CN105237631B - 一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了本发明公开了一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗寒相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的与植物抗寒性相关的蛋白极其编码基因Lc3919受低温诱导，其转基因植物具有较强的抗寒能力，实验显示，经‑8℃过夜寒冷胁迫后野生型拟南芥植株存活率仅为23.33％，而转Lc3919基因植株的存活率则可提高为46.29％，是野生型拟南芥存活率的2倍。由此可见Lc3919基因可作为植物抗寒基因工程的候选基因，用来改良植物的抗寒能力。

Description

一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

春、秋、冬季节，寒冷地区的植物经常处于零度以下的环境中，从而需要一系列分子和生理上的适应，以减轻冻害对自身造成的损伤。面对全球气温升高导致的暖冬和极端恶劣天气的频繁交替出现，全球每年因低温冻害对农作物造成的损失高达数千亿元。因此，加强植物特别是在农业、畜牧业等方面有重要利用价值的植物(如农作物、牧草等)的抗寒基因挖掘，并利用转基因技术将优质的抗寒基因资源用于改良重要农作物与畜牧草的抗寒能力，是当前我国及世界农业与畜牧业所正在面对的重大问题与挑战。

植物一般能耐零下短时低温影响的特性称为抗寒性，这一特性是植物在漫长的演化过程中对逆境环境不断适应的结果。植物的耐寒性涉及复杂的分子机制与生理生化过程，其中前者主要包括了ABA依赖、ABA不依赖共2种途径，后者则包括膜系统(质膜的“膜质相变”)、抗氧化系统(SOD,POD,CAT等)、细胞渗透调节物质(可溶性糖、脯氨酸等)和植物生长调节物质(ABA，GA等)等多方面的适应过程。尽管多年来人们对植物响应低温胁迫的过程机制进行大量研究，但由于植物本身应对外界环境变化的响应机制十分复杂，使得植物在响应低温方面的许多重要问题仍需进一步探索。同时，由于植物在抗逆机制方面存在很多相互交叉的途径，其复杂性使得利用传统杂交育种方法很难得到抗寒性特异增强的品种。此外，对于优质抗寒基因的筛选获得也成为阻碍当前植物耐低温基因工程大规模应用的重要因素。

近年，随着高通量测序技术的快速发展与广泛应用，人们开始不断利用高通量测序技术对特定胁迫处理的植物材料进行测序分析，以得到与特定胁迫处理密切相关的差异表达基因，从而为发现胁迫应答途径中的新基因开拓了新的途径。随着对耐低温新基因的持续发掘和进一步的功能验证，人们对于植物耐寒机制的了解得以拓展。随着现代基因工程技术的持续进步，利用转基因技术改良植物的抗寒性，对于维护未来农业与畜牧业的高产稳产和可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗寒性相关的蛋白及其编码基因和应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为Lc3919，来源于羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列1由198个氨基酸残基组成。

为了便于Lc3919蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述Lc3919蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Lc3919蛋白的基因(命名为Lc3919)；所述Lc3919基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码所述Lc3919蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述Lc3919蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由967个核苷酸组成，第101-697位为编码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述Lc3919基因转录的启动子可为35S启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体可为如下两种中的任一种：

(1)在pMDC45载体的重组位点attR1和attR2间插入所述Lc3919基因得到的重组质粒。

(2)在pK7WG2D载体的重组位点attR1和attR2间插入所述Lc3919基因得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述Lc3919基因表达的启动子，所述Lc3919基因，以及转录终止序列组成。

所述Lc3919蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下(a1)或(a2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(a1)调控植物的抗寒性；

(a2)选育抗寒性提高的植物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植株抗寒性具体为提高植物的抗寒性。

所述选育抗寒性提高的植物品种的方法，具体可包括如下步骤：将所述Lc3919蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交，从杂交后代中获得抗寒性高于亲本的植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗寒性提高的转基因植物的方法。

该方法包括将编码所述Lc3919蛋白的基因导入目的植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗寒性提高。

所述Lc3919蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述Lc3919蛋白的基因(即Lc3919基因)是所述基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码所述Lc3919蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述Lc3919蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述Lc3919基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。

在本发明中，以上的所述抗寒体现为抗-8℃胁迫处理12小时。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)。

扩增所述Lc3919基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，所述引物对具体为如下：

5’-ATCCTTGCTCCAGAGTCCAGATAAT-3’；

5’-TTGAGATAGTTCACCACTG-3’。

本发明所提供的Lc3919可以调控植物抗寒冷胁迫能力，受低温胁迫诱导，可以参与羊草对低温胁迫的响应，提高植物的抗冷，Lc3919及其编码基因对于培育抗寒性提高的羊草及其他植物新品种具有重要实用价性。实验显示，经-8℃过夜寒冷胁迫后野生型拟南芥植株存活率仅为20％左右，而转Lc3919基因植株的存活率则可提高为40％左右，是野生型拟南芥存活率的2倍。可见，本发明所提供的Lc3919可用于农作物与重要畜牧草所需的抗寒新品种的培育与鉴定，具有较高的应用价值。本发明在农业、畜牧业及绿色清洁能源等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为羊草总RNA的电泳图谱。泳道1-泳道3为三个重复，每个泳道中的两个条带从上到下依次为28S RNA和18S RNA。

图2为Lc3919基因的5’RACE PCR扩增产物电泳图。其中，泳道M为Trans2K PlusDNA Marker DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为5’RACE PCR扩增产物。

图3为Lc3919基因的3’RACE PCR扩增产物电泳图。其中，泳道M为Trans2K PlusDNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为3’RACE PCR扩增产物。

图4为Lc3919基因全长cDNA的PCR扩增结果。其中，泳道M为Trans2K Plus DNAMarker(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为PCR扩增产物。

图5为Lc3919基因基因组序列的PCR扩增结果。其中，泳道M为Plus IIDNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为基因组序列扩增产物。

图6为Lc3919基因在低温胁迫(4℃)条件下的相对表达量分析。其中，将0h时Lc3919基因的表达量设定为1。

图7为Lc3919基因在不同组织中的表达量分析。其中，将穗中Lc3919基因的表达量设定为1。

图8为转入pMDC45空载体的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。

图9为转入重组表达载体pMDC45-Lc3919的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。

图10为含有重组表达载体pK7WG2D-Lc3919的菌液的PCR鉴定结果。其中，泳道M为Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；泳道1为pK7WG2D-Lc3919质粒条带。

图11为重组表达载体pK7WG2D-Lc3919转化农杆菌的PCR鉴定结果。其中，泳道1-3为三个重复；泳道M为Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)。

图12为转Lc3919基因拟南芥植物基因组PCR检测结果。其中，泳道1-10表示不同的Col-0/pK7WG2D-Lc3919株系，泳道Ck表示未转基因的野生型拟南芥植株对照，泳道M为Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)。

图13为T3代转Lc3919基因拟南芥的抗寒性检测结果。其中，a为野生型(WT)与转Lc3919基因拟南芥株系(7-6、12-2和16-6)未进行处理前生长状态；b为野生型与转Lc3919基因拟南芥株系处理后恢复7-10d后生长状态。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、羊草抗寒相关基因Lc3919全长cDNA序列及基因组序列的获得

一、羊草抗寒相关基因Lc3919的5’端序列的克隆

1、植物材料处理及总RNA的提取

以羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)品种中科2号(记载于“XX Li,SL Hou,Q Gao,et al.LcSAIN1,a novel salt-induced gene from sheepgrass,confers saltstress tolerance in transgenic Arabidopsis and rice.Plant and CellPhysiology,2013,54(7),1172-1185”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得)幼苗为材料，低温胁迫(4℃)处理12小时后提取总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、羊草抗寒相关基因Lc3919的5’端序列的克隆

以步骤1提取的经寒胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的5’RACE试剂盒(产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成5’端cDNA模板。反应体系(10μl)：1μl RNA，1μl5'-CDS primer A，1μl SMART II A oligo，1μl DTT(20mM)，1μldNTP Mix(10mM)，1μl反转录酶MMLV，2μl5×First-Strand Buffer，2μl H₂O(所述5'-CDSprimer A、SMART II A oligo、5×First-Strand Buffer等组分均为随试剂盒提供)。反应条件：70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃10min。

根据本实验室454转录组测序结果，筛选出与胁迫相关的基因序列，设计引物，具体的引物序列如下：Lc1：5′-CCGATGAACCTCTCCGTGTTGGCA-3′(序列2的第637-660位的反向互补序列)。

以上述合成的5’端cDNA为模板，引物Lc1与引物UPM(Clontech公司：Long(0.4μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3')配对进行PCR扩增。PCR反应体系(50μl)：1μl50×Advantage2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water，5μl10×Advantage2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，5μl UPM，1μl引物Lc1，2.5μl cDNA模板(所述50×Advantage2Polymerase Mix、PCR-Grade Water、Advantage2PCR Buffer等组分是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份)。反应条件为：94℃30s，68℃30s，70℃60s，共35个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，经PCR扩增获得了长度约为680bp的目的片段。回收并纯化5’RACE产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为660bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3(序列2的前660位)所示。

二、羊草抗寒相关基因Lc3670的3’端序列的克隆

以步骤一提取的经寒胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的3’RACE试剂盒(产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成其3’端cDNA。反应体系(10μl)：1μl RNA，1μl5'-CDS primer A，1μl DTT(20mM)，1μl dNTPMix(10mM)，1μl反转录酶MMLV，2μl5×First-Strand Buffer，3μl H2O。(所述5'-CDS primer A、SMART II Aoligo、5×First-Strand Buffer等组分随试剂盒提供)反应条件：70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃10min。

根据上述步骤一获得的Lc3919基因5’端cDNA序列(序列3)设计引物：Lc2：5’-GGTGCCTGCCTTTGTGGCGAGTAAT-3’(序列2的第415-439位)。

以获得的3’端cDNA为模板，引物Lc2与引物UPM(Clontech公司：Long(0.4μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3')配对进行PCR扩增。PCR反应体系(50μl)：1μl50×Advantage2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water，5μl10×Advantage2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，5μl UPM，1μl引物Lc2，2.5μl cDNA模板(所述50×Advantage2Polymerase Mix、PCR-Grade Water、Advantage2PCR Buffer等组分是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份)。反应条件：先94℃30s，68℃30s，70℃60s，共35个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，经PCR扩增获得了长度约为600bp的目的片段。回收并纯化3’RACE产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为553bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4(序列2的第415-967位)所示。

三、羊草抗寒相关基因Lc3919全长cDNA序列的获得及PCR检测

利用上述步骤一和步骤二获得的长度为660bp(序列3)和553bp(序列4)片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的Lc3919基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由967个碱基组成，自5’端第101位-第697位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的蛋白质。序列表中序列1由198个氨基酸残基组成。

根据Lc3919基因全长cDNA序列(序列2)设计如下引物：Lc3：5’-GAGATAGTTCACCACTGATGCCGAATGGTAA-3’(序列2的第877-907位的反向互补序列)。

以反转录获得的cDNA为模板，引物Lc3与引物NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(Clontech公司)配对进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，经PCR扩增获得了长度约为1000bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列(序列2)在扩增部分完全相同，扩增部分的片段的核苷酸序列如序列2的自5’端第1-907位所示，自5’端第101位-第697位为其编码序列。这表明所克隆的3’RACE片段和5’RACE片段属于同一基因，将该基因命名为Lc3919，将其编码的蛋白命名为Lc3919。

四、羊草抗寒相关基因Lc3919基因组序列的获得

以羊草品种中科二号的幼苗为材料，低温(4℃)胁迫处理12小时后利用CTAB法提取其基因组DNA，贮存于-20℃备用。

以上述获得的基因组DNA为模板，根据步骤三获得的Lc3919基因全长cDNA序列(序列2)设计引物Lc4：5’-ATCCTTGCTCCAGAGTCCAGATAAT-3’(序列2的第1-25位)与引物Lc3：5’-GAGATAGTTCACCACTGATGCCGAATGGTAA-3’(序列2的第877-907位的反向互补序列)配对进行PCR扩增。PCR反应体系(20μl)：cDNA模板、Lc3引物与Lc4各1μl，10×Buffer2.5μl，dNTPMixture(10mmol/L each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O12.25μl。反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，经PCR扩增获得了长度约为900bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为907bp，其脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列2的第1-907位，通过比对与cDNA序列一致，表明所得到为羊草抗寒相关基因Lc3919的基因组序列，分析表明该基因没有内含子序列。

实施例2、Lc3919基因在胁迫条件下的表达模式及组织特异性分析

将正常生长5周的羊草品种中科二号的幼苗进行低温胁迫(4℃)处理。胁迫处理时间分别为0、1、2、4、8、12、24、48小时。分别提取上述处理羊草幼苗的总RNA，通过qRT-PCR方法分析Lc3919基因在低温胁迫条件下的表达模式。其中扩增Lc3919基因引物序列为5’-CATCTTCTTCCTCAGCGCAC-3’(序列2的第511-530位)和5’-GACTCATCCTCACATCGCCG-3’(序列2的第604-623位的反向互补序列)；以Actin作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为5’-GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT-3’和5’-CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC-3’；应用两步法PCR扩增标准程序：95℃10s；95℃5s，60℃20s，40个循环；72℃10min。

结果如图6所示，Lc3919基因的转录水平明显受低温胁迫诱导，随着低温处理时间的延长，Lc3919基因的表达量迅速增加。

以2年生羊草品种中科二号为实验材料，分别提取穗、叶、叶鞘、须根、根状茎和芽共六种组织的总RNA，利用qRT-PCR分析Lc3919基因的组织特异性表达模式(具体操作上参照上文)。

结果如图7所示，Lc3919基因在羊草的穗、叶、叶鞘、须根、根状茎和芽六种组织中的表达存在差异，其中在叶和叶鞘中表达量最高。

实施例3、Lc3919基因的亚细胞定位

将上述实施例1扩增得到的Lc3919基因(序列2的第1-907位)经重组LR反应连接到含有GFP的pMDC45载体(记载于“Mark Curtis,Ueli Grossniklaus,et al.A gatewaycloning vector set for high-throughput functional analysis of genes inplanta.(2003).Plant Physiology133:462-469.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得)的重组位点attR1和attR2间，将得到的重组表达载体命名为pMDC45-Lc3919。重组表达载体pMDC45-Lc3919的结构描述为：在pMDC45载体的重组位点attR1和attR2之间插入序列表中序列2的第1-907位核苷酸所示DNA片段后形成的重组质粒。

将重组表达载体pMDC45-Lc3919通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105，采用叶脉注射的方法转入幼嫩的烟草叶片细胞，同时以转入pMDC45空载体的烟草表皮细胞作为对照。转化的烟草在23℃条件下生长2-3d后用激光共聚焦/TIRF显微镜(Leica TCS SP5)下观察并照相。

结果如图8(转入pMDC45空载体的烟草)和图9(转入重组表达载体pMDC45-Lc3919的烟草)所示：转入载体pMDC45的转基因细胞中表达的蛋白分布在整个细胞内；转入Lc3919重组表达载体pMDC45-Lc3919的转基因细胞中表达的蛋白则特异地定位于细胞核区域。这一结果表明Lc3919蛋白在烟草表皮细胞的细胞核中表达。

实施例4、转Lc3919基因拟南芥的获得及其抗寒性检测

一、重组表达载体pK7WG2D-Lc3919的构建

将实施例1扩增得到的Lc3919基因(序列2的第101-697位)经重组LR反应连接到植物表达载体pK7WG2D(记载于“Karimi,M.,Inzé,D.,Depicker,A.,Gateway vectors forAgrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci.2002May；7(5):193-195.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得)的重组位点attR1和attR2间，获得重组表达载体pK7WG2D-Lc3919。具体如下：

采用Gateway试剂盒进行操作，Gateway试剂盒为invitrogen公司产品，其产品目录号为11789-100。试剂盒中有BP反应酶混合物(BP Clonase^TMenzyme mixture)和LR反应酶混合物(LR Clonase^TM enzyme mixture)。

1、attB-PCR产物的获得

(1)以实施例1获得的Lc3919基因(序列2的第101-697位)为模板，用引物attB-Lc3919-F与引物attB-Lc3919-R进行PCR扩增，反应结束后对其产物(记为attB-1-PCR产物)进行纯化。

(2)以步骤(1)所得attB-1-PCR产物为模板，用引物attB-adapter-F与引物attB-adapter-R进行PCR扩增，反应结束后对其产物(记为attB-PCR产物)进行纯化。

attB-Lc3919-F：5’-GCAGGCTTCATGGGGGTCAAGCTCACGCT-3’(下划线部分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列为序列2的第101-120位)；

attB-Lc3919-R：5’-AGCTGGGTCCTACTGTCTCTGCATGCTGAGCTCC-3’(下划线部分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列为序列2的第673-697位的反向互补序列)；

attB-adapter-F：5’-GGGGACAAGT TTGTACAAA AAAGCAGGCTTC-3’(下划线部分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列与attB-Lc3919-F引物中下划线部分一致)；

attB-adapter-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’(下划线部分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列与attB-Lc3919-R引物中下划线部分一致)；

2、BP反应

BP反应体系：

BP反应目的基因克隆的筛选及鉴定，如下：

1)取BP反应产物5μl转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，37℃倒置培养12-16h(培养基为Amp抗性)；

2)挑取单克隆，37℃180-200rpm摇菌培养(附加50μg/ml Amp)；

3)提取质粒，用M13引物(M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)检验阳性克隆。

4)通过对测序后的克隆与原始序列(序列2)进行比对，将经测序表明在pDONR-Amp载体的attP1和attP2之间插入序列表中序列2的第101-697位所示DNA片段的重组质粒命名为pDONR-Amp-Lc3919，重组质粒pDONR-Amp-Lc3919即为Lc3919基因的入门载体。

该步骤中，pDONR-Amp载体记载于“Ming Li,Bo Ding,Junbin Wang,Wenli Yang,Rui Wang,Shuguang Bao,Silin Zhong,Xiaodong Xie.Wheat TaWRKY10-1is involved inbiological responses to the salinity and osmostresses in transgenicArabidopsis plants.Australian Journal of Crop Science.AJCS7(6):723-729(2013)”一文中的“the pDONR(Amp')vector”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

3、LR反应

将步骤2获得的Lc3919基因的入门载体pDONR-Amp-Lc3919进行LR反应，反应体系如下：

LR反应目的基因克隆的筛选及鉴定，如下：

1)取LR反应产物5μl转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞，37℃倒置培养12-16h；

2)挑取单克隆，37℃180-200rpm摇菌培养；

3)提取质粒，用由引物5’-CTACTGTCTCTGCATGCTGAGCTCC-3’(序列2的第673-697位的反向互补序列)和位于pK7WG2D载体上重组位点上方序列5’-TACTCCAAGAAATATCAAAG-3’组成的引物对检测阳性克隆。

4)将含有目标大小约为1.2kb目的条带(见图10)单克隆菌株提取质粒，将所提质粒送样测序，获得1129bp长度的测序结果，其中前532bp为pK7WG2D载体上序列，后597bp为序列2的第101-697位序列。将经测序表明在pK7WG2D载体的attR1和attR2位点间插入了序列表序列2的第101-697位所示DNA片段的重组质粒命名为pK7WG2D-Lc3919。在重组表达载体pK7WG2D-Lc3919中，启动所述Lc3919基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。

二、转Lc3919基因拟南芥的获得

将步骤一构建的重组表达载体pK7WG2D-Lc3919通过冻融法(参见：Holsters M,deWaele D,Depicker A.Transfection and transformation of Agrobacteriumtumefaciens.Mol Gen Genet,1978,183:181-187)导入根癌农杆菌EHA105(参考文献：AnYang,Xiaoyang Dai,Wenhao Zhang.A R2R3-type MYB gene,OsMYB2,is involved insalt,cold,and dehydration tolerance in rice.Journal of Experimental Botany,2012,3:2541-2556)，重组农杆菌用由5’-ATGGGGGTCAAGCTCACGCT-3’(序列2的第101-120位)和5’-CTACTGTCTCTGCATGCTGAGCTCC-3’(序列2的第673-697位的反向互补序列)组成的引物对进行PCR鉴定，鉴定结果见图11。将经鉴定表明含有Lc3919基因(PCR目的条带大小为597bp，即序列2的第101-697位)的农杆菌EHA105命名为EHA105/pK7WG2D-Lc3919。采用同样的方法获得转入pK7WG2D空载体的重组农杆菌，命名为EHA105/pK7WG2D。

采用农杆菌花序侵染的方法(参见：Bechtold N等，(1993)In plantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants.C.R.Acad.Sci.316:1194–1199)将上述所得的重组农杆菌EHA105/pK7WG2D-Lc3919和重组农杆菌EHA105/pK7WG2D分别转化拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)(Carolina Biological Supply Company公司，Arabidopsis:Columbia(Col-0)Seed，货号：177600)。转化后进行卡那霉素抗性筛选，收集具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥的种子(T1代)，并在含有卡那霉素的平板上培养。再次通过卡那霉素抗性筛选，获得具有卡那霉素抗性的两种转基因苗，即转入pK7WG2D-Lc3919的拟南芥植株和转入pK7WG2D空载体的拟南芥植株。

进一步对上述获得的转基因拟南芥植株(T1代)进行PCR鉴定，筛选PCR鉴定阳性株系。具体操作如下：分别提取两种转基因拟南芥植株的基因组DNA作为模板，以Lc3919为靶基因，以5’-ATGGGGGTCAAGCTCACGCT-3’(序列2的第101-120位)和5’-CTACTGTCTCTGCATGCTGAGCTCC-3’(序列2的第673-697位的反向互补序列)为引物，进行PCR扩增。同时设置野生型拟南Col-0作为负对照。

结果显示：转入pK7WG2D-Lc3919的拟南芥植株可以扩增出大小为597bp的目的片段(序列2的第101-697位)，而用同样的引物对转空载体的拟南芥对照植株和野生型拟南芥植株进行PCR检测，均未得到上述扩增片段。具体结果见图12。将经PCR鉴定表明含有Lc3919基因(目的条带大小约为597bp，序列2的第101-697位)的转入pK7WG2D-Lc3919的拟南芥命名为Col-0/pK7WG2D-Lc3919。将获得的T1代转基因拟南芥植株自交授粉，获得T2代种子，T2代自交繁殖获得T3代。

三、T3代转Lc3919基因拟南芥的抗寒性检测

选取经步骤二鉴定阳性的3个T3代纯合体株系(见表1)进行抗寒试验。具体方法如下：将在土壤中正常生长2-3周的野生型拟南芥、转pK7WG2D空载体的拟南芥与转Lc3919基因拟南芥(Col-0/pK7WG2D-Lc3919)各15盆计60棵同时移往已设置特定温度(-8℃)的低温培养箱中，过夜(12小时)冷冻处理后取出，并于22℃正常培养条件下恢复生长7-10天，观察其表型，并统计各组植株的存活率。实验设三次重复，结果取平均值。

野生型(WT)与转Lc3919基因拟南芥株系(7-6、12-2和16-6)未进行处理前生长状态及抗寒处理后的生长状态如图13所示。存活率统计结果显示，经-8℃过夜寒冷胁迫后野生型拟南芥植株存活率仅为23.33％，而转Lc3919基因植株的存活率则可提高为46.29％左右，是野生型拟南芥存活率的2倍。这表明转Lc3919基因株系和作为空白对照的WT(野生型)拟南芥相比，抗寒能力得到明显提高。而转入pK7WG2D空载体的拟南芥的存活率与野生型拟南芥基本一致，无统计学意义。

表1 T3代转Lc3919基因拟南芥在寒冷胁迫(-8℃)下的存活率统计

注：粗体的平均值为转Lc3919基因拟南芥植株或野生型拟南芥植株在寒冷胁迫(-8℃)下的存活率平均值。

Claims (11)

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。

9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或7或8所述的重组表达载体或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组菌在如下(a1)或(a2)中的应用：

(a1)调控植物抗寒性；

(a2)选育抗寒性提高的植物品种；

所述植物为羊草或拟南芥。

10.一种培育抗寒性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗寒性提高；

所述植物为羊草或拟南芥。

11.扩增权利要求2或3所述核酸分子的全长的引物对。