毒性。在延时研究中，在细胞与纳米粒子结合物在不同培育温度(4℃、25℃和37℃)下培育后在12小时时间段期间，以20分钟时间间隔，使用倒置式共焦显微镜研究活细胞中纳米粒子内化的机制。
讨论
发现cRGD-PEG点和PEG点与Lysotracker红共定位于M21和B16细胞中，表明在内体通路中吸收(图22)。数据展示，这些粒子与铁传递蛋白和聚葡萄糖强有力地共定位。无论表面官能团和总电荷如何，纳米粒子(流体动力学直径为6-7nm)研究似乎遵循相同途径。两种细胞类型中的延时成像证实小分率的涂铺细胞内官能化纳米粒子的内化。粒子最终传递到核周区中的囊泡结构。未预期使用盖恩素(或GM-130)的共定位分析展示高尔基体中的纳米粒子荧光信号。
实例12用于图像引导的手术中SLN定位和干预的双模态二氧化硅纳米粒子
用于图像引导的手术中SLN定位的双模态二氧化硅纳米粒子
扩展这些研究以包括使用便携式ArteMISTM荧光相机系统的光学成像，以及使用γ探针的放射检测，对引流肿瘤淋巴和淋巴结癌转移进行实时评估，以及评估肿瘤负荷。在代表性小型猪(图23a-23i)中，使用以上成像程序，使用18F-FDG和124I-cRGDY-PEG-C点，进行初始手术前PET-CT扫描。轴向CT图像揭露了原发性骨盆肿瘤(图23a)和引流SLN(图23b)，其视为对应18F-FDGPET扫描上活性增加的区域(图23c、23d)。2天后，通过在粒子示踪剂在肿瘤部位周围皮下4象限注射后约5分钟进行动态PET-CT成像，证实这些发现；共记录的轴向(图23e、23g)和冠状面(箭头，23f、23h)视图证实了这些发现。在手术前扫描后，标记覆在SLN位点上面的皮肤以供手术中定位，并将小型猪传输到手术中套房。使用便携式γ探针在原发性肿瘤和SLN位点上进行的基线活性测量(图23i)，展示相对于背景信号，SLN内活性增加20倍。
为使淋巴系统达成实时光学成像，在肿瘤部位周围，在使皮肤完整下投与124I-cRGDY-PEG-C点的第二次皮下注射，并且在颜色(图24a)和Cy5.5荧光通道(图24b)中观看信号。暴露相邻的淋巴结盆，并在从注射位点(图24c)流动到主要近端(图24c、24d)、中间(图24e)和远端(图24f)淋巴分支的NIR通道中看到荧光信号，其引流到SLN(图24f)。还目测更小口径的淋巴通道(图24d、24e)。在连续淋巴结切除(图24j-24m)前，进一步暴露(图24i)以双通道模式观看(图24g、24h)的黑色SLN。通过γ发射，使用γ探针(图24i)证实原位(图24k)和离体(图24m)淋巴结样本内的荧光信号，并看到对应于来自H&E染色的组织切片的低功率(盒，图24n)和高功率(图24o)视图上肿瘤细胞的分散簇。在低功率(图24p)和高功率(图24q)视图上鉴别HMB45的阳性表达，与转移性黑色素瘤一致。
意外地，并且与观测到的18F-FDG发现形成对比，发现在这些小型猪中124I-RGD-PEG-C点特异性地区分转移性肿瘤浸润与发炎过程。在细胞和亚细胞水平下这些试剂的行为的机制差异以及粒子表面上整合素靶向部分的存在可以解释所观测到的成像发现。在具有因肉芽肿性疾病引起的病理学上证明的发炎变化的多个小型猪(n＝3)中，18F-FDG无法检测到转移性疾病，而鉴别到发炎性和其它代谢活性位点。这些差异发现突出显示了粒子示踪剂选择性地靶向、定位转移性疾病和分期的能力，而在多数情况下18F-FDG无法准确地将癌症扩散分期，实际上仅仅鉴别发炎位点。
在说明这些发现的代表性小型猪研究中，初始轴向18F-FDGPET-CT扫描展示CT上左后颈内的钙化(图25a)，对应于18F-FDGPET上强活性的区域(图25b)。H&E染色的组织切片的低功率(图25c)和高功率(图25d)视图揭露了扩散性发炎变化，与肉芽肿性疾病一致。另外在这些幼年小型猪的代谢活性骨髓隔室内看到强的18F-FDGPET活性(图25a、25b)。相比之下，粒子示踪剂成像研究鉴别双侧转移性颈淋巴结。在共记录的PET-CT(图25f)上看到轴向CT成像上的右颈淋巴结(图25e)是PET亲合的；更优良的CT图像(图25g)上的额外双侧淋巴结还在融合的PET-CT上是过度代谢的(图25h)。此外，在共记录的扫描(图25f、25h)上左颈钙化(图25e、25g)未展示PET活性。对应的H&E染色的SLN组织切片揭露了低功率(盒，图25i)和高功率视图(图25j)上暗色的黑素瘤簇，看到由黑色素瘤细胞和噬黑色素细胞构成。选自3DPET重构图像的单框(图25k)再次说明多个双侧PET亲合的颈淋巴结和相关引流淋巴通道。重要的是，在注射后1小时，在膀胱中看到大部分活性，在肝区域上没有显著示踪剂累积。
在从在18F-FDG(图26a)或局部粒子示踪剂投与(图26b、26c)后1小时时期期间获得的动态成像数据集产生的PET-CT融合MIP图像上更有利地看到以上发现。对于18F-FDG，指出淋巴结癌转移完全不存在，其中在代谢活性的骨结构内看到广泛增加的活性。与这些发现相对比，124I-cRGDY-PEG-C点检测到双侧转移性颈淋巴结，以及引流淋巴通道。
用于图像引导的干预的双模态二氧化硅纳米粒子：治疗反应.
粒子示踪剂区分转移性疾病与组织发炎变化的能力可以潜在地用于多种治疗装置中(以外科手术方式或干预驱动)-因为治疗反应评估常常被发炎变化的存在搞混，导致解释困难。图像引导的干预，例如治疗性肿瘤消融，可能特别得益于新粒子平台与成像装置技术的创新联合，从而(1)能够更早地对反应进行程序后评估；(2)检验完全消融或检测代表治疗失败的残余肿瘤；和(3)改善肿瘤监测策略。局部消融疗法，包括微波消融、冷冻消融、射频消融(RFA)和激光间质性疗法，经由能量施加器插入到肿瘤中来诱发局部热损伤。这些方法通常用作被认为无法进行外科切除术的患者中的替代性选择。此外，进行消融疗法的患者常常因并存病而成为不良手术候选者。广泛用于临床操作中，其提供了独特的优点，因为其可以作为门诊患者程序经皮进行，发病率显著更小，并且可以提高所选患者群体的生活质量和存活率。
通常在消融程序后1-3个月获得的准确的治疗后成像传统上利用造影增强的体积成像，例如CT或MRI。这些技术有着许多缺点。首先，其限于鉴别被视为残余肿瘤或复发性疾病的主要指示物的肿瘤区域的尺寸异常增强或生长的存在。在程序后评估时，关于消融区周围的扩散边缘增强可能与消融区中的发炎和皮肤充血相关，并且常常未必代表残余肿瘤。日益增强，特别是不规律或结节状，考虑怀疑是肿瘤。但是，这些解释是有争议的，因为消融区可能看起来比程序后若干月所预期得大，并且增强还可能反映肉芽产生或疤痕组织形成。
例如18F-FDGPET等功能性方法也用于评估局部消融手术的功效和作用，但可能无法准确区分肿瘤与发炎变化。因此，使用当前形态或功能性评估，尤其在早期时间间隔，在组织水平下回应于消融手术的成像变化(即发炎、肿瘤)的解释是显著的挑战。所需的是消融成功的可靠终点和消融后时期中残余疾病的明确检测。
作为进行转移性肝病变的将来消融的先驱，在具有转移性黑色素瘤的小型猪中进行更大(即1-2cm)SLN的概念验证的射频消融(RFA)研究以评估在粒子示踪剂存在下的早期治疗反应。在RFA前和后的PET-CT成像发现在组织学上相关。124I-cRGDY-PEG-C点(约0.6mCi)在原发性左骨盆肿瘤周围皮下注射后，初始基线冠状面CT展示优于PET亲合的肿瘤位点(图27b、27c)的2.2×1.6cmSLN(图27a)。还展示过度代谢左骨盆肿瘤(图27b)，注意到在融合的PET-CT图像上引流淋巴通道内额外粒子示踪剂流动(图27c、27d)。获得额外连续CT扫描以在消融程序前定位淋巴结(图27e)并将RFA探针插入(图27f)引入淋巴结(低于十字标线水平)。在对应消融前共记录的PET-CT扫描上，仅在十字标线后部看到PET亲合的SLN(图27g)。使用2cm活性尖端RFA探针(冷尖端消融系统，爱尔兰都柏林的科维迪恩公司(Covidienplc，Dublin，Ireland))进行部分淋巴结消融12分钟。消融后PET-CT展示消融区中，在电极尖端前部(图27h)轻度减少的示踪剂活性。在组织学上证实消融前和后的成像发现。来自SLN的消融前核心生检组织的H&E染色证实在低功率(图27i)和高功率(图27j)视图上的扩散性转移性肿瘤浸润。消融后，在对应低功率视(图27k)和高功率视图(图27l)上看到，在H&E染色淋巴结组织上转移性浸润的程度减少。还鉴别凝固性坏死和淋巴组织，以及多灶性出血(分别图27k、27l)。在消融前的TUNEL染色的高功率视图揭露分散的赘生性细胞(图27m)。在消融后的TUNEL染色上，在低功率(图27n)和高功率(图27o)视图上看到坏死病灶区域(红色)。
结论
淋巴结癌转移是黑色素瘤结果的强大预测因子。使用SIN定位的局部淋巴结中微小转移灶的早期检测可以允许及时将患者分成适当治疗臂，并且可以潜在地提高患者结果。虽然当前护理标准的SLN定位和生检技术依赖于SLN的基于放射性的鉴别的使用，但是此项技术存在许多限制。这些包括低空间分辨率、分期准确性减少、不存在标靶特异性、可能混淆手术区域的缓慢示踪剂清除以及缺乏防止对非常接近SLN的至关重要结构的损伤的准确手术中观测。
近期引入可以根据关键设计标准主动调整和优化以克服这些缺点，同时实现关键癌症标靶的选择性探测的较新产生的生物相容性粒子平台可以提供对控制转移性疾病扩散的细胞和分子过程的重要了解。此类平台为用于多模态成像而进行的额外调适可以由手术外科医生或干预者用于探究多种图像引导的程序装置中的这些过程。
一种此类双模态平台(针对光学与PET成像研发的临床上转变的靶向整合素的二氧化硅纳米粒子)满足许多关键设计标准-小尺寸、优良亮度、增强的肿瘤组织保持和低背景信号，这些使得其成为SLN生检程序期间当与便携式实时光学相机系统联合时SLN定位和分期的理想试剂。在黑色素瘤模型中区分转移性疾病与组织发炎变化(常常是共存过程)的能力可以提供一种评估将来治疗反应的更准确和可靠的标记物。使用基于外科手术或干预驱动的疗法，保证更宽泛组的癌症类型和治疗中的进一步研究。
实例13前列腺癌的SLN定位
多模态纳米粒子负载的HuJ591-F(ab′)2片段是用于结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的新颖诊断探针。通过合成粒子负载的多个F(ab′)2片段，可以(1)因多价作用而增强结合亲和力/效能，并且(2)改变体内分布，因为清除和吸收将由粒子动力学行为控制，而非抗体本身控制。通过维持粒径低于或仅为10nm直径的肾截止值，促进肾清除。此外，标靶与背景比率将基于(1)和(2)的改善而增加，潜在地改善了诊断特异性和疾病分期。
124 I-J591F(ab′)2结合的粒子的合成/表征
为了产生聚乙二醇化的F(ab′)2构筑体，将100μgF(ab′)2添加到艾本德管(eppendorftube)的100μlPBS中，接着与4μl2mg/ml特劳特试剂(Traut′sreagent)一起在室温下培育1小时，然后添加溶解于缓冲溶液中的顺丁烯二酰亚胺-PEG(6mg)。溶液培育过夜并在粒子附接前用PD-10柱纯化。F(ab′)2片段用碘-124(124I)放射性标记以产生双模态粒子平台，并得出比活性、纯度和放射性化学产率。另外通过FCS评估粒径和浓度。
实例14人类中用于黑色素瘤中靶向整合素的双模态二氧化硅纳米粒子
纳米材料，尤其是纳米粒子探针，具有独特的物理化学和生物特性，以及表面通用性。通过采用其表面通用性，生物相容性的多官能粒子可以经识别和定位关键癌症标靶的分子标记物选择性地修饰。手术环境中日益重要的是需要更稳固的光学驱动的多官能粒子探针，其可以提高原发性肿瘤部位周围局部/区域疾病扩散的实时靶向检测，因此促进治疗。手术中环境中关键神经和/或血管结构的疾病的实时划定也将是至关重要的。邓肯，聚合物治疗学的曙光时代，自然评论：药物发现2，347-360(2003)(Duncan，R，Thedawningeraofpolymertherapeutics，NatRevDragDiscov2，347-360(2003))。瓦格纳等人，新兴的纳米医学风景，自然生物技术24.1211-1217(2006)(Wagner，etal.，Theemergingnanomedicinelandscape，NatBioiechnol24.1211-1217(2006))。谢恩伯格等人，无限舰队的招募：使用纳米材料的全身性癌症治疗，自然评论：临床肿瘤学7，266-276(2010)(Scheinberg，etal.Conscriptsoftheinfinitearmada：systemiccancertherapyusingnanomaterials，NatRevClinOncol7，266-276(2010))。宫田等人，纳米规模药物传递的聚合物胶束，反应性与功能性聚合物71，227-234(2011)(Miyataetal，Polymericmicellesfornano-scaledrugdelivery，React.Func.Polym.71，227-234(2011))。李等人，用于治疗诊断应用的多官能中孔二氧化硅纳米复合纳米粒子，化学研究述评44，893-902(2011)(Leeetal，Multifunctionalmesoporoussilicananocompositenanoparticlesfortheranosticapplications，AccChemRes44，893-902(2011))。施罗德等人，用纳米技术治疗转移性癌症，自然评论：癌症12，39-50(2012)(Schroederetal.，Treatingmetastaticcancerwithnanotechnology，NatRevCancer12，39-50(2012))。罗斯霍姆等人，靶向癌症疗法中的纳米粒子：中孔二氧化硅纳米粒子进入临床前研发阶段，纳米医学(伦敦)7，111-120(2012)(Rosenholmetal.，Nanoparticlesintargetedcancertherapy：mesoporoussilicananoparticlesenteringpreclinicaldevelopmentstage，Nanomedicine(Lond)7，111-120(2012))。阿什利等人多组分负荷通过负载纳米多孔粒子的脂质双层靶向传递到癌细胞，自然材料10，389-397(2011)(Ashleyetal.Thetargeteddeliveryofmulticomponentcargostocancercellsbynanoporousparticle-supportedlipidbilayers，NatMater10，389-397(2011))。比韦罗-艾斯托等人，用于生物医学成像和治疗诊断应用的基于二氧化硅的纳米探针，化学会评论41，2673-2685(2012)(Vivero-Eseotoetal.，Silica-basednanoprobesforbiomedicalimagingandtheranosticapplications，ChemSocRev41，2673-2685(2012))。塔达等人，在小鼠肿瘤中与单克隆抗-HER2抗体结合的单量子点的体内实时追踪，癌症研究67，1138-1144(2007)(Tadaetal.，Invivoreal-timetrackingofsinglequantumdotsconjugatedwithmonoclonalanti-HER2antibodyintumorsofmice，CancerRes67，1138-1144(2007))。然而，尽管迄今为止研发了广泛的粒子，但还没有无机荧光粒子成像探针作为靶向多官能平台技术连续转变到临床。奥底诺鲁等人，用于人类乳癌的体内成像的近红外发射荧光团掺杂的磷酸钙纳米粒子，美国化学学会·纳米2，2075-2084(2008)(Altinogluetal.，Near-infraredemittingfluorophore-dopedcalciumphosphatenanoparticlesforinvivoimagingofhumanbreastcancer，ACSNano2，2075-2084(2008))。希尔德布兰德等人，近红外荧光：应用于体内分子成像，化学生物学的当前观点14，71-79(2010)(Hilderbrandetal，Near-infraredfluorescence：applicationtoinvivomolecularimaging，CurrOpinChemBiol14，71-79(2010))。蔡等人，靶向肿瘤的纳米粒子的设计考虑因素，自然·纳米技术5，42-47(2010)(Choietal.，Designconsiderationsfortumour-targetednanoparticles，Nat Nanotedmol5，42-47(2010))。何等人，用于癌症分子成像的近红外荧光纳米探针：状态和挑战，分子医学趋势16，574-583(2010)(Heetal.，Near-infraredfluorescentnanoprobesforcancermolecularimaging：statusandchallenges，TrendsMolMed16，574-583(2010))。
此处描述了首批约7nm的荧光纳米粒子，通过附接放射性标记和环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸(cRGDY)肽而修饰为杂交(光学/PET)靶向平台，不仅在转移性黑色素瘤患者中良好耐受，而且也可以在具有高信噪比的微剂量方案中优先检测和定位假定的整合素表达肿瘤。没有观测到显著的血清蛋白结合，并且体内维持粒子和其表面组分的完整性。关于安全性、药物动力学、放射量测定和靶向的结果表明此通过肾排泄的粒子在癌症诊断中和潜在引导治疗计划的普遍效用。此双模态探针构成一种可以针对特定肿瘤类型调整的平台，此可以提高人类中的光学和/或基于PET的病变检测和癌症分期以及药物传递，潜在使得癌症护理更佳且更个人化。
使用超小(约7nm直径)双模态(光学/PET)无机纳米粒子探针用于αvβ3整合素表达癌症的靶向分子成像。此纳米粒子探针是其类别和特性批准用于人类首次研究的第一FDA研究新药物(图28a)。荧光二氧化硅纳米粒子(康奈尔(Cornell)或C点)将染料分子共价隔离在被二氧化硅外壳包封的核心中以防止染料浸出并增强亮度和光稳定性。欧瓦等人，明亮和稳定的核-壳荧光二氧化硅纳米粒子，纳米快报5，113-117(2005)(Ow，etal.，Brightandstablecore-shellfluorescentsilicananoparticles，NanoLett5，113-117(2005))。彭斯等人，用于纳米医学的具有有效排尿量的荧光二氧化硅纳米粒子，纳米快报9，442-448(2009)(Burns，etal.Fluorescentsilicananoparticleswithefficienturinaryexcretionfornanomedicine，NanoLett.9，442-448(2009))。吸收匹配的光谱证实此每一染料亮度增强为包封和游离染料的发射之间的强度差异(图28b)。表面聚(乙二醇)(PEG)链的中性层能够附接少量的环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸(cRGDY)肽以有效和选择性地结合整合素受体。贝内兹拉等人，多模态二氧化硅纳米粒子是人类黑色素瘤模型中的有效癌症靶向探针，临床研究杂志121，2768-2780(2011)(Benezra，etal.Multimodalsilicananoparticlesareeffectivecancer-targetedprobesinamodelofhumanmelanoma，JClin Invest121，2768-2780(2011))。除调节分化通路、调节粘着特性和促进细胞迁移、存活和细胞周期进程外，活化的整合素还诱发细胞内许多结构和信号传导变化。胡德等人，整合素在细胞侵袭和迁移中的作用，自然评论：癌症2，91-100(2002)(Hoodetal.，Roleofintegrinsincellinvasionandmigration，NatRevCancer，2，91-100(2002))。例如124I等细胞核成像标记经由酪氨酸残基的附接放大了连续PET成像的信号灵敏度。最终产物，高度生物相容性和生物稳定的肿瘤选择性粒子示踪剂(124I-cRGDY-PeG-C点)先前已经提供了人类黑色素瘤异种移植物中通过PET成像的整合素受体状态的读出，因此确定了用于纳米医学的不同类别的肾清除的治疗诊断平台。玖克斯特等人，使用治疗诊断纳米粒子的分子成像，化学研究述评44，1050-1060(2011)(Jokerstetal.，Molecularimagingwiththeranosticnanoparticles，AccChemRes.44，1050-1060(2011))。
启动人类首次临床试验，其采用PET定量评估此试剂在一组五个转移性黑色素瘤患者中的时间依赖性肿瘤吸收和生物分布、放射线放射量测定和安全性。使用PET成像的基本原理中暗含的是所述粒子放射性示踪剂不具有药理学、放射能产生或其它明显生物作用的临床前证据。柯林斯，肿瘤学中的0期临床研究，临床药理学与治疗学，85，204-207(2009)(Collins，J.M.Phase0clinicalstudiesinoncology，ClinPharmacolTher，85，204-207(2009))。库玛尔等人，关于研发创新癌症疗法的方法的专门工作组的建议，欧洲癌症杂 志，45，741-746(2009)(Kummaretal.，Phase0clinicaltrials：recommendationsfromtheTaskForceonMethodologyfortheDevelopmentofInnovativeCancerTherapies，EurJ Cancer，45，741-746(2009))。在约185兆贝可(MBq)(约3、4...6、7纳摩尔，nmol)124I-cRGDY-PEG-粒子示踪剂(比活性范围27.8-57.4GBq/μmol)单剂静脉内(i.v.)注射到人类受试者(图28a)后，除通过γ计数和放射性薄层色谱法(radioTLC)在两周时间间隔期间分析血液和尿样本中的代谢物之外，还在72小时时期期间获得三个全身PET-CT扫描以评估药物动力学。
在研究时期期间五个患者没有不良事件并且试剂良好耐受。药物动力学行为表示为每克组织所注射剂量的百分比(％ID/g)对比注射后时间和对应平均器官吸收剂量(图28d)，其与针对其它常用的诊断放射性示踪剂所发现的药物动力学行为相当。此代表性患者的连续PET成像(图28d)展示假定血池活性从主要器官和组织的进展性丧失，到注射后(p.i.)72小时未看到明显的活性。这些患者中全身清除半衰期估计在13-21小时范围内。有趣的是，在肝、脾或骨髓中没有显著的定位，与许多疏水性分子、蛋白质和更大粒子平台(＞10nm)形成对比。虽然患者经碘化钾(KI)预处理以阻断甲状腺组织吸收，但在此患者中相对于其它组织，获得较高的平均吸收甲状腺剂量。粒子也主要通过肾排泄，具有肾与膀胱壁(在甲状腺和肿瘤后，参见下文)，证实到注射后72小时最高％ID％值之一(图28d)；这常常是通过肾排泄的放射性药物的情况，膀胱壁接收的平均吸收剂量高于其它主要器官和组织。详细的临床方案(图28C)和其设计的基本原理进一步描述于材料和方法中。
这些发现突出显示了一个事实：肾而非肝胆的排泄是从身体清除的主要途径。有效肾清除将取决于基于超小粒子的平台或大分子系统的设计，这些系统近似为约10nm或更低的有效肾小球过滤尺寸截止值。蔡等人，通过界定尺寸的纳米粒子靶向肾小球膜，美国国家科学院院刊108，6656-6661(2011)(Choi，etal.，Targetingkidneymesangiumbynanoparticlesofdefinedsize，ProcNatlAcadSciUSA，108，6656-6661(2011))。看到小分率的投与活性(小于5％)吸收在此患者的胃和唾液腺中，与游离碘一致，在成像时期期间逐渐清除。粒子未展现网状内皮剂(即锝-99m硫胶体)典型的特性：吸收反映巨噬细胞功能，主要在肝中。基于针对cRGD放射性示踪剂获得的先前数据，未观测到意外的活性病灶。霍伯纳等人，用于使αvβ3表达成像的(99m)Tc标记的环状ROD肽的合成和生物评估.核医学，43，26-32(2004)(Haubner，R.，etal.Synthesisandbiologicalevaluationofa(99m)Tc-labelledcyclicRODpeptideforimagingthealpbavheta3expression.Nuklearmedizin，43，26-32(2004))。
重要的是，这些特性指出此无机双模态成像粒子作为通过肾清除的试剂所显示的相当独特的药物动力学行为。通过γ计数对血液(图29a)和尿(图29b)样本的代谢分析揭露在72小时时期期间示踪剂活性降低至少一个数量级，其中在此时间间隔结束时基本上没有活性剩余。粒子活性在很大程度上被限制于血浆部分，没有显著血清蛋白结合的证据(数据未展示)。血浆样品的RadioTLC分析揭露到注射后24小时的单峰(图29c-29e)，对应于完整放射性标记纳米粒子。在尿样本中，在24小时时期期间看到两个峰，一个对应于完整纳米粒子和另一个对应于更多移动的物质(鉴别为游离碘)(图29f-29h)。粒子示踪剂(图29i)、放射性碘标记肽(131I-cRGDY，图29j)和游离放射碘(131I，图29k)的RadioTLC分析证实放射色谱图中的第一和第二峰分别对应于完整纳米粒子和游离碘。因此，这些发现表明在研究过程期间没有发生粒子完整性可测量的损失，即使是在通过肾排泄之后。
虽然肿瘤检测不是此PET微剂量研究的目标，但意外地，尽管所注射剂量低，但仍然有证据表明粒子示踪剂的肿瘤定位。在第一情况下，在肛门直肠粘膜黑色素瘤的患者中静脉内投与124I-cRGDY-PEG-C点之后四小时，获得全身PET-CT扫描。在冠状面CT图像(图30a)上，在肝的左下叶(通过先前的氟去氧葡萄糖(18F-FDG)PET/CT成像(数据未展示)已知转移性病变的部位)中看到减少密度的大圆形区域(箭头)。在冠状面PET(图30b)和共同记录的PET和CT扫描(图30c)上，较高吸收的边缘将此病变划定界限(图30b箭头；图30c)并且随后到24小时PET扫描的时间已清除，表明在此假定的整合素表达转移中的一些优先定位。在膀胱、胃肠道(胃、肠)、心脏和胆囊内看到显著活性。在第二受试者中，通过轴向(图31a)和径向(图31b)磁共振成像(MRI)，在垂体腺的右前凸起部中看到界限分明的囊性病变。
假定此病变(先前MRI扫描上的稳定发现)为垂体微腺瘤，一种已知展现例如血管新生和进展到瘤周组织的恶性特性的颅内肿瘤。此示踪剂亲合的病灶与多平面MRI(图31c、31d)和CT(图31e、31f)图像的精确共同记录证实了其在垂体前叶腺体内的位置，最初看到为强力活性的病灶，逐渐地其强度在72小时时间间隔期间增加(箭头，图31g-31i)，伴随着周围背景骨髓信号的对应减少，因此产生较高的肿瘤与背景比率(即肿瘤与脑(T/B)约6)和肿瘤与肝(T/L)约2))(图31j)。PET成像结果可以基于先前研究中的发现解释，展示相对于正常结缔组织细胞，在腺瘤子集的实质中αvβ3整合素表达增加以及腺瘤基质细胞中整合素表达水平增强。法诺德等人，人类垂体前叶的腺瘤转化与整合素表达的改变相关，国际癌症杂志，67，45-53(1996)(Farnoud，etal.，Adenomatoustransformationofthehumananteriorpituitaryisassociatedwithalterationsinintegrinexpression，IntJCancer，67，45-53(1996))。
初始数据支持使用此靶向成像媒剂的人类PET研究是一种针对假定整合素表达肿瘤的检测和定位的推理研究方法的概念。在更先进的临床试验中计划剂量递增方法以确定安全性、全身清除和肿瘤靶向效率的最佳平衡。此类PET驱动的研究也可以允许准确定量整合素受体表达水平以实现最大靶向效率，以及检测这些水平的改变。此外，使用这些定量分子成像工具可以产生关于肿瘤内粒子吸收和累积的时间依赖性变化的信息。凯尔福特等人，肿瘤学药物研发中分子成像探针的进展和前景，临床癌症研究，11，7967-7985(2005)(KelloftG.J.，etal.，Theprogressandpromiseofmolecularimagingprobesinoncologicdrugdevelopment，ClinCancerRes，11，7967-7985(2005))。在垂体腺瘤的情况下，能够计算此病变内粒子的累积吸收。具体来说，计算在72小时成像时期期间在此部位累积的粒子的总注射活性分率和数目。使用在注射后72小时测量的针对部分体积作用校正的病变的最大标准化吸收值(SUVmax，参见方法)(即46.5)(几乎常常高于正常垂体组织中的因子)，以及病变的近似质量(即病变体积与1g/cm3假设密度的乘积)和患者的体重，发现相对于2×1015的所注射粒子负荷，约1.78×1011个粒子(0.01％注射剂量，％ID)或每10,000份有1份累积在病变部位。标准吸收值(SUV)被定义为每克组织的活性除以每克体重的投与活性。相对于主要器官和组织，此病变的％ID/g和放射量测定的时间依赖性变化展示在图28c和28d中。
结果表明全身性注射的粒子示踪剂良好耐受并为安全的。安全性量度包括正常器官中吸收的监测以及实验室毒性指示物。二级目标为评估放射线剂量和评估血浆和尿代谢活动。安全性评估是基于放射量测定、缺乏临床症状和不存在粒子(药物)毒性的任何实验室指示。
从人类首次临床试验获得的结果指出全身性注射的粒子示踪剂显示有利和可再生的PK特征，由肾排泄界定。与网状内皮剂(即锝-99m硫胶体)和例如抗体等大分子对比，粒子示踪剂不明显累积在肝、脾或骨髓内。数据清楚地指示大比例的投与活性经由泌尿系统消除(图28E、29B)；膀胱中的活性浓度达到例如高于肝中活性浓度的数量级。基于所有肝活性最终都经由肝胆途径排泄的保守假设，这些数据与约90％投与活性经由泌尿系统排泄和仅仅约10％经由肝胆途径排泄一致。在剩余的器官/组织中，特别是在早期时间点(2-4小时)，残余活性很大程度上反映了血池的活性。
靶向检测不充当研究终点，并且因此在疾病部位实现最大吸收的剂量递增程序不并入试验设计中(即不尝试调整粒子剂量以最佳化肿瘤靶向)。但是，尽管使用低纳摩尔量，但粒子示踪剂仍然优先定位和累积在若干肿瘤中。在具有假定垂体腺瘤的一个患者中，PET成像结果展示在病变部位粒子示踪剂活性的进展性净累积。本研究的结果表明全身性注射的粒子良好耐受并且展现明显独特的‘大分子’PK特征，其中主体肾清除占主导，没有显著RES吸收。此与许多疏水性分子、蛋白质和更大粒子平台(＞10nm)形成对比。此特征是纳米粒子(其一般展现超过所估肾截止值的直径，并且因此几乎无肾排泄和清除更缓慢)高度非典型的，并且准许临床评估超小纳米粒子平台。
这些结果以及有关双模态C点成像平台的安全性、药物动力学和放射量测定的必不可少的数据表明就产生用于癌症诊断学的关键肿瘤特异性读出而言此人类微剂量技术的普遍效用。此类评估的肿瘤累积的粒子示踪剂负荷(或浓度)以及细胞抑制反应(即IC50或50％抑制浓度)的知识可以潜在用于预测既定药物的治疗给药需求。
方法
cRGDY-PEG-C-点的合成和表征：关于囊封有机染料Cy5(发射最大值约650nm，粒子核心内2染料当量)的聚乙二醇化和cRGDY(肯塔基州路易斯维尔的肽国际公司(PeptidesInternational，LouisvilleKY)表面官能化的荧光核-壳二氧化硅纳米粒子(cRGDY-PEG-C-点)的合成和表征，参见此基团的前面公开案和其中的参考文献。贝内兹拉等人，多模态二氧化硅纳米粒子是人类黑色素瘤模型中的有效癌症靶向探针，临床研 究杂志121，2768-2780(2011)。简单来说，通过经修改的施托贝尔型二氧化硅缩合(Stober-typesilicacondensation)来制备粒子。博古什等人，单分散二氧化硅粒子的制备：尺寸和质量分率的控制，非晶态固体杂志104，95-106(1988)(Bogush，etal.，Preparationofmonodispersesilicaparticles：Controlofsizeandmassfraction，JNon-CrystSolids.104，95-106(1988))。汉斯等人，用于单一激发多路复用的发射比游离染料增强的大斯托克斯变换荧光二氧化硅纳米粒子，大分子快速通信，30，1907-1910(2009)(Hens，etal.，Largestokes-shiftfluorescentsilicananoparticleswithenhancedemissionoverfreedyeforsingleexcitationmultiplexing，MacromolRapidCommun，30，1907-1910(2009))。萨达思瓦等人，酒精性溶剂对二氧化硅合成的作用-NMR和DLS研究，溶胶-凝胶科学与技术杂志12，5-14(1998)(Sadasivan，etal.，Alcoholicsolventeffectonsilicasynthesis-NMRandDLSinvestigation，JSol-GelSciTechnol12，5-14(1998))。双官能PEG用硅烷衍生以附接到二氧化硅表面和肽偶合。含有序列环-(Arg-Gly-Asp-Tyr)和负载半胱氨酸残基(肽国际公司)的肽经由半胱氨酸-顺丁烯二酰亚胺键附接到官能化的PEG链。如针对游离Cy5染料，在蔡司LSMS10Confocor2FCS上，使用HeNe633nm激发，分析cRGDY-PEG-C点的流体动力学半径、亮度和浓度。
cRGDY-PEG-C点的放射性标记.酪氨酸残基结合于PEG链以附接放射线碘部分(即124I、131I)。赫曼森，生物结合物技术(学术出版社，英国伦敦，2008)(Hermanson，G，BioconjueateTechniques(AcademicPress，London，UK，2008))。尹等人，使用智能磁性二氧化硅核-壳纳米材料的特异性靶向、细胞分选和生物成像.Small，2，209-215(2006)(Yoon，T.J.，etal.Specifictargeting，cellsorting，andbioimagingwithsmartmagneticsilicacore-shellnanomaterials.Small，2，209-215(2006))。使用1ODOGEN方法(皮尔斯(Pierce))进行cRGDY-PEG-C点的放射性标记。皮亚斯克等人，核酸的碘-Gen介导的放射性碘化，分析生物化学172，356-359(1988)(Piatyszek，etal.，Iodo-Gen-mediatedradioiodinationofnucleicacids，AnalBiochem.172，356-359(1988))。放射性标记产物从PD-10柱洗脱并使用剂量校验仪(新泽西州拉姆齐的卡皮技术(Capintec，RamseyNJ)和radioTLC分析；124I结合的粒子洗脱份的比活性为约1450毫居里(mCi)/μmol并且放射化学纯度超过95％。
患者选择.组织学上证实患有疾病并含有新诊断或复发性肿瘤的转移性黑色素瘤受试者符合试验条件。从研究排除患有与黑色素瘤不相关的医学疾病，将阻止粒子示踪剂投与的受试者。在静脉内注射放射性碘化的粒子示踪剂(124I-cRGDY-PEG-C点，185MBq/5ml)之前2天和之后至多2周投与碘化钾溶液(SSKI，每天130mg)以阻断甲状腺功能。此方案经纪念斯隆凯特琳癌症中心机构审查委员会(theInstitutionalReviewBoardoftheMemorialSloanKetteringCancerCenter)批准。在PET前后测试患者的血液、肾和肝功能并提供签名的知情同意书。
图像获取和处理.根据标准程序获得低剂量螺旋形CT扫描，接着在注射粒子示踪剂后4、24和72小时在专用GEDiscoverySTEPET/CT扫描仪上获取三个全身PET扫描。使用有序子集最大期望值(OSEM)算法重构正电子发射数据。针对衰减，使用在相同区域上收集的CT透射数据，校正图像，并使用CT数据集进行串行数据组的记录。
成像和代谢分析.对于药物动力学和放射量测定分析，在PET成像数据(新泽西州里齐伍的通用电气医疗集团AW工作站(AWWorkstation，GEHealthcare，Ridgewood，NJ))上绘制相关区域(ROI)以提取包括脑、肺、左心室、肝、脾、肠、肾、膀胱、肌肉、乳房和肿瘤在内的所有主要正常器官和组织的平均和最大标准吸收值(SUV)。对于药物动力学评估，SUV转化成％ID/g值(即，SUV＝％ID/g组织×患者体重/100)。器官/组织吸收数据通过来自血液和尿的时间-活性数据补充。在124I-cRGDYPEG-C点注射后约30分钟、3小时、24小时、72小时和至多2周收集静脉血液和尿样本。全血样本离心(4000rpm，10分钟)后，在针对124I校准的闪烁孔计数器(1480自动γ计数器，康涅狄格州谢尔顿的珀金埃尔默(PerkinElmer，SheltonCT))中分析血浆上清液以及尿样本。RadioTLC分析另外在生物样本上进行。粒子示踪剂、标记有131I的天然肽(cRGDY)和游离碘(131I)的RadioTLC分析充当对照以便于解释。活性(每分钟计数，cpm)转化成微居里，衰变校正，并针对等分体积来调整。最终值表示为％ID/g。获得示踪剂的保留因子(Rf)值并用于鉴别母体化合物和可能代谢物。
放射线放射量测定.标准放射线放射量测定方法是由MIRD(医学内部放射性核素放射量测定(MedicalInternalRadionuclideDosimetry))委员会颁布的方法的改编，解释了投与的放射性核素(124I)的物理特性以及放射性药物在个别患者中的生物特性(药物动力学和生物分布)。从MIRD放射性核素数据和衰变方案公开案获得124I发射和其相应频率和能量。连续全身PET扫描能够使用ROI来源的时间-活性数据推导正常器官吸收剂量(rad和rad/mCi)估计值。在所有参数，包括扫描时间一致下，获得PET扫描。使用患者的总体重(kg)和70kg标准男性器官质量，将全身和器官ROI数据(即平均标准吸收值(SUV))转化成活性(即所注射剂量的分率)。使用最小二乘拟合算法将以上图像来源的时间-活性数据拟合成指数函数，并且所得时间-活性函数在分析上积分，并入124I的物理衰变的作用，得到在器官和全身中的累积活性(或保留时间)，以μCi-hr/μCi计。通过采用OLINDAEXMMIRD程序，累积活性用于计算器官的124I标记的粒子平均吸收剂量(rad/mCi)和70kg标准男性解剖模型的有效剂量(rem/mCi)。洛文杰等人，用于吸收剂量 计算的MIRD基底.核医学协会，纽约，纽约州，1991(Loevingeretal.，MIRDPrimerfor AbsorbedDoseCalculations.SocietyofNuclearMedicine，NewYork，NY，1991)。
血清蛋白结合分析.从转移性黑色素瘤小型猪模型(密苏里州辛克莱研究中心(SinclairResearchCenter，MO))收集全血样本在血清隔膜管中，接着离心(4000rpm，10分钟)，以分离血浆部分。血清的等分试样放在一旁以供γ计数；剩余的部分用乙醇(200proof，宾夕法尼亚州普鲁士王村的德肯实验室(DecernLabs，KingofPrussia，PA))处理，涡旋直到混浊，并放在干冰上(5分钟)以促进血清蛋白沉淀。离心后，收集上清液以供γ计数并用磷酸盐缓冲盐水重复洗涤集结粒并离心(4000rpm，10分钟)以收集100μL上清液等分试样供γ计数(1480维兹德(Wizard)3″)。
实例15α-MSH-PEG-Cy5-粒子(MSH肽结合粒子)
用于纳米粒子结合的N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH(或αMSH)肽具有图32中展示的结构。其经由N端半胱氨酸硫醇附接到纳米粒子上。两个氨基己酸单元的间隔基将纳米粒子附接点与D-Lys-ReCCMSH靶向分子分离。图33中展示初始ReCCMSH靶向分子。其经设计以将放射性核素靶向黑色素瘤肿瘤用于成像和治疗。MSH肽类似物可以直接用99mTc或188Re放射性标记(在Re部位)或经由附加到氨基端的金属螯合剂。
图32中展示的αMSH肽类似物非常不同于图33中展示的初始MSH类似物。初始MSH分子可以不附接到纳米粒子。纳米粒子MSH肽含有具有侧链用于放射性标记的游离氨基。此当前是D-离胺酸，但可以为长度为1到许多个碳的氨基终止侧链。
N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH(或α-MSH)结合于纳米粒子允许纳米粒子靶向和结合黑色素瘤细胞和肿瘤。使用FCS，所得粒子或α-MSH-PEG-Cy5-C点为约6-7nmi.d.并且平均每一粒子含有约2.6个染料。估计每一粒子α-MSH配体的数目＜10。
使用N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH(或α-MSH)结合粒子的竞争性结合研究：在使用黑皮质素-1受体促效剂(125I-NDP)的竞争性结合分析中，αMSH结合纳米粒子对培养的B16/F1黑色素瘤细胞的IC50为6.6×10-10M(图34A)，而分子的零乱序列型式的IC50为2.3×10-7M(图34B)。此外，结合存在3个数量级差异。仅供参考，在相同类型的竞争性结合分析中，初始DOTA-ReCCMSH具有2.1×10-9M的IC50。
N-Ac-Cys-(Ahx)-D-Lys-ReCCMSH(或α-MSH)肽结合纳米粒子结合物对B16/F1细胞的亲和力优于初始DOTA-ReCCMSH并且亲和力比零乱肽纳米粒子大得多。
对于B16F10和M21黑色素瘤两种细胞系，另外获得剂量反应数据作为靶向粒子浓度(图35A)和培育时间(图35B)的函数。基于流动式细胞测量术研究，发现对于这两个细胞类型来说，这些细胞系的饱和浓度为约100nM，并且需要至少2小时培育时间来最大化结合。
在一系列粒子浓度上进行48小时固定培育时间的人类M21细胞存活研究证实细胞活力未显著丧失(图36)。
125I放射性标记的α-MSH结合纳米粒子证实在B16F10和M21两种鼠类异种移植模型中在24小时时期期间的主体肾排泄(图37A、37B)；在稍后时间点(即，＞24小时)未测量到明显的粒子示踪剂。此外，B16F10与M21异种移植模型都未展示靶向粒子探针在网状内皮系统中的显著累积(即非RES剂)，肾也没有(图38A、38B)，后一器官通常是在其净正电荷下非特异性地累积α-MSH的部位。因此，α-MSH附接到粒子探针明显地提高其肾清除特性并消除在肾内的累积。
实例16肿瘤生物学的整合素介导的信号传导和调节
整合素信号传导调节肿瘤细胞中的不同功能，包括粘着/扩展、迁移、侵袭、增殖和存活。在包括黑色素瘤在内的若干肿瘤类型中，具体整合素的表达与疾病进展增加和患者存活减少相关。整合素介导的粘着相互作用已经在细胞存活机制和发散信号传导通路的活化中鉴别出新颖整合素功能。众所周知，含有RGD序列的肽(或肽簇)结合于整合素受体导致整合素交联或丛集，此又调节以上过程。但是，并不清楚负载多个RGD肽配体的纳米粒子是否可以另外触发此类整合素信号传导事件，因此此将反映对多个基于粒子的因素(尺寸、电荷、组成、表面化学、配体数目/类型)、肿瘤(或内皮)细胞类型、细胞受体密度和粒子给予的复杂依赖性。剂量反应研究证实在细胞暴露于超过100nM的粒子浓度时发散信号传导通路的适度活化，此又促进M21和HUVEC细胞迁移、增殖活性并改变粘着特性。
cRGDY-PEG-C点与M21和HUVEC细胞的结合
αvβ3整合素受体在血管重塑和血管生成中起关键作用，证实对于多种肿瘤细胞系，在内皮和肿瘤细胞表面上表达增加。此使得此受体用作标靶以达成诊断和治疗目的。在我们的情况下，测试cRGDY-PEG-C点结合于黑色素瘤细胞(M21)或人类脐部血管内皮细胞(HUVEC)的能力，随浓度和时间而变。初始剂量反应研究展示通过流动式细胞量测术，cRGDY-PEG-C点与M21和HUVEC细胞的结合随浓度而变，进展性增加(图39、图47A)。粒子结合证实两种细胞系在约100nM下饱和，其中M21细胞的平均门控值％为约80％并且HUVEC细胞为96％。对于两种细胞类型，在与100nMcRGDY-PEG-C点一起培育后剂量反应行为另外作为粒子培育时间的函数来研究。在培育后2小时，观测到最大结合，此后保持相对恒定(图47B)。
cRGDY-PEG-C点的内吞作用和细胞内运输
为了阐明在M21细胞中培育后cRGDY-PEG-C点利用的通路的性质-是否此为αvβ3整合素受体介导和/或非特异性吸收过程，检验这些粒子在三种温度下达4小时培育时间的温度依赖性吸收：4℃、25℃和37℃。图39A、C中概述的结果指示在测试的两种细胞系中与25℃或4℃相比，在37℃下细胞相关的cRGDY-PEG-C点增加。此外，在M21和HUVEC细胞中存在αvβ3受体的过量(x250)抗体下部分阻断cRGDY-PEG-C点的内化(图39A、39C)，表明受体介导的结合的组分。另外，αvβ3阴性M21L细胞中的吸收分别是在37℃和25℃下表达αvβ3的细胞下所看到的吸收的1/4到1/8(图39B)。
为进一步表征涉及cRGDY-PEG-C点内化的细胞隔室，在M21细胞中用cRGDY-PEG-C点和不同内吞囊泡的生物标记物进行共定位分析。通过装备有HCXPLAPO物镜(63x1.2NAWaterDICD)的倒置式共焦显微镜(徕卡TCSSP2AOBS)灵敏地检测靶向粒子的内化(约1μM，红色，4小时培育)(图39D)。使用内吞标记物LysoTracker红(100nM，绿色)(图39D)和铁传递蛋白-Alexa488，证实吸收到酸性内吞结构中，表明网格蛋白依赖性通路活性和囊泡的逐渐酸化。图39D展示粒子与酸性内吞30囊泡(黄色凹陷)之间的共定位数据。在与cRGDY-PEG-C点共定位的70kDa聚葡萄糖-FITC下也观测到吸收到巨胞饮细胞中；此发现提出了内化的第二通路。用赫斯特(Hoechst)进行细胞核对比染色(蓝色)。没有粒子进入核。延时成像证实粒子吸收到M21细胞中并与溶酶体标记物Lamp1共定位。
竞争性αvβ3整合素受体结合和分子特异性
竞争性结合分析展示使用过量(x50-x100)cRGDY肽和放射性标记粒子示踪剂(124I-PEG-cRGDY-C点)的γ计数，M21和HUVEC细胞中受体介导的粒子结合在前者中阻断80％-85％，并在后者中阻断30-40％(图48A)。与cRGDY-PEG-C点形成对比，在M21(约30％-43％)和HUVEC(约13％-27％)细胞中在与非靶向(即PEG-C点)粒子探针一起培育之后，通过流动式细胞测量术(图48B)，看到受体结合的量值显著减少。
cRGDY-PEG-C点对细胞活力和增殖的影响
为证实cRGDY-PEG-C点不会不利地影响细胞存活和增殖，将G0/G1期同步M21和HUVEC细胞暴露于37℃下补充血清的培养基(2％、10％FBS)中一系列粒子浓度(25-200nMcRGDY-PEG-C点；15分钟或24小时)和培育时间(0-93小时)，并使用光学板式读取器(λ＝440nm)测量吸光度的时间依赖性变化。相对于对照(即补充血清的培养基)，看到吸光度测量值在测试的粒子浓度范围内相对恒定，表明细胞存活未显著丧失(图49A、49B)。此外，在多剂(n＝5)100nMcRGDY-PEG-C点添加到M21和HUVEC细胞后未发现吸光度的时间依赖性减少，表明细胞的增殖特性未改变(图49C、49D)。
cRGDY-PEG-C点对FAK通路的活化
已知配体结合于αvβ3整合素受体启动信号转导通路。结合后，发生整合素丛集，导致在酪氨酸397(Src家族激酶的结合位点)的非受体激酶FAK自体磷酸化。Src激酶的募集导致羧基端区域中在酪氨酸576/577的FAK和在酪氨酸925的FAK的磷酸化。还已知在酪氨酸397的FAK磷酸化活化大量信号级联和下游通路中间物，例如Ras-有丝分裂原活化蛋白(MAPK)信号传导，其诱发Raf/MEK/Erk和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT通路(AKT、mTOR、S6K)的活化(图40A)。
为了确定αvβ3整合素结合cRGDY-PEG-C点是否调节这些通路的活性，在37℃下用100nMcRGDY-PEG-C点处理缺乏血清(0.2％FCS)的M21细胞2小时；用单独0.2％FCS处理缺乏血清的细胞，充当对照。来自暴露于粒子的细胞的溶解物的蛋白质印迹分析揭露了多种蛋白质中间物的磷酸化水平增强：pFAK-397和pFAK-576/577、Src、pMEK、pErk和AkT(图40B)，此表明下游信号传导通路的活化。这些发现以图形方式描绘为标准化强度比率，已经相对于其相应总体蛋白质水平表述，并针对在对照条件下测量的对应值标准化(图40C)。细胞与PEG-C点一起培育未加强测试的蛋白质的磷酸化水平(数据未展示)。
通过用小分子抑制剂PF-573228阻断此通路，评估所观测到的下游信号传导通路的活化是否取决于在酪氨酸397的FAK的磷酸化。此抑制剂与ATP结合袋中的FAK相互作用并有效地阻断FAK蛋白质的催化活性与随后Tyr397上FAK磷酸化。添加两种浓度的PF-573228到缺乏血清的预先暴露于100nMcRGDY-PEG-C点的M21细胞后，蛋白质印迹分析揭露了Tyr397和Src上FAK磷酸化的抑制(图41A)，以图形方式显示在图41B中。仅仅在较高抑制剂浓度下观测到MEK或Erk磷酸化的抑制(图41A、41B)。
cRGDY-PEG-C点对细胞迁移的作用
已知在许多类型的肿瘤和血管生成细胞上高度表达的αvβ3整合素受体调节许多下游生物过程，包括细胞迁移、粘着、增殖、侵袭和血管生成。在以下实验中，寻求确定cRGDY-PEG-C点是否改变M21和HUVEC细胞的迁移。初始一组实验使用在三种连续较高粒子浓度(0nM-400nM；37℃)下在96小时时段期间的延时成像(图42A，i-xx)，检验M21细胞迁移的时间依赖性变化，如平均闭合面积所反映。观测到与对照样品(73％；p＜0.05)相比，在96小时时期期间平均闭合面积的统计学上显著增加，呈在使用的粒子浓度范围内相对恒定的基线值(t＝0)的百分比(即约87％-92％)(图42A、B)。在更早时间间隔未看到显著变化(图42B)。
HUVEC细胞(37℃，20小时)与一系列cRGDY-PEG-C点浓度(100-400nM)在0.2％FCS存在下培育展示与未暴露于粒子的细胞的19％(p＜0.05)相比，对于400nM的浓度，平均闭合面积的统计学上显著的增加(即34％)(图43A、43B)。针对所使用的较低粒子浓度，未观测到迁移的明显改变(图43A、43B)。看到暴露于粒子的细胞展现与对照细胞相比更高的迁移速率。
进一步展示通过添加FAK抑制剂PF-573228，使细胞迁移速率的增加减少。在HUVEC细胞与400nM粒子经24小时时间间隔培育之后获得初始相差图像(图44A，i-viii)，并且确定平均闭合面积并相对于单独血清以图形方式显示(图44B)。看到平均闭合面积相对于对照的改变百分比和添加抑制剂前后的改变百分比从+34％减少到+3％。发现在相对于缺乏血清的对照，不具有抑制剂的暴露于粒子的细胞(p＜0.03)与用不同抑制剂浓度(250nM、500nM；p＜0.001)处理的粒子的值之间的统计学上显著的差异；前两组之间的差异也是统计学上显著的(图44C)。
cRGDY-PEG-C点对细胞粘着和扩展的作用
已知RGD三肽是细胞外基质组分、纤维结合蛋白和玻璃连结蛋白的组分。在将细胞转移到纤维结合蛋白涂布的孔后，使用在有或无400nMcRGDY-PEG-C点和纤维结合蛋白下预先培育(25℃、30分钟)的M21细胞(104个细胞/孔)进行竞争性结合分析。未与cRGDY-PEG-C点预先培育的约60％细胞在纤维结合蛋白涂布的培养板上在开始30分钟内附接并扩散。相比之下，与400nMcRGDY-PEG-C点预先培育的极低百分比(15％)的M21细胞甚至在接种后120分钟还在纤维结合蛋白涂布的孔上附接和扩散(图45A、45B)。在2小时时期内‘伸长’(扩展细胞)相对于‘圆形’细胞的平均细胞数揭露了在不存在粒子(即，对照条件)下，在大部分细胞中观测到细胞扩展(‘伸长’细胞)，而在暴露于粒子的细胞的情况下看到主要‘圆形’外观(图45A)。这些结果分别以图形方式描绘于图45B和45C中。在添加亚甲基蓝(吸光度)之后细胞光学密度的检核揭露了在纤维结合蛋白上附接和扩散的细胞(即，无粒子预先培育)吸收的亚甲基蓝是暴露于粒子的细胞的两倍多(图45D)。观测到如果使用玻璃连结蛋白涂布的孔，那么现象相同(数据未展示)。总之，这些数据证实cRGDY-PEG-C点通过结合于在M21和HUVEC细胞上发现的整合素αvβ3受体增强细胞的迁移和扩展。
cRGDY-PEG-C点对M21细胞中的细胞周期的影响
因为整合素受体与细胞的存活和增殖有关，所以分析cRGDY-PEG-C点对细胞周期的作用。在补充0.2％FCS的培养基中使用两种浓度的cRGDY-PEG-C点(100nM、300nM)培育G0/G1期同步M21细胞48小时。在此范围内，S期细胞的百分比上升11％，其中相对于对照，在100nM(p＜0.05)和300nM(p＜0.005)下实现统计显著性(图46A、46B)。看到细胞周期的G1和G2期分别对应6％和5％的降低。综合来说，这些数据指示在cRGDY-PEG-C点存在下S期增强。
材料和方法
试剂、抗体和化学物质.RPMI1640、胎牛血清(FBS)、青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)和HBSS(不具有钙和镁，含有0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA)从斯隆凯特琳癌症中心(纽约州纽约)的核心培养基制造机构(CoreMediaPreparationFacility)获得。抗多克隆兔：磷酸化-Erk1/2(p-Erk1/2Thr202/Tyr204)、磷酸化-AKT(p-AktSer473)、磷酸化-Src(p-SrcTyr419)、磷酸化-p70S6(p-p70S6Thr389)、磷酸化-MEK1/2(p-MEK1/2Ser217/221)、磷酸化-FAK-Tyr397、磷酸化-FAK-Tyr576/577、磷酸化-FAKTyr925、Erk、AKT、Src、p70S6、MEK1/2(47E6)和FAK从赛信通技术公司(CellSignalingTechnology)(马萨诸塞州丹佛斯(Danvers，MA))获得。山羊抗兔IgC、山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)结合物从圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruzBiotechnology)(加利福尼亚州圣克鲁兹(SantaCruz，CA))获得。碘化丙锭、RNA酶A、铁传递蛋白-AlexaFluor488结合物、FITC-聚葡萄糖、荧光素、LysoTracker红DND-99、LysoTracker绿DND-26、pHrodo红聚葡萄糖和赫斯特从英杰生命技术公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA)获得。PF-573228从TOCRIS生物科学(TOCRISbioscience)(密苏里州埃利斯维尔(Ellisville，MO))获得。环(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)来自肽国际公司(肯塔基州路易斯维尔)。
cRGDY-PEG-C点和PEG-点的合成.含有有机染料Cy5的荧光粒子通过如先前描述的经修改的施托贝尔型二氧化硅缩合来制备。酪氨酸残基结合于PEG链以附接放射线碘。含有序列环-(Arg-Gly-Asp-Tyr)和负载半胱氨酸残基(肽国际公司)的cRGDY肽经由半胱氨酸-顺丁烯二酰亚胺键附接到官能化的PEG链。凭经验计算每一纳米粒子的cRGD配体数目。
PEG附接到C点表面的机制.双官能PEGMAL-12-NHS酯(量子生物设计有限公司(QuantaBiodesigns，Ltd))用硅烷、特别是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(盖勒斯特(Gelest))衍生，以经由硫氢基与衍生化PEG的顺丁烯二酰亚胺部分之间的反应附接到二氧化硅表面和肽耦合。此外，根据经修改的方案，使用官能性有机硅化合物(Si化合物)、特别是(MeO)3Si-PEG(盖勒斯特)将甲氧基封端的PEG链添加到粒子表面。简单来说，以约三摩尔过量将(MeO)3Si-PEG添加到水/醇基础混合物(约1∶5v/v)中的粒子中，并在室温下搅拌混合物过夜。
通过荧光相关性光谱法(FCS)的流体动力学尺寸和相对亮度比较测量.如针对游离Cy5染料，最初通过将这些粒子样品渗吸到水，用生理盐水(H2O中0.15MNaCl)稀释，并在蔡司LSM510Confocor2FCS上使用HeNe633nm激发分析所得样本，来确定cRGDY-PEG和PEG点的流体动力学半径、亮度和浓度。在所有测量前仪器相对于粒径校准。基于扩散时间差估计染料和粒子物质的平均流体动力学尺寸，同时使用每一分子/粒子的计数速率评估亮度的相对差异。
细胞和细胞培养物：人类黑色素瘤细胞系M21和M21变异体M21L(av阴性)从迪艾查瑞希(D.A.Cheresh)(加利福尼亚州圣地亚哥的加利福尼亚大学(UniversityofCalifornia，SanDiego，CA))获得。细胞维持在补充有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和青霉素链霉素的RPMI1640中。将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)从龙沙(LONZA)(马里兰州沃克斯维尔(Walkersville，MP))获得，在含有2％FBS和生长因子龙沙的EGM-2培养基中培养。
使用光学检测方法的体外细胞结合研究：为了分析M21、M21-L或HUVEC细胞的粒子结合，将24孔板用含10μg/mlI型胶原蛋白(碧迪生物科学)的PBS涂布，在37℃下培育30分钟，并用PBS洗涤一次。细胞(3.0×105个细胞/孔到4.0×105个细胞/孔)生长到汇合。使用流动式细胞量测术，在一系列培育时间(至多4小时)和粒子浓度(10-600nM)上评估cRGDY-PEG-C点与M21或HUVBC细胞的差异结合。在培育后，将细胞用RPMI1640培养基/0.5％BSA洗涤，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA分离，在微量离心管(在153g、25℃下5分钟)中粒化，再悬浮于碧迪FACSFlow溶液(碧迪生物科学公司)中，并在Cy-5通道中分析以确定粒子结合探针的百分比(FACSCalibur，加利福尼亚州山景城百克顿-迪金森公司(BectonDickinson，MountainView，CA)。
内化研究：实验如上进行，但在三种不同温度下培育4小时：4℃、25℃和37℃。过量(x250)cRGDY抗人类整合素αvβ3荧光素结合抗体(马萨诸塞州比勒利卡的密理博(Millipore，Billerica，MA))与cRGDY-PEG-C点共培育用于受体阻断以评估特异性。用固定和活细胞进行分析。对于固定M21细胞，使用装备有HCXPLAPO物镜(63x1.2NAWaterDICD)的倒置式共聚焦显微镜(徕卡TCSSP2AOBS)并且延时成像用于追踪活M21细胞。
在若干浓度的靶向(或对照)粒子与以下染料标记物共培育4小时后获取成像：70kDa聚葡萄糖-FITC结合物(1mg/mL，37℃，30分钟；英杰公司)以标记巨胞饮小体、Lysotracker红(100nM；英杰公司)以标记内吞通路(即酸性细胞器)和铁传递蛋白Alexa488(2μg/mL)。
竞争性结合研究：为了分析特异性结合，M21细胞与124I-cRGDY-PEG-C点(25nM)和过量cRGDY肽培育(25℃，4小时)。然后用RPMI1640培养基/0.5％BSA洗涤细胞，并溶解于0.5ml0.2MNaOH中。使用针对碘-124校准的1480自动γ计数器(珀金埃尔默)分析放射性。
蛋白质印迹(WB)：M21细胞(1×106细胞/六孔板)生长在用胶原蛋白(10mg/ml)涂布的六个孔中，并通过在缺乏血清的条件下生长而处于静态。然后培养基变成0.2％FCS，并添加不同浓度(25-400nM)cRGDY-PEG-C点(37℃、0.5-8小时)。将细胞在冰冷PBS中冲洗两次，通过胰蛋白酶消化来收集，并使集结粒再悬浮于裂解缓冲液(10mMTrisPH-8.5、150mMNaCl、1mMEDTA、1％曲拉通X-100(TritonX-100)；新泽西州安可乐斯有机物公司(ACROSorganics，NJ))、1％脱氧胆酸纳、0.1％SDS、CompleteTM蛋白酶抑制剂(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏公司)和磷酸酶抑制剂混合物Tablet-PhosSTOP(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏公司)。溶解物离心(10分钟，4℃)。通过二喹啉甲酸分析(BCA，伊利诺伊州罗克福德的赛默科技公司(ThermoScientific，Rockford，IL))测定蛋白质浓度。通过4-12％梯度十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离每一部分的50μg蛋白质等分试样并转移到PVDF膜(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。将膜用含5％无脂奶粉(加利福尼亚州埃库莱斯的拜耳雷德公司(Bio-Rad，Hercules，CA))的Tris缓冲生理盐水(TBS)-吐温(Tween)0.1％阻断，并在涂覆初级(1∶1000)和二级(1∶1200-1∶1500)抗体后通过ECL化学发光(伊利诺伊州罗克福德的赛默科技公司)或西方伊比隆(ImmobilonWestern)(马萨诸塞州比勒利卡的密理博(MilliporeBillerica，MA))目测信号。
细胞周期分析：在培养基变成0.2％FCS后，使用两种浓度(100和300nM)cRGDY-PEG-C点，培育G0/G1期同步M21细胞48小时。胰蛋白酶消化后，细胞离心(1200rpm，5分钟)，并使集结粒悬浮于PBS中，接着用70％乙醇固定(4℃，0.5-1小时)。细胞连续再悬浮于1ml含有1％FCS和0.1％曲拉通X-100的PBS、200μl含有25μg/ml碘化丙锭的PBS和100mg/mlRNA酶A中(4℃，60分钟)。通过流动式细胞测量术FACSCalibur(加利福尼亚州山景城)和菲尼克斯流动MultiCycle软件(加利福尼亚州圣地亚哥的菲尼克斯流动系统公司(PhoenixFlowSystems，Inc.，SanDiego，CA))进行细胞周期分析。
细胞增殖：细胞在用胶原蛋白涂布的96孔板中分流(1×104个细胞/孔)，如体外细胞结合研究中所述。在37℃下添加不同浓度的cRGDY-PEG-C点(25-200nM)，历时24-48小时。然后，添加20ml增殖试剂WST-1(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏公司)到培养板(37℃，1小时)。为测定光学密度，使用SpectraMax5微量板式读取器(加利福尼亚州森尼韦尔的分子装置公司(MolecularDevices，Sunnyvale，CA))。在440nm下测量吸光度。
迁移分析：M21细胞：使用迁移试剂盒(OrisTM胶原蛋白I涂布的培养板，鸭嘴兽技术公司(PLATYPUSTEC))接种M21细胞(6×104个细胞/孔)。细胞接种后二十四小时，去除培养板中的塞子。引入补充有0.2％FBS的新鲜培养基(100μl)并添加若干浓度的cRGDY-PEG-C点：25、100和400nM。此后每24小时，在72小时时间间隔期间置换培养基，以及新粒子。在37℃下培育板过夜前，通过艾斯维特(Axiovert)200M显微镜(卡尔蔡司(CarlZeiss))，使用5x(.15NA)物镜并使用美魔软件(Metamorphsoftware))(宾夕法尼亚州分子装置公司)中的扫描载玻片模块捕捉零时图像。然后进行连续显微法并且每24小时捕捉图像，培育后总共96小时。通过使用ImageJ软件分析数据。HUVEC细胞：HUVEC细胞另外接种(5×104个细胞/孔)，并且24小时后，在替换培养基后与若干粒子浓度(100、200和400nM)一起培育。对针对M21细胞一样，进行类似的显微法程序，其中20小时后获得连续成像。
粘着和扩展分析：通过最初用含纤维结合蛋白的PBS(5μg/ml)、接着200μlRPMI/0.5％BSA(37℃、1小时)涂布96孔微量滴定盘，评估cRGDY-PEG-C点对M21细胞结合于纤维结合蛋白涂布的培养板的作用。在有或无含400nMcRGDY-PEG-C点的RPMI/0.1％BSA下培育细胞(1-3×104个细胞/100微升/孔)(25℃、30分钟)，并添加到纤维结合蛋白涂布的孔(37℃、30-120分钟)。为定量粘着细胞的数目，将孔用RPMI/0.1％BSA冲洗以去除未粘着细胞。将粘着细胞用4％PFA(25℃、20分钟)固定并用亚甲基蓝染色(37℃、1小时)。通过添加200ml0.1MHCl(37℃、1小时)，从细胞提取亚甲基蓝。为测定光学密度，使用SpectraMax5微量板式读取器并在650nm下测量吸光度。对于扩展分析：进行延时(37℃、2小时)，并通过艾斯维特200M显微镜(卡尔蔡司)，使用20x(.15NA)物镜并使用美魔软件(分子装置公司)中的扫描载玻片模块捕捉图像。
定量分析：为了定量蛋白质印迹带之间的尺寸和强度差异，使用PhotoshopCS2(加利福尼亚州圣何塞的阿多博(Adobe，SanJose，CA))进行进行磷酸化和总蛋白质中间物的光密度测定法。在300dpi(Scanjet7650，加利福尼亚州帕洛帕洛阿尔托的休利特帕卡德公司(HewlettPackard，PaloAlto，CA)下扫描亮带并转化成灰度。然后套索工具用于牵伸每一亮带边界内的相关区域(ROI)以推导以下各者：面积(像素数目)、所选面积内的平均灰度值(0-255)和相关标准偏差。计算每一亮带的头两个值的乘积，并除以每一组中初始亮带的乘积(对照亮带)，得到相对于对照，每一样品的强度值。最终，使用相对强度，计算每一样品的磷酸化蛋白与总蛋白质的比率和对应传播误差(SD)。
使用ImageJ1.45s(美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)，rsbweb.nih.gov/ij/)分析针对迁移研究所捕捉的相差图像，以定量M21细胞和HUVEC的细胞迁移程度(即，闭合面积)。在高功率视图下，绘出封闭面积与去除塞子后在每一图像中看到的粘着细胞的边缘相邻。测量每一图像的封闭面积(像素)并用于如下计算相对于零时(添加粒子和培养基替换后)的闭合％：在既定时间点(24、48、72或96小时)和零时的面积差异除以在零时的相同面积乘以100。所得值求平均值并计算每一组的标准误差。
统计数据：除非指出，否则所有图形值都绘制为平均值±SE。一尾史都登氏t检验(Student′st-test)用于测试与单独血清或cRGDY-PEG-C点一起培育的HUVEC或M21细胞之间的细胞迁移差异的统计显著性。单向方差分析(ANOVA)用于执行与单独血清、100nM或300nMcRGDY-PEG-C点一起培育的S期M21细胞之间的统计学逐对比较。分配所有测试的统计显著性为P＜0.05。
实例17用于二氧化硅诊断性/治疗性粒子的增强肿瘤传递的鞘磷脂脂质体
研究小于10nm的粒子(例如C点)作为药物传递媒剂的治疗潜能。已经通过将药物附接到粒子结合的双官能化的PEG链来发展药物结合的粒子。利用此概念验证工作的模型药物是受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂。粒子治疗有效负载在标靶位点的传递和累积可以通过采用剂量递增策略，利用光学和/或PET成像评估肿瘤内增强的粒子吸收和分布来最大化。增强粒子负荷传递的一种替代性方法利用脂质体调配物囊封治疗粒子探针。脂质体经由增强的渗透性和保留(EPR)作用被动靶向肿瘤，同时保护有效负载避免在循环中降解。在粒子囊封前，cRGDY或连接子-药物结合物将以活性靶向机制附接到粒子表面以最大化传递到标靶位点。
一旦在标靶位点，粒子可以因肿瘤中存在的上调酶系统而从脂质体调配物释放到肿瘤间质。酸神经磷脂酶(ASMase、酸SMase或SMase)回应于例如X射线照射和毒素等细胞应力从肿瘤细胞进行细胞外释放，导致快速的神经酰胺介导的细胞损伤并且随后细胞凋亡。酸SMase使脂质体调配物内存在的鞘磷脂水解成神经酰胺。神经酰胺在生物系统中起到作为细胞凋亡过程中的二级信使的作用。神经酰胺的膜特性明显不同于亲本分子鞘磷脂。当含鞘磷脂的脂质体用SMase裂解时，膜刚性显著改变。鞘磷脂是一种适合于脂质体调配的脂质；对于神经酰胺则非如此，因为其作为脂质体构建基块并入会导致脂质体泄漏。此泄漏将引起脂质体内含物释放。此使得大的经药物和/或细胞内化标记物(即，肽KLAKLAC和小分子抑制剂)官能化的二氧化硅纳米粒子有效负载在细胞内的靶向可以监测和/或治疗疾病。
为了确定相对于未经囊封的粒子探针，脂质体囊封是否明显增加粒子传递到肿瘤部位，将利用光学和PET成像方法监测神经磷脂酶脂质体囊封和未囊封的粒子批料在表达EGFRmt+的脑肿瘤异种移植模型(即H1650、A431)中的吸收。脂质体和粒子探针都将含有光学标记物用于目测。
参考：索卡尼克，麦曲斯，斯摩拉兹，赛通，斯尼图，查加，斯查拉.使用分裂血管肽和脂质体包覆的化学治疗剂的实验性抗癌疗法.免疫治疗实验档案(Warsz).2010年6月；58(3)：235-45(SochanikA1，MitrusI，SmolarczykR，T，SnieturaM，CzajaM，SzalaS.Experimentalanticancertherapywithvascular-disruptivepeptideandliposome-entrappedchemotherapeuticagent.ArchlmmunolTherExp(Warsz).2010Jun；58(3)：235-45)。
以上用于检测和靶向应激细胞的方法包括由双层脂质体构成的调配物，双层脂质体每一者具有形成脂质体的脂质、鞘磷脂或其混合物的初始外层；形成脂质体的脂质、鞘磷脂或其混合物的第二内层；形成双层脂质体并界定其中内部空间的第一和第二层；其中内部空间含有二氧化硅纳米粒子。二氧化硅纳米粒子和/或脂质体将被光学标记物和/或PET标记(染料、荧光团、放射性标记、造影剂)、酶底物和/或治疗剂，包括细胞毒性药物、DNA区段或放射性示踪指示物标记损害。在其中神经磷脂酶存在于细胞中或被细胞释放的条件下鞘磷脂脂质体内含有的标记物和/或药物标记的二氧化硅粒子接触细胞样品。此酶接触又将水解脂质体中的鞘磷脂以从脂质体的亲水性(内部)或疏水性(双层)隔室释放二氧化硅纳米粒子和/或标记物标记和/或药物。
本发明的范围不受上文特别展示和描述的内容限制。所属领域的技术人员将认识到材料、配置、构造和尺寸的所描绘的实例存在适合的替代物。本发明的具体实施方式中引用和论述包括专利和各种公开案在内的大量参考文献。此类参考文献的引用和讨论仅仅为了阐明本发明的具体实施方式而提供，并且并不是承认任何参考文献是本文中所描述的本发明的现有技术。所有在本说明书中引用和论述的参考文献都以全文引用的方式并入本文中。对于所属领域的技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围下将进行本文所述内容的变化、修改和其它实施。虽然已经展示和描述本发明的某些实施例，但所属领域的技术人员显而易见，在不脱离本发明精神和范围下可以进行这些变化与修改。以上描述和附图中阐述的主题仅仅是以说明方式提供并且非限制性。

Claims (46)

1.一种用于检测肿瘤细胞的方法，其包含以下步骤：
(a)以在约0.01纳摩尔/千克体重到约1纳摩尔/千克体重范围内的剂量向患者投予多个荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，所述纳米粒子包含：
基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；
围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；
附接到所述纳米粒子上的有机聚合物；
附接到所述纳米粒子上并且能够结合肿瘤标记的配体；以及
至少一种治疗剂；以及
(b)检测所述纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子经真皮下、瘤周、经口、静脉内、经鼻、皮下、肌内或经皮投予。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约25nm之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约8nm之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机聚合物选自由以下各项组成的群组：聚(乙二醇)PEG、聚乳酸酯、聚乳酸、糖、脂质、聚谷氨酸PGA、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)PLGA、聚乙酸乙烯酯PVA以及其组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中附接到所述纳米粒子上的配体的数量在约1到约25范围内。
7.根据权利要求6所述的方法，其中附接到所述纳米粒子上的配体的数量在约1到约10范围内。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体选自由以下各项组成的群组：肽、蛋白质、生物聚合物、合成聚合物、抗原、抗体、微生物、病毒、受体、半抗原、酶、激素、化合物、病原体、毒素、表面改性剂以及其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肽选自由以下各项组成的群组：三肽RGD、环肽cRGD、奥曲酯、EPPT1以及α-MSH的肽类似物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中将造影剂或螯合物附接到所述纳米粒子上。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述造影剂是放射性核素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述放射性核素选自由以下各项组成的群组：89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I以及177Lu。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述螯合物经调适以结合放射性核素。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述螯合物选自由以下各项组成的群组：DFO、DOTA、TETA以及DTPA。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子可由PET、SPECT、CT、MRI、光学成像、生物发光成像或其组合检测。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述光学成像是荧光成像。
17.根据权利要求1所述的方法，其中将治疗剂附接到所述纳米粒子上。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下各项组成的群组：抗生素、抗微生物剂、抗增殖剂、抗肿瘤药、抗氧化剂、内皮细胞生长因子、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、抗血小板凝集剂、胶原蛋白合成抑制剂、治疗性抗体、一氧化氮供体、反义寡核苷酸、创伤愈合剂、治疗性基因转移构筑体、细胞外基质组分、血管扩张剂、溶解血栓剂、抗代谢物、生长因子激动剂、抗有丝分裂剂、他汀、类固醇、类固醇和非类固醇消炎剂、血管收缩素转化酶ACE抑制剂、自由基清除剂、PPAR-γ激动剂、小干扰RNAsiRNA、微RNA以及抗癌化学治疗剂。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂经放射性标记。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗剂与放射氟18F结合。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂是放射性核素。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述放射性核素选自由以下各项组成的群组：90Y、131I以及177Lu。
23.一种荧光的基于二氧化硅的纳米粒子，其包含：
基于二氧化硅的核心，其包含安置在所述基于二氧化硅的核心内的荧光化合物；
围绕所述核心的至少一部分的二氧化硅外壳；
附接到所述纳米粒子上的有机聚合物；以及
附接到所述纳米粒子上的配体，
其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约15nm之间，
并且在将所述纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子在约24小时内的肾清除率在约80％ID(初始剂量)到约100％ID范围内。
24.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中在将所述纳米粒子投予受试者之后，所述纳米粒子在约24小时内的肾清除率在约90％ID到约100％ID范围内。
25.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中附接到所述纳米粒子上的配体的数量在约1到约25范围内。
26.根据权利要求25所述的纳米粒子，其中附接到所述纳米粒子上的配体的数量在约1到约10范围内。
27.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子的直径在约1nm与约8nm之间。
28.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中所述有机聚合物选自由以下各项组成的群组：聚(乙二醇)PEG、聚乳酸酯、聚乳酸、糖、脂质、聚谷氨酸PGA、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)PLGA、聚乙酸乙烯酯PVA以及其组合。
29.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中所述配体能够结合到至少一种细胞组分上。
30.根据权利要求29所述的纳米粒子，其中所述细胞组分是肿瘤标记。
31.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中所述配体选自由以下各项组成的群组：肽、蛋白质、生物聚合物、合成聚合物、抗原、抗体、微生物、病毒、受体、半抗原、酶、激素、化合物、病原体、毒素、表面改性剂以及其组合。
32.根据权利要求31所述的纳米粒子，其中所述肽选自由以下各项组成的群组：三肽RGD、环肽cRGD、奥曲酯、EPPT1以及α-MSH的肽类似物。
33.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中将造影剂附接到所述纳米粒子上。
34.根据权利要求33所述的纳米粒子，其中所述造影剂是放射性核素。
35.根据权利要求34所述的纳米粒子，其中所述放射性核素选自由以下各项组成的群组：89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I以及177Lu。
36.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中将螯合物附接到所述纳米粒子上。
37.根据权利要求36所述的纳米粒子，其中所述螯合物经调适以结合放射性核素。
38.根据权利要求36所述的纳米粒子，其中所述螯合物选自由以下各项组成的群组：DFO、DOTA、TETA以及DTPA。
39.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子可由PET、SPECT、CT、MRI、光学成像、生物发光成像或其组合检测。
40.根据权利要求39所述的纳米粒子，其中所述光学成像是荧光成像。
41.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中将治疗剂附接到所述纳米粒子上。
42.根据权利要求41所述的纳米粒子，其中所述治疗剂选自由以下各项组成的群组：抗生素、抗微生物剂、抗增殖剂、抗肿瘤药、抗氧化剂、内皮细胞生长因子、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、抗血小板凝集剂、胶原蛋白合成抑制剂、治疗性抗体、一氧化氮供体、反义寡核苷酸、创伤愈合剂、治疗性基因转移构筑体、细胞外基质组分、血管扩张剂、溶解血栓剂、抗代谢物、生长因子激动剂、抗有丝分裂剂、他汀、类固醇、类固醇和非类固醇消炎剂、血管收缩素转化酶ACE抑制剂、自由基清除剂、PPAR-γ激动剂、小干扰RNAsiRNA、微RNA以及抗癌化学治疗剂。
43.根据权利要求41所述的纳米粒子，其中所述治疗剂经放射性标记。
44.根据权利要求41所述的纳米粒子，其中所述治疗剂与放射氟18F结合。
45.根据权利要求41所述的纳米粒子，其中所述治疗剂是放射性核素。
46.根据权利要求45所述的纳米粒子，其中所述放射性核素选自由以下各项组成的群组：90Y、131I以及177Lu。
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