CN105254760A - 一株分泌抗wt1蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株分泌抗WT1蛋白的单克隆抗体及其应用。WT1蛋白是Wilms本发明通过对WT1蛋白分析后制备重组可溶蛋白并经动物免疫和筛选获得了一株可分泌IgG1亚型的单克隆抗体的细胞株60660-2C10，其亲和常数为3.84×10⁹。免疫印记（Western？blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的WT1蛋白以及表达WT1蛋白的肾母细胞瘤组织。该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western？Blot）方式检测细胞中WT1蛋白的表达水平，可以用于肾母细胞瘤、卵巢癌和乳腺癌的免疫学诊断和分级。

Description

一株分泌抗WT1蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种可以识别人WT1蛋白质分子的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原WT1分子的单克隆抗体，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（WesternBlot）方式检测细胞中WT1蛋白的表达水平，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

肾母细胞瘤是最常见的腹部恶性肿瘤，其发病率在小儿腹部肿瘤中占首位。肿瘤主要发生在生后最初5年内，特别多见于2～4岁。Wilms肿瘤基因(Wilms'tumorgene, wt1 )是与Wilms肿瘤的发生、发展有关的基因，最初发现，其等位基因的功能缺失可导致肾母细胞瘤(Wilmstumor)。WT1蛋白可以抑制胰岛素样生长因子Ⅱ、集落刺激因子、Pax2等多种生长因子及受体基因的转录，最先被认为是一种肿瘤抑制基因。近来认为WT1还具有激活基因转录的功能，有类癌基因样活性，在肿瘤的发生中起一定作用。并且发现WT1在白血病细胞中高度表达并与白血病的发生、发展及预后有关。发现在急性髓系白血病（AML）中序列特异性的转录因子WT1以一种与TET2、IDH1和IDH2相互排斥的方式发生了突变。他们证实通常情况下，WT1可与TET2发生物理互作并将TET2招募至靶基因处激活它们表达。TET2以一种依赖于WT1的形式抑制了白血病细胞增殖及克隆形成。而多个源自AML的TET2突变则破坏了WT1与TET2之间的互作。对494例肿瘤样本的研究发现，该蛋白的表达与胃癌、前列腺癌及白血病的发生有关。在富含血管的乳腺癌组织和卵巢癌组织以及内皮细胞中的表达情况及可能的用途也有研究。WT1可以与P53、EGFR等标志物一同作为一种卵巢癌诊断和分型的工具。

对于肾母细胞瘤的诊断，过去以影像学方法为主，但部分病例肾功能减退或完全不显影，需应用大剂量造影剂造影。此外结合利用超声方法检查将有助于鉴别肾积水与肿瘤。而CT检查有助于确定肿瘤侵染的范围。在与神经母细胞瘤等肿瘤鉴别分析时，可进行骨髓穿刺，尿VMA、HVA定量，血清乳酸脱氢酶（LDH），甲胎蛋白（AFP）定量，神经元特异性烯醇化酶（NSE）定量等检查。获得高灵敏度和高特异性的WT1抗体是免疫诊断方法的基础，目前可以通过商业途径获得针对WT1的多克隆抗体或者单克隆抗体，部分抗体的制备采用的是WT1蛋白的C末端多肽作为免疫原，部分采用的是截取的蛋白片段。目前使用较多的一株抗体为6F-H2（DAKO），该抗体由重组蛋白作为抗原免疫小鼠获得，其所识别的抗原表位位于蛋白的N端的1-84位区域。在对多种肿瘤的诊断价值研究中，发现该单克隆抗体与多克隆抗体（c19，同为DAKO产品）相比，对于肾母细胞瘤的判别有所不同，6F-H2的阳性率为36%,而多单克隆抗体为47%，阳性率的差别反应了单克隆抗体识别表位的专一性，但也限制了因亲合力不同导致的敏感度下降。

针对以上研究现状，我们将发现适宜IHC诊断抗体开发的WT1重组抗原制备和WT1抗体筛选方法，并通过组织芯片技术收集大样本的病例，进行免疫组织化学检测，探明WT-1抗体在肾母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌诊断和分型、分级中的应用价值。

发明内容

本发明是提供一株分泌抗WT1蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明获得的杂交瘤（60660-2C10）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Westernblotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明对在肾母细胞瘤和卵巢癌组织中细胞核表达的WT1分子，按照公布的序列进行分析，依据在其氨基酸的组成和性质、抗原性、表面可及性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端和C端分别融合有GST蛋白和组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-30a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组WT1蛋白筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，ProteinA/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1亚型的单克隆抗体，亲和常数为3.84×10⁹。免疫印记（Westernblotting）实验显示该抗体能特异识别重组的WT1蛋白以及表达WT1蛋白肾母细胞瘤组织。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系60660-2C10分泌。所述的小鼠杂交瘤细胞系60660-2C10，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京是朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.10400。

其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组WT1抗原。该重组抗原由可促使分泌表达的信号肽序列、优选的具有抗原性的WT1蛋白1-183位氨基酸区域及用于重组蛋白纯化的组氨酸标签组成。

所述的单克隆抗体，是由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列编码，其中包括WT1蛋白第1位至第181位氨基酸序列的片段，在大肠杆菌中表达，且经镍柱亲和纯化而来。获得杂交瘤细胞株所分泌抗体为一种鼠源IgG1亚型单克隆抗体。

该重组蛋白由可促使分泌表达的信号肽序列、优选的具有抗原性的WT1蛋白1-183位氨基酸区域及用于重组蛋白纯化的组氨酸标签组成。

所述的单克隆抗体其重链可变区DNA序列为SEQIDNo.2，其编码的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.3。

所述的单克隆抗体，可识别重组蛋白和肿瘤细胞表面的WT1分子。

所述的单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的WT1表达情况。

所述的单克隆抗体，可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法。

所述的单克隆抗体，在免疫组化病理诊断剂上的应用。

所述的单克隆抗体在制备肾母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的诊断剂上的应用。

本发明的优点及有益效果：

（1）本发明获得的杂交瘤（60660-2C10）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白WT1蛋白分子和高表达WT1的细胞系，能够检测高表达WT1蛋白的肾母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤组织。

（2）本发明获得的杂交瘤（60660-2C10）分泌产生的单克隆抗体为一种IgG1类抗体，与WT1蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3）本发明获得的杂交瘤（60660-2C10）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Westernblotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化抗体WT49的对比实验中，本发明细胞株制备的抗体在卵巢浆液性肿瘤、卵巢子宫内膜样癌、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤、恶性间皮瘤等各种肿瘤类型的诊断和鉴别诊断中表达同对照，且对于个别肿瘤类型，如卵巢浆液性癌的诊断敏感性稍高于对照，此外在各种正常组织的表达都同对照类似。因此，本发明的WT1单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1pET30a-GST-WT1的表达和纯化；电泳条件：12%SDS-PAGE凝胶电泳。离心收集菌体后超声破碎细胞，经镍柱纯化。M：蛋白分子量标记；1：15mM咪唑洗脱产物；2：60mM咪唑洗脱产物；3：300mM咪唑洗脱产物。图1所示，300mM咪唑洗脱产物条带均一，蛋白纯度高。

图2抗体的识别特性和实际应用效果；应用纯化的60660-2C10单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出WT1重组蛋白，WT1重组蛋白上样10微升，His-Tag一抗1:2000稀释，二抗1:5000稀释，目标蛋白为45kDa左右。图2所示，纯化的60660-2C10单克隆抗体能够特异识别WT1重组蛋白，特异性好，敏感性高。

图3WT1单克隆抗体在肾母细胞瘤中免疫组织化学检测结果；应用纯化的WT1抗体60660-2C10同商品化抗体上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体WT49，右为纯化抗体60660-2C10。图3所示，抗体60660-2C10在肾母细胞瘤上的染色结果同对照，且染色强度稍高于对照。

图4WT1单克隆抗体在卵巢浆液性癌中免疫组织化学检测结果；应用纯化的WT1抗体60660-2C10同商品化抗体上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体WT49，右为纯化抗体60660-2C10。图4所示，抗体60660-2C10在卵巢浆液性癌上的染色结果同对照，且染色强度稍高于对照。

图5WT1单克隆抗体在正常子宫内膜中免疫组织化学检测结果；应用纯化的WT1抗体60660-2C10同商品化抗体上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体WT49，右为纯化抗体60660-2C10。图5所示，抗体60660-2C10在正常子宫上的染色结果同对照，且染色强度稍高于对照。

图6WT1单克隆抗体在正常睾丸中免疫组织化学检测结果；应用纯化的WT1抗体60660-2C10同商品化抗体上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体WT49，右为纯化抗体60660-2C10。图6所示，抗体60660-2C10在正常睾丸上的染色结果同对照，且染色强度稍高于对照。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1重组WT1蛋白片段的制备

i.WT1重组蛋白按照Uniprot数据库中登录号为P19544.2的蛋白质序列及对应的Genbank数据库中登录号为NM_000378.4的DNA序列，合成长度为577bp的WT1基因片段（南京金斯瑞生物科技有限公司），在基因5’和3’端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点和保护碱基便于进行内切酶消化。pET30a-GST载体购自Merck公司，载体也用EcoRI和XhoI进行酶切，电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21codonplus（Novogen，Merck），挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。

蛋白表达和纯化

基因克隆重组蛋白表达

a）酶切反应如下进行，内切酶均购自TaKaRa公司。

基因片段双酶切：

XhoⅠ2μL

EcoRⅠ2μL

Buffer（10×K）8μL

质粒10μL

双蒸水补至80μL

37℃消化3h。

载体质粒双酶切：

XhoⅠ2μL

EcoRⅠ2μL

Buffer（10×K）8μL

pET30a-GST/pET30a5μL

双蒸水补至80μL

37℃消化3h。

酶切产物电泳检测，切胶回收。

b)连接转化

连接：

1μL载体，2μL酶切回收产物，3μl连接酶混合物（TaKaRa，DNAligationKitVer2.0），混匀，室温反应30min以上。

转化：

1）取出-80℃保存的感受态细胞（BL21（codonplus），放在冰上缓慢解冻。

2）将感受态细胞加入连接产物中混匀，冰上放置30min。

3）42℃热激90s。

4）冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基。

5）37℃培养45min。

6）5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μL，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板。

7）晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

c)小量表达

（1）从转化的平板挑单克隆到1.5mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养。

（2）培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5mM）诱导，37℃，200rpm培养2h。

（3）取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的2×loadingbuffer，100℃煮5min，电泳检测。

d)测序鉴定：单克隆菌液进行测序鉴定

测序鉴定后，挑选序列完全正确的pET30a-GST-WT1克隆进行大量表达。

e)大量表达

（1）挑选测序正确的菌株，接1-2μL活化的菌液到5mlLB液体培养基中，37℃，200rpm，培养。

（2）将培养的菌液转接到500mlLB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5mM）诱导4h。

（3）大量收菌：用400ml大离心筒，6000rpm，离心5min。弃上清。

(4)超声破菌：沉淀用20-30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声。

(5)电泳确定表达形式：取100μL菌液，设置超声功率500W，超声30个循环，每个循环超声10s，间隔15s，超声产物经12000rpm离心10min，取50μL上清至另一离心管，上清去除干净后沉淀用50μL10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50μL2×loadingbuffer，100℃煮5min，电泳。

f）可溶重组蛋白的纯化：

（1）使用终浓度为0.5M样品缓冲液将待纯化的样品稀释上柱。

（2）上样结束后，用含0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液洗柱。

（3）分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM咪唑的10mMTris-HCl（pH8.0）（含0.5M氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳分析。BCA法测定所获得重组GST-WT1蛋白的浓度。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的可溶性重组蛋白约500μg（0.5mg/ml）用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，重组蛋白使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（ATCC）以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500（Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM（Sigma公司），混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT（Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5%CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5%CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1%HT（Sigma公司）的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养，液氮冷冻保存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTraprProteinAFF（GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mMPBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5μg/ml,每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05%Tween的PBS（PBS-T）洗3次，每孔加入200μL封闭液（含2%BSA和3%蔗糖的PBS），37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ,λ）抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA）抗体（SouthernBiotech公司）0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15%ABTS（SouthernBiotech公司）和0.03%H₂O₂的柠檬酸缓冲液（pH4.0）进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组WT1蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μL封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μL含0.1%TMB（Sigma公司）和0.03%H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μL0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为3.84×10⁹。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择重组的GST融合WT1蛋白蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种重组蛋白上样10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体60660-2C10（约1mg/ml，按1：1000稀释）4℃孵育过夜。用TBS-T溶液洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBS-T洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDocMP多色荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像数据的采集。

实施例4.组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在56～58℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内1h，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂在凉水中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二．IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（动物非免疫血清）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

三．数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表160660-2C10同商业化抗体WT49在各肿瘤的表达差异

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福州迈新生物技术开发有限公司

<120>一株分泌抗WT1蛋白的单克隆抗体及其应用

<130>3

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>577

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cctgaattcggcggtggcggcagtatgggctccgacgtgcgggacctgaacgcgctgctg60

cccgccgtcccctccctgggtggcggcggcggctgtgccctgcctgtgagcggcgcggcg120

cagtgggcgccggtgctggactttgcgcccccgggcgcttcggcttacgggtcgttgggc180

ggccccgcgccgccaccggctccgccgccacccccgccgccgccgcctcactccttcatc240

aaacaggagccgagctggggcggcgcggagccgcacgaggagcagtgcctgagcgccttc300

actgtccacttttccggccagttcactggcacagccggagcctgtcgctacgggcccttc360

ggtcctcctccgcccagccaggcgtcatccggccaggccaggatgtttcctaacgcgccc420

tacctgcccagctgcctcgagagccagcccgctattcgcaatcagggttacagcacggtc480

accttcgacgggacgcccagctacggtcacacgccctcgcaccatgcggcgcagttcccc540

aaccactcattcaagcatgaggatcccctcgagcaag577

<210>2

<211>363

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caggttcagctgcaggagtctggggctgagctggcaagacctggggcttcagtgaagttg60

tcctgcaagacttctggctacacttttactaattactggatgcagtgggtaaaacagagg120

cctggacaggggctggaatggattggggccgtttatcccggagatggtgatactaaatac180

agtcagaagttcaagggcaaggccacattgactgcagataaatcctccagcacagcctac240

atacaactcagcagcttggaatctgaggactctgcggtctatttctgtgcagaaggtgcc300

tttgtttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccaag360

ctt363

<210>3

<211>121

<212>PRT

<213>氨基酸序列

<400>3

GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAla

151015

SerValLysLeuSerCysLysThrSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr

202530

TrpMetGlnTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle

354045

GlyAlaValTyrProGlyAspGlyAspThrLysTyrSerGlnLysPhe

505560

LysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr

65707580

IleGlnLeuSerSerLeuGluSerGluAspSerAlaValTyrPheCys

859095

AlaGluGlyAlaPheValTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrVal

100105110

SerAlaAlaLysThrThrProLysLeu

115120

Claims (8)

1.一种单克隆抗体，其特征在于：由小鼠杂交瘤细胞系60660-2C10分泌；所述的小鼠杂交瘤细胞系60660-2C10，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo.10400。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组WT1抗原。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，该重组抗原由可促使分泌表达的信号肽序列、优选的具有抗原性的WT1蛋白1-183位氨基酸区域及用于重组蛋白纯化的组氨酸标签组成。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其重链可变区DNA序列为SEQIDNo.2，其编码的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.3。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其识别重组WT1和肿瘤细胞表面的WT1分子。

7.如权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征在于：其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的WT1表达情况。

8.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。