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CN105264090B - 校准方法、设备和计算机程序产品 - Google Patents

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CN105264090B CN201480012147.0A CN201480012147A CN105264090B CN 105264090 B CN105264090 B CN 105264090B CN 201480012147 A CN201480012147 A CN 201480012147A CN 105264090 B CN105264090 B CN 105264090B
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Abstract

使用实时扩增和内部校准调节来量化靶核酸的方法和系统。该办法采用可以自外部仪器获得的一个固定数据点，与在要校准的仪器上扩增的一种调节校准物组合，用来接近完全校准曲线。

Description

校准方法、设备和计算机程序产品
对相关申请的交叉引用
此申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/792,409的权益，在此通过援引将该申请的内容完整收入本文。
发明领域
本公开文本涉及生物技术领域。更具体地说，本公开文本涉及使用来自实时扩增规程的结果量化多核苷酸的校准方法和系统。
发明背景
现在常规使用牵涉体外核酸扩增的动力学分析的方法来量化分析物核酸。在有时称作“实时”扩增规程的这些规程中，在扩增规程的过程上作为时间的函数监测核酸扩增反应混合物中存在的扩增子的量。完全自动化的实时核酸测定法需要能够分析在反应期间获取的时间依赖性数据的机器可执行算法。在这点上，需要精确输出核酸的量或浓度(它会产生观察扩增结果)的数据处理算法。
专利文献中已意识到与量化特定核酸靶的绝对量有关的困难。这些困难已归于扩增过程的指数性质及任何控制反应速率的变量(包括引物对的长度和核苷酸序列)的小差异能引起扩增子产量的剧烈差异的事实。Wang等人在美国专利No.5,219,727中描述了使用扩增分析物多核苷酸的相同引物扩增的内部标准品的使用，而且解决了与量化的特定靶核酸无关的第二套寡核苷酸引物是使用无关cDNA作为标准品所必需的事实。依照Wang等人，使用两套无关引物的分析只能提供两个独立扩增反应的相对比较，而非靶核酸浓度的绝对测量。其他人跟随这种技术，并采用通过具有相似序列且通过用共用引物对进行扩增而类似感兴趣靶的内部标准品(参见已公布的流水号10/230,489的美国专利申请)。还有其他人描述了依赖于测定扩增效率的定量方法(参见已公布的欧洲专利申请EP 1138784)。牵涉测定对照和靶序列的扩增比的方法也已有记载(参见美国专利No.6,066,458)。
用于对实时核酸扩增结果实施内部校准调节的最常用方法包括“运行内”校准调节和调节“存储”校准曲线。这些方法中的第一种(由McMillan等人在US 6,713,297中例示)在每次绘制校准曲线图时需要两种或更多种校准标准品与重复的分析物核酸平行进行常规扩增。不幸的是，这种要求在每次再校准仪器时消耗一般以试剂盒形式购买且可能是昂贵的有限试剂。第二方法(由Carrick在US 7,930,106中例示)有利地避免在每次再校准仪器时对运行多种校准物的需要，但是仍然需要(例如由试剂盒制造商或终端用户进行)在一些点绘制完全校准曲线图。这种技术的经验显示较好的能力，当所量化的靶以高或很高水平存在时使用一种校准标准品再生成定量结果。例如，回溯检验确认了使用一种具有107个靶拷贝的调节校准物调节存储的曲线有利地再生成在104至108个靶拷贝的范围中几乎相同的完全本地曲线。在这种情况中，经过调节的曲线在输入量102个靶拷贝处偏离本地曲线不超过0.6log个拷贝。相反，使用一种具有102个靶拷贝的调节校准物产生在输入靶水平103个靶拷贝处偏离0.4log个拷贝且在输入靶水平106个靶拷贝处偏离1.6log个拷贝的经过调节的曲线。因此，使用具有高靶量的校准标准品调节存储的曲线显然有好处。
甚至鉴于这些有用办法，仍然需要允许使用体外扩增技术高度精确量化核酸的自动化解决方案，其中可以以简化方式执行内部校准调节。此外，会想要能够使用一种包含低浓度的分析物多核苷酸标准品的校准标准品在要测量的靶量或浓度的完全动态范围间实现精确量化。本公开文本解决这些问题。
发明概述
本公开文本的第一个方面关于为使用扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的本地仪器实施的定量测定法建立经过调节的校准曲线的方法。该方法包括步骤(a)，为对定量测定法特异性的校准曲线上的一个固定点获得一对坐标，其中该对坐标规定分析物多核苷酸的量和标准化扩增指标值。还有步骤(b)，获得包含固定量的内部校准物和已知量的分析物多核苷酸的调节校准物。还有步骤(c)，使用本地仪器共扩增调节校准物的分析物多核苷酸和内部校准物。还有步骤(d)，为步骤(c)中共扩增的分析物多核苷酸和内部校准物每一项确定扩增指标。还有步骤(e)，将为分析物多核苷酸确定的扩增指标针对为内部校准物确定的扩增指标标准化。还有步骤(f)，通过绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线，其中第一点包含调节校准物的分析物多核苷酸的已知量和标准化步骤(d)中为分析物多核苷酸确定的扩增指标的坐标，且其中第二点包含步骤(a)中为固定点获得的对坐标。在一个优选实施方案中，由步骤(a)中获得的对坐标规定的分析物多核苷酸的量是使用除本地仪器以外的第一实时扩增和监测仪器确定的，且不是使用来自用本地仪器实施的任何扩增反应的结果确定的。更优选的是，该方法进一步包括用第一实时仪器共扩增多种校准标准品每一种中含有的分析物多核苷酸和内部校准物的步骤，其中多种校准标准品每一种包含不同起始浓度的调节校准物的分析物多核苷酸，且其中多种校准标准品每一种中和调节校准物中的内部校准物的浓度是基本上相同的。或者，步骤(a)的校准曲线和步骤(f)中建立的经过调节的校准曲线可以均为通过线性方程式描述的线性校准曲线。依照一个不同优选实施方案，步骤(a)和步骤(b)共同牵涉获得(例如购买)包括调节校准物和固定点的对坐标的有形体现的试剂盒。在这种情况中，有形体现可包括机器可读条形码。依照还有另一个优选实施方案，在步骤(a)之前有通过拟合方程式至使用除本地仪器以外的扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合绘制对定量测定法特异性的校准曲线的步骤，其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结果。依照还有另一个优选实施方案，步骤(f)牵涉通过用与本地仪器通讯的处理器绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线。例如，与本地仪器通讯的处理器可以是本地仪器的整合构件。依照还有另一个优选实施方案，步骤(a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核苷酸的量。依照其中由步骤(a)中获得的对坐标规定的分析物多核苷酸的量是使用除本地仪器以外的第一实时扩增和监测仪器确定的且不是使用来自用本地仪器实施的任何扩增反应的结果确定的某些实施方案，步骤(a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核苷酸的量。依照其中在步骤(a)之前有通过拟合方程式至使用除本地仪器以外的扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合绘制对定量测定法特异性的校准曲线的步骤且其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结果的不同优选实施方案，步骤(a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核苷酸的量。
本公开文本的另一个方面关于使用核酸扩增测定法量化测试样品中可能存在的分析物多核苷酸的计算机程序产品，该核酸扩增测定法牵涉用扩增核酸并作为时间的函数监测扩增子合成的本地仪器共扩增分析物多核苷酸和固定量的内部校准物。该计算机程序产品包括用于实施一系列步骤的软件指令的有形体现。这些步骤包括步骤(a)，为对要用于量化分析物多核苷酸的核酸扩增测定法特异性的校准曲线上的一个固定点接收一对坐标，其中该对坐标规定分析物多核苷酸的量和标准化扩增指标值。还有步骤(b)，为已知量的分析物多核苷酸的扩增指标获得针对调节校准物中含有的且在用本地仪器实施的第一扩增反应中共扩增的固定量的内部校准物的扩增指标标准化的值。还有步骤(c)，绘制包含第一点和第二点的经过调节的校准曲线，其中第一点包含调节校准物的分析物多核苷酸的已知量和步骤(b)中获得的值的坐标，且其中第二点包含步骤(a)中为固定点接收的对坐标。还有步骤(d)，为测试样品中的未知量的分析物多核苷酸的扩增指标获得针对在用本地仪器实施的第二扩增反应中与之共扩增的固定量的内部校准物的扩增指标标准化的值。还有步骤(e)，将步骤(d)中获得的值与经过调节的校准曲线比较从而为测试样品中存在的未知量的分析物多核苷酸产生定量结果。还有步骤(f)，输出来自步骤(e)的定量结果的有形记录。在一个优选实施方案中，步骤(a)中接收的对坐标规定当校准曲线投射至标准化扩增指标值零时分析物多核苷酸的量。在一个不同实施方案中，软件指令的有形体现包括在可以是下述各项的介质上存储的软件指令：光盘，磁存储介质，闪存驱动器，计算机硬盘驱动器，和由至少一台计算机可存取的网络驱动器。在一个不同实施方案中，步骤(b)和步骤(d)各自牵涉通过数学计算来获得。在一个不同实施方案中，步骤(b)和(d)牵涉通过接收相应值的数字输入来获得。在一个不同实施方案中，步骤(c)中绘制的经过调节的校准曲线通过线性方程式定义。在一个不同实施方案中，步骤(e)的有形记录印刷在纸上。在一个不同实施方案中，核酸扩增测定法为等温核酸扩增测定法。
本公开文本的另一个方面涉及用于测定测试样品中靶核酸序列的起始数量的设备。该设备包括(a)至少一台测量下述各项的检测机械：(i)指示在第一核酸扩增反应中扩增的靶核酸序列和第一内部校准物的相应数量的信号，其中第一内部校准物包含与靶核酸序列不同的第二核酸序列；(ii)指示在第二核酸扩增反应中扩增的已知量的分析物多核苷酸和第二内部校准物的相应数量的信号，其中分析物多核苷酸和第二内部校准物均是调节校准物的成分，其中第二内部校准物包含第二核酸序列，且其中第一和第二核酸扩增反应中第二核酸序列的起始数量基本上相等。所发明的设备进一步包括(b)至少一台与检测机械通讯的处理器，其中处理器编程有一个固定点的一对坐标，该对坐标规定分析物多核苷酸量和标准化扩增指标值，且其中处理器进一步编程为实施下述步骤：(i)自测量的信号为已知量的分析物多核苷酸、第一和第二内部校准物每一种、和靶核酸序列的扩增指标确定相应值；(ii)将为靶核酸序列确定的扩增指标值针对为第一内部校准物确定的扩增指标值标准化；(iii)将为已知量的分析物多核苷酸确定的扩增指标值针对为第二内部校准物确定的扩增指标值标准化；(iv)自固定点、分析物多核苷酸的已知量和已知量的分析物多核苷酸的标准化扩增指标建立校准曲线；并(v)使用校准曲线和靶核酸序列的标准化扩增指标确定测试样品中靶核酸序列的起始数量。在一个优选实施方案中，固定点的对坐标是使用来自多个核酸扩增反应的结果确定的，该多个核酸扩增反应是使用除实施第一和第二核酸扩增反应的设备以外的仅一台设备实施的。更优选的是，对坐标的一个成员规定标准化扩增指标值零。或者，该设备可进一步包括其中发生第一和第二核酸扩增反应的温度控制的温箱。在一种特定情况中，温度控制的温箱维持基本上恒定的温度，且第一和第二核酸扩增反应为等温核酸扩增反应。依照一个不同优选实施方案，步骤(iv)中的校准曲线通过线性方程式定义。依照还有一个不同优选实施方案，至少一台检测机械包含测量荧光信号的荧光计。
本公开文本的另一个方面涉及为使用扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的本地仪器实施的定量测定法建立经过调节的校准曲线的方法。所发明的方法包括步骤(a)，为对定量测定法特异性的校准曲线上的一个固定点获得一对坐标，其中该对坐标规定分析物多核苷酸的量和扩增指标值。还有步骤(b)，获得包含已知量的分析物多核苷酸的分析物多核苷酸标准品。还有步骤(c)，使用本地仪器在核酸扩增反应中扩增分析物多核苷酸标准品的分析物多核苷酸。还有步骤(d)，为步骤(c)中扩增的分析物多核苷酸确定扩增指标。还有步骤(e)，通过绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线，其中第一点包含分析物多核苷酸标准品的分析物多核苷酸的已知量和步骤(d)中确定的扩增指标的坐标，且其中第二点包含步骤(a)中为固定点获得的对坐标。在一个优选实施方案中，在步骤(a)之前有通过拟合方程式至使用除本地仪器以外的扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合绘制对定量测定法特异性的校准曲线的步骤，且其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结果。依照一个不同优选实施方案，步骤(e)包括使用与本地仪器通讯的处理器来绘制校准曲线图。
发明详述
导言
本文中公开一种内部校准办法，其采用在终端用户的仪器上测定的结果，组合以校准曲线图上的存储的点(例如“固定点”)。任选地，可以在终端用户的仪器上确定固定点，然后为该同一仪器上的以后使用而存储。或者，可以使用一台或多台仪器(例如在试剂盒制造商的场所)确定固定点，然后为终端用户的仪器上的使用而提供。所公开的办法有利地方便为使用少至一种核酸校准标准品的核酸量化生成完全校准曲线。而且，该办法比每次需要再校准规程时使用整套校准物生成完全校准曲线简化工作流且更加划算。再者，该办法在扩大的动态范围上提供杰出量化，而且适应使用陈化或部分降解的试剂。
特别有用的系统和方法会能够使用最小数目的在要校准的终端用户的仪器上扩增的校准标准品再生成完全校准曲线。通过本文中详述的办法，只使用一种校准标准品再创建完全校准曲线，确实实现了杰出的结果。这可以牵涉首先使用多种校准标准品建立校准参照曲线，每种校准标准品具有不同量的分析物多核苷酸标准品和相同恒定量的内部校准物(即“IC”)。接着，可以鉴定参照曲线上的一个外推点用作固定点。然后可以使用来自在终端用户的仪器上使用校准标准品(例如一种校准标准品)实施的扩增反应的结果确定靶/IC比值(即相应扩增指标的比)，由此建立“本地”(例如由终端用户生成)数据点。可以组合使用本地数据点和固定点以生成“经过调节的校准曲线”，诸如线性校准曲线。最后，有使用经过调节的校准曲线在终端用户的仪器上量化测试样品中存在的靶量的步骤。优选地，这牵涉将使用为靶和IC测量的扩增指标(通过测试样品扩增获得的)计算的比值与经过调节的校准曲线比较。
依照第一个实施方案，使用来自在扩增核酸并作为时间或循环数的函数监测扩增子生成的第一仪器上使用不同校准标准品实施的两个或更多个扩增反应的结果(例如扩增的靶和IC的标准化阈或其它扩增指标值)绘制主校准曲线。将阈CT值或指示校准标准品中靶核酸扩增的特定反应过程水平的其它扩增指标针对为相同反应确定的IC的相应值标准化，例如通过除法以产生比。然后将为两个或更多个校准反应每一个计算的比值作为输入反应的靶的起始量的函数绘图(例如使用电子表单)。在一些优选情况中，建立线性校准曲线图。
可使用少至一种具有已知起始拷贝水平的靶核酸和与用于建立校准曲线(其可用于建立固定点)的反应中采用的相同的恒定量的IC的校准标准品来实施校准或再校准规程。实时扩增反应中靶和IC的阈值的确定和标准化产生一个点，其可以与固定点组合使用来生成完全校准曲线图。
正如上文指出的，有不同方式可以将固定点与第二点组合使用以生成校准曲线图。在第一种情况中，为校准标准品确定的固定点和比值均是在同一仪器(例如“第一”仪器)上产生的。在第二种情况中，为校准标准品确定的固定点和比值是在不同仪器(例如第一和第二仪器)上产生的。在两种情况中，该技术有利地校正校准曲线图以考虑陈化的试剂，包括已经上和下特定仪器循环数次的试剂。而且，该技术不依赖于测定扩增效率。再者，不需要知道每个反应中包括的IC的拷贝水平或量。然而，每个反应中的IC拷贝水平或量应当是相同的。
定义
除非本文中有明确相反叙述，为本公开文本的目的，下述术语具有下述含义。
如本文中使用的，“多核苷酸”表示RNA、DNA任一，或含有RNA和DNA二者的嵌合分子。该术语还涵盖含有RNA或DNA的核苷酸类似物的分子。
“分析物多核苷酸”或“分析物核酸”表示要量化的感兴趣多核苷酸。一般而言，会在测试样品中找到分析物核酸。特定病毒的基因组会是分析物多核苷酸的例子。
如本文中使用的，“测试样品”指要调查特定多核苷酸序列的存在情况的任何样品。测试样品包括任何组织或自人、动物、环境、或实验室衍生或合成样品获得的含有多核苷酸的材料。血液和尿液是测试样品的优选例子。
“分析物多核苷酸标准品”表示包含已知数量的分析物多核苷酸或其片段的组合物。例如，HIV-1分析物多核苷酸标准品可以含有已知数目拷贝的HIV-1基因组、HIV-1转录物、或体外合成转录物(代表病毒基因组的一部分)。
“校准标准品”表示包括已知或预定量的分析物多核苷酸标准品、与已知恒定量的内部校准物多核苷酸组合的组合物。两种不同校准标准品可以含有不同量的分析物多核苷酸或其片段，但是会含有相同量的内部校准物核酸。分析物多核苷酸标准品的分析物多核苷酸和内部校准物核酸会是彼此可区分的，例如通过具有不同的核苷酸碱基序列。
“调节校准物”指用于在本地仪器上进行扩增反应的校准标准品，其中自那些扩增反应获得的结果提供数据来创建校准曲线图。例如，扩增调节校准物可提供一个数据点，它可以与固定点组合使用来创建完全校准曲线图。
“扩增子”指扩增反应的多核苷酸产物，其中靶核酸序列充当合成多核苷酸拷贝或扩增产物的模板。
“扩增”或“核酸扩增”或“体外核酸扩增”等等表示用于获得靶核酸序列或其互补物或片段的多个拷贝(容许RNA和DNA等同物)的任何已知规程。扩增“其片段”指如下的生成，即扩增的核酸含有少于完全的靶区核酸序列或其互补物。此类片段可以通过扩增靶核酸的一部分来生成，例如通过使用与靶核酸的内部位置杂交并自靶核酸的内部位置启动聚合的扩增寡核苷酸。
如本文中使用的，术语“共扩增”及其变型指在一个(即同一/相同)扩增反应中扩增不同靶核酸序列的过程。例如，当在一个管中发生的反应中扩增两种核酸时，及当两个扩增反应分享至少一种共同试剂(例如脱氧核糖核苷酸三磷酸、酶、引物、等)时，分析物多核苷酸和无关内部校准物核酸“共扩增”。
如本文中使用的，“热循环”指反应混合物中温度的重复变化(即温度的升高或降低)。经历热循环的样品可以从一种温度变换成另一种温度，稳定在该温度，转换至第二温度或返回起始温度。温度循环可以根据研究或完成特定感兴趣化学反应的需要重复多次。
“靶”或“靶核酸”表示含有要扩增、检测和量化的序列的核酸。要扩增的靶核酸序列优选会位于两种相反部署的寡核苷酸之间，而且会包括靶核酸中与每一种寡核苷酸互补的部分。
“靶核酸序列”或“靶序列”或“靶区”表示包含单链核酸分子的整个或部分核苷酸序列的特定脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，及与其互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。
“转录相关扩增”表示使用RNA聚合酶自一个核酸模板生成多个RNA转录物的任何类型的核酸扩增。常规地，这些扩增反应采用至少一种具有能通过DNA聚合酶的活性来延伸的3'末端的引物。转录相关扩增方法的一个例子(称作“转录介导的扩增”(TMA))一般采用RNA聚合酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、和与靶核酸互补的含有启动子的寡核苷酸。TMA的变型是本领域公知的，详细披露于Burg等人，美国专利No.5,437,990；Kacian等人，美国专利No.5,399,491和5,554,516；Kacian等人，PCT No.WO 93/22461；Gingeras等人，PCT No.WO 88/01302；Gingeras等人，PCT No.WO 88/10315；Malek等人，美国专利No.5,130,238；Urdea等人，美国专利No.4,868,105和No.5,124,246；McDonough等人，PCT No.WO 94/03472；及Ryder等人，PCT No.WO 95/03430。该定义特别涵盖采用仅一种能由DNA聚合酶延伸的引物的其它转录相关扩增方法(如披露于流水号11/213,519的美国专利申请)，而且对于与本文中公开的方法联合使用是高度优选的。
如本文中使用的，“寡核苷酸”或“寡聚物”指至少两个、通常约5个至约100个化学亚单位(每个亚单位包含核苷酸碱基模块、糖模块、和以线性空间构造连接各亚单位的连接模块)的聚合链。常见的核苷酸碱基模块是鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，尽管能够成氢键的其它罕见或经修饰核苷酸碱基是本领域技术人员公知的。寡核苷酸可任选包括任何糖模块、碱基模块、和主链组分的类似物。本发明的优选寡核苷酸落在约10至约100个残基的大小范围中。寡核苷酸可以自天然发生来源纯化，但是优选使用各种公知的酶促或化学方法任一合成。
“扩增寡核苷酸”或“扩增寡聚物”表示与靶核酸或其互补物杂交且参与核酸扩增反应的寡聚物。扩增寡聚物的例子包括含有作为扩增过程的一部分延伸的3'末端的引物，但是还包括不由聚合酶延伸(例如3'封闭的寡聚物)但可参与或推动自引物高效扩增的寡聚物。扩增寡聚物的优选大小范围包括长约10至约80个核苷酸或长约10至约60个核苷酸且含有与靶核酸序列(或其互补链)的一个区互补的至少约10个连续碱基且更优选至少12个连续碱基的那些。连续碱基与扩增寡聚物结合的靶序列优选至少约80％、更优选至少约90％、且最优选约100％互补。扩增寡聚物可任选包括经修饰核苷酸或类似物，或参与扩增反应但与靶核酸不互补或靶核酸中不包含的别的核苷酸。3'封闭但能够与靶核酸杂交并提供上游启动子序列用来启动转录的扩增寡聚物称作“启动子提供者”寡聚物。
“引物”指与模板核酸杂交且具有能由DNA聚合酶延伸的3'OH末端的扩增寡聚物。引物的5'区可以与靶核酸(例如启动子序列)不互补，产生称作“启动子引物”的寡聚物。本领域技术人员会领会，可以修饰能作为引物发挥功能的任何寡聚物以包括5'启动子序列，并因此能作为启动子引物发挥功能。类似地，可以通过去除启动子序列或在没有启动子序列的情况下合成来修饰任何启动子引物，仍然作为引物发挥功能。
如本文中使用的，一“套/组”扩增寡核苷酸指合作参与体外核酸扩增反应以合成扩增子的两种或更多种扩增寡核苷酸的集合。
如本文中使用的，“探针”指在促进杂交的条件下与核酸(优选扩增的核酸)中的靶序列特异性杂交以形成可检测杂合物的寡核苷酸。
如本文中使用的，“时间依赖性”监测核酸扩增或“实时”监测核酸扩增指作为反应时间或循环数的函数测量核酸扩增反应中存在的扩增子的量，然后用于确定扩增反应启动时反应混合物中存在的模板的起始量的过程。例如，可以在开始包含热循环的扩增反应(诸如PCR)的每个完全循环之前测量扩增子的量。或者，可以连续地或以规则时间间隔监测不需要物理干预来启动扩增循环间转变的等温扩增反应以作为时间的函数获得关于存在的扩增子的量的信息。
如本文中使用的，“生长曲线”指作为时间或循环数的函数，反应中合成产物(诸如扩增子)出现的特征性样式。生长曲线方便地作为时间(x轴)对产物量的一些指标(诸如荧光测量)(y轴)的二维曲线图呈现。一些但非所有生长曲线具有S形。
如本文中使用的，生长曲线的“基线阶段”指曲线的初始阶段，其中产物(诸如扩增子)的量以基本上恒定的速率增多，此速率小于生长曲线的生长阶段(它可以具有对数-线性概况)特征性的增多速率。生长曲线的基线阶段通常具有很缓的斜率，常常接近零。
如本文中使用的，生长曲线的“生长阶段”指曲线中可测量产物随时间实质性增多的部分。典型的核酸扩增反应中基线阶段到生长阶段的转变以扩增子出现速率随时间升高为特征。生长曲线中生长阶段到高台阶段的转变始于扩增子出现速率开始降低时的转折点。
如本文中使用的，三阶段生长曲线的“高台阶段”指曲线的最终阶段。在高台阶段，可测量产物形成的速率一般实质性低于对数-线性阶段中的扩增子生成的速率，而且甚至可以接近零。
如本文中使用的，短语“扩增指标”指实时运行曲线的特征，它们指示核酸扩增反应中预定水平的进展。此类指标通常通过运行曲线(有时称作“生长曲线”)的数学分析来确定，运行曲线显示可测量信号(诸如荧光读数)，其强度作为时间、循环数、等的函数与反应混合物中存在的扩增子的数量有关。
如本文中使用的，短语“基于阈的扩增指标”指测量生长曲线信号交叉任意值或阈时的时间或循环数的扩增指标。T时间测定是基于阈的扩增指标的例子，而TArc和OTArc测定是非基于阈的扩增指标的例子。
如本文中使用的，短语“时间依赖性”扩增指标一般指以时间单位(例如分)测量的扩增指标(例如反应进展参数)。时间依赖性扩增指标通常用于监测等温核酸扩增反应中不以独特“循环”为特征的进展。T时间、TArc和OTArc均是时间依赖性扩增指标的例子。
如本文中使用的，“内部校准物”(本文中有时称作“IC”)指能在体外核酸扩增反应中扩增且与在同一反应中共扩增的分析物多核苷酸可区分的多核苷酸。“内部”表示校准物多核苷酸与分析物多核苷酸或其片段在同一反应混合物内扩增、检测和量化。一般而言，内部校准物的量或浓度在用于绘制校准曲线和用于量化分析物多核苷酸的不同反应中会是恒定的。优选地，内部校准物的恒定量或浓度会是内部校准物的已知量或内部校准物的已知浓度。在某些优选实施方案中，在使用一种或多种不同扩增寡聚物或引物的体外核酸扩增反应中共扩增内部校准物和分析物多核苷酸。例如，使用不共享的扩增寡核苷酸扩增下文详述的实施例中采用的分析物和内部校准物多核苷酸。在其它优选实施方案，在使用一种或多种相同扩增寡聚物或引物的体外核酸扩增反应中共扩增内部校准物和分析物多核苷酸。
如本文中使用的，短语“作为……的函数”描述应变量(即依赖于一种或多种其它变量的变量)和自变量(即可以不考虑任何其它变量的值而自由选择其值的变量)之间的相关性，其中自变量的每个输入值涉及应变量的正好一个输出值。涉及作为x值(即自变量)的函数的y值(即应变量)的方程式的常规表示法是y＝f(x)。
如本文中使用的，“优化”或“拟合”方程式指如数学建模或曲线拟合规程中常常实施的，用于为方程式中的系数获得数值以产生“拟合/符合”或接近实验测量的表达式的过程。通常，优化的方程式会定义最佳拟合曲线。
如本文中使用的，术语“优化的方程式”和“拟合的方程式”择一指作为优化规程的结果含有系数的固定数值的方程式。“拟合的”曲线源自优化方程式。
“本地”表示涉及终端用户。例如，本地仪器指终端用户的仪器。本地校准曲线图指使用由终端用户(例如通过在本地仪器上进行扩增反应)获得的结果的校准曲线图。
“再校准”表示使用同一仪器实施或获得的较早校准规程或结果之后的校准规程或结果。例如，第一次使用扩增核酸并作为循环数或时间的函数监测扩增子合成的仪器(例如实时PCR仪器)实施校准规程时，可扩增两种不同校准标准品且可生成校准曲线图。校准曲线图可以在数学上涉及作为输入扩增反应的起始靶量的函数的比值。再校准规程会采用该同一仪器来生成后续或更新的校准曲线图。
“校准曲线图”表示将对扩增反应可测量的数量(例如扩增的靶和内部校准物的测量阈值的比)与输入扩增反应的底物的已知量(例如靶核酸的起始量)联系起来的图形或数学呈现。校准曲线图优选使用计算机表单软件来建立，而且包括校准结果或信息的电子呈现。“校准曲线图”和“校准曲线”可互换使用。要理解，校准曲线图或曲线可以指线性和非线性校准曲线。
如本文中使用的，“固定点”指可用于在校准或再校准规程中建立校准曲线图的数据点(例如具有x和y坐标)，其中该数据点不会随时间变化。可以在一台设备(例如本地仪器)上确定和使用固定点。或者，可使用测定法试剂盒制造商的地点处的设备确定固定点，然后由消费者或终端用户在不同设备上使用。
“试剂盒”表示包装的材料组合，通常意图彼此联合使用。依照本公开文本的试剂盒可包括“有形”形式(例如印刷的信息、电子记录在计算机可读介质上、或以其它方式记录在机器可读介质(诸如条形码)上，用于存储数值)的指令或其它信息。
“基本上由……组成”表示本发明中可以包括不会本质改变本发明的基本和新颖特征的额外构件/成分、组合物、或方法步骤。对本发明的基本和新颖特征有本质影响的任何构件/成分、组合物、或方法步骤会落在此术语以外。
优选的核酸扩增方法
在与本发明联合中有用的扩增方法的例子包括但不限于：转录介导的扩增(TMA)，单引物核酸扩增，基于核酸序列的扩增(NASBA)，聚合酶链式反应(PCR)，链置换扩增(SDA)，自持序列复制(3SR)，DNA连接酶链式反应(LCR)和使用自我复制多核苷酸分子和复制酶诸如MDV-1RNA和Q-β酶的扩增方法。用于进行这些各式各样扩增技术的方法相应地可见于美国专利No.5,399,491；流水号11/213,519的美国专利申请；已公布的欧洲专利申请EP0525882；美国专利No.4,965,188；美国专利No.5,455,166；Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878(1990)；国际公开No.WO89/09835；美国专利No.5,472,840；及Lizardi等人，Trends Biotechnol.9：53-58(1991)。在此通过援引收录这些文件描述如何实施核酸扩增反应的公开内容。
还可以使用所公开的算法和方法来处理使用只需要一种可延伸引物的扩增反应获得的结果。这些反应包括采用一种可延伸引物与不能由核酸聚合酶延伸的3'封闭的寡核苷酸组合的转录相关扩增系统。用于进行此类扩增反应的方法详述于例如流水号11/213,519的美国专利申请。
有用的扩增指标的例子
多种扩增指标可以与所公开的方法联合使用。例如，可使用本领域普通技术人员熟悉的数学和计算技术来鉴定实时运行曲线的第一导数出现最大值的时间或第二导数出现最大值的时间。Wittwer等人已经在美国专利No.6,503,720中详述了用于确定生长曲线的这些特征的办法(通过援引将其公开内容收入本文)。其它有用的办法牵涉计算生长曲线的导数，鉴定生长曲线的特征，然后确定与导数的特征对应的阈时间或循环数。美国专利No.6,783,934中已经披露了此类技术(通过援引收录其公开内容)。还有其它有用的扩增指标包括“T时间”和“TArc”。值得注意的是，用于确定TArc值的不同办法采用方向相似的矢量(即产生仅仅标识为“TArc”的值)和方向相反的矢量(即产生标识为“OTArc”的值)。还有其它技术牵涉作为反应期间信号(优选荧光信号)等于静态阈(例如预定的静态阈值)时的时间或循环数鉴定循环阈(例如“Ct”)值。稍后下文给出这些方法的一般描述。
确定T时间值的方法
简言之，T时间值评估实时扩增反应中指示扩增子生成的特定阈通过时的时间。流水号60/659,874的美国专利申请中已经记载了用于计算和使用T时间值的算法(通过援引收录其公开内容)。依照这种算法，将曲线拟合规程应用于标准化的且经过背景调节的数据。虽然可采用任何公知的曲线拟合方法学，但是在一个优选实施方案中采用线性最小二乘(“LLS”)曲线拟合。只对预定低限和高限之间的一部分数据实施曲线拟合。找到拟合数据的曲线之后，终极目标是评估与曲线或其投射与预定静态阈值交叉时的点对应的时间。在一个实施方案中，标准化数据的阈是0.11。凭经验确定高和低限，该范围上拟合至多个对照数据集的曲线在与给定阈值有关的时间中展现最小变异性。在一个实施方案中，低限是0.04且高限是0.36。为数据拟合曲线，自低限以下的第一个数据点延伸穿过越过高限的第一个数据点。接着，确定拟合的斜率是否是统计学显著的。例如，如果一阶系数的p值小于0.05，那么认为拟合是显著的，并继续处理。否则，停止处理。或者，可以通过R2值来确定数据的有效性。为拟合的曲线确定线性曲线y＝mx+b的斜率m和截距b。凭借该信息，能确定T时间。
确定TArc值的方法
使用对实时运行曲线进行的基于矢量的分析确定称作“TArc”和“OTArc”的时间依赖性扩增指标。TArc值鉴定在时间上生长曲线开始弯曲或“曲折”向上的点。可使用这个确定的点来创建标准曲线或建立与测试样品中分析物多核苷酸的量或浓度有关的扩增反应参数。最方便的是使用具有在基本上均匀的时间间隔上分布的数据点的生长曲线进行矢量分析。关于TArc和OTArc值的确定和使用的详细介绍出现于美国专利No.7,739,054(通过援引将其收入本文)。
优选的系统和设备
方便地使用计算机或类似处理装置(此后“计算机”)执行本文中公开的方法。在不同优选实施方案中，可以在如下的计算机的记忆构件中加载或以其它方式保持用于实施算法的软件或机器可执行指令，该计算机是独立式的或是连接用于监测(优选作为时间的函数)经历分析的产物的量的装置。在一个高度优选的实施方案中，在如下的计算机的记忆构件中保持用于执行校准算法的软件，该计算机连接能够作为时间的函数监测反应混合物中存在的扩增子的量的装置或是该装置的整合部分。
用于控制实时扩增装置的控制器系统和/或实时扩增装置的检测系统任一或二者确实可偶联适当编程的计算机，该计算机发挥依照预编程或用户输入的指令指导这些仪器操作的功能。计算机优选还能自这些仪器接收数据和信息，并解读、处理和报告此信息给用户。
一般而言，计算机通常包括用于接收用户指令的适宜软件，或是用户输入一套参数字段的形式，或是预编程指令(例如为多种不同特定操作预编程)的形式。然后软件将这些指令转变成适宜语言用于指导实时扩增控制器操作以进行期望操作。计算机还能够自一台或多台系统内包括的传感器/检测仪接收数据，并依照编程解读数据。系统优选包括将作为时间的函数呈现感兴趣核酸的扩增拷贝的数量(如由检测仪检测的)的生长曲线的特征与测试样品中存在的感兴趣核酸的拷贝数关联起来的软件。
优选地，当用于执行所公开的校准算法的计算机是用于实施和分析实时核酸扩增反应的设备的整合构件时，设备优选包含温度控制的温箱、用于收集信号的检测装置、用于分析信号的分析装置(例如计算机或处理器)和用于显示由分析装置获得或生成的数据的输出装置。分析装置可经由本领域知道的输入装置连接温度控制的温箱，和/或连接本领域知道的用于数据显示的输出装置。在一个实施方案中，温度控制的温箱能够进行温度循环。
一般而言，在与所公开的方法联合中有用的用于实施实时核酸扩增的设备的各种构件会是本领域普通技术人员熟悉的常规构件。用于实施和分析实时核酸扩增的温度控制的温箱可以是常规设计的，能保持多个反应管，或能在标准扩增反应管中的温度控制块中或在多孔板的孔中保持多个反应样品。在一个方面，检测系统适合于检测来自一种或多种荧光标记物的光学信号。可以将检测系统的输出(例如与扩增反应期间生成的那些对应的信号)供应给计算机进行数据存储和处理。在一个实施方案中，系统检测多种不同类型的光学信号(诸如多种不同类型的荧光标记物)且具有微量板荧光读数仪的能力。检测系统优选是含有激发光源(它可以是可见光激光或紫外灯或卤素灯)的多路荧光计、用于将激发光分配给各个反应管及自反应管接收荧光的多路装置、用于通过它们的波长将荧光与激发光分开的滤光手段、和用于测量荧光强度的检测手段。优选地，温度控制的温箱的检测系统提供宽检测范围，容许荧光团选择的灵活性、高灵敏度和卓越的信噪比。通常将由检测系统接收的光学信号转变成处理器能处理的信号，以提供用户能在与处理器通讯的用户装置的显示器上查看的数据。用户装置可包含用户界面，或者可以是带有键盘和视频监测器的常规商品化计算机系统。用户装置能显示的数据的例子包括扩增曲线图、散布图、针对组装中的所有管或反应容器及针对使用的所有标记物的样品值屏、光学信号强度屏(例如荧光信号强度屏)、最终调用结果、文本报告、等等。
计算机程序产品
本发明的范围内包括可用于实施数据处理方法的基于软件的产品(例如用于指导计算机执行各个规程步骤的软件的有形体现)。这些包括存储在计算机可读介质(诸如磁介质、光学介质、“闪光”记忆装置、和计算机网络)上的软件指令。同样，本发明涵盖扩增核酸、检测核酸扩增产物、和处理结果以指示测试样品中靶的定量结果的系统或设备。虽然设备的各种构件优选以合作方式发挥功能，但是不要求构件是整合组装的一部分(例如在一个底盘上)。然而，在一个优选实施方案中，设备的构件彼此连接。“连接”的含义内包括经有线和无线连接的连接。
特别地，包括与扩增核酸并作为循环数或时间的函数监测扩增子合成的装置连接的计算机的设备或系统落在本发明的范围内，其中计算机编程为执行本文中公开的定量算法。依照本公开文本的一种例示性系统会包括温度控制的温箱和能够监测和区分至少两种荧光发射波长的荧光计。可使用这些发射来指示靶扩增子合成和IC扩增子合成。
单点校准和再校准规程方便随机存取型式
使用实时扩增量化测试样品中的靶核酸的现代“随机存取”装置会有利地允许终端用户上和下仪器循环试剂多次。因此，一个试剂盒的试剂可以在完全使用试剂盒之前加载/卸载数次。结果是，可能必须再运行校准曲线图(例如每次将试剂盒加载到仪器上时)。如果每次校准或再校准规程采用两种或更多种校准物的话，会消耗大量的试剂盒资源来提供随机存取特征。然而，这个过程可以使用本文中公开的固定点办法来简化。
在一个优选实施方案中，由测定法制造商建立固定点，然后与试剂盒的购买联合提供给消费者或终端用户。例如，可以在测定法制造商的场所处的仪器上扩增校准标准品集合，由此为分析物多核苷酸标准品和IC每一种测定扩增指标。将这些值彼此相除(例如CT靶/CTIC)建立比值，它们可以使用电子表单软件绘图。拟合曲线或线至收集的点产生第一校准曲线图。延伸校准曲线图至比值等于零处的点鉴定可用作固定点的点。更特别地，可使用输入靶量或浓度会对应于比值零处的外推点作为固定点来绘制相同仪器或甚至不同仪器上的校准曲线图。换言之，所有使用一种调节校准物绘制的校准曲线图会共享该同一固定点。
在一个不同优选实施方案，要用于内部校准调节的固定点可以由终端用户仅使用本地仪器来制备。例如，这可以牵涉确定预期产生比值零的分析物多核苷酸标准品的输入量或浓度。当然，这会需要额外的努力，至少最初在终端用户的部分上。或许平衡这一点是创建对特定仪器特异性的参照曲线的可能好处。
在某些实施方案中，可以由终端用户在第一次使用试剂盒时在本地仪器上建立常规校准曲线图。这可以牵涉实施两个校准反应。可以测定两种校准物中靶和IC扩增的时间依赖性或循环数依赖性，并标准化，例如通过将靶的指标除以同一反应中扩增的IC的指标。可使用两个点建立校准曲线图，它可立即用于量化测试样品中的靶核酸。分开地，可以投射所得校准曲线图以鉴定与比值零有关的输入靶数量或浓度所对应的点。可以使用这个投射点作为固定点来绘制再校准曲线图。虽然没有用于创建初始校准曲线图，但是可存储鉴定的固定点，供与再校准规程联合使用。
可使用少至一种调节校准物来进行系统再校准。鉴于固定点的可得性，可以将靶和共扩增的IC的扩增指标标准化以给出比值，并将标准化结果与固定点组合使用以产生完全校准曲线。
一般而言，实施使用最少资源的校准和再校准规程来进行定期仪器校准显然是有利的。节约实验室资源确实是采用单点系统校准或再校准规程的一个原因。
选择参照校准曲线和固定点的优选方法
可以以多种方式确定靶和IC的扩增指标(作为输入靶量或浓度的函数)的比的校准曲线图上的固定点，如所公开的校准办法中采用的。在某些优选办法中，组合来自使用不同实时扩增和检测仪器扩增和检测多种校准标准品的合并结果，并将一条最佳拟合校准曲线拟合至合并数据(即来自不同校准标准品每一种的合并扩增指标数据点)。这有效地均衡在不同仪器(例如属于测定法制造商和终端用户)上进行测定法产生的校准曲线图中的变异。在一种备选办法中(在本文中的实施例中演示)，使用来自仅一台实时仪器的结果建立一条校准曲线。一般而言，一旦通过一些手段建立校准曲线，接着是选择要用于与来自在相同或不同仪器上运行的一种调节校准物的结果组合的固定点的过程。这可以牵涉测试来自校准曲线的候选点(例如与不同校准标准品、内插数据点、或外推数据点对应的)，与来自调节校准物的结果组合，以产生“经过调节的”校准曲线，它对于在各种条件下量化分析物多核苷酸是有用的。这些不同条件可包括在不同仪器上或使用陈化或“应力”试剂条件等运行测定法。
在其它优选办法中，作为通过校准曲线图外推会产生比值(例如CT靶/CTIC或T时间靶/T时间IC，等)零的输入靶量或浓度来鉴定固定点。在一种优选方法中，使用在一台或多台不同仪器上生成的校准数据绘制曲线图。例如，可使用测定法制造商的地点处的一台或多台仪器来确定固定点，然后提供给试剂盒的终端用户，供终端用户的仪器上使用(即与用于进行测定的(一台或多台)仪器不同的仪器)。或者，可以在与用于量化经历测试的样品中靶核酸的仪器相同的仪器(例如本地仪器)上确定固定点。在这种情况中，终端用户可以在一台仪器上进行扩增反应，使用所得数据来生成多幅校准曲线图，然后使用校准曲线图确定固定点。如果超过两幅校准曲线图可得的话，可能想要通过对与比值零有关的输入靶值取平均值来确定固定点。在某些优选实施方案，使用多种不同校准标准品绘制用于建立固定点的校准曲线图自身。在某些高度优选实施方案中，使用两种不同校准标准品绘制用于建立固定点的校准曲线图。
实施例
所有下述实施例中的核酸靶捕捉和扩增规程是在Gen-Probe Incorporated(SanDiego，CA)使用能够在温度控制的条件下扩增核酸并作为循环数或时间的函数监测扩增子生成(例如通过光学监测荧光)的自动化仪器实施的。已公布的美国专利申请2011/0147610(通过援引将其完整公开内容收入本文)详述了用于实施实时扩增规程的一种优选仪器的特征。另一种优选仪器记载于US 6,713,297，通过援引将其公开内容收入本文。分析物靶和IC的合成转录物充当反应中的模板。通过组合恒定150,000个拷贝的合成IC转录物和含有一定量的分析物靶转录物的0.5ml等分试样来制备要处理和扩增的样品，充当扩增的模板。规程中使用的靶核酸的浓度在多组六个反应间的范围为102至107个拷贝/ml。在靶捕捉和清洗步骤(用于去除或减少样品中的杂质)后使用模板核酸进行扩增反应。在同一反应中使用独立的引物套组(即无共用引物)共扩增靶和IC模板。使用可区分标记的各自包含不同荧光报告物的扩增子特异性分子火炬杂交探针检测和监测扩增产物。重复实施所有扩增反应。使用基本上如已公布的美国专利申请No.2006/0276972(通过援引将其公开内容收入本文)中记载的T时间算法确定代表共扩增的靶和IC每一种的扩增指标的阈时间值。通过将为靶确定的T时间值(即T时间靶)除以为在同一反应中扩增的IC确定的T时间值(即T时间IC)计算比值。
要清楚，校准标准品中的、调节校准物中的、和测试样品扩增反应中的内部校准物多核苷酸是相同的。同样，所有反应中的内部校准物多核苷酸的量(例如起始浓度)是相同的。
实施例1描述如何在单点校准规程中用使用扩增核酸并以实时型式监测扩增子生成的第一仪器生成的线性参照校准曲线图为后续使用建立固定点。第一仪器在下文中称作仪器“V35”。
实施例1
为内部校准调节建立固定点
使用标识为V35的第一实时仪器5次重复扩增6种核酸校准标准品。使用标准靶捕捉试剂(“TCR”)进行仪器V35上的所有反应，从而在扩增之前富集靶核酸。用于校准反应的样品具有每个0.5ml的体积和范围为102至107个拷贝/ml的核酸靶浓度。与固定的150,000个拷贝的IC一起重复共扩增自不同样品捕捉的核酸。将为靶和IC测量的T时间扩增指标标准化以产生阈比值(即T时间靶/T时间IC)。作为输入靶数量(例如浓度)的函数建立比值的线性校准曲线图并用于对每种不同校准标准品指派实际靶起始数量，在本文中称作“值指派的”数量。表1呈现校准标准品的汇总结果和值指派浓度，其中值指派是使用所有6种校准物建立的。表1中的数字结果是使用超过适宜两个小数位呈现的。
表1
在仪器V35上扩增的校准标准品的汇总结果
Figure BDA0000795021890000191
Figure BDA0000795021890000201
使用来自仪器V35的数据建立的拟合线性校准曲线图(例如代表第一校准参照曲线)通过方程式1定义，其中X和Y相应地是靶数量(例如浓度)和比值。
Y＝-0.1267X+1.3179 [方程式1]
使用方程式1计算的X截距(即比值等于零时的点)是10.3989。因此，通过此规程建立的固定点是(10.3989，0)。
实施例2例示如何能使用在第一实时仪器(即V35)上建立的固定点来处理在第二实时仪器(即在下文中称作“V53”)上获得的结果。个别地将使用仪器V53对扩增不同校准标准品获得的结果与使用仪器V35已建立的固定点配对以创建线性校准曲线图。随后将这些校准曲线图用于回溯检验来自在仪器V53上进行的其余反应的结果。换言之，作为调节校准物处理一种校准标准品，而作为模拟测试样品处理其它校准标准品，并用使用来自调节校准物和固定点的结果确定的经过调节的校准曲线确定模拟测试样品中存在的靶核酸的数量。
实施例2
绘制掺入固定点的经过调节的校准曲线
使用实时仪器V53实施和监测与实施例1中描述的核酸扩增反应相似的核酸扩增反应。表2呈现校准标准品的汇总结果和值指派浓度，其中值指派是使用所有6种校准物进行的。值指派数量一般看作是真实定量值。表2中的数字结果是使用超过适宜两个小数位呈现的。
表2
在仪器V53上扩增的校准标准品的汇总结果
Figure BDA0000795021890000202
Figure BDA0000795021890000211
表3例示如何能使用用第一仪器(V35)建立的固定点与在第二仪器(V53)上产生的一个结果组合来生成经过调节的校准曲线。将来自表2中各种校准标准品1-6的比和值指派结果与固定点(10.3989，0)配对以生成六条不同的经过调节的线性校准曲线。例如，第一线性校准曲线图基于两个点(2.0252，1.0424)和(10.3989，0)。以这种方式，作为模拟调节校准标准品独立处理每种校准标准品。然后表2中未用于建立经过调节的线性校准曲线的其余条目充当模拟测试样品，并计算靶量。表3中还呈现值指派的靶数量和使用经过调节的校准曲线计算的值之间的差异。所有列表值为log拷贝/ml。
表3
使用一个固定点和来自一种调节校准物的结果进行的单点校准
Figure BDA0000795021890000212
所有数值为log拷贝/ml
N/A＝不适用
实施例3例示通过上文所述方法建立的固定点如何也能用于使用因加速降解而受损的试剂量化核酸靶的规程。
实施例3
使用经受加速降解条件的试剂量化靶核酸
使用标识为V47的第三实时仪器扩增6种核酸校准标准品。使用已经受于55℃加热28天以促进加速降解的TCR进行所有反应。所有其它扩增反应和监测条件与上文描述的那些相似。
表4呈现校准标准品的汇总结果和值指派浓度，其中使用所有6种校准物进行值指派。表4中的数字结果是使用超过适宜两个小数位呈现的。
表4
在仪器V47上使用经受加速降解的试剂扩增的校准标准品的汇总结果
Figure BDA0000795021890000221
正如上文，将来自表4中各种校准标准品1-6的结果与使用仪器V35建立的固定点(10.3989，0)配对以产生6条不同的经过调节的线性校准曲线。以这种方式，作为模拟调节校准标准品独立处理每种校准标准品。然后表4中未用于建立经过调节的线性校准曲线的其余条目充当模拟测试样品，并计算靶量。表5中还呈现值指派的靶数量和使用经过调节的校准曲线计算的值之间的差异。所有列表值为log拷贝/ml。
表5
使用一个固定点和使用陈化试剂获得的结果进行的单点校准
Figure BDA0000795021890000222
Figure BDA0000795021890000231
所有数值为log拷贝/ml
N/A＝不适用
实施例4通过使用一个不同的固定点处理来自表2和4的数据例示所公开的单点校准办法的优点。更特别地，不是使用实施例1中建立的固定点，而是建立了使用仪器V35生成的校准曲线上的一个不同点。如下文指出的，此不同固定点在处理使用标准品试剂获得的数据时产生很好的结果，但是在处理使用已经历加速降解条件的试剂获得的数据时实施较差。
实施例4
使用不同固定点导致差异定量能力
解答方程式1为使用仪器V35生成的线性校准曲线上的一个点确定坐标，其中该点对应于输入靶水平7log拷贝/ml的分析物多核苷酸标准品。此点具有坐标(7，0.431)。
将来自表2中各种校准标准品1-6的结果与固定点(7，0.431)配对以生成6条不同的经过调节的线性校准曲线。以这种方式，作为模拟调节校准标准品独立处理每种校准标准品。然后表2中未用于建立经过调节的线性校准曲线的剩余条目充当模拟测试样品，并计算靶量。表6中还呈现值指派的靶数量(即代表黄金标准品值)和使用经过调节的校准曲线确定的值之间的差异。所有列表值为log拷贝/ml。
表6
使用一个固定点和使用标准试剂获得的结果进行的单点校准
Figure BDA0000795021890000232
Figure BDA0000795021890000241
所有数值为log拷贝/ml
N/A＝不适用
将来自表4中各种校准标准品1-6的结果与固定点(7，0.431)配对以产生6条不同的经过调节的线性校准曲线。以这种方式，作为模拟调节校准标准品独立处理每种校准标准品。然后表4中未用于建立经过调节的线性校准曲线的其余条目充当模拟测试样品，并计算靶量。表7中还呈现值指派的靶数量和使用经过调节的校准曲线计算的值之间的差异。所有列表值为log拷贝/ml。
表7
使用一个固定点和使用经历加速降解的试剂获得的结果进行的单点校准
Figure BDA0000795021890000242
所有数值为log拷贝/ml
N/A＝不适用
上文例示如何能作为候选固定点评估来自一条校准曲线(例如“第一”校准曲线)的不同点，用于与来自一种调节校准物的结果组合以再生成完全校准曲线(即经过调节的校准曲线)。清楚的是，所得经过调节的校准曲线关于量化测试样品中的分析物多核苷酸的值之间有差异。虽然使用x截距和来自第一校准曲线的一个点例示该技术，但是要理解的是可选择任何数目的来自第一校准曲线的点进行分析。例如，可测试的别的来自第一校准曲线的点包括但不限于y截距、x截距、对应于各种校准标准品中使用的分析物多核苷酸的输入量的值、或甚至在校准标准品数据点之间内插或外推超出测定法动态范围的点。
选择哪个点应当作为固定点用于处理使用生成生长曲线的本地仪器获得的定量结果的过程可考虑不同考虑事项。这些考虑事项包括但不限于：试剂稳定性，在不同温度之间循环试剂，使用不同温度条件来实施核酸扩增，等。可能想要评估校准标准品的回收浓度的精确性，及基于由此交付的最高精确性来选择固定点。
已参照其多个具体实施例和实施方案描述了本发明。当然，本领域普通技术人员在阅读上述详细描述后会想到本发明的多个不同实施方案。因此，本发明的真实范围要参照所附权利要求书来确定。

Claims (31)

1.一种为使用扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的本地仪器实施的定量测定法建立经过调节的校准曲线的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)为对定量测定法特异性的校准曲线上的一个固定点获得一对坐标，其中该对坐标规定分析物多核苷酸的量和标准化扩增指标值；
(b)获得包含固定量的内部校准物和已知量的分析物多核苷酸的调节校准物；
(c)使用本地仪器共扩增调节校准物的分析物多核苷酸和内部校准物；
(d)为步骤(c)中共扩增的分析物多核苷酸和内部校准物每一项确定扩增指标；
(e)将为分析物多核苷酸确定的扩增指标针对为内部校准物确定的扩增指标标准化；并
(f)通过绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线，
其中第一点包含调节校准物的分析物多核苷酸的已知量和步骤(d)中为分析物多核苷酸确定的且步骤(e)中标准化的扩增指标的坐标，且
其中第二点包含步骤(a)中为固定点获得的对坐标。
2.权利要求1的方法，其中由步骤(a)中获得的对坐标规定的分析物多核苷酸的量是使用除本地仪器以外的第一实时扩增和监测仪器确定的，且不是使用来自用本地仪器实施的任何扩增反应的结果确定的。
3.权利要求2的方法，其进一步包括用第一实时仪器共扩增多种校准标准品每一种中含有的分析物多核苷酸和内部校准物的步骤，
其中多种校准标准品每一种包含不同起始浓度的调节校准物的分析物多核苷酸，且
其中多种校准标准品每一种中和调节校准物中的内部校准物的浓度是相同的。
4.权利要求2的方法，其中步骤(a)的校准曲线和步骤(f)中建立的经过调节的校准曲线均为通过线性方程式描述的线性校准曲线。
5.权利要求2的方法，其中步骤(a)和步骤(b)共同包括获得包含调节校准物和固定点的对坐标的有形体现的试剂盒。
6.权利要求5的方法，其中有形体现包括机器可读条形码。
7.权利要求1的方法，其中在步骤(a)之前有通过拟合方程式至使用除本地仪器以外的扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合绘制对定量测定法特异性的校准曲线的步骤，且
其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结果。
8.权利要求1的方法，其中步骤(f)包括通过用与本地仪器通讯的处理器绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线。
9.权利要求8的方法，其中与本地仪器通讯的处理器是本地仪器的整合构件。
10.权利要求1的方法，其中步骤(a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核苷酸的量。
11.权利要求2的方法，其中步骤(a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核苷酸的量。
12.权利要求7的方法，其中步骤(a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核苷酸的量。
13.权利要求1的方法，其中获得步骤(b)包括组合固定量的内部校准物和已知量的分析物多核苷酸。
14.一种使用核酸扩增测定法量化测试样品中可能存在的分析物多核苷酸的计算机，该核酸扩增测定法包括用扩增核酸并作为时间的函数监测扩增子合成的本地仪器共扩增分析物多核苷酸和固定量的内部校准物，所述计算机包含用于实施下述软件指令的处理器，所述软件指令用于实施下述步骤的：
(a)为对要用于量化分析物多核苷酸的核酸扩增测定法特异性的校准曲线上的一个固定点接收一对坐标，
其中该对坐标规定分析物多核苷酸的量和标准化扩增指标值；
(b)为已知量的分析物多核苷酸的扩增指标获得针对调节校准物中含有的且用本地仪器实施的第一扩增反应中共扩增的固定量的内部校准物的扩增指标标准化的值；
(c)绘制包含第一点和第二点的经过调节的校准曲线，
其中第一点包含调节校准物的分析物多核苷酸的已知量和步骤(b)中获得的值的坐标，且
其中第二点包含步骤(a)中为固定点接收的对坐标；
(d)为测试样品中的未知量的分析物多核苷酸的扩增指标获得针对用本地仪器实施的第二扩增反应中与之共扩增的固定量的内部校准物的扩增指标标准化的值；
(e)将步骤(d)中获得的值与经过调节的校准曲线比较从而为测试样品中存在的未知量的分析物多核苷酸产生定量结果；并
(f)输出来自步骤(e)的定量结果的有形记录。
15.权利要求14的计算机，其中步骤(a)中接收的对坐标规定当校准曲线投射至标准化扩增指标值零时分析物多核苷酸的量。
16.权利要求14的计算机，其中所述软件指令存储在选自下组的介质上：光盘，磁存储介质，闪存驱动器，计算机硬盘驱动器，和由至少一台计算机可存取的网络驱动器。
17.权利要求14的计算机，其中步骤(b)和步骤(d)各自包括通过数学计算来获得。
18.权利要求14的计算机，其中步骤(b)和(d)包括通过接收相应值的数字输入来获得。
19.权利要求14的计算机，其中步骤(c)中绘制的经过调节的校准曲线通过线性方程式定义。
20.权利要求14的计算机，其中步骤(e)的有形记录印刷在纸上。
21.权利要求14的计算机，其中核酸扩增测定法为等温核酸扩增测定法。
22.一种用于测定测试样品中靶核酸序列的起始数量的设备，该设备包括：
(a)至少一台检测机械，其测量：
(i)指示第一核酸扩增反应中扩增的靶核酸序列和第一内部校准物的相应数量的信号，
其中第一内部校准物包含与靶核酸序列不同的第二核酸序列；
( ii)指示第二核酸扩增反应中扩增的已知量的分析物多核苷酸和第二内部校准物的相应数量的信号，
其中分析物多核苷酸和第二内部校准物均是调节校准物的成分，
其中第二内部校准物包含第二核酸序列，且
其中第一和第二核酸扩增反应中第二核酸序列的起始数量相等；
(b)至少一台与检测机械通讯的处理器，
其中处理器编程有一个固定点的一对坐标，该对坐标规定分析物多核苷酸量和标准化扩增指标值，且
其中处理器进一步编程为实施下述步骤：
(i)自测量的信号为已知量的分析物多核苷酸、第一和第二内部校准物每一项、和靶核酸序列的扩增指标确定相应值；
(ii)将为靶核酸序列确定的扩增指标值针对为第一内部校准物确定的扩增指标值标准化；
(iii)将为已知量的分析物多核苷酸确定的扩增指标值针对为第二内部校准物确定的扩增指标值标准化；
(iv)自固定点、分析物多核苷酸的已知量和已知量的分析物多核苷酸的标准化扩增指标建立校准曲线；并
(v)使用校准曲线和靶核酸序列的标准化扩增指标确定测试样品中靶核酸序列的起始数量。
23.权利要求22的设备，其中固定点的对坐标是使用来自多个核酸扩增反应的结果确定的，该多个核酸扩增反应是使用除实施第一和第二核酸扩增反应的设备以外的仅一台设备实施的。
24.权利要求23的设备，其中所述对坐标的一个成员规定标准化扩增指标值零。
25.权利要求23的设备，其进一步包括其中发生第一和第二核酸扩增反应的温度控制的温箱。
26.权利要求25的设备，其中温度控制的温箱维持恒定的温度，且其中第一和第二核酸扩增反应为等温核酸扩增反应。
27.权利要求23的设备，其中步骤(iv)中的校准曲线通过线性方程式定义。
28.权利要求23的设备，其中所述至少一台检测机械包含测量荧光信号的荧光计。
29.一种为使用扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的本地仪器实施的定量测定法建立经过调节的校准曲线的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)为对定量测定法特异性的校准曲线上的一个固定点获得一对坐标，其中该对坐标规定分析物多核苷酸的量和扩增指标值；
(b)获得包含已知量的分析物多核苷酸的分析物多核苷酸标准品；
(c)使用本地仪器在核酸扩增反应中扩增分析物多核苷酸标准品的分析物多核苷酸；
(d)为步骤(c)中扩增的分析物多核苷酸确定扩增指标；并
(e)通过绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线，
其中第一点包含分析物多核苷酸标准品的分析物多核苷酸的已知量和步骤(d)中确定的扩增指标的坐标，且
其中第二点包含步骤(a)中为固定点获得的对坐标。
30.权利要求29的方法，其中在步骤(a)之前有通过拟合方程式至使用除本地仪器以外的扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合绘制对定量测定法特异性的校准曲线的步骤，且
其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结果。
31.权利要求29的方法，其中步骤(e)包括使用与本地仪器通讯的处理器来绘制校准曲线图。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105264090B (zh) 2013-03-15 2020-04-07 简·探针公司 校准方法、设备和计算机程序产品
EP3378000B1 (en) 2015-11-20 2021-09-01 Seegene, Inc. Method for calibrating a data set of a target analyte
US10510436B2 (en) * 2016-07-05 2019-12-17 Credo Biomedical Pte Ltd. Using serial dilutions of reference samples to construct a reference table for sigmoidal fitting in real-time PCR copy number analysis
US20200152294A1 (en) * 2017-05-19 2020-05-14 Seegene, Inc. Method for calibrating a data set of a target analyte using an analyte-insusceptible signal value
WO2019144112A1 (en) * 2018-01-22 2019-07-25 Phadia Ab Method for the harmonization of assay results
US11624757B2 (en) * 2019-03-04 2023-04-11 Meta Platforms, Inc. Modeling poses of tracked objects by predicting sensor data
EP4073268B1 (en) 2019-12-09 2024-04-10 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
CN111123263B (zh) * 2019-12-12 2022-04-19 创新奇智(浙江)科技有限公司 基于地质雷达检测数据的隧道钢筋识别检测系统、方法
JP7564633B2 (ja) 2020-03-30 2024-10-09 株式会社安川電機 細胞製造装置、細胞製造方法、細胞製造装置用プログラム、および、細胞製造システム
JP7580930B2 (ja) 2020-03-30 2024-11-12 株式会社安川電機 処理物製造装置、処理物製造方法、処理物製造装置用プログラム、および、処理物製造システム
WO2024128468A1 (ko) * 2022-12-12 2024-06-20 주식회사 씨젠 Assay용 컴포넌트 생성 방법 및 이를 수행하는 assay용 컴포넌트 생성 장치

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19614852A1 (de) * 1996-04-15 1997-10-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäure
WO2008067567A2 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Gen-Probe Incorporated Quantitative method employing adjustment of pre-defined master calibration curves

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
DE3785658T2 (de) 1986-08-11 1993-08-12 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
WO1989001050A1 (en) 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
WO1989009835A1 (en) 1988-04-08 1989-10-19 The Salk Institute For Biological Studies Ligase-based amplification method
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
JP3276955B2 (ja) 1988-09-30 2002-04-22 ジーン−トラック・システムス Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5219727A (en) 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
EP0525882B1 (en) 1991-08-02 2004-01-14 bioMerieux B.V. Quantification of nucleic acid
AU681082B2 (en) 1992-05-06 1997-08-21 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
JP4372837B2 (ja) 1992-08-04 2009-11-25 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 核酸配列増幅
KR100189229B1 (ko) 1993-07-23 1999-06-01 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 핵산 증폭을 강화하는 방법
US6066458A (en) * 1998-05-18 2000-05-23 Becton, Dickinson And Company Methods, apparatus and computer program products for determining quantities of nucleic acid sequences in samples using standard curves and amplification ratio estimates
US6303305B1 (en) 1999-03-30 2001-10-16 Roche Diagnostics, Gmbh Method for quantification of an analyte
DE10045521A1 (de) 2000-03-31 2001-10-04 Roche Diagnostics Gmbh Nukleinsäureamplifikationen
US6783934B1 (en) 2000-05-01 2004-08-31 Cepheid, Inc. Methods for quantitative analysis of nucleic acid amplification reaction
DE60213730T2 (de) 2001-08-31 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Echtzeit-Quantifizierung mit internen Standards
US7788039B2 (en) * 2003-09-25 2010-08-31 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitation of nucleic acids using growth curves
JP2008532526A (ja) 2005-03-10 2008-08-21 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド サンプル内の検体を検出または定量化するためのアッセイを実施するためのシステムおよび方法
US7739054B2 (en) 2005-06-22 2010-06-15 Gen-Probe Incorporated Method and algorithm for quantifying polynucleotides
EP2273404B1 (en) * 2005-11-14 2013-10-09 Gen-Probe Incorporated Computer-readable medium for parametric calibration method
US9280515B2 (en) * 2010-12-03 2016-03-08 Echostar Technologies L.L.C. Provision of alternate content in response to QR code
US9932628B2 (en) * 2012-07-27 2018-04-03 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
CN105264090B (zh) 2013-03-15 2020-04-07 简·探针公司 校准方法、设备和计算机程序产品

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19614852A1 (de) * 1996-04-15 1997-10-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäure
WO2008067567A2 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Gen-Probe Incorporated Quantitative method employing adjustment of pre-defined master calibration curves

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a multiplex real-time PCR assay with an internal amplification control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in oysters;Jessica L Nordstrom et al.;《Appl Environ Microbiol》;20070930;5840-5847 *
Nucleic acid isothermal amplification technologies a review;Gill P and Ghaemi A.;《Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids》;20080302;224-243 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2899645A1 (en) 2014-09-18
CN105264090A (zh) 2016-01-20
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US20180298432A1 (en) 2018-10-18
US20140272991A1 (en) 2014-09-18
AU2014228343B2 (en) 2019-11-07
HK1220235A1 (zh) 2017-04-28
US9976175B2 (en) 2018-05-22
WO2014143665A1 (en) 2014-09-18
DK2971090T3 (da) 2020-06-08
CA2899645C (en) 2022-08-30
JP6463332B2 (ja) 2019-01-30
AU2014228343A1 (en) 2015-10-29
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JP2016513473A (ja) 2016-05-16
ES2795677T3 (es) 2020-11-24
US11781174B2 (en) 2023-10-10

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