CN105264073A

CN105264073A - 用于递送治疗性寡核苷酸的双链剂

Info

Publication number: CN105264073A
Application number: CN201480030545.5A
Authority: CN
Inventors: 横田隆德; 仁科一隆; 吉冈耕太郎; 水泽英洋
Original assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2016-01-20
Also published as: US11028387B2; EP3004347B1; JP6472087B2; AU2014272526A1; CA2913499A1; EP3004347A1; EP3004347A4; WO2014192310A1; US20160145614A1; ES2700277T3; JP2016524588A

Abstract

本文公开了可在生物样品内递送治疗性寡核苷酸的双链核酸剂，及使用所述双链核酸剂的方法。在一个实施方案中，双链核酸剂包含：包含第一RNA区的第一链和包含第一DNA区的第二链，其中所述第一RNA区和所述第一DNA区杂交成RNA/DNA异源双链体。所述第一链还包含核酸治疗性寡核苷酸区，其能够从所述第一RNA区中的至少一个核苷酸上被切割。使用双链核酸剂的方法包括通过将治疗性寡核苷酸从第一RNA区的至少一部分上切割来递送作为单链的治疗性寡核苷酸的方法。该方法还包括递送双链核酸剂并由此递送治疗性寡核苷酸到治疗受试者体内的靶位点。

Description

用于递送治疗性寡核苷酸的双链剂

技术领域

本申请涉及可用于递送治疗性寡核苷酸到诸如生物样品内或患者体内的细胞的双链核酸剂。治疗性寡核苷酸可以包括反义寡核苷酸、antagomir、剪接转换寡核苷酸、单链siRNA、微小RNA、前体微小RNA及相似物。所述治疗性寡核苷酸是双链剂的一条链的组成部分，并通过酶的作用或通过双链结构的解旋至少部分被释放。该治疗性寡核苷酸可被用于此类寡核苷酸已知的任何目的，其包括，例如，修饰细胞内RNA转录水平或蛋白水平。

背景技术

近年来，寡核苷酸成为正在开发中的被称为核酸药的药物产品的感兴趣的主题，且尤其是从对靶基因的高选择性和低毒性的角度，对利用反义方法的核酸药的开发正在积极进行中。反义方法包括通过将与靶基因的mRNA的部分序列(有义链)互补的寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸，或ASO)引入细胞来选择性地修饰或抑制由靶基因编码的蛋白的表达的方法。相似地，反义方法还靶向miRNA并起作用以修饰此类miRNA的活性。

如图1中所阐述的(上部)，当将包含RNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，ASO结合到靶基因的转录产物(mRNA)，并且形成部分双链。已知这种双链作为防止核糖体翻译的掩蔽物发挥作用，并因此抑制由靶基因编码的蛋白的表达。

另一方面，当将包含DNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，形成部分DNA-RNA异源双链体。因为这个结构被RNA酶H识别且靶基因的mRNA因此被分解，由靶基因编码的蛋白的表达被抑制。(图1，下部)。在许多情况下，与使用RNAASO的情况比较，当使用DNA作为ASO(RNA酶H依赖途径)时，基因表达抑制效应更高。

当利用寡核苷酸作为核酸药时，多种核酸类似物，诸如锁定核酸(LNA)(注册商标)、其他桥接核酸(BNA)及相似物已经被开发以提高体内对靶RNA的结合亲和力和稳定性。

如图2中所阐述的，由于天然核酸(RNA或DNA)的糖部分有具有四个碳原子和一个氧原子的五元环，该糖部分具有两种构象，N型和S型。已知这些构象从一种旋转为另一种，并因此，核酸的螺旋结构也采用不同的型，A型和B型。由于用作之前提到的ASO靶的mRNA采用呈A型的螺旋结构，糖部分主要呈N型，所以从增加对RNA的亲和力的角度，ASO的糖部分采用N型很重要。已经在该概念下被开发的产品是修饰的核酸，诸如LNA(2’-O,4’-C-亚甲基-桥接核酸(2’,4’-BNA))。例如，在LNA中，因为在2’位置上的氧和在4’位置上的碳通过亚甲基基团桥接，该构象被固定为N型，且构象之间不再存在波动。因此，与用常规天然核酸合成的寡核苷酸(参见专利文件1)比较，通过掺入几个LNA单元合成的寡核苷酸具有对RNA的非常高亲和力和非常高的序列特异性，并且还显示极佳的热耐受性和核酸酶耐受性。由于其他人工核酸也具有此类特征，与反义方法和相似方法的利用相关的人工核酸已备受关注(参见专利文件1到9)。

尽管如此，即使使用这些高性能的修饰的核酸设计的反义寡核苷酸仍然缺乏作为治疗剂使用的适合的效率、效力和/或安全性。

限制治疗性寡核苷酸使用的一个技术问题是不能有效递送剂到其可引发效力的位置。对一些类型的治疗性寡核苷酸，剂本身的直接递送可到达活性位置，但通常需要大剂量且大剂量会损害安全性。低效率递送的原因可包括代谢的不稳定性、低效率的运输和隔绝剂的非特异性的捕获或结合的相互作用。其他类型，诸如短干扰RNA双链体(siRNA)，需要复杂的脂质制剂用于递送，但这些被报道为是昂贵、难以制备并且具有某些毒副作用(非专利文件1)。因此，存在对将寡核苷酸治疗物递送至生物样品或患者中的细胞和组织的更有效方法的公认的需要。

此外，当使用反义寡核苷酸作为药物时，对于一些应用，相关寡核苷酸可以以高特异性和高效率递送到靶位置也很重要。用于递送寡核苷酸的方法包括使用脂质，诸如胆固醇和维生素E(非专利文件2和3)，使用受体特异性肽，诸如RVG-9R(非专利文件4)，或使用对靶位置特异的抗体(非专利文件5)。

引用列表

专利文献

PTL1：JP10-304889A

PTL2：WO2005/021570

PTL3：JP10-195098A

PTL4：JP2002-521310W

PTL5：WO2007/143315

PTL6：WO2008/043753

PTL7：专利文件7：WO2008/029619

PTL8：WO2003/011887

PTL9：WO2007/131238

非专利文献

NPL1：WaltF.Lima等，Cell，卷150，883-894(2012)

NPL2：KazutakaNishina等，MolecularTherapy，卷16，734-740(2008)

NPL3：JurgenSoutscheck等，Nature，卷432，173-178(2004)

NPL4：KazutakaNishina等，MolecularTherapy，卷16，734-740(2008)

NPL5：DanPeer等，Science，卷319，627-630(2008)

发明概述

技术问题

本发明的目的是提供可递送治疗性寡核苷酸的双链核酸剂。

问题的解决方案

提供了可递送治疗性寡核苷酸的双链核酸剂，所述双链核酸剂包含第一链和第二链，其中所述治疗性寡核苷酸是所述第一链的一部分。治疗性寡核苷酸通常是单链剂，但本身可以是双链或发卡结构。在一些实施方案中，治疗性寡核苷酸被设计为引发反义效应。例如，反义效应可针对蛋白编码的或非蛋白编码的转录产物。双链核酸剂可因此被应用于改变靶向的转录产物的浓度或活性水平。在一些实施方案中，可使用该剂治疗、预防或改善以具有异常水平转录产物为特征的患者中的疾病或状况。

如图中3A和3B所示，第一链包含治疗性寡核苷酸区和第一互补区。第一互补区与第二链的一部分或全部互补。第二链包含第二互补区。第二互补区与第一互补区的一部分或全部互补，并任选地可与治疗区的一部分互补。然而，不要求第一互补区与第二互补区完全互补或具有和第二互补区相同的碱基数目。

治疗性寡核苷酸区可如图3A和3B中所示与第一链的互补区的3’末端，或如图5中所示与第一链的互补区的5’末端连接。优选地，治疗性寡核苷酸可以被连接到第一链的互补区的5’末端。

在一些实施方案中，如图3B中所示，双链核酸剂还包含功能部分。功能部分(x)可以是检测标记、递送或靶向分子或纯化标签。来自一个或更多个这样类别的一个或更多个此类部分可被连接到双链核酸剂。在一些实施方案中，此类部分被连接在核酸链3’或5’末端的末端位置。在其他实施方案中，部分可以被连接在中间位置。部分还可通过可断裂的接头连接到链。在一些实施方案中，一个或更多个功能部分增强双链核酸剂到靶位置的高特异性和高效率的递送。

第二链可包含一种类型的核苷酸或核苷酸类似物(统称为“碱基”)，或它可包含两种或更多种类型的碱基。当包含两种或更多种类型时，碱基可以以gapmer或mixmer结构排列。例如，作为gapmer，如通过引用以其整体并入本文的名称为"ChimericDouble-StrandedNucleicAcid"的PCT/JP2012/083180中关于反义链描述的，第二链可以被布置为具有由至少4个连续的DNA核苷酸组成的中心区、包含位于中心区的5’末端侧的至少2个核苷酸类似物的第一5’翼区、和包含位于区的3’末端侧的至少2个核苷酸类似物的第一3’翼区。例如，作为mixmer，第二链可以被布置为不具有由4个或更多个连续DNA核苷酸组成的区。该链还可包含以双翼结构排列的核苷酸或核苷酸类似物，诸如在共同待审和共同拥有的美国临时申请号61/771,115，名称为"ChimericSingle-StrandedAntisensePolynucleotides"和美国临时申请号61/806,887，名称为"Double-StrandedAntisenseAgents"的文件中所公开的，其通过引用以其整体并入本文。例如，作为双翼结构，第二链可以被布置为包含：

中心核苷酸区，其包含至少4个DNA核苷酸；

第一5’翼区，其连接到中心核苷酸区的5’末端，包含1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；

第一3’翼区，其连接到中心核苷酸区的3’末端，包含1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；及

第二5’翼区和/或第二3’翼区，其中：

第二5’翼区被连接到第一5’翼区的5’末端，具有比天然DNA或RNA更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送完嵌合多核苷酸后在细胞内消失；及

第二3’翼区被连接到第一3’翼区的3’末端，具有比天然DNA或RNA更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性。第二链还可以全部或部分地包含肽核酸(PNA)单元。第二链可以自身是反义寡核苷酸。

通常，第二链被设计为当放入生物样品(细胞、组织、动物、人等)中时对核酸酶降解耐受，或更通常，对代谢降解耐受。

第一链可包含一种类型的核苷酸或核苷酸类似物(统称为“碱基”)，或它可包含两种或更多种类型的碱基。如注明的，第一链包含第一互补区和治疗性寡核苷酸区。仅为了提及链的每个部分的便捷方式命名这些区。一些单独的核苷酸和/或核苷酸类似物可以是两个区的一部分。因此，区可“重叠”，其中特定碱基既与第二链中的碱基互补且也是治疗性寡核苷酸的一部分。例如，如图4A-4F中所阐述的，治疗性寡核苷酸可不具有与第二链的重叠(图4A)，或治疗性寡核苷酸区可与第二链中的一些或甚至多于一半碱基配对(图4B-4F)。

仅考虑第一链的第一互补区，当包含两种或更多种类型的核苷酸或核苷酸类似物时，碱基可以以gapmer或mixmer结构排列。例如，作为gapmer，如名称为"ChimericDouble-StrandedNucleicAcid"的PCT/JP2012/083180中关于反义链描述的，第一互补区可被布置为具有包含至少4个连续的RNA核苷酸的中心区、第一5’翼区和第一3’翼区。

仅考虑第一链的治疗性寡核苷酸区，该区可包含任何类型的核酸治疗剂。具体实例包括反义寡核苷酸、antagomir寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、单链siRNA寡核苷酸、双链siRNA寡核苷酸、微小RNA、前体微小RNA和适配体(aptamer)。这些剂可用本领域技术人员已知的任何结构和设计来制备。例如，特定核苷酸或核苷酸类似物可被掺入结构，或可应用不同类型的碱基在gapmer、mixmer、单翼或双翼排列中的排列。

在一些实施方案中，第一互补区被设计为当放入生物样品(细胞、组织、动物、人等)中时对核酸酶降解耐受，或更通常地，对代谢降解耐受。例如，第一互补区可包含比天然碱基对核酸酶切割更耐受的碱基(修饰的核苷酸或核苷酸类似物)，或它可包含PNA。当第一互补区被设计为对核酸酶降解耐受时，该区将通常保留与本文公开的方法中的治疗性寡核苷酸的连接。在这种情况，当提及治疗性寡核苷酸的释放时，可恰当理解为意指第一链的释放(治疗性寡核苷酸被连接到第一互补区)。

在其他实施方案中，第一互补区被设计为当第一链与第二链杂交时易被RNA酶H切割。因此，第一互补区和第二互补区的至少一部分被设计为当两链退火为双链体时被RNA酶H识别。通常，为此目的，第一链包含RNA核苷酸且第二链包含DNA核苷酸以形成异源双链体。在一些实施方案中，第一互补区包含2个、3个、4个或5个或更多个连续的天然RNA碱基，任选地其可在一侧或两侧的侧翼为被修饰的RNA核苷酸。与此类第一互补区互补的第二互补区的部分可包含天然DNA、修饰的DNA、DNA类似物或促进异源双链体结构的识别和第一链的切割的其他此类碱基。

在一些实施方案中，治疗性寡核苷酸区被设计为当放入生物样品(细胞、组织、动物、人等)中时对核酸酶降解耐受，或更通常地，对代谢降解耐受。例如，治疗性寡核苷酸区可包含比天然碱基对核酸酶切割更耐受的碱基(修饰的核苷酸或核苷酸类似物)，或它可包含PNA。尤其是，治疗性寡核苷酸区通常被设计为在该区的3’和5’末端部分具有比天然碱基对于切割或降解更为耐受的至少1个、2个、3个或至少4个碱基。如以上指出的，在末端部分之一的这些碱基中的一些还可以是第一互补区的一部分。

当第一互补区包含易被诸如RNA酶H切割或降解的一些碱基，且切割反应发生时，包含治疗性寡核苷酸区的第一链的部分可仍还包含第一互补区的一部分。是第一互补区的一部分的这些碱基中的一些可容易被进一步的切割或降解。例如，此类碱基可经历外切核酸酶切割。即使在样品环境中可存在此类碱基，它们可被除去，但预计在治疗性核苷酸区的末端部分比天然碱基对切割或降解更耐受的碱基的存在防止诸如通过外切核酸酶的进一步作用对治疗性寡核苷酸的切割或降解。

在仍其他实施方案中，可包括在任一第一或第二链的5’末端、3’末端或两个末端上和/或在治疗性寡核苷酸区的任一个或两个末端上添加的另外的核苷酸或类似物，其显示核酸酶耐受性和对于蛋白和蛋白样细胞组分低的结合亲和力。

本发明人已确定了，当双链核酸剂被引入细胞时，双链核酸剂可释放治疗性寡核苷酸，然后治疗性寡核苷酸可以起作用以例如修饰转录产物的活性或功能。转录产物可以是蛋白编码转录产物或非蛋白编码产物诸如miRNA。本申请还设计了通过反义效应改变细胞中蛋白的表达水平和改变蛋白结构的方法。

双链核酸剂还可用于治疗具有以改变的基因表达水平使得例如蛋白过表达为特征的状况的患者。通过用包含双链核酸剂的药物组合物治疗患者，基因表达水平可被特异地阻抑或抑制到蛋白水平下降的程度，由此减轻状况。

在某些实施方案中，以下被提供。

(1)一种递送治疗性寡核苷酸到细胞的方法，所述方法包括：

使组合物与所述细胞接触，所述组合物包含：

双链核酸剂，所述双链核酸剂包含退火到第二核酸链的第一核酸链，

其中：

所述第一核酸链包含(i)第一RNA区，所述第一RNA区具有当所述第一核酸链与所述第二核酸链杂交时可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸，(ii)治疗性寡核苷酸区，其中在所述治疗性寡核苷酸区的3’和5’末端的至少一个核苷酸间键比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，和(iii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第一核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的第一RNA区杂交，且可促进所述第一核酸链中的至少2个连续的RNA核苷酸被RNA酶H识别，且任选地(ii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第二核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；且

所述第一核酸链的治疗性寡核苷酸区不能与所述第二核酸链杂交。

(2)根据项目(1)所述的方法，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链包含选自RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的核苷酸。

(3)根据项目(1)所述的方法，其中所述第一核酸链包含选自DNA核苷酸、RNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的核苷酸，且所述第二核酸链包括选自DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的核苷酸。

(4)根据项目(1)-(3)中的任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸区包含选自反义寡核苷酸、antagomir寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、单链siRNA寡核苷酸、双链siRNA、微小RNA、前体微小RNA和适配体的寡核苷酸。

(5)根据项目(4)所述的方法，其中所述antagomir寡核苷酸是mixmer、包含核苷酸或核苷酸类似物中的一种类型、或是gapmer。

(6)根据项目(5)所述的方法，其中所述antagomir包含选自2’-OMeRNA、MOE、CET、ENA、LNA和AmNA的至少一种核苷酸，且至少一个核苷酸间键任选地被硫代磷酸酯化(phosphorothioated)。

(7)根据项目(1)-(6)中的任一项所述的方法，其中所述第二核酸链是gapmer或mixmer。

(8)根据项目(1)-(7)中的任一项所述的方法，其中所述双链核酸剂还包含靶向部分；

另外其中所述靶向部分选自脂质、糖、肽和蛋白；

另外其中所述脂质选自胆固醇、生育酚、生育三烯酚、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。

(9)根据项目(8)所述的方法，其中所述靶向部分被连接到所述第二核酸链的3’末端核苷酸或5’末端核苷酸，或连接到所述第一核酸链的3’末端核苷酸或5’末端核苷酸。

(10)根据项目(1)-(9)中的任一项所述的方法，其中所述核苷酸间键中的增加的核酸酶耐受性是由于至少一个硫代磷酸酯基团、修饰的核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸所致。

(11)根据项目(1)-(10)中的任一项所述的方法，其中所述第一核酸链包含选自修饰的RNA核苷酸和核苷酸类似物、位于可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’的一个或更多个核苷酸。

(12)根据项目(11)所述的方法，其中所述位于可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’的一个或更多个核苷酸独立地选自LNA核苷酸、BNA核苷酸、2’-O-MeRNA核苷酸和2’-O-甲氧基乙基RNA核苷酸。

(13)根据项目(11)或(12)所述的方法，其中所述位于可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’的一个或更多个核苷酸独立地任选地被硫代磷酸酯化。

(14)一种递送治疗性寡核苷酸到细胞的方法，所述方法包括：

使组合物与所述细胞接触，所述组合物包含：

双链核酸剂，所述双链核酸剂包含退火到第二核酸链的第一核酸链，其中：

所述第一核酸链包含(i)第一RNA区，所述第一RNA区具有当所述第一核酸链与所述第二核酸链杂交时可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸，(ii)一个或更多个核苷酸，所述一个或更多个核苷酸选自修饰的RNA核苷酸和核苷酸类似物，位于被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’，(iii)治疗性寡核苷酸区，所述治疗性寡核苷酸区包含选自修饰的RNA核苷酸和核苷酸类似物的在3’末端和5’末端的一个或更多个核苷酸，且其独立地任选地被硫代磷酸酯化，(iv)靶向部分，所述靶向部分选自脂质、肽和蛋白，连接到3’末端核苷酸或5’末端核苷酸，和(v)所述第一核酸链中核苷酸的总数为从12到100；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的第一RNA区杂交，且可促进所述第一核酸链中的至少2个连续的RNA核苷酸被RNA酶H识别，及(ii)一个或更多个核苷酸，所述一个或更多个核苷酸选自修饰的DNA核苷酸和核苷酸类似物，位于所述第一DNA区的5’和3’，且其独立地任选地被硫代磷酸酯化；且

(15)一种递送治疗性寡核苷酸到细胞的方法，所述方法包括：

使组合物与所述细胞接触，所述组合物包含：

所述第一核酸链包含(i)第一PNA区，所述第一PNA区具有至少2个PNA核苷酸，(ii)治疗性寡核苷酸区，其中在所述治疗性寡核苷酸区的3’末端和5’末端的至少一个核苷酸间键比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，和(iii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第一核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的第一PNA区杂交，和(ii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第二核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；且

(16)一种组合物，所述组合物包含：

所述第一核酸链包含(i)第一RNA区，所述第一RNA区具有当所述第一核酸链与所述第二核酸链杂交时可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸，(ii)治疗性寡核苷酸区，其中在所述治疗性寡核苷酸区的3’末端和5’末端的至少一个核苷酸间键比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，(iii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第一核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，和(iv)所述第一核酸链中核苷酸的总数为从12到100；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的第一RNA区杂交，且可促进所述第一核酸链中的至少2个连续的RNA核苷酸被RNA酶H识别，(ii)任选地至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第二核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，和(iii)所述第二核酸链中核苷酸的总数为至少8；且

所述第一核酸链的治疗性寡核苷酸区在生理温度下在哺乳动物细胞内不能与所述第二核酸链杂交。

(17)一种药物组合物，所述药物组合物包含如项目(16)所述的双链核酸剂和药学上可接受的载体。

(18)一种减少细胞内基因表达水平的方法，所述方法包括施用有效量的项目(16)或(17)所述的组合物到所述细胞的步骤。

(19)一种修饰细胞内转录产物的功能的方法，所述方法包括施用项目(16)或(17)所述的组合物到所述细胞的步骤。

(20)一种改变细胞内蛋白的表达水平的方法，所述方法包括施用项目(16)或(17)所述的组合物到所述细胞的步骤。

(21)一种改变细胞内蛋白结构的方法，所述方法包括施用项目(16)或(17)所述的组合物到所述细胞的步骤。

(22)一种治疗具有以靶基因的改变的表达水平、功能或编辑为特征的状况的患者的方法，所述方法包括：

对所述患者施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含

(a)至少一种项目(16)所述的双链核酸剂；和

(b)药学上可接受的载体。

某些实施方案包括纯化的或分离的双链核酸剂，所述双链核酸剂包含第一链和第二链，所述第一链包含第一互补区和治疗性寡核苷酸区，且所述第二链包含退火到所述第一链的第二互补区。在某些实施方案中，此类双链核酸剂还包含靶向部分。

根据某些实施方案，可通过将功能部分例如递送部分与双链复合体缔合以高特异性和高效率将双链核酸剂递送至靶位点。

发明的有益效果

本发明的双链核酸剂可以以高特异性和高效率被递送到靶位点，且包括在双链核酸内的治疗性寡核苷酸区显示在靶位置的极好的治疗效应。

附图简述

[图1]图1是阐述某些反义方法的一般机制的图解。如图解所阐明的，当将与靶基因的mRNA的部分序列互补的寡核苷酸(反义寡核苷酸(ASO))(图解中的“DNA”)引入细胞时，由靶基因编码的蛋白的表达被选择性抑制。在虚线框中示出降解机制，其中RNA酶H在mRNA与ASO杂交的位置上切割mRNA。作为RNA酶H切割的结果，mRNA通常将不被翻译以产生功能基因表达产物。

[图2]图2是阐述RNA、DNA和LNA核苷酸的结构的示意图。

[图3]图3A-3B是能够递送治疗性寡核苷酸的双链核酸剂的适合的实施方案的示意图。图3A示出基本核苷酸框架，且图3B向其添加任选的功能部分“X”，功能部分“X”可独立地代表脂质(例如，胆固醇或生育酚)、糖或相似物、或蛋白、肽(例如，抗体)或相似物，且其可用为靶向部分。

[图4]图4A-4F是第一链和第二链的多种结构、和第一链的治疗性寡核苷酸部分与第一和第二链的互补区的关系的示意图。

[图5]图5A-5D是展示治疗性寡核苷酸可藉以从双链核酸剂释放的机制的示意图。

[图6]图6示出多种天然和修饰的核酸或核酸类似物部分的结构式。

[图7-1]图7-1A到7-1C是实施例1中使用的双链核酸剂的结构的示意图。

[图7-2]图7-2D到7-2E示出实施例1的实验的RNA印记分析。

[图8]图8在图的上部示出实施例2中使用的寡核苷酸的序列和组成，并在图下部示出实施例2的结果图，其中测试了通过双链核酸剂，小鼠中微小RNA122(miR122)的体内抑制。

[图9]图9示出实施例3中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图10a]图10a示出实施例3的结果的图，其中测试了微小RNA122(miR122)的体内抑制。

[图10b]图10b示出实施例3的结果的图，其中测试了通过双链核酸剂，小鼠中醛缩酶A(ALDOA)的表达。

[图10c]图10c示出实施例3的结果的图，其中测试了通过双链核酸剂，小鼠中支链酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)的表达。

[图10d]图10d示出实施例3的结果的图，其中测试了通过双链核酸剂，小鼠中的血清的总胆固醇水平(图10d)。

[图10e]图10e示出实施例3的结果的图，其中测试了通过双链核酸剂，小鼠中的血清LDL水平。

[图10f]图10f示出血清总胆固醇水平的剂量依赖性表型效应。

[图11]图11示出实施例4中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图12]图12示出实施例4的结果的图，比较了双链核酸与单链核酸的外显子跳跃效应。

[图13]图13示出实施例5中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图14]图14示出实施例5的结果的图，展示通过用双链核酸靶向ApoB的前体mRNA的内显子的ApoBmRNA表达的抑制。

[图15]图15示出实施例6中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图16]图16示出实施例6的结果的图，比较了通过双链核酸与通过单链核酸对miR122表达的抑制。

[图17]图17示出实施例7中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图18]图18示出实施例7的结果的图，展示通过用双链核酸靶向ApoB的前体mRNA的内显子的ApoBmRNA表达的抑制。

[图19]图19示出实施例8中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图20]图20示出实施例8的结果的图，展示通过用双链核酸靶向ApoB的前体mRNA的内显子的ApoBmRNA表达的抑制。

[图21]图21示出实施例9中使用的寡核苷酸的序列和组成。

[图22]图22示出实施例8的结果的图，展示antimiR-3’和antimiR-5’的治疗效应。

实施方案的描述

“反义效应”意指抑制靶基因的表达或靶向的转录产物的水平，其由于靶向的转录产物(RNA有义链)与例如DNA链或更通常地被设计为与转录产物等的部分序列互补以引起反义效应的链杂交而发生。在某些情况下，翻译或剪接功能修饰效应诸如外显子跳跃的抑制(参见在图1中被虚线包围的区域外部的上部中的描述)可由杂交产物覆盖转录产物引起，和/或转录产物的分解可由于识别杂交部分而发生(参见图1中被虚线包围的区域内的描述)。另外，在某些情况下，反义效应由靶向前体mRNA的内含子带来。

反义效应由用于递送本发明的治疗性多核苷酸的双链剂的治疗性寡核苷酸部分所具备。反义效应可由第一核酸链所具备。在这种情况下，治疗效应通过寡核苷酸部分和第一核酸链协同地增强。

其表达被反义效应抑制的“靶基因”或“靶向的转录产物”不被特别限定，且其实例包括在多种疾病中其表达被增加的基因。另外，“靶基因的转录产物”是从编码靶基因的基因组DNA转录的mRNA，且还包括未经历碱基修饰的mRNA、未被剪接的mRNA前体及类似物。更通常，“转录产物”可以是通过DNA依赖性RNA聚合酶合成的任何RNA。

如本文所用，术语“核酸”可指单体的核苷酸或核苷，或可意指由多个单体组成的寡核苷酸。还在本文使用术语“多核苷酸”和“核酸链”指寡核苷酸。核酸链可完全或部分地通过化学合成方法或酶方法被制备，化学合成方法包括使用自动合成器，酶方法包括但不限于聚合酶、连接酶或限制性反应。

如本文所用的术语“互补”意指在其中可通过氢键形成称为Watson-Crick碱基对(天然型碱基对)或非Watson-Crick碱基对(Hoogsteen碱基对和类似物)的关系。(a)第一互补区和第二互补区，或(b)靶向的转录产物，例如靶基因的转录产物的碱基序列，和治疗性寡核苷酸的碱基序列不必完全互补，且如果碱基序列具有至少70％或更高，优选地80％或更高，且更优选地90％或更高(例如95％、96％、97％、98％或99％或更高)的互补性是可接受的。序列的互补性可通过使用BLAST程序或类似程序来确定。当序列互补时，第一链可与第二链“退火”或“杂交”。本领域普通技术人员考虑到链之间的互补性的程度可容易地确定在其下两条链可被退火的条件(温度、盐浓度等等)。另外，具有本领域普通技术的人员基于例如靶基因的碱基序列信息，可容易地设计第一和第二互补区，和与靶向的转录产物互补的治疗性寡核苷酸。

第一或第二互补区或治疗性寡核苷酸区的长度不被特别限制，但任一区的长度通常为至少8个碱基、至少10个碱基、至少12个碱基或至少13个碱基。任一区的长度可为多达20个碱基、25个碱基或35个碱基，或更多。第一链的总长度甚至可长达约100个碱基。在一些实施方案中，第二链的长度范围可以是10个到35个碱基、12个到25个碱基或13个到20个碱基。

第一或第二互补区长度的选择取决于每个相对碱基的结合亲和力、互补性的程度和将与双链核酸剂接触的生物样品的温度之间的平衡。彼此结合的第一和第二互补区的部分的长度应当足够长，使得退火的链的热力学稳定性促成两条链在剂与生物样品接触的时间内基本上保持彼此结合。其他因素，诸如蛋白、酶或其他细胞组分可导致链分离或解旋。

在一些实施方案中，治疗性寡核苷酸区包括与退火的双链剂中的第二互补区结合的一些碱基。该“重叠区”长度的选择取决于将与剂接触的生物样品的温度。通常，第一链的治疗性寡核苷酸区在操作温度不能与第二链杂交。操作温度可以是孵育温度或受试者或患者的生理体温。

治疗性寡核苷酸长度的选择通常取决于用于靶的核酸序列的反义效应的强度与特异性之间的平衡，以及其他因素，诸如成本、合成产量等等。

在一些实施方案中，治疗性寡核苷酸的长度及其和靶向的转录产物之间互补性程度的选择还可取决于治疗性寡核苷酸和靶之间在靶已被RNA酶H切割后的结合亲和力。治疗性寡核苷酸的效力取决于在切割前治疗性寡核苷酸与靶的结合亲和力以及切割的材料从治疗性寡核苷酸解离使其自由地与另一个靶链结合的解离率二者。

第一和第二互补区可包含天然和/或非天然的核苷酸。为互补区选择的核苷酸的类型主要确定了治疗性寡核苷酸可藉以被释放的机制类型。例如，在第一链中包括RNA和/或RNA样核苷酸，及第二链中包括DNA和/或DNA样核苷酸，引起可被RNA酶H识别的DNA/RNA异源双链体结构的形成。因此，RNA酶H依赖性作用机制在这个情况下是可能的，在该情况下第一链可被RNA酶H切割。

此类过程在图5A-5D中阐述。图5A中示出在(i)包含2’-OMeRNA/RNAgapmer类第一互补区和2’-OMeRNAantagomir类治疗性寡核苷酸的第一链(图中底部链)和(ii)具有LNA/DNAgapmer类第二互补区的第二链(图中上部链)之间形成的退火的双链体。第一链还包含可递送双链剂到，例如，肝脏的胆固醇部分。剂被递送，例如，到肝脏，并进入细胞后，如图5B中所示，RNA酶H识别DNA/RNA异源双链体并切割第一链中的RNA序列。这将治疗性寡核苷酸从靶向部分分离，并留下很少的碱基以将切下的第一链结合到第二链。并且，这使在正被切割的第一链末端上的一些RNA碱基暴露。图5C中阐明，被切割的第一链从第二链分离而成为自由的单链寡核苷酸，且暴露的RNA碱基经历外切核酸酶切割。如图5D中阐述的，外切核酸酶活性可修剪释放的链刚好到治疗性寡核苷酸区，且因此双链剂可用于在生物样品内递送治疗性寡核苷酸。

另一方面，如果DNA和/或DNA样核苷酸被从第二互补区排除，则预计发生非RNA酶H依赖性作用机制。当然，即使形成了DNA/RNA异源双链体结构，非RNA酶H依赖性机制可发生。

在一些实施方案中，第二互补区包含当与RNA多核苷酸杂交时的至少5个核苷酸，第一/第二互补区双链体被RNA酶H识别。

当与RNA杂交时被“RNA酶H识别”的“至少5个核苷酸”通常是包含5个到20个连续碱基的区、包含5个到16个连续碱基的区、包含5个到12个连续碱基的区或包含5个到8个连续碱基的区。此外，在该区可使用的核苷酸是类似天然DNA的那些，当与RNA核苷酸杂交时被RNA酶H识别，其中RNA酶H切割RNA链。适合的核苷酸，诸如修饰的DNA核苷酸和其他碱基是本领域已知的。在一些实施方案中，天然DNA和修饰的DNA核苷酸可以以mixmer类排列被混合，并仍诱发RNA酶H活性。已知包含2’-羟基基团的核苷酸，如RNA核苷酸，不适合。当期望RNA酶H依赖性效应时，本领域技术人员可容易地确定用于在“至少5个核苷酸”的该区中使用的核苷酸的适合性。在一个实施方案中，互补区的核苷酸独立地选自DNA核苷酸和硫代磷酸酯化的DNA核苷酸。

在一些实施方案中，第二互补区当与RNA多核苷酸杂交时可包含少至4个核苷酸，中心核苷酸区/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别并切割。

在一些实施方案，第一互补区可具有2个、3个、4个或5个或更多个连续的天然RNA核苷酸，并且该子序列可以在适合的异源双链体结构中被RNA酶H切割。

如本文所用的，“DNA核苷酸”意指天然DNA核苷酸或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键的亚基的DNA核苷酸。相似地，“RNA核苷酸”意指天然RNA核苷酸或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键的亚基的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯键的亚基是在其中亚基中已添加或取代了单个取代基，且亚基作为整体还没有被不同的化学基团代替的亚基。从核酸链的部分或整体具有对脱氧核糖核酸酶和类似物的高耐受性的角度，DNA可以是修饰的核苷酸。此类修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和N4-甲基化；胸苷的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；磷硫酰化(phosphorothioation)、甲基磷酸化、甲基硫代磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸化、磷酰胺化、2’-O-甲基化、2’-甲氧基乙基(MOE)化、2’-氨丙基(AP)化和2’-氟化。然而，从具有卓越的药代动力学的角度，优选磷硫酰化。可进行此类修饰使得相同的DNA可以以组合经历多种修饰。并且，如下面讨论的，可修饰RNA核苷酸以达到类似的效应。

在某些情况下，修饰的DNA的或RNA的数目和修饰的位置可影响如本文公开的治疗性寡核苷酸提供的反义效应等，或如本文公开的治疗性寡核苷酸的释放。由于这些实施方案可随互补物的序列等变化，它可取决于情况，但具有本领域普通技术的人员可通过参考与反义方法相关的文件的描述确定适合的实施方案。此外，当修饰后测量治疗性寡核苷酸具备的反义效应或治疗性寡核苷酸的释放时，如果因此获得的测量的值显著低于修饰前治疗性寡核苷酸测量的值(例如，如果修饰后获得的测量的值比修饰前治疗性寡核苷酸的测量的值低30％或更多)，则可评估相关的修饰。可如下面实施例中所示进行反义效应的测量，通过将受验的候选双链剂引入细胞或类似物，并通过适当地使用已知的技术，诸如RNA印迹、定量PCR和蛋白印迹测量靶向的转录产物在其中表达被受验候选剂提供的反义效应抑制的细胞中的表达的量(mRNA的量、cDNA的量、蛋白的量、微小RNA的量或类似)。候选剂可以是治疗性寡核苷酸本身，或作为双链核酸剂的一部分。

如本文所用的，“RNA核苷酸”意指天然存在的RNA核苷酸或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键的亚基的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯键的亚基是其中亚基中已添加或取代了单个取代基，且亚基作为整体还未被不同的化学基团代替的亚基。

从对核酸酶诸如核糖核酸酶(RNA酶)具有高耐受性的角度，核酸链的部分或整体可以是修饰的核苷酸。此类修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和N4-甲基化；胸苷的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；磷硫酰化、甲基磷酸化、甲基磷硫酰化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸化、磷酰胺化、2’-O-甲基化、2’-甲氧基乙基(MOE)化、2’-氨丙基(AP)化和2’-氟化。另外，还预期了用胸苷碱基替换尿嘧啶碱基的RNA核苷酸。然而，从具有卓越药代动力学的角度，使用磷硫酰化。此外，可进行此类修饰使得相同核酸可以以组合经历多种修饰。例如，如下面描述的实施例中所使用的，相同RNA可经历磷硫酰化和2’-O-甲基化以提供对酶切的耐受性。然而，当预计或期望RNA核苷酸被RNA酶H切割时，则通常仅应用磷硫酰化或2’-O-甲基化。

如本文所用的，“核苷酸类似物”意指非天然存在的核苷酸，其中碱基、糖或磷酸酯键的亚基具有多于一个的在亚基中添加或取代的取代基，或亚基作为整体被不同的化学基团代替。具有多于一个的取代的类似物的实例是桥接核酸，其中桥接单元已凭借通常连接到2’和4’碳原子的糖环上的2个取代来添加。对于某些实施方案，从增加对靶向的转录产物的部分序列的亲和力和/或链对核酸酶的耐受性角度，反义多核苷酸链还包含核苷酸类似物。“核苷酸类似物”可以是其中由于修饰(桥接基团、取代基等)增强了对互补物或靶向的转录产物的部分序列的亲和力和/或核酸对核酸酶的耐受性的任何核酸，且其实例包括在JP10-304889A、WO2005/021570、JP10-195098A、JP2002-521310W、WO2007/143315、WO2008/043753、WO2008/029619和WO2008/049085(在下文中，这些文件将称为“与反义方法有关的文件”)中公开为适用于在反义方法中使用的核酸。即，其实例包括在以上描述的文件中公开的核酸：己糖醇核酸(HNA)、环己烷核酸(CeNA)、肽核酸(PNA)、甘醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、吗啉代核酸、三环-DNA(tricyclo-DNA,tcDNA)、2’-O-甲基化核酸、2’-MOE(2’-O-甲氧基乙基)化核酸、2’-AP(2’-O-氨丙基)化核酸、2’-氟化核酸、2’-F-阿拉伯糖核酸(2’-F-ANA)和BNA(桥接核酸)。

根据某些实施方案，BNA可以是其中2’碳原子和4’碳原子被2个或更多个原子桥接的任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。桥接核酸的实例是本领域技术人员已知的。此类BNA的一个亚组可被描述为具有在2’位置上的碳原子和在4’位置上的碳原子由4’-(CH₂)_p-O-2’,4’-(CH₂)_p-S-2’,4’-(CH₂)_p-OCO-2’,4’-(CH₂)_n-N(R₃)-O-(CH₂)_m-2’桥接(此处，p、m和n分别表示从1到4的整数、从0到2的整数和从1到3的整数；并且R₃表示氢原子、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团和单元取代基(荧光或化学发光标记分子、具有核酸切割活性的官能团、细胞内或核内定位信号肽或类似物))。此外，关于根据某些实施方案的BNA，在3’位置处碳原子上的OR₂取代基和5’位置处碳原子上的OR₁取代基内，R₁和R₂通常是氢原子，但可彼此相同或不同，并还可以是用于核酸合成的羟基基团的保护基团、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团、甲硅烷基基团、磷酸基团、被用于核酸合成的保护基团保护的磷酸基团或-P(R₄)R₅(此处，可彼此相同或不同的R₄和R₅各自表示羟基基团、被用于核酸合成的保护基团保护的羟基基团、巯基基团、被用于核酸合成的保护基团保护的巯基基团、氨基基团、具有1个到5个碳原子的烷氧基基团、具有1个到5个碳原子的烷基硫代基团、具有1个到6个碳原子的氰基烷氧基基团或用具有1个到5个碳原子的烷基基团取代的氨基基团)。此类BNA的非限制性实例包括还称为LNA(锁定核酸(注册商标)，2’,4’-BNA)的α-L-亚甲基氧(methyleneoxy)(4’-CH₂-O-2’)BNA或β-D-亚甲基氧(4’-CH₂-O-2’)BNA，还被称为ENA的乙烯氧基(4’-CH₂)₂-O-2’)BNA，β-D-硫代(4’-CH₂-S-2’)BNA，氨氧基(4’-CH₂-O-N(R₃)-2’)BNA，还称为2’,4’-BNA^NC、2’,4’-BNA^COC的氧基氨基(4’-CH₂-N(R₃)-O-2’)BNA，3’-氨基-2’,4’-BNA，5’-甲基BNA，还称为cEtBNA的(4’-CH(CH₃)-O-2’)BNA，还称为cMOEBNA的(4’-CH(CH₂OCH₃)-O-2’)BNA，还称为AmNA的酰胺BNA(4’-C(O)-N(R)-2’)BNA(R＝H,Me)和本领域技术人员知晓的其他BNA。

此外，根据某些实施方案，可修饰核酸类似物中的碱基部分。在碱基部分上修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和N4-甲基化、胸苷的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；和鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化。此外，根据某些实施方案，可在修饰的核酸中修饰磷酸二酯结合位点。磷酸二酯结合位点的修饰的实例包括磷硫酰化、甲基磷酸化、甲基磷硫酰化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸化和磷酰胺化。然而，从具有卓越药代动力学的角度，优选磷硫酰化。另外，可进行碱基部分的此类修饰或磷酸二酯结合位点的修饰使得相同核酸可以以组合经历多种修饰。

通常，修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物不限于本文例示的那些。许多修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物是本领域已知的，例如在属于Tachas等的美国专利号8,299,039，特别是第17-22栏中公开的那些，并可用于本申请的实施方案。天然核苷酸、修饰的核苷酸和核苷酸类似物的实例在图6中示出。

本领域普通技术人员当考虑对靶基因的转录产物的部分序列的反义效应、亲和力、对核酸酶的耐受性等时可在此类修饰的核酸中适当地选择和使用核苷酸类似物。然而，在一些实施方案中，核酸类似物是由以下式(1)表示的LNA：

[化学式1]

在式(1)中，“碱基”表示可被取代的芳香杂环基团或芳香烃环基团，例如天然核苷的碱基部分(嘌呤碱基或嘧啶碱基)或非天然(被修饰的)核苷的碱基部分，同时碱基部分的修饰的实例包括以上所述的那些；并且

可以彼此相同或不同的R₁和R₂各自表示氢原子、用于核酸合成的羟基基团的保护基团、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团、甲硅烷基基团、磷酸基团、被用于核酸合成的保护基团保护的磷酸基团或-P(R₄)R₅{此处，可以彼此相同或不同的R₄和R₅各自表示羟基基团、被用于核酸合成的保护基团保护的羟基基团、巯基基团、被用于核酸合成的保护基团保护的巯基基团、氨基基团、具有1个到5个碳原子的烷氧基基团、具有1个到5个碳原子的烷基硫代基团、具有1个到6个碳原子的氰基烷氧基基团或用具有1个到5个碳原子的烷基基团取代的氨基基团}。

由以上化学式示出的化合物表示为核苷，但“LNA”或更通常地，根据某些实施方案的BNA，包括其中磷酸衍生的基团结合到相关核苷(核苷酸)的核苷酸形式。换言之，BNA，诸如LNA，被作为核苷酸掺入到包含双链核酸复合物的核酸链。

“低蛋白亲和力核苷酸”是(i)比天然DNA或RNA核苷酸对DNA酶或RNA酶更耐受，且(ii)具有对结合蛋白或蛋白样细胞组分的低亲和力的核苷酸。具体地，该核苷酸具有比硫代磷酸酯化的核苷酸更低的对蛋白的结合亲和力。因此，低蛋白亲和力核苷酸是如以上描述的修饰的核苷酸或核苷酸类似物，但该核苷酸不被硫代磷酸酯化。

低蛋白亲和力核苷酸的实例包括2’-O-甲基RNA核苷酸、2’-O-甲氧基乙基RNA核苷酸、LNA、cMOEBNA、2-氟化RNA核苷酸、硼烷磷酸酯(boranophosphate)核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶和5-丙炔基尿苷。

当某些实施方案的双链核酸剂被细胞中的RNA酶H识别，且第一核酸链被切割，释放治疗性寡核苷酸时，第二链被不变化地释放到溶液。在一些实施方案，第二链本身可具有反义活性。

在一些实施方案中，双链核酸剂包含多于两个的多核苷酸链。例如，两个第一链可与一个第二链形成双链复合物。每个第一链可包含同样的治疗性寡核苷酸区或具有不同的治疗性寡核苷酸，所述不同的治疗性寡核苷酸将对相同或不同靶向的转录产物起作用。用于递送多个治疗性寡核苷酸的其他多链构建体可鉴于本文提供的描述来制备。

在双链核酸剂中，一个或更多个连续的多核苷酸还可包含功能部分。

在一些实施方案中，第一或第二链可包含结合到多核苷酸的功能部分。回顾图3B，示出了连接到两条链的末端位置的功能部分“X”。在下面进一步描述的功能部分可被连接到这些末端的部分或全部或在多核苷酸的中间位置被连接。在其他实施方案中，互补链包含多于一个的功能部分，其可在多个位置上被连接，和/或作为一组连接到多核苷酸的一个位置。

多核苷酸(例如第一链或第二链)和功能部分之间的键合可以是直接键合，或可以是通过另一种剂介导的间接结合。然而，在某些实施方案中，优选地功能部分可通过共价键、离子键、氢键等直接键合到多核苷酸，且从可获得更稳定的键合的角度，更优选共价键。功能部分还可通过可切割的连接基团键合到多核苷酸。例如，功能部分可通过二硫键连接。

根据某些实施方案，对“功能部分”的结构不存在特别限制，只要其对嵌合多核苷酸赋予期望的功能。期望的功能包括标记功能、纯化功能和递送功能。提供标记功能的部分的实例包括化合物诸如荧光蛋白、萤光素酶及类似物。提供纯化功能的部分的实例包括化合物诸如生物素、抗生物素蛋白、His标签肽、GST标签肽、FLAG标签肽及类似物。

此外，从以高特异性和高效率递送双链剂到靶位置，并由此通过相关核酸非常有效抑制靶基因的表达的角度，优选具有递送一些实施方案的双链剂到体内“靶位置”的活性的分子作为功能部分被键合到第一链。在一些实施方案中，优选地功能部分在最接近第一互补区的末端，即，距离治疗性寡核苷酸区更远的末端，被连接到第一链。

从能够以高特异性和高效率递送某些实施方案的双链剂到肝脏或类似物的角度，具有“靶向的递送功能”的部分可以是，例如，脂质。此类脂质的实例包括脂质诸如胆固醇和脂肪酸(例如，维生素E(生育酚、生育三烯酚)、维生素A和维生素D)；脂溶性维生素诸如维生素K(例如，酰肉碱)；中间代谢物诸如酰基辅酶A；糖脂、甘油酯及其衍生物。然而，在这些中，从具有较高安全性的角度，在某些实施方案中，使用胆固醇和维生素E(生育酚和生育三烯酚)。此外，从能够以高特异性和高效率递送某些实施方案的双链剂到脑的角度，根据某些实施方案的“功能部分”的实例包括糖(例如，葡萄糖和蔗糖)。另外，从能够通过与在多种器官的细胞表面上存在的多种蛋白结合，以高特异性和高效率递送某些实施方案的双链剂到多种器官的角度，根据某些实施方案的“功能部分”的实例包括肽或蛋白，诸如受体配体和抗体和/或其片段。

用于将标签结合到核酸链的技术随标签部分的性质和在核酸中的连接点而不同，且这些在本领域中是熟知的。尽管没有阐述，但功能部分可以在内部位点而非链末端位点连接到多核苷酸。再一次，此类技术在本领域中是熟知的。

因此，已描述了一些实施方案的双链剂的一些适合的示例性实施方案，但双链剂不意图被限制于以上描述的示例性实施方案。此外，具有本领域普通技术的任何人员可通过适当选择已知的方法产生组成根据多种实施方案的双链核酸剂的多核苷酸。例如，根据一些实施方案的核酸可通过以下产生：基于靶向的转录产物的碱基序列(或，在一些情况下，靶基因的碱基序列)的信息设计核酸的各自碱基序列，通过使用商购可得的自动核酸合成器(AppliedBiosystemsInc.产品；BeckmanCoulterInc.产品；及类似)合成核酸，并随后通过使用反相柱或类似物纯化所得的寡核苷酸。以这种方式产生的核酸在适当的缓冲溶液中混合，并在约90摄氏度到98摄氏度变性几分钟(例如，5分钟)，随后核酸在约30摄氏度到70摄氏度退火约1到8小时，并因此可产生一些实施方案的双链核酸剂。此外，在寡核苷酸合成期间或之后，携带功能部分的多核苷酸可通过将功能部分连接到寡核苷酸链来产生。用于将功能部分连接到核酸的多种方法在本领域中是熟知的。

因此，已描述了第一链和第二链的适合的示例性实施方案。在以下实施例中还公开了另外的实施方案。然而，由发明人所预期的双链剂不限于以上描述的示例性实施方案或以下的实施例。

还预期了用于通过反义效应修饰靶基因的表达或靶向的转录产物的水平的组合物。

如将在下面描述的实施例中公开的，一些实施方案的双链核酸剂可以以高特异性和高效率被递送到靶位置，并可非常有效地抑制靶基因的表达或转录产物的水平。因此，一些实施方案提供了包含一些实施方案的双链反义剂作为活性成分的组合物，且所述组合物意图通过反义效应修饰或抑制，例如，靶基因的表达或微小RNA的活性。特别地，一些实施方案的双链剂甚至当以低浓度施用时可给予高效力，并且该设计还展示减少的毒性。此外，通过将双链剂导向到特定的器官，可减少不良副作用。因此，一些实施方案还可提供意图治疗和预防与例如靶基因的增加的表达相关的疾病，诸如代谢疾病、肿瘤和感染的药物组合物。

一些实施方案的包含双链剂的组合物可通过已知的药学方法来配制。例如，组合物可以以以下的形式肠内地(口服地或类似)使用：胶囊、片剂、丸剂、液体、粉末、颗粒剂、细颗粒剂、薄膜包衣剂、微丸、糖锭、舌下剂、胶溶剂、口服制剂、糊剂、糖浆剂、悬浮剂、酏剂、乳剂、包衣剂、软膏、硬膏剂、泥罨剂、经皮制剂、洗剂、吸入器、气雾剂、注射剂、和栓剂，或非肠内地使用。

关于这些制剂的配制，可适当地掺入药学上可接受的载体或作为食物和饮品可接受的载体，特别是无菌水、生理盐水、植物油、溶剂、基质(bases)、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、pH调节剂、稳定剂、调料、香料、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂、稀释剂、等渗剂、舒缓剂、延展剂、崩解剂、缓冲剂、包衣剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、矫味剂、溶解助剂和其他添加剂。

在配制之际，如在非专利文件2中公开的，可致使与作为功能部分的脂质结合的一些实施方案的双链剂与脂蛋白形成复合物，所述脂蛋白诸如乳糜微滴或乳糜微滴剩余物。此外，从增加肠内施用的效率角度，除脂蛋白外，还可使用与具有结肠粘膜上皮渗透性增加作用的物质(例如，中链脂肪酸、长链不饱和脂肪酸或其衍生物(盐、酯形式或醚形式))和表面活性剂(非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂)的复合物(混合的胶团和乳剂)。

对一些实施方案的组合物的施用的优选形式不存在特别的限制，并且其实例包括肠内(口服或类似)或非肠内施用，更具体地，静脉施用、动脉施用、腹腔施用、皮下施用、皮内施用、气管支气管施用、直肠施用和肌肉施用和通过输液的施用。

一些实施方案的组合物可被用于作为受试者的动物包括人类。然而，除人类和多种家养动物、家养禽类、宠物、实验动物和类似的以外，对可作为一些实施方案的受试者的动物不存在特别的限制。

当一些实施方案的组合物被施用或摄入时，施用的量或摄入的量可根据受试者的年龄、体重、症状和健康状况、组合物的类型(药物产品、食品和饮品或类似的)等等适当选择。然而，根据某些实施方案的组合物的摄入的有效量是0.001mg/kg/天到50mg/kg/天的治疗性寡核苷酸。

如将在接着的实施例中公开的，一些实施方案的双链剂可以以高特异性和高效率递送到靶位置，并可有效地修饰或抑制靶基因的表达或转录产物的水平。因此，一些实施方案可提供将一些实施方案的双链剂施用到受试者，并通过反义效应抑制靶基因的表达或转录产物水平的方法。此外，还可提供通过施用一些实施方案的组合物到受试者，治疗或预防与例如靶基因的增加的表达相关的多种疾病的方法。

实施例

在下文中，将通过实施例和比较实施例更具体地描述一些实施方案，但实施方案不意图被以下实施例所局限。

实施例1

进行展示gamper或mixmer类结构在根据实施方案的双链核酸剂中的应用的体内实验。双链剂的结构和实验的结果在图7-1和7-2中示出。

第一链包含具有gapmer样结构的基于RNA的互补区和是部分硫代磷酸酯化的2’-OMeRNAantagomir的治疗性寡核苷酸。第一链还具有连接在5’末端位作为靶向部分的生育酚基团，以递送双链剂到肝脏。第一链被在图7A和7B中图示地说明。另外，作为对照，相似地制备完全包含2’-OMeRNA核苷酸的第一链。通过用2’-OMeRNA核苷酸代替RNA核苷酸，预计基于RNA的互补区对RNA酶H的切割耐受。

第二链是13-mergapmer类型(图7-1A、7-1C)或mixmer类型(图7-1B)LNA/DNA寡核苷酸。每个核苷酸间位置被硫代磷酸酯化。gapmer具有与第一链序列完全互补的8个碱基的DNA碱基中心区。如图示，Mixmer具有被LNA碱基隔开的3碱基、2碱基和3碱基的DNA延伸(runs)。第二链与小鼠apoBmRNA(NM_009693)互补。

第一和第二链的序列、组成和链长如下所示：

第一链：

(SEQIDNO：1)31merToc-cRNA-G

5′-Toc-u*g*a*AUACCAAUg*c*uacgcauacgcacca*c*c*a-3′

(SEQIDNO：2)31merToc-2′OMeRNA

5′-Toc-u*g*a*auaccaaug*c*uacgcauacgcacca*c*c*a-3′

第二链：

(SEQIDNO：3)13merLNA/DNAgapmer

5′-G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A-3′

(SEQIDNO：4)13merLNA/DNAmixmer

5′-G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3′

大写/下划线：LNA(C＝甲基胞嘧啶LNA)

未大写的：DNA

大写的：RNA

未大写/下划线：2’-0-MeRNA

*：硫代磷酸酯核苷酸间键

还制备范围从20个到31个碱基的RNA寡核苷酸用作RNA印迹分析中的迁移标准物：

(SEQIDNO：5)20mercRNA

5′-GCUACGCAUACGCACCACCA-3′

(SEQIDNO：6)22mercRNA

5′-AUGCUACGCAUACGCACCACCA-3′

(SEQIDNO：7)23mercRNA

5′-AAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3′

(SEQIDNO：8)24mercRNA

5′-CAAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3′

(SEQIDNO：9)25mercRNA

5′-CCAAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3′

(SEQIDNO：10)31mercRNA

5′-UGAAUACCAAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3′

(缩写如上)

还制备了用于RNA印迹分析的地高辛标记的(DIG)DNA探针：

(SEQIDNO：11)28mer3′DIG-DNA

5′-tggtgcgtatgcgtagcagtggtattca-DIG-3′

(缩写如上)

LNA/DNA寡核苷酸由GeneDesign(Osaka，Japan)合成，且cRNA由HokkaidoSystemScience(Sapporo，Japan)合成。DIGDNA探针使用第2代DIG寡核苷酸3’-末端标记试剂盒(DIGOligonucleotide3′-EndLabelingKit，2ndGeneration)(RocheDiagnostics)通过用地高辛ddUTP标记DNA寡核苷酸来制备。

由具有13merLNA/DNAgapmer(图7-1A)或13merLNA/DNAmixmer(图7-1B)的31merToc-cRNA-G、或具有13merLNA/DNAgapmer的31merToc-2’OMeRNA组成的双链剂，通过以下方法制备：将等摩尔的量的每种链在磷酸盐缓冲的盐水(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并然后冷却至并保持在37摄氏度1小时以由此退火核酸链并形成双链核酸剂。退火的核酸储存于4摄氏度或冰上。将双链剂配制为PBS溶液用于体内实验。

治疗性寡核苷酸在小鼠中的释放的体内研究。鼠龄4-5周的雌性野生型Crlj:CD1(ICR)小鼠(OrientalYeast,Tokyo,Japan)在无菌动物设施中以12h光/暗周期来保持，可自由获得食物和水。双链剂以6mg/kg/剂量通过尾静脉注射被分别一次施用到一只小鼠。对照小鼠接受PBS注射。静脉注射后24小时，收获肝脏以用于RNA印迹分析。肝脏的总RNA使用ISOGENII试剂盒(WakoPureChemicals,Osaka,Japan)来提取。

RNA印迹分析。总RNA(30微克)通过在18％聚丙烯酰胺-尿素凝胶上电泳来分离。迁移标准物SEQIDNO:4-9，以及作为单链的第一链被包括在单独的泳道中作为对照。将经电泳的材料转移到Hybond-N⁺膜(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。印迹用3’-DIGDNA探针杂交，并用GeneImages仪可视化。比较gapmer与mixmer的结果(图7-1A对7-1B)在图7-2D中示出。比较具有含可切割的基于RNA的互补区的第一链的双链剂和具有完全2’-O甲基化的RNA链的双链剂(图7-1A对7-1C)的结果在图7-2E中示出。单独的印迹与小鼠U6微小RNA序列杂交作为内部对照(未示出)。

结果。图7-2D中的印迹分析显示，双链剂中的每一个的Toc-cRNA-G第一链被体内切割为较短的长度。与未处理的Toc-cRNA-G对照(泳道M7)相比，显示gapmer双链剂(泳道1)基本上完成Toc-cRNA-G第一链到较短长度的转化。相似地，mixmer双链剂(泳道2)显示到较短长度探针的显著转化。在两种情况下，基于与泳道M1-M5中对照cRNA的迁移距离的对比，第一链都被加工成具有从20个到约26个碱基的寡核苷酸。

图7-2E中的印迹分析显示，尽管Toc-cRNA-G链(具有在基于RNA的互补区中的RNA)(泳道1)被切割成较短的片段，完全2’-O甲基化的第一链(泳道2)没有被切割，且反而迁移与泳道M6和M7的全长31mer对照约相同的距离。

图7-2D的泳道1-2和图7-2E的泳道1而非泳道2中较短的第一链片段的出现说明，双链剂在体内被递送到肝脏，且双链DNA/RNA异源双链体互补区被RNA酶H识别，并且第一链被切割。图7-2D的泳道1-2和图7-2E的泳道1中一些20mer产物的出现说明，切割的第一链的一些进一步的加工可能通过外切核酸酶将寡核苷酸修剪至由硫代磷酸酯键赋予的核酸酶耐受性位置而发生。

实施例2

进行评估根据实施方案的双链核酸剂对微小RNA表达的体内抑制能力的实验。将两种常规的单链反义寡核苷酸对照与双链剂比较。多核苷酸结构在图8中示出。

对照是被称为miravirsen(注册商标)的LNA/DNAmixmerantimir，和包含胆固醇部分的2’-O甲基化的RNAantagomir。后者与LNA/DNAgapmer退火形成在实施例中使用的双链剂。链的序列、组成和链长如下所示：

第一链

(SEQIDNO:12)36merRNA链

5′-a*c*aaacaccauugucacacuc*c*a*UGAAUACCAAU*g*c-3′-chol

第二链

(SEQIDNO:13)13merLNA/DNAgapmer互补链

5′-G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A-3′

单链对照

(SEQIDNO：14)AntimiR(miR122)

5′-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3′

(缩写如上)

为制备双链剂，LNA/DNA互补链和36merRNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并然后冷却至并保持在37摄氏度1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体内实验。小鼠是具有20g到25g体重的鼠龄4到6周的雌性ICR小鼠。使用小鼠的实验都以n＝3来进行。核酸剂通过尾静脉以每只0.75mg/kg的量静脉注射到小鼠。同样，作为阴性对照组，仅被注射PBS(而不是核酸剂)的小鼠也被准备。

注射后72小时，小鼠被灌注PBS，并然后解剖小鼠以提取肝脏。随后，根据方案使用Isogen试剂盒(GeneDesign,Inc.)提取mRNA。根据方案使用SuperScriptIII(Invitrogen,Inc.)合成cDNA。定量RT-PCR通过TaqMan(RocheAppliedBioscienceCorp.)进行。定量RT-PCR中使用的引物是由LifeTechnologiesCorp.基于多种基因编号设计并产生的产物。扩增条件(温度和时间)是在95摄氏度下15秒，在60摄氏度下30秒，和在72摄氏度下1秒(一个循环)，重复40个循环。基于因此获得的定量RT-PCR结果，微小RNA(miR122)的表达的量/微小RNA(SNO234；内部对照基因)的表达的量被分别计算，并且每一组的结果通过t检验被比较和评估。结果在图8底部的图中示出。

结果。如由图8中的结果所示，所有三种核酸试剂相对于阴性对照(仅PBS)显示对miR122的表达的抑制。然而，用根据实施方案的双链剂达到的抑制程度比用单链寡核苷酸达到的更大，并且该差异在统计学上显著。

实施例3

进行展示嵌合双链核酸剂用于微小RNA体内抑制的应用的实验。具体地，不仅对于是本实验中使用的核酸的直接靶的微小RNA122(miR122)的抑制效应，而且对醛缩酶A(ALDOA)和支链酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)mRNA的表达的抑制效应被评估，ALDOA和BCKDK是miR122的下游靶。是ALDOA的表型的总血清胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)值也被评估。抑制miR122的已知的单链核酸剂被用作对照，并且该对照核酸剂被与异源双链体核酸比较，该已知单链核酸被引入所述异源双链体核酸。核酸结构在图9中示出。LNA/DNAmixmerantimiR(miravirsen(注册商标))被用作阳性对照。施用PBS的组被用作阴性对照。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO:15)28merRNA链

5′-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*CGCGAUACCAAU*c*g-3′

第二链

(SEQIDNO:16)13merLNA/DNAgapmer互补链

5′-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3′

单链对照

(SEQIDNO:14)AntimiR(miR122)

5′-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3′

(缩写如上)

双链剂如实施例1和2制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液被加热到95摄氏度5分钟，并随后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体内实验

小鼠是具有20g到25g的体重的4周鼠龄的雌性ICR小鼠。使用小鼠的实验都以n＝3来进行。核酸剂通过尾静脉，静脉注射到小鼠。核酸剂在实验中以每只0.1mg/kg的量被注射至小鼠一次以评估对miR122的抑制效应(图10a)。然后，小鼠在注射后72小时被灌注PBS，并且收集肝脏左叶。核酸剂在实验中以每只0.75mg/kg的量每周三次注射至小鼠以评估ALDOA(图10b)和BCKDK(图10c)，ALDOA和BCKDK是miR122和总血清胆固醇的下游靶(图10c)。然后，在注射时和在注射后168小时收集血液，且肝脏组织也被收集。RNA提取、cDNA合成和定量PCR通过与实施例2相同的方案来进行。通过用U6修正和用GAPDH修正进行评估，U6是用于是直接靶的miRNA(图10a)的内源性对照，GAPDH是ALDOA(图10b)和BCKDK(图10c)的内源性对照。每一组的表达水平如实施例2一样被比较。在对表型的评估中，注射后从0小时到168小时的总血清胆固醇(图10d)和LDL(低密度脂蛋白)(图10e)的减少被测量，并与注射PBS的组比较。为评估对表型的剂量依赖效应，核酸剂以每只0.1、0.75和1.5mg/kg的量每周三次被注射，且如前面所述的一样的评估总血清胆固醇的减少(图10f)。

结果。如图10a中的结果所示，所有三种核酸试剂相对于阴性对照(仅PBS)显示对miR122的表达的抑制。然而，用根据实施方案的双链剂达到的抑制程度比用单链寡核苷酸达到的更大，并且该差异在统计学上显著。如图10b和c所示，与单链核酸相比，双链antimiR显示miR122的下游靶(ALDOA、BCKDK)的表达的统计学上显著的提高。如图10d和10e所示，与单链核酸相比，双链antimiR显示总血清胆固醇和LDL的在统计学上显著的降低。如图10f所示的，双链antimiR显示优于单链antimiR的剂量依赖表型效应。

实施例4

我们进行评估双链核酸剂到其他类型寡核苷酸的应用的实验，所述其他类型寡核苷酸具有其他靶并与靶RNA相互作用。靶RNA是肌萎缩蛋白的前体mRNA，其是杜氏肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy,DMD)的责任基因。实施例4中的寡核苷酸是剪接转换寡核苷酸(SSO)，其诱发肌萎缩蛋白的外显子58跳跃。多核苷酸结构在图11中示出。

对照是单链SSO。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO:17)28merRNA链

5′-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*aGCGAUACCAAU*c*g-3′

第二链

(SEQIDNO:16)13merLNA/DNAgapmer互补链

5′-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3′

单链对照

(SEQIDNO:18)15merSSO

5′-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*a-3′

(缩写如上)

双链剂如实施例1到3来制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并随后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

为实验，构建人类肌萎缩蛋白基因片段稳定表达质粒，并建立包含该构建体的稳定细胞系。肌萎缩蛋白基因片段具有除内含子57外的从外显子57到外显子59的全长序列，内含子57因其长度而为了便利被缩短。通常期望肌萎缩蛋白片段在稳定细胞系中的表达产生包含外显子57、58和59的mRNA。然而，在具有在处理前体mRNA期间引起外显子58的跳跃的能力的剪接转换寡核苷酸的存在下，期望表达的mRNA包含外显子57和59，但缺少外显子58。

在实验中，在反义寡核苷酸(ASO)能够达到细胞核的程度，ASO应能够改变由肌萎缩蛋白基因表达的mRNA产物的剪接，并因此肌萎缩蛋白的三个外显子片段(外显子57、58和59)的量将显示相应的减少。

可以引起外显子58的外显子跳跃的单链反义寡核苷酸被制备并测试。ASO结合到外显子58内的序列。肌萎缩蛋白基因表达质粒的构建。

用于构建的起始质粒是pcDNA5/FRT载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。为生成包含Flag标签的片段，两个寡核苷酸，5’-AGCTTACCATGGATTACAAGGACGACGACGACAAGGGGGTAC-3′(SEQIDNO：19)(包含加下划线的HindIII和KpnI位点)和5’-CCCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAATCCATGGTA-3′(SEQIDNO：20)被一起退火。退火后，将片段克隆进pcDNA5/FRT载体(pcDNA5/FRT-FLAG)的HindIII/KpnI位点。Flag标签包含两个沉默突变，以避免额外的第一蛋氨酸的意外表达。

使用pcDNA3-EGFP载体作为模板，EGFP片段使用正向引物5′-CCCGGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3′(SEQIDNO：21)(包含加下划线的SmaI位点)和反向引物5′-ATAGGGCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3′(SEQIDNO：22)(包含加下划线的ApaI位点)来扩增。循环条件是：94摄氏度2分钟，然后98摄氏度0.5分钟，63摄氏度0.5分钟，68摄氏度0.75分钟，30个循环，及68摄氏度3分钟。PCR反应根据制造商的说明书使用KODFXNEO(TOYOBO，Osaka，Japan)来进行。EGFP片段被插入SmaI/ApaI消化的pcDNA5/FRT-FLAG载体(pcDNA5/FRT-FLAG-EGFP)。

使用pDsRed-Express-N1载体作为模板，EGFP片段使用正向引物5′-ATATGGATCCAACCGGTGTGGCCTCCTCC.GAGGACGTCA-3′(SEQIDNO：23)(包含加下划线的BamHI和AgeI位点)和反向引物5′-CGGTCTACAGGAACAGGTGGTGGC-3′(SEQIDNO：24)来扩增。循环条件是：94摄氏度2分钟，然后98摄氏度0.5分钟，63摄氏度0.5分钟，68摄氏度0.75分钟，35个循环，及68摄氏度3分钟。PCR反应根据制造商的说明书使用KODFXNEO(TOYOBO，Osaka，Japan)来进行。EGFP片段被插入BamHI/SmaI消化的pcDNA5/FRT-FLAG-DsRed载体(pcDNA5/FRT-FLAG-DsRed-EGFP)。

为收集进入细胞核的荧光蛋白，NLS序列(细胞核定位信号)被插入BamHI消化的pcDNA5/FRT-Flag-DsRed-EGFP。NLS序列通过退火两个寡核苷酸来制备，所述两个寡核苷酸是5′-ATGCCC-CAAAAAAAAAACGCAAAGTGGAGGACCCAAAGGTACCAAAG-3′(SEQIDNO：25)和5′-GATCCTTTGGTACCTTTGGGTCCTC-CACTTTGCGTTTTTTTTTTGGGGCATGTAC-3′(SEQIDNO：26)(pcDNA5/FRT-Flag-NLS-DsRed-EGFP)。

为生成人肌萎缩蛋白基因稳定表达质粒，人肌萎缩蛋白基因片段用HepG2基因组通过PCR来获得。包含肌萎缩蛋白基因片段的质粒具有除内含子57之外的从外显子57到外显子59的全长序列。内含子57序列(17683碱基对)对于插入质粒过长，因此内含子57的序列+207到+17486部分通过PCR被缺失，所述PCR使用正向引物5′-AACGGTACCAACGCTGCT-GTTCTTTTTCA-3′(SEQIDNO：27)(包含加下划线的KpnI位点)，反向引物5′-AAATCGTCCATTACAAACACAGCGCTTTCC-3′(SEQIDNO：28)，及正向引物5′-GTGTTTGTAATGGACGATTTCTTAAAGGGTATT-3′(SEQIDNO：29)，反向引物5′-AGACCGGTACTCCTCAGCCTGCTTTCGTA-3′(SEQIDNO:30)(包含加下划线的AgeI位点)。该片段被克隆进KpnI/AgeI消化的pcDNA5/FRT-Flag-NLS-DsRed-EGFP载体(pcDNA5/FRT-Flag-NLS-DMD-外显子57_58_59(短内含子57)-DsRed-EGFP)。

所有构建体通过ABIPRISM310分析仪(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)验证或通过Fasmac(Kanagawa,Japan)测序。

稳定细胞系的建立。Flp-In-293(Invitrogen,Carlsbad,CA)细胞被培养于补充有10％胎牛血清(FBS)(Biowest,Nuaille,France)、2％青霉素链霉素混合溶液(青霉素10,000单位/mL、链霉素10,000微克/mL)(Nacalaitesque,Kyoto,Japan)的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)(Nacalaitesque,Kyoto,Japan)，并用100mg/mL的博来霉素在37摄氏度下选择。pcDNA5/FRT-Flag-Dys57>59di-NLS-DsRed-EGFP和pOG44(Flp重组酶表达质粒)(Invitrogen,Carlsbad,CA)被共转染到Flp-In-293细胞。基于耐受50mg/mL的潮霉素B(Invitrogen,Carlsbad,CA)选择稳定的细胞系。

细胞培养。稳定细胞系被培养于包含10％胎牛血清(FBS)(Biowest,Nuaille,France)和2％青霉素链霉素混合溶液(青霉素10,000单位/mL，链霉素10,000微克/mL)(Nacalaitesque,Kyoto,Japan)的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)(Nacalaitesque,Kyoto,Japan)。

体外实验。在无抗生素的包含血清的培养基里，细胞被平铺到24孔平板内。对于基于脂质的转染，将单链对照和双链剂任一种遵循制造商的说明书与LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)混合，并与细胞在无血清培养基中培养4小时。在RNA提取之前，细胞用PBS洗涤一次并在包含抗生素的完全培养基中培养20小时。遵循制造商的说明书使用Isogen试剂盒(GeneDesign,Inc.)提取mRNA。根据方案使用转录子通用cDNAMaster(TranscriptorUniversalcDNAMaster)(RocheAppliedBioscienceCorp.)合成cDNA。定量RT-PCR通过SYBRGreenRealTimePCRMasterMix(RocheAppliedBioscienceCorp)进行。引物的序列在以下示出。

外显子58跳跃分析引物：

SEQIDNO：315′-AACGGTACCAACGCTGCTGTTCTTTTTCA-3′

SEQIDNO：325′-CTTGGAGCCGTACTGGAACT-3′

GAPDH分析引物：

SEQIDNO：335′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′

SEQIDNO：345′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′

所有引物由HokkaidoSystemScience(Sapporo，Japan)合成。扩增条件(温度和时间)是：在98摄氏度下10秒，在55摄氏度下15秒，及在72摄氏度下15秒(一个循环)，重复35个循环。基于因此获得的定量RT-PCR的结果，外显子跳跃的肌萎缩蛋白的表达的量/3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；内部对照基因)的表达的量被分别计算，并且每一组的结果被与对照组比较并用t检验评估。结果在图12的图中给出。

结果。如图12中的结果示出的，用根据实施方案的双链剂达到的外显子跳跃程度比用单链寡核苷酸达到的程度更大，并且该差异在统计学上显著。

实施例5

我们进行评估双链核酸剂到其他类型反义寡核苷酸的应用的实验，所述其他类型反义寡核苷酸具有其他的靶和化学结构。靶是载脂蛋白B的前体mRNA的内含子。多核苷酸结构在图13中示出。

对照是LNA/DNAgapmer。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO：35)29merRNA链

5′-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*AGCGAUACCAAU*c*g-3′

第二链

(SEQIDNO：16)13merLNA/DNAgapmer互补链

5′-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3′

单链对照

(SEQIDNO：36)16mer内含子gapmer

5′-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*A-3′

(缩写如上)

双链剂如实施例1到3制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并然后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体外实验。Huh-7(人类肝细胞癌细胞系7)细胞在推荐的培养基条件下培养。在无抗生素的包含血清的培养基里，细胞被平铺到24孔平板内。对于基于脂质的转染，将单链对照和双链剂的任一种遵循制造商的说明书与LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)混合，并在无血清培养基中与细胞一起培养4小时。在RNA提取之前，细胞用PBS洗涤一次并在包含抗生素的完全培养基中培养20小时。遵循制造商的说明书使用Isogen试剂盒(GeneDesign,Inc.)提取mRNA。根据方案使用转录子通用cDNAMaster(RocheAppliedBioscienceCorp.)合成cDNA。定量RT-PCR通过TaqMan(RocheAppliedBioscienceCorp.)进行。定量RT-PCR中使用的引物是由LifeTechnologiesCorp.基于多种基因编号设计并生产的产物。扩增条件(温度和时间)是：在95摄氏度下15秒，在60摄氏度下30秒，及在72摄氏度下1秒(一个循环)，重复40个循环。基于因此获得的定量RT-PCR的结果，ApoB的表达的量/3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；内部对照基因)的表达的量被分别计算，并且每一组的结果被与对照组比较并用t检验评估。结果在图14的图中给出。

结果。如图14中的结果示出的，相对于阴性对照(仅Lipofectamine)，单链内含子gapmer不显示对ApoBmRNA表达的抑制。然而，根据实施方案的双链剂达到了对ApoBmRNA的显著抑制。

实施例6

我们进行评估双链核酸剂的应用的实验，所述双链核酸剂的第二链由13merLNA/DNAGapmer变为13merLNA/DNAMixmer。靶与实施例2-3相同，为微小RNA122。多核苷酸结构在图15中示出。

对照是2’-O甲基化的RNAantagomir。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO:37)36merRNA链

5′-a*c*aaacaccauugucacacuc*c*a*UGAAUACCAAU*g*c-3′

第二链

(SEQIDNO:4)13merLNA/DNAmixmer互补链

5′-G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3′

单链对照

(SEQIDNO:38)23merantagomir(miR122)

5′-a*c*aaacaccauugucacacuc*c*a-3′

(缩写如上)

双链剂如实施例1到5制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并随后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体外实验。Huh-7(人类肝细胞癌细胞系7)细胞在推荐的培养基条件下培养。在无抗生素的包含血清的培养基里，细胞被平铺到24孔平板内。对于基于脂质的转染，将单链对照和双链剂的任一种遵循制造商的说明书与Lipofectamine2000(Invitrogen)混合，并在无血清培养基中与细胞一起培养4小时。在RNA提取之前，细胞用PBS洗涤一次并在包含抗生素的完全培养基中培养20小时。遵循制造商的说明书使用Isogen试剂盒(GeneDesign,Inc.)提取mRNA。根据方案使用转录子通用cDNAMaster(RocheAppliedBioscienceCorp.)合成cDNA。定量RT-PCR通过TaqMan(RocheAppliedBioscienceCorp.)进行。定量RT-PCR中使用的引物是由LifeTechnologiesCorp.基于多种基因编号设计并生产的产物。扩增条件(温度和时间)是：在95摄氏度下15秒，在60摄氏度下30秒，及在72摄氏度下1秒(一个循环)，重复40个循环。基于因此获得的定量RT-PCR的结果，微小RNA(miR122)的表达的量/微小RNA(U6；内部对照基因)的表达的量被分别计算，并且每一组的结果被比较并用t检验评估。结果在图16的图中给出。

结果。相对于阴性对照(仅Lipofectamine)，两种核酸试剂都显示对miR122表达的抑制。然而，用根据实施方案的双链剂达到的抑制程度比用单链寡核苷酸达到的更大，并且该差异在统计学上显著。

实施例7

我们进行评估另一种双链核酸剂的应用的实验，所述双链核酸剂的第二链由13merLNA/DNAGapmer变为13merLNA/DNAMixmer。靶与实施例4相同，为肌萎缩蛋白的前体mRNA。实施例7中的寡核苷酸是剪接转换寡核苷酸(SSO)，其诱发肌萎缩蛋白的外显子58跳跃。多核苷酸的结构在图17中示出。

对照是单链SSO。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO:17)28merRNA链

5′-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*aGCGAUACCAAU*c*g-3′

第二链

(SEQIDNO:4)13merLNA/DNAmixmer互补链

5′-G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3′，

单链对照

(SEQIDNO:18)15merSSO

5′-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*a-3′

(缩写如上)

双链剂如实施例1到6制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并然后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体外实验。实验条件与实施例4相同。

结果。如图18中的结果所示，用根据实施方案的双链剂达到的外显子跳跃程度比用单链寡核苷酸达到的更大，并且该差异在统计学上显著。

实施例8

我们进行评估另一种双链核酸剂的应用的实验，所述双链核酸剂的第二链由13merLNA/DNAGapmer变为13merLNA/DNAMixmer。靶与实施例5相同，为载脂蛋白B的前体mRNA的内含子。多核苷酸的结构在图19中示出。

对照是LNA/DNAgapmer。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO:35)29merRNA链

5′-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*AGCGAUACCAAU*c*g-3′

第二链

(SEQIDNO:4)13merLNA/DNAmixmer互补链

5′-G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3′

单链对照

(SEQIDNO:36)16mer内含子gapmer

5′-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*A-3′

(缩写如上)

双链剂如实施例1到3制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并随后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体外实验。实验条件与实施例5相同。

结果。如图20中的结果所示，相对于阴性对照(仅Lipofectamine)，单链内含子gapmer不显示对ApoBmRNA表达的抑制。然而，根据实施方案的双链剂以剂量依赖的方式达到了对ApoBmRNA的显著抑制。

实施例9

我们进行评估双链核酸剂的应用的实验，所述双链核酸剂的核酸剂的位置由RNA链的5’末端变为3’末端。靶与实施例2-3相同，为微小RNA122。多核苷酸的结构在图21中示出。

对照是LNA/DNAmixmerantimiR122(miravirsen(注册商标))。链的序列、组成和链长如下：

第一链

(SEQIDNO:15)28merRNA链-5'

5′-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*CGCGAUACCAAU*c*g-3′

(SEQIDNO:39)28merRNA链-3'

5′-g*c*g*AUACCAAUCGC*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3′

第二链

(SEQIDNO:16)13merLNA/DNAmixmer互补链

5′-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3′

单链对照

(SEQIDNO:14)23merAntimiR(miR122)

5′-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3′(缩写如上)

双链剂如实施例1到5制备。即，LNA/DNA互补链和RNA链以等摩尔的量混合，溶液在95摄氏度下被加热5分钟，并然后冷却至并保持在37摄氏度下1小时以由此核酸链退火并形成双链核酸剂。退火的核酸被储存在4摄氏度或冰上。

体外实验。

Huh-7(人类肝细胞癌细胞系7)细胞在推荐的培养基条件下培养。在无抗生素的包含血清的培养基里，细胞被平铺到24孔平板内。对于基于脂质的转染，将单链对照和双链剂的任一种遵循制造商的说明书与LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)混合，并在无血清培养基中与细胞一起培养4小时。在RNA提取之前，细胞用PBS洗涤一次并在包含抗生素的完全培养基中培养20小时。遵循制造商的说明书使用Isogen试剂盒(GeneDesign,Inc.)提取微小RNA。根据方案使用转录子通用cDNAMaster(RocheAppliedBioscienceCorp.)合成cDNA。定量RT-PCR通过TaqMan(RocheAppliedBioscienceCorp.)进行。定量RT-PCR中使用的引物是由LifeTechnologiesCorp.基于多种基因编号设计并生产的产物。扩增条件(温度和时间)是：在95摄氏度下15秒，在60摄氏度下30秒，及在72摄氏度下1秒(一个循环)，重复40个循环。基于因此获得的定量RT-PCR的结果，微小RNA(miR122)的表达的量/微小RNA(U6；内部对照基因)的表达的量被分别计算，并且每一组的结果被比较并用t检验评估。结果在图22的图中给出。

结果。相对于阴性对照(仅Lipofectamine)和单链antimiR，两种双链antimiR-5’和antimiR-3’都显示对miR122表达的抑制。然而，用双链antimiR-3’达到的抑制程度少于双链antimiR-5’达到的。

结果

如图22中的结果所示，相比于阴性对照(仅PBS)，所有三种核酸试剂都显示对miR122表达的抑制。然而，双链antimiR-5’达到的抑制程度多于双链antimiR-3’达到的，并且其差异在统计学上显著。

序列表独立文本

1-20、35-39合成序列

21-34引物

Claims

1.一种双链核酸剂，所述双链核酸剂包含退火到第二核酸链的第一核酸链，其中：

所述第一核酸链包含(i)第一RNA区，所述第一RNA区具有当所述第一核酸链与所述第二核酸链杂交时可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸，(ii)治疗性寡核苷酸区，其中在所述治疗性寡核苷酸区的3’末端和5’末端的至少一个核苷酸间键比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，及(iii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第一核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的所述第一RNA区杂交，并可所述第一核酸链中的所述至少2个连续的RNA核苷酸被RNA酶H识别，和(ii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第二核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；且

所述第一核酸链的所述治疗性寡核苷酸区不能与所述第二核酸链杂交。

2.根据权利要求1所述的双链核酸剂，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链包含选自RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的核苷酸。

3.根据权利要求1所述的双链核酸剂，其中所述第一核酸链包含选自DNA核苷酸、RNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的核苷酸，且所述第二核酸链包含选自DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的核苷酸。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的双链核酸剂，其中所述治疗性寡核苷酸区包含选自反义寡核苷酸、antagomir寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、单链siRNA寡核苷酸、双链siRNA、微小RNA、前体微小RNA和适配体的寡核苷酸。

5.根据权利要求4所述的双链核酸剂，其中所述antagomir寡核苷酸是mixmer、包括核苷酸或核苷酸类似物的一种类型、或是gapmer。

6.根据权利要求5所述的双链核酸剂，其中所述antagomir寡核苷酸包含选自2’-OMeRNA、MOE、CET、ENA、LNA和AmNA的至少一种核苷酸，且至少一个核苷酸间键任选地被硫代磷酸酯化。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的双链核酸剂，其中所述第二核酸链是gapmer或mixmer。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的双链核酸剂，其中所述双链核酸剂还包含靶向部分，所述靶向部分选自脂质、糖、肽和蛋白，并与所述第二核酸链的3’末端核苷酸或5’末端核苷酸连接，或与所述第一核酸链的3’末端核苷酸或5’末端核苷酸连接。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的双链核酸剂，其中所述第一核酸链包含选自修饰的RNA核苷酸和核苷酸类似物，位于可被RNA酶H识别的所述至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’的一个或更多个核苷酸。

10.根据权利要求9所述的双链核酸剂，其中所述位于可被RNA酶H识别的所述至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’的一个或更多个核苷酸独立地选自LNA核苷酸、BNA核苷酸、2’-O-MeRNA核苷酸和2’-O-甲氧基乙基RNA核苷酸。

11.一种双链核酸剂，所述双链核酸剂包含退火到第二核酸链的第一核酸链，其中：

所述第一核酸链包含(i)第一RNA区，所述第一RNA区具有当所述第一核酸链与所述第二核酸链杂交时可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸，(ii)一个或更多个核苷酸，所述一个或更多个核苷酸选自修饰的RNA核苷酸和核苷酸类似物，位于被RNA酶H识别的所述至少2个连续的RNA核苷酸的5’和3’，(iii)治疗性寡核苷酸区，所述治疗性寡核苷酸区在3’末端和5’末端包含选自修饰的RNA核苷酸和核苷酸类似物且独立地任选地被硫代磷酸酯化的一个或更多个核苷酸，(iv)靶向部分，所述靶向部分选自脂质、肽和蛋白，连接到3’末端核苷酸或5’末端核苷酸，和(v)所述第一核酸链中核苷酸的总数为从12到100；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的第一RNA区杂交，并可促进所述第一核酸链中的所述至少2个连续的RNA核苷酸被RNA酶H识别，和(ii)一个或更多个核苷酸，所述一个或更多个核苷酸选自修饰的DNA核苷酸和核苷酸类似物，位于所述第一DNA区的5’和3’且独立地任选地被硫代磷酸酯化；且

12.一种双链核酸剂，所述双链核酸剂包含退火到第二核酸链的第一核酸链，其中：

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的所述第一PNA区杂交，和(ii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第二核酸链的3’末端和5’末端上，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶；且

13.一种双链核酸剂，所述双链核酸剂包含退火到第二核酸链的第一核酸链，其中：

所述第一核酸链包含(i)第一RNA区，所述第一RNA区具有当所述第一核酸链与所述第二核酸链杂交时可被RNA酶H识别的至少2个连续的RNA核苷酸，(ii)治疗性寡核苷酸区，其中在所述治疗性寡核苷酸区的3’末端和5’末端的至少一个核苷酸间键比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，(iii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第一核酸链的3’末端和5’末端上，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，和(iv)所述第一核酸链中核苷酸的总数为从12到100；

所述第二核酸链包含(i)第一DNA区，所述第一DNA区与所述第一核酸链的第一RNA区杂交，并可促进所述第一核酸链中的至少2个连续的RNA核苷酸被RNA酶H识别，(ii)至少一个核苷酸间键，所述至少一个核苷酸间键在所述第二核酸链的3’末端和5’末端，比天然核苷酸间键更耐受核酸酶，和(iii)所述第二核酸链中核苷酸的总数为至少8；且

所述第一核酸链的所述治疗性寡核苷酸区在生理温度下在哺乳动物细胞内不能与所述第二核酸链杂交。

14.一种递送治疗性寡核苷酸到细胞的方法，所述方法包括：

使组合物与所述细胞接触，所述组合物包含根据权利要求1至13中的任一项所述的双链核酸剂。