CN105229021A - 在哺乳动物中起抗病毒免疫作用的rna干扰 - Google Patents

Abstract

本公开书提供了包含缺少宿主RNAi的功能病毒RNA抑制子的病毒的重组病毒载体和减毒病毒和病毒疫苗。本公开书提供缺少哺乳动物受试对象RNAi的功能性病毒编码的RNAi抑制子(VSR)的减毒病毒。在进一步的实施方案中，所述减毒病毒在VSR多肽的编码序列中包含一或多个突变，例如缺失、插入、替代或前述的组合。在另一实施方案中，减毒病毒不能够抑制受试对象中的siRNA生物发生。

Description

在哺乳动物中起抗病毒免疫作用的RNA干扰

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119要求于2013年3月15日提交的临时申请系列号61/800,536的优先权，所述临时申请的公开内容以引用的方式并入本文中。

政府许可权

本发明依据美国国立卫生研究院所授予的许可号AI052447在政府支持下进行。政府对本发明享有特定权利。

技术领域

本公开书提供用于治疗或预防病毒感染或降低病毒载量的疫苗和方法。

背景技术

RNA干扰(RNAi)充当植物、昆虫、线虫和真菌中的天然抗病毒防御，因此，这些有机体中的毒性感染需要由病毒编码的RNAi抑制子(VSR)对抗病毒RNAi进行抑制。病毒感染是否引起哺乳动物中典型病毒siRNA的生产或哺乳动物病毒感染是否需要抗病毒RNAi响应的特异性抑制仍然未知。

发明内容

例如西尼罗病毒、登革热病毒和流感病毒等RNA病毒是重要的新兴人类病原体，且与使用DNA作为遗传物质的病毒和细胞病原体相比，呈现不同的遗传和免疫特性。本公开书提出，利用可通过蚊子传播的正链RNA病毒在哺乳动物细胞培养物和小鼠中产生的感染引发了很强的抗病毒RNAi响应，其一定在生产性感染和/或毒性感染发生之前被病毒抑制。本公开书进一步提出，在诱导哺乳动物抗病毒RNAi响应的同时伴随着产生典型Dicer依赖性的病毒源性siRNA。这些发现提供了RNAi充当哺乳动物中的天然抗病毒防御的直接证据。因此，本公开书展示了在第一种情况下，在哺乳动物中的基于RNA的新颖抗病毒免疫性，其中宿主细胞死亡不是降低病原体负担所必需的。

高度保守的先天免疫机制(例如Toll样受体路径)调节果蝇和哺乳动物中的针对病原体的天然防御。然而，虽然RNA干扰(RNAi)是真核生物中的一种保守机制且充当果蝇、线虫和植物中的抗病毒免疫性，但是近十年来的研究尚未提供RNAi在哺乳动物中的抗病毒功能的确凿证据。本公开书显示，被培养的哺乳动物细胞回应于可通过蚊子传播的RNA病毒野田村病毒(Nodamuravirus，NoV)的攻击而产生病毒特异性的典型小干扰RNA(siRNA)，已知野田村病毒编码RNAi的病毒抑制子(VSR)。本公开书进一步证明，与对乳小鼠致命的野生型NoV不同，VSR缺陷型NoV突变体在乳小鼠中引起大量的病毒siRNA发生积累且变得没有毒力，表明对RNAi响应的病毒抑制对于小鼠中的疾病诱发来说是重要的。总之，这些发现揭示哺乳动物中的一种新型的基于RNA的抗病毒免疫性。

此外，本公开书证明对培养的人类细胞的NoV感染也诱导病毒源性siRNA的产生且需要对RNAi响应的病毒抑制。这些发现第一次显示人使用免疫机制RNAi防御病毒感染，此外，哺乳动物(包括人)中的病毒感染通过表达由病毒编码的蛋白以抑制哺乳动物RNAi响应而被促进。

本公开书进一步证明上调RNAi防御将会增加针对病毒感染的免疫性。此外，本公开书提出了用于预防或控制人类体内的病毒感染的一个新类别的药物靶标，即由病毒编码的RNAi抑制子(VSR)。

另外，已被制成VSR缺陷型的病毒代表一类新的活减毒病毒疫苗。通过用VSR缺陷型NoV对乳小鼠接种疫苗且在两天后用致死剂量的野生型NoV攻击它们来测试这个想法。与对照小鼠相比，被接种疫苗的小鼠受到充分保护。

在特定实施方案中，本公开书提供一种减毒病毒，其缺乏哺乳动物受试对象RNAi的由病毒编码的功能性RNAi抑制子(VSR)。在另一个实施方案中，减毒病毒在用于VSR多肽的编码序列中包含一个或多个突变，例如缺失、插入、取代或上述任一者的组合。在另一个实施方案中，减毒病毒不能抑制受试对象中的siRNA生物发生。在另一个实施方案中，减毒病毒选自野田村病毒、埃博拉病毒、HIV-1、HIV-2、麻疹病毒、流感病毒、乳头状瘤病毒、细小核糖核酸病毒和嗜肝DNA病毒。

在特定实施方案中，本公开书提供一种包含本文中所公开的减毒病毒的疫苗。在另一个实施方案中，被接种疫苗的受试对象在暴露于本公开书的疫苗时产生典型siRNA。在另一个实施方案中，典型siRNA以Argonaute依赖性方式产生。在另一个实施方案中，通过施用疫苗而产生的典型病毒siRNA预防或降低哺乳动物受试对象的细胞被病毒感染的可能性。病毒的实例包括野田村病毒、埃博拉病毒、HIV-1、HIV-2、麻疹病毒、流感病毒、乳头状瘤病毒、细小核糖核酸病毒和嗜肝DNA病毒。

在特定实施方案中，本公开书进一步提供一种VSR抑制剂，其降低或抑制哺乳动物受试对象RNAi的病毒RNA抑制子的活性。在另一个实施方案中，VSR抑制可以用于治疗或预防哺乳动物受试对象中的病毒感染。在另一个实施方案中，VSR抑制剂被施予具有病毒感染的受试对象，受试对象的典型病毒siRNA的产量增加。在另一个实施方案中，通过对具有病毒感染的受试对象施用VSR抑制剂，病毒感染的严重性得到降低。在另一个实施方案中，VSR抑制剂是针对哺乳动物受试对象RNAi的病毒RNA抑制子的抗体。在一个替代性实施方案中，VSR抑制剂是针对哺乳动物受试对象RNAi的病毒RNA抑制子的siRNA。

在特定实施方案中，本公开书提供一种重组复制型病毒载体，其包含本公开书的减毒病毒和目的异源基因。在另一个实施方案中，目的异源基因是抗原。

本公开书提供一个或多个实施方案，其在附图和以下描述中加以阐述。本发明的其它特征、目标和优点根据所述描述和附图以及权利要求书将是显而易见的。

附图说明

图1A-B展示BHK-21细胞中的病毒源性小RNA(vsRNA)的siRNA性质。(A)来自于用NoV或NoVΔB2接种2天或3天后(dpi)的细胞的正链或负链vsRNA的长度分布和丰度。(B)在互补vsRNA对的5′端与3′端之间的每个距离类别(以核苷酸计)中的NoV或NoVΔB2的互补22-ntvsRNA对的总数，对于具有平末端的完美碱基配对22-ntvsRNA来说定义为0，对于在每条链的3′端(α和β)具有2-nt突出的对来说定义为-2，或对于在5′端(α和γ)具有20-nt突出的对来说定义为20。

图2A-C呈现被NoV或NoVΔB2感染的BHK-21细胞中或被NoVΔB2感染的小鼠中的细胞miRNA和病毒源性小RNA(vsRNA)的图。(A)来自于被NoVΔB2感染的BHK-21细胞(左图)和乳小鼠(右图)的不同长度的成熟miRNA的百分比。细胞miRNA在7个小RNA文库中的每一个中都非常丰富(参见表3)且长度主要为22个核苷酸。给出每个文库中的miRNA读段的总数量。(B)来自于被NoVΔB2感染的BHK-21细胞和乳小鼠的正链(红色)或负链(蓝色)vsRNA的独特种类的长度分布和丰度。还检测到22-nt处的峰。(C)在用NoVΔB2感染1天或2天后来自于乳小鼠的每个距离类别中的互补22-ntvsRNA的独特种类的对的总数，显示具有2-nt3′突出的22-nt双螺旋(-2群体)和连续22-ntvsRNA(+20群体)的富集。互补vsRNA的5′端与3′端之间的距离(以核苷酸计)对于具有平末端的完美碱基配对22-ntvsRNA来说是0，对于在3′端具有2-nt突出的对来说是-2，或对于在5′端具有20-nt突出的对来说是20。

图3提供乳小鼠感染期间B2和mB2蛋白的Western印迹检测。通过腹膜内注射(IP)分别来自于NoV、NoVΔB2、NoVmB2储备制品的滴定组的10μl、30μl或50μl对出生后6天到8天大的BALB/c小鼠接种。携带R59Q突变的突变型B2蛋白显示比野生型B2蛋白更快地迁移。

图4A-B证明NoV感染需要RNAi抑制。(A)稳定表达B2(B2)或VP35(VP35)的BHK-21细胞(-)或BHK细胞被模拟感染或用相同滴度的NoVΔB2或NoV感染。感染后每12小时(hpi)，通过定量RT-PCR确定病毒基因组RNA-1水平，其中12hpi时BHK-21细胞中的NoVΔB2的积累水平被设为1。误差棒表明三个复本的标准偏差。(B)通过Northern印迹法检测的在感染细胞中的NoV和NoVΔB2RNA1-3的积累。显示通过磷相仪定量的RNA-1信号，48hpi时BHK-21细胞中的NoVΔB2的信号被设为1。B2转基因mRNA(箭头)的检测是可见的。18SrRNA染色用作负载对照。

图5A-D证明体内病毒清除与病毒siRNA的生产有关。(A,B)通过病毒RNA-1的定量RT-PCR和Northern印迹法分别检测的小鼠前肢(F)和后肢(H)组织中的NoV、NoVΔB2和NoVmB2的积累。1dpi时后肢中的NoVΔB2水平被设为1，且误差棒表明三个复本的标准偏差(A)。rRNA染色之后的NoVRNA-1和RNA-2(箭头)是可见的，显示等负载(B)。(C)乳小鼠在用NoVΔB2(右图)或NoVmB2(未图示)感染4周后与模拟接种小鼠(左图)一样保持健康，而所有5只NoV接种小鼠在5dpi时都死亡(未图示)。(D)用NoVΔB2(中图)或NoVmB2(左图)感染的小鼠中的负链病毒siRNA和来自于NoV感染小鼠的vsRNA(右图)的Northern印迹检测。图6B呈现4个siRNA探针的杂交位置，且尺寸标志物是合成的21-nt和25-ntRNA。针对小鼠microRNA127(miR-127)和作为负载对照的U6RNA探测相同的滤器(filter)。对每个实验执行至少三次具有可再现结果的独立重复。

图6A-D呈现体内生产的小鼠病毒siRNA的性质。(A)来自于接种NoVΔB21天或2天后(dpi)或接种NoV4dpi时的小鼠的正链或负链vsRNA的长度分布和丰度。(B)在用NoVΔB2感染之后从乳小鼠(上面两个图)或BHK-21细胞(下面两个图)测序的21-nt到23-nt病毒siRNA的病毒基因组分布。显示通过病毒二分RNA基因组编码的功能蛋白和B2mRNA(RNA3)自RNA-1的转录。箭头指示用于检测小鼠中的负链病毒siRNA的4个锁核酸探针的位置。(C)如图1B中所定义的每个距离类别中的NoVΔB2和NoV的互补22-ntvsRNA的对的总数。(D)全部(上图)和独特(下图)22-nt负链病毒siRNA在每个位置上的核苷酸频率。编码3种病毒蛋白的病毒开放阅读框分别从RNA1、2和3翻译。

图7A-E提供感染的mESC中来源于EMCV的siRNA的表征。(A)在3hpi和6hpi时E14mESC中的EMCVVP1水平的Western分析。NI：未感染。肌动蛋白：蛋白负载对照。(B)来自于(A)的样品中针对EMCV基因组定位的vsRNA深度测序读段的尺寸分布。(C)在6hpi时沿EMCV基因组RNA的(+)链和(-)链的21-23-nt和24-44-nt读段分布。(D)与(C)相同，但沿着5′端前300-nt。将对称读段编号。星号指示据以设计寡核苷酸探针以通过(E)中的Northern分析检测EMCV5′端siRNA的读段序列。插图：由丰富读段1-2和3-4形成的完美双螺旋；2-nt3′突出以红色指示。雷达标图显示完整EMCV(+)链和(-)链中的22个可能寄存器(register)中的每一个中的21-23-nt读段；基因组的5′第一核苷酸定义寄存器#1。距中心的距离指示每个寄存器中读段的百分比。(E)在6hpi时对EMCV5′端siRNA的Northern分析。平行跑胶且随后杂交的来自SUC-SUL(SS)转基因拟南芥的总RNA提供用于21-nt和24-ntsiRNA的RNA尺寸标志物。

图8A-E提供用EMCV感染的mESC细胞系的表征。(A)在未感染情况下(-)或以在BHK-21细胞上所确定的指定病毒滴度感染3小时或6小时后(hpi)，各种mESC细胞系(E14、PGK、HM1)中的EMCV病毒蛋白1(VP1)的Western分析。TCID50/细胞：50％组织培养感染剂量/细胞。(B)EMCV基因组(上图)和对ES或Glasgow培养基中被感染的(+)或未被感染(-)的mESC中的多能性因子Oct4、Nanog和EMCVRNA(5′UTR、VP3和2A)的定量实时PCR分析(qRT-PCR)(下图)的图示。用于通过qRT-PCR分析定量EMCVRNA的3对引物的位置在EMCV基因组图谱上用黑条指示。结果是两次独立实验的平均值和标准偏差(SD)。(C)沿EMCVRNA(+)链和(-)链的5′端前110-nt的21-23-nt读段的序列。对于每个序列来说，指示出带有沿着病毒基因组和其测序变异体位置(以nt计)的读段的对应数量(粗斜体)。未通过深度测序检测到的读段序列利用以X表示的每个核苷酸描绘，且随着具有～22-nt周期性的viRNA的明显阶段生产而组装。2-nt3′突出以红色表示。(D)通过奇异谱分析，从通过奇异谱分析(参见方法)从原始数据提取的总方差的10个最高贡献因子重建的模型周期信号。分别用红线和蓝线指示EMCVRNA(+)链的5′端读段和(-)链的3′端读段的模型周期信号。(+)链和(-)链的对应原始计数用黑线指示。(E)显示EMCVRNA(+)链的5′端读段和(-)链的3′端读段的周期性的自相关曲线。0.95的置信区间用红色虚线指示。ACF：自相关函数。

图9A-G证明EMCVsiRNA被装载入AGO2中且在Dcr^-/-mESC中和分化之后剧烈减少。(A)在用EMCV感染(+)或未被感染(-)的Dcr^Flx/Flx和Dcr^-/-mESC中的VP1(上图)、EMCV5′端siRNA(中图)和miR-16(下图)的Western和Northern分析。如在图7E中，SSsiRNA用作尺寸标志物。肌动蛋白和U6：分别用于蛋白质和RNA的负载对照。(B)在从用EMCV感染(+)或未被感染(-)的WTmESC或稳定表达FHA-hAGO2的mESC分离的FLAG特异性免疫沉淀物中，在6hpi时EMCV5′端siRNA的Northern分析。SS：如在(A)中。Western分析显示相当的感染水平且证实FHA-hAGO2免疫沉淀。全部：考马斯染色的蛋白提供负载对照。(C)根据从mESC的内源AGO2IP6hpi分离的RNA的深度测序，沿着EMCV基因组的21-23-nt读段分布。星号指示图10E中分析的读段。(D)与(C)相同，但沿着开头5′端150-nt。(E)在用EMCV感染(+)或未被感染(-)的、未分化(d0)或分化10天之后(d10)的mESC中OCT4、EMCVVP1、EMCV5′端siRNA和miR-16的Western和Northern分析。全部：如(B)中所示；U6，SS：如在(A)中。(F)针对来自于(E)的样品中的EMCV基因组定位的vsRNA深度测序读段的尺寸分布。将读段丰度标准化为针对EMCV基因组定位的读段的总数。(G)如图7D中，针对感染的d0和d10mESC中的EMCV基因组定位的读段。注意读段计数中的比例变化，以红色突出显示。插图：双螺旋1-2在d10细胞中仍可被检测到。

图10A-F提供RNA标志物和EMCV基因组结构的表征。(A)在用EMCV感染(+)或未被感染(-)的Dcr^Flx/Flx和Dcr^-/-mESC中，Oct4mRNA、一种公认mESCmiRNA靶标(由miR-196a调控的Hmga2)、miR-295和EMCVRNA(VP3区)的qRT-PCR分析。结果是两次独立实验的平均值和标准偏差(SD)。(B)在用EMCV感染(+)或未被感染(-)的WTmESC或稳定表达表位标记的FLAG-HA人类AGO2(FHA-hAGO2)的mESC中，FLAG特异性免疫沉淀(IPFLAG)中miR-21和miR-295的富集，由qRT-PCR分析评估。从一式三份进行的qRT-PCR计算SD。(C)在用EMCV感染(+)或未被感染(-)的mESC中，使用特异性抗体或IgG对照(IgG)的内源小鼠AGO2(mAGO2)的免疫沉淀。蛋白印迹分析确定相当的感染水平(VP1，上图)且证实mAGO2免疫沉淀(下图)。(D)读段的百分比，所述读段定位至在如(C)中所示的EMCV感染mESC的内源mAGO2(mAGO2)的IP中的miRNA前体(pre-miRNA)，如ncPRO流程所注释。读段在未定位任何miRNA前体时被分类为“未注释”。(E)根据从mESC的内源AGO2IP6hpi分离的RNA的深度测序，沿着EMCV基因组的21-23-nt读段分布。描绘的两个区域对应于图9C中用星号标记的峰。左边的图描绘EMCVIRES的J基序，其结构先前已经通过核酸酶探测而证实；值得注意的是，主要的小RNA种类对应于EiF4A的结合位点，已知其改变IRES局部构形。右图上的RNA结构通过RNA折叠预测，但没有在实验上证实。在EMCV基因组中在nt1497-1670出存在的两个峰(a和b)被描绘在对应的RNA结构上。最丰富的读段在结构内以红色指示，且热图代表读段变体或二级读段。(F)在用EMCV感染(+)或未被感染(-)的mESC中，在分化第0天(d0)和第10天(d10)时的Oct4和Nanog(多能性标志物)和Fgf5(外胚层标志物)的qRT-PCR分析。通过qRT-PCR对EMCVRNA积累的平行定量(如图8B中)提供于最右边的两个图中(5′UTR和2A)。结果是两次独立实验的平均值和SD。

图11A-F证明由NoV编码的B2拮抗来源于NoV的dsRNA的加工。(A)用NoV或NoVΔB272hpi的mESC的基因组RNA1和亚基因组RNA3的Northern分析。rRNA：核糖体RNA的溴化乙锭染色；NI，未感染；sgRNA3：亚基因组RNA3。(B)针对(A)中所使用的感染mESC中的NoV或NoVΔB2基因组定位的深度测序读段的标准化尺寸分布。(C)在感染的mESC中，沿着NoV(左图)和NoVΔB2(右图)RNA1的(+)链和(-)链的21-23-nt和24-44-nt读段分布。(D)与(C)相同，但沿着NoV(左图)或NoVΔB2(右图)RNA1的开头5′端300-nt。(E)如图7D中的雷达标图，但针对NoV和NoVΔB2；RNA1的5’第一核苷酸定义为寄存器#1。(F)沿着NoVΔB2RNA1(+)链和(-)链的开头5′端180-nt的读段的序列。指示带有沿着病毒基因组位置(以nt计)的每个读段的数目和其测序变异体。未通过深度测序检测到的读段序列利用以‘X’表示的核苷酸描绘，且随着在～22-nt周期性内的viRNA的阶段生产而组装。在用NoVΔB2感染的BHK-21细胞和小鼠中检测到的相同读段以蓝色描绘。2-nt3′突出以红色表示。

图12A-E证明通过使来源于NoV的dsRNA突变来构建NoVΔB2，和NoVΔB2活性的表征。(A)两种NoV基因组(RNA-1和RNA-2)和单一亚基因组RNA(RNA-3，从其生产B2蛋白)的图示。描绘在RNA-1中工程改造以产生NoVΔB2的突变：U2745C和U2754C破坏两种B2开放阅读框(B2-137和B2-134)的起始密码子，而C2757G产生终止密码子。这3种突变都不影响重叠的蛋白A/B1ORF。先前确定了在NoVΔB2中不存在B2生产。在(B)中用于qRT-PCR分析的寡核苷酸引物的位置用黑条指示。(B)在用NoV或NoVΔB2感染的mESC中通过qRT-PCR分析对复制酶(左图)和衣壳(右图)的定量。结果是两次独立实验的平均值和SD。(C)与主要部分的图11C中相同，但具有针对NoV和NoVΔB2的RNA2定位的深度测序读段。(D)与图8D中相同，但具有针对NoV和NoVΔB2的RNA1定位的深度测序读段。(E)与图8E中相同，但针对NoV和NoVΔB2的RNA-1定位的深度测序读段。

图13A-C证明AGO2缺陷型mESC中的NoVΔB2积累的拯救。(A)用他莫昔芬处理5天(+)或未被治疗(-)的未感染(NI)、被NoV感染和被NoVΔB2感染的E7mESC中hAgo2转基因mRNA水平的qRT-PCR分析。结果显示两次独立实验的平均值和标准偏差(s.d)。(B)用他莫昔芬处理(+T)或未被处理的E7mESC中72hpi的NoV或NoVΔB2RNA1的相对积累，通过针对(A)中使用的样品的qRT-PCR评估。结果显示从两次独立实验计算的比率的平均值和s.d。(C)在(A)中使用的细胞的72hpi的NoV和NoVΔB2基因组RNA-1和亚基因组RNA3的Northern分析。rRNA：如图11A中；sgRNA3：亚基因组RNA-3。

图14A-B提供用于在果蝇中诱导和抑制抗病毒RNAi的模型。现有数据表明通过剪切在从(-)-RNA模板合成子代RNA的起始期间产生的dsRNA，引发抗病毒RNAi，导致高密度的5’端病毒siRNA，如FHVΔB2感染细胞中所发现的(A)。在FHV感染细胞(B)中，预测检测到的B2与病毒RdRP的相互作用促进B2接近新生病毒dsRNA以抑制宿主剪切。现有模型也构想在末端区域的剪切的B2抑制允许内部来自抗基因组RNA模板的亚基因组RNA的稳健转录起始，从而引发生产一组不同的siRNA热点以靶向RNA1的下游RNA3编码区。在FHV感染细胞中也可以检测到B2病毒siRNA复合物，暗示第二种VSR活性。

图15呈现以下病毒siRNA的长度分布和5′端核苷酸偏好(用彩色指示)：在用NoVΔB2感染3、7或15天后(dpi)来自于乳小鼠的全部正链(顶部)和负链(底部)病毒siRNA，和来自于NoVΔB2感染的乳小鼠的3dpi的从通过抗-panAgo抗体共免疫沉淀的Ago复合物测序的病毒siRNA(左边4张图)。每个文库中的病毒siRNA的相对丰度被标准化为每百万小鼠miRNA的读段。右图显示在与Ago蛋白共免疫沉淀之前(上图)和之后(下图)在3dpi时来自于NoVΔB2感染的乳小鼠的21-nt到23-nt正链(红色)和负链(蓝色)病毒siRNA的基因组范围的分布模式。显示NoV的基因组组织和B2表达策略(经由亚基因组RNA)。

图16呈现在用缓冲液、NoVΔB2或UV失活的NoVΔB2预接种之后，用NoV攻击2、3或4天后的乳小鼠中通过qRT-PCR的NoV积累(被显示为RNA-1积累)倍数。

图17显示NoVB2隔绝病毒双螺旋siRNA并抑制其被装载入Ago复合物中。来自于用NoV感染3天后(dpi)的乳小鼠的全部正链(上图)和负链(下图)病毒siRNA和来自于Ago和B2复合物的那些的相对丰度(每百万小鼠miRNA的读段)、长度分布和5′端核苷酸偏好。B2复合物中的22-nt病毒RNA富含典型siRNA，如-2位置的峰所示。

图18A-B显示在通过I.P.接种1、4或7天后(dpi)的野生型(C57)乳小鼠或MAVS/RIG-I敲除乳小鼠的后肢组织中通过qRT-PCR的NoVΔB2的积累，其被显示为RNA-1积累倍数。(A)在1dpi时C57BL/6中的RNA-1水平被设为1。(B)来自于用NoVΔB24dpi的野生型乳小鼠和基因敲除乳小鼠的全部正链(上图)和负链(下图)病毒siRNA的相对丰度(每百万小鼠miRNA的读段)、长度分布和5′端核苷酸偏好。

图19提供成年小鼠中的NoV感染的表征。从左边数的第1张图显示在2、4和6dpi时年幼成年小鼠后肢中的NoV积累，其通过病毒RNA1的实时RT-PCR检测来测量(1dpi时后肢中NoVΔB2的积累水平被设为1)。从左边数的第2张图显示在用NoV或NoVΔB2(ΔB2)2dpi和4dpi时，在年幼成年小鼠后肢组织中的负链病毒siRNA的Northern印迹检测。对作为负载对照的U6RNA也探测相同的滤器。合成21-nt和25-nt单链RNA被用作尺寸标志物。从左边数的第3张图显示来自于用NoV4dpi时的6周大Balb/c小鼠的全部正链(上图)和负链(下图)病毒siRNA的相对丰度(每百万小鼠miRNA的读段)、长度分布和5′端核苷酸偏好。右边的图显示来自于NoV感染的成年小鼠的22-nt病毒RNA富含典型siRNA，如-2位置的峰所示。

具体实施方式

除非上下文另外明确指示，否则如本文中和附加权利要求书中所使用，单数形式“a(一)”“和”以及“所述”包括复数指示物。因此，举例来说，提及“(a(一))病毒”包括多个此类病毒，且提及“所述细胞”包括提及一个或多个细胞，诸如此类。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义都与本公开书所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然与本文中所述的那些类似或相同的方法和材料可以用于实施所公开的方法和组合物，但是本文中描述了示例性方法、装置和材料。

另外，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是可互换的且不打算构成限制。

应进一步理解，当各种实施方案的描述使用术语“包含”时，所属领域的技术人员将理解在一些特定情况下，可以使用措辞“基本上由......组成”或“由......组成”来替代性地描述一个实施方案。

上文和本文全篇中所讨论的任何出版物仅为了在本申请的申请日之前的公开被提供。本文中没有任何内容被解释为承认发明人不能凭借先前公开而先于这样的公开。

如本文中所定义，术语“失活”是指减少或消除特定基因的表达的行为。

如本文中所使用的术语“足以激活RNA沉默的病毒的多核苷酸序列”或“激活RNA沉默的病毒的多核苷酸序列”是指能够诱导病毒RNA或病毒的任何其它靶标RNA降解的病毒基因组的任何部分。

如本文中所使用，术语“重组载体”是指重组DNA构建体，其具有可实现宿主中构建体的稳定和可遗传表达或瞬时表达的多核苷酸序列。典型地，此类载体是非感染性的且通过标准方法被引入到细胞中，所述标准方法包括但不限于磷酸钙介导的转染、脂质介导的转染、电穿孔、DNA枪等。

如本文中所使用，术语“异源”是指来自于另一个有机体的任何序列。举例来说，如本文中所使用的术语“来自于异源病毒的多核苷酸序列”是指来自于如下病毒的序列，所述病毒不同于提供激活RNA沉默的序列的病毒。

如本文中所使用，术语“内源基因”是指作为基因组的天然部分且尚未通过人工方式引入的任何基因。

如本文中所使用的术语“RNA沉默”是指由天然“引发事件”(例如病毒感染)而不是人为操纵所诱导的过程—RNA降解，其被称为RNAi。在本申请中，所述术语明确地是指响应于植物或动物细胞中的病毒感染、病毒RNA通过其而被降解的抗病毒防御机制。

如本文中所使用的术语“RNAi”或“RNA干扰”是指通过将dsRNA引入到细胞中或被设计成诱导细胞生产人工dsRNA的操纵而诱导的RNA降解。

如本文中所使用的术语“RNA沉默抑制子”是指能够阻断或减少RNA沉默的任何多肽。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中该部分典型地保留当该部分存在于完整抗体中时通常与该部分相关的功能中的至少一种，更通常地是大部分或全部。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双价抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点且因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段)保留当Fc区存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的生物功能中的至少一种，例如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有基本上类似于完整抗体的体内半衰期的单价抗体。举例来说，此类抗体片段可以包含一个抗原结合臂，其连接到能够赋予片段体内稳定性的Fc序列上。

“抗原”是抗体可以选择性地结合的预定抗原。靶标抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的化合物或合成化合物。

“结合亲和力”一般是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配对物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总计强度。除非另外表明，否则如本文中所使用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对于其配对物Y的亲和力一般可以用解离常数(K_d)表示。亲和力可以通过包括本文中所述的方法在内的所属领域中已知的常用方法测量。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原且往往容易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原且往往保持更长时间的结合。测量结合亲和力的各种方法在所属领域中是已知的，其中任一种都可用于本发明的目的。

在植物和无脊椎动物中，病毒感染引发病毒特异性dsRNA被Dicer加工成siRNA，其是通过RNAi的特异性抗病毒防御所必需的；因此，毒性感染需要表达干扰病毒siRNA的生物发生或抗病毒活性的由病毒编码的RNAi抑制子(VSR)。抗病毒RNAi的诱导依赖于通过Dicer核酸酶将病毒特异性双链RNA(dsRNA)加工成21到24核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)，其是在任一条链的3′端具有两个不成对核苷酸的短dsRNA。举例来说，关于果蝇中的兽棚病毒(Flockhousevirus，FHV)的研究已经提供了一种用于诱导和抑制抗病毒RNAi的模型(参见图14)。FHV是野田病毒科(Nodaviridae)的甲型野田村病毒属(Alphanodavirus)的成员且含有二分正链RNA基因组。果蝇针对22-ntmiRNA[Dicer-1(DCR1)/Argonaute-1(AGO1)]和21-ntsiRNA(DCR2/AGO2)的生物发生和活性编码两个在很大程度上独立的路径。FHVsiRNA(主要是21-nt)由Dicer-2产生且被DCR2与dsRNA结合蛋白R2D2的杂二聚体装载入Argobnaute-2中(参见图14)。作为对抗防御，FHV编码从FHVRNA1的亚基因组RNA(RNA3)翻译的dsRNA结合VSR蛋白B2，所述蛋白B2充当具有RNAi抑制的双重模式的同型二聚体(参见图14)：其结合长dsRNA且抑制其被剪切成siRNA，同时其还结合双螺旋siRNA，预计这会抑制病毒siRNA被装载入RISC中。一贯地，将B2的第54残基(在甲型野田村病毒B2蛋白中保守的Arg)取代成Gln(R54Q)会使dsRNA结合活性和RNAi抑制活性失活。值得注意的是，虽然野生型FHV在成年苍蝇中引起毒性感染，但是FHV的B2缺陷型突变体FHVΔB2在野生型苍蝇中被迅速清除，而在Dicer-2、R2D2或Argonaute-2被敲除的苍蝇突变体中诱导毒性感染。这些发现说明，RNAi的病毒抑制是生产性感染所必需的，且抗病毒RNAi的诱导足以在不存在RNAi病毒抑制的情况下终止病毒感染。

哺乳动物编码单一Dicer，其用于siRNA和miRNA的生物发生以及用于具有高度重叠的活性以装载siRNA和miRNA的4种Argonaute。关于RNAi在哺乳动物病毒感染中的角色知之甚少。哺乳动物病毒mRNA与细胞mRNA一样对由合成siRNA编程的RNAi敏感。一些DNA病毒编码miRNA以调节基因表达，而C型肝炎病毒(HCV)RNA与宿主miRNA-122的直接相互作用是复制所必需的。不同的哺乳动物病毒蛋白质可以抑制非脊椎动物系统中的RNAi或哺乳动物细胞中的实验性RNAi。近来的深度测序研究检测到了在受到RNA病毒感染的哺乳动物细胞中积累有病毒源性小RNA(vsRNA)。被测序的HCVvsRNA尤其含有互补的20-21ntvsRNA，其具有1nt或2nt3′突出，其中一些在具有未知功能的AGO复合物中被发现。然而，至今所报道的哺乳动物vsRNA呈现近乎随机的长度分布模式，这不同于在植物和无脊椎动物中表征的Dicer依赖性病毒siRNA。在不存在产生典型病毒siRNA的哺乳动物感染模型的情况下，保守RNAi机制是否在哺乳动物中具有抗病毒功能或者哺乳动物病毒感染是否需要VSR活性仍然是未知的。

已经鉴别了可以在哺乳动物细胞中抑制昆虫和植物RNAi或人工诱导的RNAi的哺乳动物病毒蛋白质，且一种此类蛋白质的毒性作用可以被不同的隔离siRNA的植物VSR补充。虽然哺乳动物病毒对通过合成小干扰RNA(siRNA)的实验性RNA干扰(RNAi)是敏感的，但是哺乳动物中天然抗病毒RNAi响应的存在是有争论的。首先，在许多被感染的体细胞中，病毒双链RNA(dsRNA)引发强烈的非序列特异性干扰素(IFN)响应，其可能已经在很大程度上取代了抗病毒RNAi功能。其次，若干哺乳动物病毒蛋白质显示RNAi病毒抑制子(VSR)样活性，这仍有待在可信的病毒表达环境中进行验证。第三，不同的被病毒感染的哺乳动物细胞类型积累病毒源性小RNA(vsRNA)，但是这些具有未指明的功能且缺乏植物和无脊椎动物病毒siRNA的生化特征、尺寸和分布模式。病毒感染是否在哺乳动物中引发典型病毒siRNA的产生或者哺乳动物病毒感染是否需要对抗病毒RNAi响应的特异性抑制仍然是未知的。

本公开书是基于RNA沉默充当动物细胞中的抗病毒防御机制这一发现。具体地说，本公开书确定了病毒可以诱导强烈的病毒RNA沉默且相同的病毒配备有感染所必需的有效沉默抑制子。在此项发现之前，已经知道RNA降解可以通过dsRNA在动物中被人工诱导，以及RNA沉默是植物中的抗病毒防御机制，但是并不知道RNA降解可以在动物中响应于天然引发物(即病毒)而发生。

新颖的动物抗病毒防御机制的发现为治疗人类和动物病毒疾病以及为基因疗法提供了巨大机会。举例来说，可以通过增强RNA沉默抗病毒防御反应或者通过阻断RNA沉默抑制子的作用来治疗病毒感染。另外，因为RNA病毒是RNA沉默的强力引发剂，所以可以将来自于内源人类基因或异源病毒的外来序列插入减毒RNA病毒中以产生一个新颖类别的治疗载体，用于使特定人类基因失活(基因疗法)或者以反式方式靶向其它病毒(作为活减毒疫苗)。

因此，在一个实施方案中，可以通过减少或消除产生RNAi病毒抑制子(VSR)的病毒基因来产生减毒疫苗。可以在重组病毒基因组中对基因进行遗传改造或敲除。举例来说，在一个实施方案中，本公开书提供一种缺乏功能性RNAi病毒抑制子(VSR)的减毒病毒，其中所述病毒能够感染宿主细胞且其中宿主细胞可以使用siRNA针对病毒载体产生防御。在一个实施方案中，举例来说，病毒是埃博拉病毒，且病毒缺乏功能性VP35(SEQIDNO:1)：

MTTRTKGRGHTAATTQNDRMPGPELSGWISEQLMTGRIPVSDIFCDIENNPGLCYASQMQQTKPNPKTPNSQTQTDPICNHSFEEVVQTLASLATVVQQQTIASESLEQRITSLENGLKPVYDMAKTISSLNRVCAEMVAKYDLLVMTTGRATATAAATEAYWAEHGQPPPGPSLYEESAIRGKIESRDETVPQSVREAFNNLDSTTSLTEENFGKPDISAKDLRNIMYDHLPGFGTAFHQLVQVICKLGKDSNSLDIIHAEFQASLAEGDSPQCALIQITKRVPIFQDAAPPVIHIRSRGDIPRACQKSLRPVPPSPKIDRGWVCVFQLQDGKTLGLK。

在另一个实施方案中，病毒包括野田村病毒，且所述病毒缺乏功能B2蛋白(SEQIDNO:2)：

MTNMSCAYELIKSLPAKLEQLAQETQATIQTLMIADPNVNKDLRAFCEFLTVQHQRAYRATNSLLIKPRVAAALRGEELDLGEADVAARVRQLKQQLAELEMEIKPGHQQVAQVSGRRKAAAAAPVAQLGRVGVVNE。

在另一个实施方案中，减毒病毒包括分别缺乏功能VP35或B2且包含表达抗原或期望多肽的另一种异源多核苷酸的上述埃博拉病毒或野田村病毒。

在一个实施方案中，本公开书提供重组减毒病毒，其包含足以激活宿主中的病毒RNA沉默的病毒序列。此类多核苷酸典型地缺乏编码功能性病毒RNA沉默抑制子(VSR)的序列。在另一个实施方案中，本公开书提供鉴别另外的RNA沉默抑制子的方法。抑制子可以通过使用本公开书的重组DNA构建体的功能方法或者通过用于鉴别具有类似关键特征的其它基因的生物信息学/序列分析方法来鉴别。在另一个实施方案中，本公开书提供用于使基因失活的重组DNA构建体，其中所述构建体包含足以激活RNA沉默的病毒序列和用于失活的靶标基因。在另一个实施方案中，本公开书提供使用本公开书的重组DNA构建体来鉴别抗病毒RNA沉默路径中的基因的方法。本公开书还提供用于鉴别RNA沉默抑制子和抗病毒RNA沉默路径的调节剂的方法，以及用于通过上调抗病毒路径来治疗被病毒感染的动物和预防病毒感染的方法。本公开书进一步提供缺乏功能VSR的任何减毒病毒载体。另外，本公开书包括此类缺乏功能VSR的减毒病毒用于接种疫苗和用于针对由减毒病毒携带的抗原(例如异源抗原)诱导免疫反应的用途。

本公开书提供具有足以激活RNA沉默的病毒多核苷酸序列但是缺乏功能VSR基因的载体。这些载体具有多种用途，包括基因疗法、免疫接种和接种疫苗，以及鉴别抗病毒RNA沉默防御路径中的基因。这些载体典型地缺乏编码功能病毒RNA沉默抑制子的序列。这典型地是通过缺失所有或基本上所有的编码抑制子的序列、使抑制子序列突变以破坏功能或使抑制子序列突变以降低活性来实现的。在某些情况下，多核苷酸也可以编码具有弱活性的天然抑制子。

所属领域的技术人员将认识到，减毒病毒包括能够诱导宿主细胞中的siRNA沉默/抑制的任何病毒。在某些实施方案中，载体是感染性病毒载体。此类载体包含缺乏VSR的病毒基因组，且可以任选地包含目的多肽的异源编码序列。在其它实施方案中，除了去除VSR基因以外，还已经对病毒基因组进行修饰以去除赋予毒力的序列。

本公开书的感染性病毒载体典型地能够感染大范围的宿主，包括人、狗、猫、马、牛、猴和其它哺乳动物物种；这些病毒载体通常能够有效地感染人类。可以使用已被开发出来用作基因疗法载体的任何病毒。示例性病毒包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、鼠白血病病毒、腺相关病毒、1型单纯疱疹病毒等。另外，病毒载体可以来源于人腺病毒或牛腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、小鼠细小病毒(MVM)、HIV、辛德毕斯病毒、劳氏肉瘤病毒和MoMLV的基因组。在某些实施方案中，本公开书的感染性病毒载体进一步包含改变宿主范围的多核苷酸序列。可以通过掺入宿主范围的这些决定子来构建宿主范围与天然病毒多核苷酸序列不同或与之相比更宽的感染性病毒载体。

病毒DNA或RNA可以使用所属领域的技术人员已知的标准方法被引入细胞中。此类方法包括电穿孔、使用DNA枪、磷酸钙介导的转染、脂质介导的转染、使用被设计用于此类目的的试剂盒等。载体还可以通过其它系统被引入，所述其它系统包括但不限于：HVJ(仙台病毒)-脂质体基因递送系统(参见例如Kaneda等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.811:299-308(1997))；“肽载体”(参见例如Vidal等人,CRAcad.SciIII32:279-287(1997))；作为附加体或质粒载体中的基因(参见例如Cooper等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:6450-6455(1997),Yew等人HumGeneTher.8:575-584(1997))；作为肽-DNA聚集体中的基因(参见例如Niidome等人,J.Biol.Chem.272:15307-15312(1997))；作为“裸DNA”(参见例如美国专利号5,580,859和美国专利号5,589,466)；在脂质载体系统中(参见例如Lee等人,CritRevTherDrugCarrierSyst.14:173-206(1997))；被聚合物包被的脂质体(Marin等人,美国专利号5,213,804，1993年5月25日授权；Woodle等人,美国专利号5,013,556,1991年5月7日授权)；阳离子脂质体(Epand等人,美国专利号5,283,185,1994年2月1日授权；Jessee,J.A.,美国专利号5,578,475,1996年11月26日授权；Rose等人,美国专利号5,279,833,1994年1月18日授权)。

足以激活RNA沉默的病毒部分可以通过使用所属领域的技术人员已知的标准诱变和缺失方法容易地鉴别。举例来说，可以将包含具有各种缺失且缺乏功能RNA沉默抑制子的病毒基因组的载体转染入细胞中，且测试其RNA沉默活性。针对RNA沉默的分析法包括测量病毒RNA的积累或检测在RNA降解期间产生的中间物(例如siRNA等)。

本公开书的载体可以使用分子生物学中的标准方法构建，例如在许多通用分子生物学教科书(例如Sambrook等人,MolecularCloningaLaboratoryManual第2版ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor(1989)，和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(现行版))中所描述的方法。

在一个实施方案中，本公开书提供动物病毒的RNA沉默抑制子。这些动物病毒可以是DNA或RNA病毒。特定病毒可以编码一种以上RNA沉默抑制子。

在一个实施方案中，本公开书提供一种被称为B2(例如SEQIDNO:2)的RNA沉默抑制子。在其它实施方案中，本公开书提供其它动物病毒的RNA沉默抑制子，所述其它动物病毒包括其中感染分布广泛、具有严重后果、或者在开发有效疫苗或治疗剂方面已经取得有限成功的那些病毒。示例性病毒包括HIV、HCV、HBV、流感病毒、麻疹病毒等。在某些实施方案中，本公开书还提供鉴别内源/细胞RNA沉默抑制子的方法(参见Anandalakshmi等人,Science290:142-144(2000))。单独使用湿法工作台实验(wet-benchexperimentation)或使用其与容易获得的生物信息学的组合，所鉴别的VSR序列(例如SEQIDNO:1和2)可用于鉴别来自于其它病毒的同源物(homolog)。

可以使用此处提供的教导内容和所属领域的技术人员已知的标准方法鉴别沉默抑制子。举例来说，通过序列分析、使用本文中描述的载体的功能测试或其组合鉴别抑制子。

因此，可以利用病毒基因组的分析来鉴别RNA沉默抑制子。因此方便地检查病毒基因组中的“重叠”基因。重叠基因通常仅在特定分类群中是保守的，且其编码的蛋白质可能具有不寻常的生化性质。在一些实施方案中，特别要注意+1阅读框中的RNA聚合酶的“重叠”基因。然而，所属领域的技术人员将容易地理解，推定的病毒RNA沉默抑制子不限于这个特定实施方案；抑制子可以与任何阅读框中的任何基因重叠。

在一些实施方案中，将检查病毒基因组中的似乎是毒性和病毒积累所必需，但是不存在已知的具体功能的基因。还典型地检查病毒基因组中的为某些细胞类型中的病毒感染所必需但不为其它细胞类型中所必需的基因。具有这些特征的基因是抑制子基因的良好候选者(参见表1)。

表1.各种病毒的RNA沉默抑制子。

一旦鉴别出推定的RNA沉默抑制子，就可以使用所属领域的技术人员已知的任何功能测试(例如在以下章节中描述的那些)对其进行测试。

还可以使用本文中描述的载体通过功能测试来鉴别RNA沉默抑制子。典型地，一项测试将检查由候选RNA沉默抑制子基因编码的多肽阻碍、阻断或减缓病毒载体所诱导的RNA沉默的能力。

在特定实施方案中，本公开书的方法包括表达足以在细胞中激活如本文中所定义的RNA沉默的病毒的多核苷酸序列(“被沉默病毒序列”)，将编码候选RNA沉默抑制子的多核苷酸引入到细胞中，和测试“被沉默病毒序列”的增加的积累率或程度。

应理解多核苷酸序列可以是感染性载体或非感染性载体的一部分。应进一步理解，“被沉默病毒序列”和候选抑制子序列可以位于相同或不同的载体上且在不同的时刻引入。在一些实施方案中，“被沉默病毒序列”在候选抑制子基因之前引入。基于使用植物抑制子的研究，已经知道某些病毒RNA沉默抑制子靶向RNA沉默早期，而其它的则靶向晚期(参见Li和Ding,Curr.Opin.Biotech.12:150-154(2001))。除非在RNA沉默起始之前或期间被表达，否则靶向RNA沉默路径的早期的抑制子不大可能是活性的。因此，在一些实施方案中，在RNA沉默之前或者期间，抑制子基因与“被沉默病毒序列”被引入到同一载体上；在引入"被沉默病毒序列"之前被引入到另外的载体上；或者与"被沉默病毒序列"被引入同一载体上，但是经过改造从而首先表达。

“被沉默病毒序列”可以在其中抗病毒RNA沉默路径响应于“被沉默病毒序列”而被激活的任何动物细胞中表达。在某些实施方案中，使用哺乳动物细胞。

候选RNA沉默抑制子可以是通过以上章节中描述的序列分析所鉴别的任何基因，或者是具有表明基因可以是RNA沉默抑制子的性质或序列的任何其它基因。为了鉴别病毒RNA沉默抑制子，候选基因可以来自于病毒。为了鉴别内源抑制子，候选基因可以来自于与宿主细胞相同的有机体的基因组，或者来自于不同有机体的基因组。

“被沉默病毒序列”的RNA积累可以使用所属领域的技术人员已知的任何方法测量；这些方法包括用于检测与多核苷酸连接的报道分子的Northern印迹或分析法。报道分子可以是可检测的荧光分子或者可选择的抗生素标记。RNA沉默的抑制允许GFP的表达，GFP可以通过UV照明来显现。活跃的RNA沉默产生红色荧光区域。

在某些实施方案中，缺乏功能VSR的上述减毒病毒载体进一步包含目的多核苷酸。所属领域的技术人员将认识到，本公开书的载体可用于其中期望特定基因的基因递送或蛋白质表达水平的任何应用。本公开书的载体尤其可用于其中抑制病毒传播非常重要、但是期望基因序列的定点递送的方法。

本公开书还提供通过上调病毒RNA的降解且因此降低病毒水平来治疗或预防病毒感染的方法。典型地，使用用本文中所公开的方法鉴别的调节剂，通过激活抗病毒RNA沉默路径或者通过抑制任何RNA沉默抑制子来上调病毒RNA的降解。

在另一个实施方案中，减毒病毒被用作疫苗，其中所述病毒缺乏功能性抑制子系统(例如VSR)，使得病毒包含抗原，但是具有有限的复制和传播能力，因为减毒病毒不能抑制宿主细胞RNA沉默路径。

在另一个实施方案中，通过施用上调抗病毒沉默路径中的基因表达水平或增强抗病毒沉默路径中的基因活性的医药组合物来激活宿主细胞中的抗病毒沉默路径。

在另一个实施方案中，通过施用抑制RNA沉默抑制子的活性或降低RNA沉默抑制子的表达水平的VSR抑制剂来阻断或降低RNA沉默的抑制。此类药剂的实例包括抗体和siRNA。

因此，本公开书提供一种识别且结合VSR抑制子的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含可变重链(V_H)结构域和/或可变轻链(V_L)结构域，且其中(a)所述V_H结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括1个、2个或3个互补决定区(CDR)。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段选自由以下组成的群组：(a)具有包含互补决定区的重链和轻链结构域的抗体或scFv；和(b)具有包含互补决定区的重链和轻链结构域的抗体或scFv。在任何上述内容的另一个实施方案中，重链和轻链结构域连接到Fc区上，典型地通过连接子/铰链结构域。在一个实施方案中，scFv在生理条件下是可溶的。在另一个实施方案中，scfv是鼠科的。在另一个实施方案中，scfv是人源化的。

本公开书提供结合到VSR抑制子上的抗体、抗体片段和人源化抗体。抗体片段可以通过传统方法例如酶消化或通过重组技术产生。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体存在一些优势。片段的更小尺寸允许快速清除，且可能导致更容易进入肿瘤、斑块和患病组织。关于特定抗体片段的综述，参见Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134。

已经开发了用于生产抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是经由完整抗体的蛋白水解消化而得到的(参见例如Morimoto等人,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接生产。Fab、Fv和ScFv抗体片段可以在大肠杆菌(E.Coli)中表达和从大肠杆菌分泌，从而容易生产大量的这些片段。抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离。或者，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌回收且被化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter等人,Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)₂片段。在美国专利号5,869,046中描述了包含抢救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段。用于生产抗体片段的其它技术对于所属领域的技术人员将是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185、美国专利号5,571,894和5,587,458。Fv和scFv是具有完整的结合位点但是缺乏恒定区的唯一种类；因此，其可适合于在体内使用期间降低的非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端融合效应蛋白。参见AntibodyEngineering,Borrebaeck编,上文。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利号5,641,870中所描述的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。

本公开书提供在受试对象中诱导病毒响应的方法，其包括对受试对象施用含有减毒病毒的组合物。在这些方法中，组合物可以作为单剂、双剂或多剂施用。人类体内的给药途径可以是吸入、鼻内、经口和肠胃外。肠胃外给药途径的实例包括真皮内、肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下给药。人类免疫接种剂量的范围可以为约10²到约10⁹PFU。本文中所公开的方法在受试对象中诱导体液免疫反应和细胞免疫反应。此外，在本公开书的实施方案中，这些方法在受试对象中诱导保护性免疫反应。保护性免疫反应可以是其中受试对象不展现任何感染症状、展现症状的减少、组织或鼻分泌物中的病毒滴度的降低、和/或抵御特定病毒感染的完全保护。

本公开书还提供用于施用本公开书的减毒病毒的试剂盒，所述减毒病毒以有助于减毒病毒在实施本公开书的方法中使用的方式包装。在一个实施方案中，此类试剂盒包括本文中描述的减毒病毒或组合物，所述减毒病毒或组合物被包装在容器例如密封瓶或器皿中，所述容器带有粘贴在容器上或者包括在包装中的标签，所述标签描述化合物或组合物在实施所述方法中的使用。优选地，减毒病毒或组合物以单位剂型包装。试剂盒可以进一步包括适合于根据特定给药途径给药或者适合于实施筛选分析的装置。优选地，试剂盒含有描述减毒病毒的使用的标签。在一些实施方案中，试剂盒包括关于对人类受试对象给药的使用说明书。

本文中还提供了生产表达本公开书的突变VSR多核苷酸的减毒病毒的方法。举例来说，生产本公开书的突变VSR多核苷酸包括以下步骤：(a)用减毒病毒感染适当的永久细胞系(例如哺乳动物癌细胞系)，(b)用包括编码突变VSR多核苷酸序列的多核苷酸以及与NoV基因组的VSR编码区同源的侧翼序列的质粒转染被感染的细胞，(c)使细胞生长以允许在NoV于细胞中复制期间质粒与NoV基因组重组，从而将基因盒插入NoV基因组的非必需区中，和(d)获得所生产的重组VSR。示例性细胞包括在美国专利号5,391,491(Slavik等人1983)中描述的鸡胚细胞，或脊椎动物细胞系，例如MRC-5、MRC-9、CV-1(非洲绿猴)、HEK(人胚肾)、PerC6(人成视网膜细胞)、BHK-21细胞(幼仓鼠肾)、BSC(猴肾细胞)和LLC-MK2(猴肾)。BHK-21细胞是根据世界卫生组织可接受的用于生产病毒疫苗的细胞系。在一些实施方案中，本公开书的减毒病毒在BHK-21细胞中生产。

下列实施例是用来说明而不是限制本公开书。虽然它们是可能使用的那些中有代表性的，但是所属领域的技术人员已知的其它程序也可以替代性地使用。

实施例

细胞系和病毒.从美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)获得BHK21细胞并将其在完全生长培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′sModifiedEagle′sMedium，DMEM)+10％胎牛血清)中于37.0℃和5％CO₂下繁殖。野田村病毒(NoV)拯救自感染性cDNA克隆并在BHK21细胞中繁殖。通过用野生型RNA-2和突变型RNA-1的全长NoVcDNA克隆的体外转录物转染BHK21细胞来产生B2缺陷型突变病毒(NoVΔB2)，所述突变型RNA-1含有3个点突变(U2745C、U2754C和C2757G)以终止B2ORF的翻译，同时不影响病毒RNA依赖性RNA聚合酶的-1重叠ORF。通过RT-PCR和DNA测序且通过使用针对B2蛋白的兔抗体的Western印迹法确认NoVΔB2的基因型。通过比较NoVΔB2病毒粒子中的基因组RNA含量与NoV病毒粒子中的基因组RNA含量来确定NoVΔB2浓度。

mESC的细胞培养和体外分化：在不存在饲养细胞的情况下，在涂布有明胶的载体上，于达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Invitrogen)中培养雌性PGK(129×PGK背景)、雄性HM1(129/Ola背景)、Dcr^Flx/Flx和Dcr^-/-(混合背景)，DMEM含有15％的针对mESC的最佳生长所测试的特殊选择批次的胎牛血清FBS(LifeTechnologies)、1000U/mLLIF(Millipore)、0.1mM2-β巯基乙醇(LifeTechnologies)、0.05mg/mL的链霉素(Sigma)和50U/mL的青霉素(Sigma)。在不存在饲养细胞的情况下，在涂布有明胶的载体上，于GlasgowMEM培养基(Invitrogen)中培养雄性E14(129/Ola背景)mESC细胞系和E14-FHA-hAgo2(通过转染质粒pIRESneo-FLAG/HAAgo2corrected(Addgene质粒10822)和在含G418的培养基上选择来产生)，所述GlasgowMEM培养基含有15％FBS(LifeTechnologies)、1000U/mLLIF(Chemicon)、0.1mM2-β-巯基乙醇(Invitrogen)、0.05mg/mL的链霉素(Invitrogen)和50U/mL的青霉素(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠MEM和1XMEM氨基酸。培养基每天更换一次。所有细胞都在37℃和8％CO₂下生长。从Dcr^Flx/Flx侧翼为LoxP的Dcr^Flx/Flx小鼠与ROSA-CreERT2小鼠的杂交种分离新的CreERT2-Dcr^Flx/FlxmESC。表S3展示了用于表征这些细胞系的基因分型引物。诱导型mESC细胞系(E7细胞系)缺乏这4种小鼠Argonaute(Ago1,2,3,4_KO)且携带有侧翼为LoxP的人类Ago2转基因。用在细胞培养基中1:1000稀释到1μM最终浓度的4-OHT(Tam)储备溶液(1mM，溶解于100％乙醇中)诱导Dcr和hAgo2缺失。为了产生Dcr^-/-，用4-OHT处理Dcr^Flx/FlxmESC长达12天，且将分离的克隆繁殖若干世代以获得用于该研究的组成型Dcr^-/-mESC细胞系。在基因组层面通过基因分型且在功能层面通过各种miRNA(miR-295、miR-16)产量的损失以及已知miRNA靶标(Hmga2和Btg2)的含量的增加来确认Dcr的缺失。通过将mESC在低附着性组织培养皿中聚集到无LIF的DMEM(10％FBS培养基)中直到分化第10天来产生胚状体培养物。培养基每天更换一次。所有细胞都在37℃和8％CO₂下生长。在补充有10％胎牛血清“金”(PAA)、100U/mL青霉素(Sigma)和0.1mg/mL链霉素(Sigma)的含有Glutamax^TM的达尔伯克改良伊格尔培养基(Gibco,LifeTechnologies)中培养BHK-21细胞。

重组病毒的生产：使用含有EMCV株(2887A/91)的全长cDNA克隆(pBL/T7EMCgB2887)的重组载体生产EMCV。简单来说，用NotI将pBL/T7EMCgB2887(10μg)线性化4小时，且使用GeneJET胶提取和DNA净化试剂盒(GelExtractionandDNACleanupMicroKit)(Fermentas)纯化DNA。使用MEGAscript试剂盒(Ambion)，在37℃下用T7RNA聚合酶对线性化质粒(1μg)进行体外转录2小时。然后在37℃下用TurboTMDNA酶(Ambion)消化DNA30分钟，且用Tri-Reagent(Sigma)根据制造商的说明书提取RNA。利用甲醛琼脂糖电泳测定所合成的RNA的尺寸。在6孔培养皿中，分别使用FuGENE6(RocheAppliedScience)转染试剂(μL)与DNA(μg)的3:1比率，用体外转录的RNA(4μg)转染50％融合的BHK-21细胞。两天后，当细胞病变效应(CPE)很明显时，采集上清液且通过离心(1500rpm/300g，5min)净化。通过用1mL含EMCV的上清液在T75烧瓶中感染50％融合细胞而将被拯救的病毒在BHK-21细胞上传代，且在37℃和5％CO₂下培育细胞1小时。然后加入培养基且将细胞培育1天直到CPE出现为止。通过3个冷冻-解冻循环溶解细胞，且收集上清液，通过离心(1500rpm/300g，5min)净化，等分并储存在-80℃。通过针对BHK-21细胞的50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)分析法确定滴度。简单地说，用10倍病毒稀释液感染BHK-21细胞，且将其在37℃和5％CO₂下培育1到2天。通过在显微镜下检视来确定CPE，且使用Reed和Muench统计方法，将具有CPE的孔的数目用于计算TCID₅₀。NoV和NoVΔB2DNA克隆和病毒粒子的生产如本文中所述。

mESC的感染：在感染当天，更换培养基，且以50-100TCID₅₀/细胞的剂量(在BHK-21细胞中确定)将EMCV加入到于T75烧瓶中培养的50-80％融合mESC上。在感染后将细胞在37℃和8％CO₂下培育3或6小时，然后用磷酸盐缓冲盐水1X(PBS1X)洗涤两次，胰蛋白酶化，然后收集。使细胞沉淀，用PBS1X再一次洗涤，且处理以用于下游应用。对于旨在测试来源于EMCV的小RNA的DCR依赖性的实验来说，使用经过多个世代被维持在培养中且在感染前一天被接种在T-75烧瓶中的Dcr^Flx/Flx和组成型Dcr^-/-mESC。密度使得在感染当天获得Dcr^Flx/Flx和Dcr^-/-mESC的类似数量。然后依据前述感染程序用EMCV攻击细胞。利用NoV和NoVΔB2的感染：在感染当天，制备混合物，其中病毒制品(1mL的NoV或1mL的NoVΔB2)与无FBS的GlasgowMEM完全培养基(9mL)混合。用含有钙和镁的达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco,LifeTechnologies)将于T75烧瓶中生长的30-40％融合度的E14mESC细胞系洗涤两次，然后通过加入感染混合物将其感染。将细胞在37℃和8％CO₂下培育1小时，然后更换培养基，且将细胞在37℃和8％CO₂下培育3天。然后用不含钙和镁的PBS1X(Gibco,LifeTechnologies)洗涤细胞，胰蛋白酶化且沉淀以用于下游应用。对于遗传拯救实验，对缺乏4种小鼠Argonaute(Ago1,2,3,4_KO)且携带有侧翼为LoxP的人类Ago2转基因的诱导型mESC细胞系(E7细胞系)进行感染。在感染前，用4-OHT(在1μM下使用)处理E7mESC细胞系2天以诱导Ago2转基因的缺失，而未经处理的E7mESC被用作对照组。两天后，依据前述感染程序用NoV或NoVΔB2攻击未经处理和经处理的E7mESC。然后在37℃和8％CO₂下在存在4-OHT的情况下将细胞进一步培育3天，用不含钙和镁的PBS1X洗涤，且沉淀以用于下游应用。

病毒源性小RNA的文库构建和测序.使用如Han等人(J.Virol.85:13153-13163(2011))中所描述的依赖于小RNA的5′单磷酸盐的方法构建来自于细胞培养物和乳小鼠的小RNA的文库。使用来自于用NoV或NoVΔB2接种2或3天后的BHK-21细胞的全部小RNA来构建文库，其具有被添加给5′连接接头的条码。使用Illumina(SanDiego,CA)的TruSeq小RNA样品制备试剂盒构建来自于用NoVΔB2接种1天或2天后或在用NoV接种4天后的乳小鼠后肢组织的全部小RNA的文库。用IlluminaHiSeq2000对文库测序。使用Bowtie0.12.9将具有100％同一性的病毒源性小RNA(vsRNA)读段定位至野田村病毒基因组(NC_002690.1和NC_002691.1)。只有与miRBase19中的全长成熟miRNA是100％一致的那些读段才被确定为是细胞微小RNA。对于BHK-21细胞文库，从表征中国仓鼠卵巢细胞系中的miRNA的先前研究获得miRNA列表。使用Perl脚本执行成熟细胞miRNA和病毒小RNA的随后的生物信息学分析。通过用一些改动修改Parameswaran等人(PLoSPathog.6:e1000764(2010))和Brennecke等人(Drosophila.Cell128:1089-1103(2007))中先前描述的基本原理来计算每个文库中的不同距离类别中的互补22-ntvsRNA的对。该程序使用等式1计算互补22-ntvsRNA的5′端和3′端之间的每一核苷酸距离类别中的对数：

x指示每一距离类别。

a和b通过所检查的小RNA的尺寸确定。

f(x)指示每一距离类别的小RNA对的总数。

i指示来自于正链的小RNA。

t指示正链小RNA的总数。

j指示与距离类别x中的小RNAi重叠的来自于负链的小RNA。

l_xi指示符合由x和i确定的要求的负链小RNA的总数。

n_i指示小RNAi的重复数目。

p_i指示小RNAi的多病毒基因组命中数。

m_j指示小RNAj的重复数目。

q_j指示小RNAj的多病毒基因组命中数。

稳定细胞系.将B2和VP35基因克隆入pQCXIP反转录病毒载体(pQCXIP-B2和pQCXIP-VP35)中。在转染前一天将BHK细胞接种到6孔板中。使用转染试剂(Mirus,Madison,WI)，依据供应商的推荐方案，用LASVGP蛋白、gag-pol和pQCXIP-B2(或pQCXIP-VP35)表达质粒转染细胞。在转染后6小时，去除转染培养基并将细胞维持在新的生长培养基中。在转染48小时后采集上清液，且使用0.45μm注射器式滤器过滤。构建表达野田村病毒(NoV)的B2或埃博拉病毒的病毒粒子蛋白35(VP35)的稳定的BHK-21细胞系，且如Huang等人(PLoSPathog.7:e1001258(2011))中所述，使用用于转导的假型鼠白血病病毒来选择所述稳定的BHK-21细胞系。这些仓鼠细胞系被称为BHK-B2和BHK-VP35细胞。如Johnson等人(Virology305:436-451(2003))中所述，起初从BHK-21细胞中的全长cDNA克隆的感染性体外转录物拯救NoV和其B2缺陷突变体(NoVΔB2)。NoVΔB2的RNA-1含有3个点突变(U2745C、U2754C和C2757G)，以在不影响病毒RNA依赖性RNA聚合酶的-1重叠ORF的情况下终止B2ORF的翻译，如Johnson等人所述。NoVmB2的RNA-1在RNA1的核苷酸2919处含有单个G到A取代，其将B2ORF的第59个密码子CGA(Arg)变为CAA(Gln)，而不改变-1重叠ORF处的Ser(TCG变为TCA)的编码。通过测序和使用针对NoVΔB2的兔抗体的Western印迹法确认NoVΔB2和NoVmB2的基因型。在Western印迹分析中，mB2比野生型B2略微更快地移动(参见图3)。

细胞培养物中的感染.NoV在BHK-21细胞中繁殖，而NoVΔB2和NoVmB2在稳定的BHK-B2细胞中扩增，因为这两者在BHK-21细胞的感染方面方面有缺陷。因为NoV是非溶细胞性的且NoVΔB2感染有缺陷，所以通过先前报道的实时RT-PCR方案测定在NoV和NoVΔB2的储备制品以及NoVmB2制品中的病毒基因组RNA1的拷贝数。简单地说，用T7聚合酶体外合成具有已知浓度的NoVRNA-1的10倍稀释液系列，并将其用于通过实时RT-PCR用NoV复制酶(Replicase)_Fwd和NoV复制酶_Rev扩增RNA-1的核苷酸595-732来建立标准曲线(参见表2)。使用标准曲线作为参考，通过相同的实时RT-PCR定量从确定体积的每一种病毒储备制品中提取的病毒粒子RNA。这种定量方法显示，每毫升NoV、NoVΔB2和NoVmB2的储液分别含有7×10⁸、3.6×10⁸和1.3×10⁸个基因组RNA拷贝。

对于在细胞培养物中的感染，将BHK-21、BHK-B2或BHK-VP35细胞接种在6孔板中，且在每个孔中对所述细胞进行模拟接种或用具有相同量的病毒基因组拷贝(5×10⁶)的NoV和NoVΔB2进行感染。每隔12小时采集细胞，持续到感染后72小时(hpi)，且通过用于扩增RNA-1的核苷酸595-732的实时RT-PCR，使用β-肌动蛋白mRNA作为内部对照，使用从细胞中提取的总RNA来测量每个时间点的病毒积累(参见下文)。还通过Northern印迹分析法检测48和72hpi时的NoV或NoVΔB2RNA的积累(参见下文)，且记录每次感染的RNA-1信号的磷屏成像仪读数。时程实验另外重复两次。

乳小鼠中的感染.通过如(29)所述腹膜内注射(IP)分别来自于NoV、NoVΔB2、NoVmB2储备2制品的滴定组的10μl、30μl或50μl而对出生后6到8天大的5只BALB/c小鼠(JacksonLab,BarHarbor,ME)中的每一只接种。因此，接种给每只小鼠的病毒基因组拷贝数的比率为1(NoV):1.54(NoVΔB2):0.93(NoVmB2)。在接种1、2、3、4和7天后，使用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA)根据制造商说明书从一只经过麻醉的乳小鼠的单独前肢(2个样品)和后肢(2个样品)组织分别提取总RNA。该实验重复两次。因此，每种病毒的每个时间点都由来自用于3次生物学重复中的3只小鼠中的每一只的4个RNA样本表示。然而因为用在此项研究中的NoV的滴度截至接种5天后引起乳小鼠100％的死亡率，所以利用NoV的时程感染在随后实验中被终止，且感染的小鼠在接种4天后当后肢瘫痪变得明显时被实施安乐死。

乳小鼠中的高分子量和低分子量病毒RNA的检测.使用上文所述的被提取的RNA样品，通过使用iScript^TMSelectcDNA合成试剂盒和iQSYBRgreenSupermix(超混液)(Bio-Rad,Richmond,CA)的定量PCR测定小鼠中的病毒积累。将来自于每只被接种小鼠的单独前肢或后肢组织的1μg总RNA用于cDNA合成，且将获得的cDNA产物的1/100用于使用NoV复制酶_Fwd和NoV复制酶_Rev引物扩增NoVRNA-1的核苷酸595-732的实时PCR。将病毒RNA-1的相对丰度对比作为内部对照的β-肌动蛋白mRNA进行标准化，且如Han等人所述通过ΔCT方法评估。使用来自于细胞培养物或小鼠组织的5μg总RNA，如Han等人所述，通过Northern印迹杂交法来检测正链病毒基因组和亚基因组RNA。在一个修改方案中，Han等人还描述了使用来自于每个小鼠的组织样品的20μg总RNA和化学交联的病毒siRNA的Northern印迹检测。所用的探针是从Exiqon(Woburn,MA)购买的4种被³²P标记的合成锁核酸(LNA)寡核苷酸的混合物，如Kurreck等人(NucleicAcidsRes.30:1911-1918(2002))中所述。这些LNA探针对应于NoVRNA-1的核苷酸1-50、2754-2797和3151-3198和NoVRNA2的核苷酸1-42，且对靶向这些区域的负链的检测具有特异性。关于这些LNA探针的位置和病毒siRNA的热点请参见图6B。

mESC和拟南芥(Arabidopsisthaliana)RNA分析：从mESC和从拟南芥SUC:SUL细胞系(生态型Col-0)的3周龄幼苗提取总RNA，且使用Isol-RNA溶解试剂(5PRIME)根据制造商说明书纯化。对于低分子量(LMW)RNA的Northern印迹分析，如Jay等人(Methods63:85-92(2013))中所述分级分离总RNA且分离LMWRNA。使用分光光度计确定产量，且将等量的LMWRNA(2-10μg)在变性17.5％聚丙烯酰胺/脲凝胶上解析，转移到Hybond^TM-NX膜(GEHealthcare)上且使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学交联，如Pall等人(Nat.Protoc.3:1077-1084(2008))中所述。对于高分子量(HMW)RNA的Northern印迹分析，将5μg的总RNA在具有2.2M甲醛的变性1.2％琼脂糖凝胶上解析，毛细管转移到Hybond^TM-NX膜(GEHealthcare)上且通过UV照射来交联。通过RNA凝胶内的总RNA的溴化乙锭染色在转移之前确认相等负载量。在LMW和HMWNorthern印迹法的杂交步骤中使用Perfect-Hyb缓冲液(Sigma)。使用T4多核苷酸激酶(ThermoScientific)，用[γ³²P]ATP5’端标记与miR-16或U6互补的DNA寡核苷酸和与EMCV(+)viRNA互补的锁核酸(LNA^TM,Exiqon)。通过在存在α-³²P-dCTP(HartmannAnalytic)的情况下使用Prime-a-gene试剂盒(Promega)的随机引物法来制造用于检测SULsiRNA的探针。用于这种随机引物反应的模板是使用SUL_Fwd和SUL_Rev引物从拟南芥基因组DNA(生态型Col-0)扩增的400-bp长的PCR产物(参见表2)。表2列出了在此项研究中用于Northern印迹法的所有探针。

表2.引物序列

定量实时PCR.对于利用Nov、NoVΔB2和NoVmB2的小鼠研究：将来自于被感染小鼠的1μg总RNA用作使用iScript^TMSelectcDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Richmond,CA)的cDNA合成的模板。将1/100的cDNA产物用作使用以下列举的基因特异性引物的PCR分析的模板。在存在iQSYBRgreen超混液(Bio-Rad,Richmond,CA)的情况下进行实时定量PCR。对比内部对照(β-肌动蛋白)标准化所选RNA的相对丰度。通过ΔCT方法评估相对丰度。

对于mESC：如Ciuado等人(Methods63:85-92(2013))中所述进行实时PCR。简单地说，用于miRNA和对照U6snRNA的实时PCR试剂是来自于Qiagen。对于RT反应，使用miScript反转录试剂盒(Qiagen)依据制造商说明书反转录1μg总RNA。在RT反应后，将cDNA产物在蒸馏水中稀释5次，且在使用QuantiTectSYBRGreenPCR强效预混液(MasterMix)和miScript通用引物(Qiagen)的PCR中使用2μL的稀释cDNA。在LightCycler480实时PCR仪(Roche)上如下进行PCR反应：95℃下持续10min，随后经历95℃下15s和60℃下30s的40个循环。使用Rrm2作为报道基因，如Bourdet等人(PLoSGenet.2:e94(2006))中所述进行用于mRNA的实时PCR。基于2-ΔCT方法计算样品与对照组之间的差别。每个实时PCR反应都使用来自于所有mESC的两种独立培养物的样品一式三份地进行。表2列举了用于此项研究中的所有引物。

qPCR阵列.使用来自于QIAGEN(Valencia,CA)的路径聚焦小鼠抗病毒响应RT²Profiler^TMPCR阵列，根据制造商说明书来比较在用NoV或NoVΔB2感染后的乳小鼠中的先天免疫反应。所述阵列含有在由Toll样、Nod样和RIG样免疫受体引发的先天免疫性中所涉及的84种关键基因的qPCR引物，外加作为内部对照的5种看家基因。简单地说，从由缓冲液、NoV或NoVΔB2接种4天后的同窝出生小鼠分离的1μg总RNA被用于使用iScript^TMSelectcDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Richmond,CA)的cDNA合成。将等量的cDNA与iQSYBRgreen超混液(Bio-Rad,Richmond,CA)混合，随后转移到含有预分配的基因特异性引物组的96孔PCR阵列板中。根据制造商说明书执行CFX96仪器(Bio-Rad,Richmond,CA)上的热循环和PCR阵列基因表达数据3的分析(http://www]///[sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)。

细胞裂解物和免疫沉淀物.将mESC刮入到细胞裂解缓冲液(25mMTris(pH7.9)，250mMKCl，0.2mMEDTA，20％甘油，补充有蛋白酶抑制剂混合物(Complete,Roche))中。细胞在冰上裂解10分钟，超声处理，且离心(10,000rpm，4℃下10min)，随后进行Western印迹法或免疫沉淀(IP)。对于E14-FHA-hAgo2，将裂解物在4℃下与20μL的抗FLAG磁珠(Invitrogen)一起培育12小时。对于内源mAGO2的IP，将E14裂解物在4℃下与20μL的G-琼脂糖珠(Invitrogen)一起培育2小时，然后与1/10大鼠抗-小鼠Ago2抗体(克隆6F4)一起培育过夜。次日，将裂解物在4℃下与20μL的G-琼脂糖珠(Invitrogen)再次一起培育2小时。通过离心(2000rpm，1min)收集珠子。对于E14-FHAhAGO2的IP，在1mL裂解缓冲液中至少进行3次洗涤，且将珠子与100μL0.1M甘氨酸(pH2.5)在振荡器上一起室温培育10分钟。加入10μL的1MTris-HCl(pH8)以中和洗脱缓冲液。已经利用Isol-RNA裂解试剂(5PRIME)从洗脱蛋白质中提取了免疫沉淀的RNA。对于内源mAGO2的IP，将珠子洗涤3次，再悬浮于1mLIsol-RNA裂解试剂(5PRIME)中。依据制造商说明书分离RNA，且通过加入5倍体积的冰冷丙酮而从酚相沉淀出蛋白质，并将所述蛋白质在-20℃下培育过夜。在13,500rpm和4℃下离心15分钟后，用冰冷的80％丙酮洗涤沉淀物，并将其再悬浮于含有3％[v/v]SDS、62.3mMTris-HClpH8、10％[v/v]甘油的缓冲液中。

Western印迹分析：如Li等人(J.Biol.Chem.283:23397-23409(2008))中所述以微小改动进行Western印迹分析。乳小鼠的肌肉组织用于利用Trizol依据供应商的推荐方案进行蛋白质和RNA的提取，且来自每一样品的蛋白质部分用于Western印迹分析中。接下来，SDSPAGE，转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad,Richmond,CA)上，且在室温下用含有0.1％Tween-20和5％脱脂乳的Tris缓冲盐水封闭1小时。

或者，在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Complete,Roche)的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(含有1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％SDS的磷酸盐缓冲盐水(PBS))中提取总蛋白质。使用Bio-RadDC蛋白质分析试剂盒定量蛋白质，且将等量的蛋白质在Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶上解析，通过电印迹法转移到Inmobilon-PPVDF膜(Millipore)上，且依据标准Western印迹程序在含有0.2％Tween-20和5％脱脂奶粉的PBS中与抗体一起培育。在与结合HRP的二级抗体一起培育后，通过使用ECLWestern印迹检测试剂盒(GEHealthcare)或通过使用结合HRP的抗-兔IgG二级抗体(ThermoFisherScientific,Rockford,IL)和增强型化学发光试剂(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)来显现信号，

通过用针对NoVB2蛋白的兔多克隆抗体在4℃下探查膜过夜来检测NoVB2蛋白。使用小鼠单克隆抗VP1抗体检测来自于EMCV的衣壳蛋白VP1。分别使用大鼠抗-小鼠Ago2(克隆6F4)和兔抗Oct4(ab19857,Abcam,Cambridge,UK)抗体检测内源小鼠AGO2和OCT4蛋白。使用结合过氧化物酶的大鼠单克隆抗体(克隆3F10,Roche)检测带HA标签的蛋白质。肌动蛋白被用作蛋白质负载对照，且通过使用抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体(Chemicon或CellSignalingTechnology,Beverly,MA)来检测。或者，通过在Western印迹法后对膜的考马斯染色来确认等负载。

深度测序和siRNA分析：使用Isol-RNA溶解试剂(5PRIME)提取总RNA，且使用Illumina技术的经调整Illumina方案将5μg加工成测序文库，并通过FasterisSME(http://www]]][[[fasteris.com,Switzerland)测序。已经将所有的下一代测序数据提交给NCBI基因表达汇编(GeneExpressionOmnibus，GEO)，且可以通过收录号GSE43153得到。使用ncPRO管线(pipeline)过滤掉针对小鼠基因组定位的读段且全局分析深度测序的质量。使用采用默认选项但-m5000和-e50的Bowtie将不匹配小鼠基因组的读段针对病毒基因组定位。已经从NCBIftp资源库(http://www]]][[[ncbi.nlm.nih.gov/Ftp/)下载了EMCV和两种NoV基因组序列，其各自的参考名为AF356822.1、NC_002690.1和NC_002691.1。对于所有的相位/周期性研究，基于以下任一种来计算读段计数：从(+)链产生的读段的5′端坐标，和从(-)链产生的读段的3′端坐标；或相反地，从(+)链产生的读段的3′端坐标，和从(-)链产生的读段的5′端坐标。

雷达标图通过显示落入22个可能寄存器中的每一个中的读段的丰度来表示相位。寄存器丰度计算值被计算成针对病毒基因组定位的每个读段的坐标的模数-22的频率。使用R-cran脚本产生显示读段的寄存器和直方图。自相关是检测重复模式的公认数学工具。这种方法显示变数(这里是沿着整个病毒基因组的读段丰度)与其自身的相关。以从1-nt到100-nt渐增的间隔应用，其允许检测针对病毒基因组定位的读段中的周期性(相位)，即使当21到23-nt读段的5′端峰值从数据组中省略时。使用皮尔森相关检验计算P值。谐波模型信号重建是基于典型地用于信号周期性分析或气候学预测的奇异谱分析。这个方法学是通过将沿着病毒基因组的读段丰度视为信号而应用的。在使用对于EMCV和NoV被设为110-nt的窗口参数在特征向量中于开头300-nt上分解信号的第一步之后，使用10个最佳特征向量(即总方差的最佳贡献因子)重建每条链的模型信号。这允许噪声去除和符合原始数据的主要趋势的信号的重建。为了增强清晰度，将模型信号水平乘以5。仅仅考虑21到23nt读段来计算自相关，而奇异谱分析包括所有的读段。自相关和奇异谱分析是使用R中的Rssa包进行的。

哺乳动物病毒siRNA的体外鉴别.使用以上方法，本公开书在细胞培养物和小鼠的哺乳动物RNA病毒感染期间主要检测了22-nt病毒siRNA。野田村病毒(NoV)可通过蚊子传播，对乳小鼠和乳仓鼠的毒力很高，且与昆虫病原体兽棚病毒(FHV)属于同一个二分正链RNA病毒属。在被感染的苍蝇细胞中生产的FHVdsRNA复制中间物被Dicer-2主要加工成21-ntsiRNA；这些病毒siRNA随后通过涉及R2D2和Argonaute-2的RNAi路径指导有效的抗病毒防御，使得B2对RNAi的抑制是细胞培养物和苍蝇成虫两者中的FHV感染所必不可少的。值得注意的是，昆虫细胞培养物中FHV的B2缺陷型突变体的感染的遏制是与病毒siRNA的大量积累有关的，所述积累是因为缺乏B2对病毒siRNA生物发生的抑制。NoV的B2蛋白在体外和昆虫细胞中都展现类似的VSR活性，且在哺乳动物细胞中抑制人工诱导的RNAi。因此，使用类似的NoV的B2缺失突变体攻击被培养的哺乳动物细胞可能有助于哺乳动物病毒siRNA的检测。

使用这种策略，在用NoV或NoV突变体NoVΔB2的病毒粒子接种2天和3天后，检测了来自于幼仓鼠肾21细胞(BHK-21)的18-到32-核苷酸小RNA。NoVB2含有被引入到NoV的RNA1中的3个点突变以防止B2表达，而不会改变在B2的-1阅读框中编码的病毒RNA依赖性RNA聚合酶的氨基酸序列。深度测序在各个4个小RNA文库中得到长度为18到32个核苷酸的9.7到19.1百万读段。每个文库中20％到38％的读段对应于在人和其它哺乳动物物种(包括仓鼠)中保守的细胞miRNA。如对于Dicer依赖性哺乳动物miRNA所已知的，仓鼠miRNA在所有4个文库中主要是22个核苷酸长度。所回收的24.48％和26.76％的读段具有用NoV分别感染2天和3天后的BHK-21细胞中的NoV来源。

在两次独立实验中，比较来自于用NoV或NoVΔB2接种2天或3天后(dpi)的BHK-21细胞的18-到28-nt小RNA的深度测序图谱。在由NoV感染的细胞中，vsRNA的丰度很高，但其对于正链展示压倒性的偏向(～97％)，显示对于Dicer产物没有预计的尺寸偏好。其丰度与尺寸反向相关(参见图1A和表3)，且可能是来自于大量的正链病毒RNA的分解产物。

表3.哺乳动物病毒源性小RNA的图谱

1.在括号里提供文库的全部合格读段中的病毒读段(与病毒基因组RNA1和2具有100％同一性/互补性)的百分比以及文库的全部病毒读段中的正链病毒读段和负链病毒读段的百分比。

2.在每个文库的全部22-nt病毒读段中检测了两个互相不排斥的群体：“-2”是指作为在每条链的3′端具有2-nt突出的完美碱基配对双螺旋的22-nt病毒读段；“+20”是指根据其在病毒基因组中的定位位置而立即连续的22-nt病毒读段。在括号里提供全部病毒读段中的每个群体的百分比。

相比之下，来自于NoVΔB2感染细胞的vsRNA的丰度低得多，且vsRNA展现降低的正链偏向(～85％)(参见表3)。值得注意的是，两个文库中的全部负链vsRNA读段的～77％处于21到23-nt尺寸范围内，具有22-nt的主峰，这类似于Dicer依赖性细胞microRNA(参见图1A和图2A)。独特的负链vsRNA也具有显著的22-nt峰(参见图2B)。因此，NoVΔB2vsRNA展示对于Dicer产物所预计的长度分布模式和链偏向，与对于植物和无脊椎动物病毒siRNA所发现的一样。

然而，两个文库中的97.28％和97.24％的vsRNA对应于NoVRNA的正链，被测序的vsRNA没有显示尺寸偏好(参见图1A，上图)。与仅仅用作复制中间物的负链RNA相比，正链RNA病毒在感染细胞中生产显著更高水平的正链RNA作为复制模板和mRNA。因此，如对来自于感染各种野生型RNA病毒的哺乳动物细胞的vsRNA分析的先前研究中所提出的，大部分的被测序vsRNA可以对应于病毒RNA的分解产物。

来自于从接种NoVΔB2的BHK-21细胞构建的两个文库的正链和负链vsRNA在22个核苷酸的尺寸处具有峰(参见图1A，下图)。具体来说，两个文库中的全部负链vsRNA中的大约42.5％的长度是22个核苷酸，在21和23个核苷酸处存在较小的峰(参见图1A，下图)。负链vsRNA的独特种类也在22-nt处具有主峰。此外，接种NoVΔB2的BHK21细胞中的负链vsRNA的相对含量(12.21％和13.32％)是感染NoV的BHK21细胞中的4倍以上。来自于感染NoVΔB2的BHK21细胞的负链vsRNA的群体含有许多携带有被引入的点突变的读段，且Western印迹法无法检测到B2的表达，从而证明了NoVΔB2的基因型。因此，在BHK-21细胞中检测的正义和反义NoVΔB2特异性vsRNA两者都展现与已知由Dicer生产的细胞miRNA相同的尺寸偏好，表明NoVΔB2攻击引发哺乳动物宿主细胞中真正病毒siRNA的生产。

通过被设计用于克隆miRNA的方法对NoVΔB2vsRNA的成功克隆表明，NoVΔB2vsRNA含有5′单磷酸盐和3′羟基端基，这是对于DicerRNA酶(Rnase)的产物所预计的。然而，不同于主要作为单链RNA积累的miRNA，siRNA是在任一条链的3′端具有两个未配对核苷酸的短的dsRNA片段。因此，使用生物信息学方法检查了NoVΔB2的22-ntvsRNA形成在任一条链的3′或5′端具有或不具有未配对核苷酸的短双螺旋dsRNA对的潜力。该分析揭示与NoVΔB2的22-ntvsRNA群体相关的两个显著特征(参见图1B)。首先，观察到在两个NoVΔB2文库中都高度富集了在3′端具有2-nt突出的互补22-ntvsRNA的对的群体(参见图1B，siRNAα和β)。这个发现表明，在BHK-21细胞中检测到的NoVΔB2的22-ntvsRNA主要是由Dicer产生的典型siRNA。其次，检测到更占优势的、意想不到的在3′端区域之间具有2-nt互补性的22-nt正链和负链病毒siRNA的群体(参见图1B)。这个发现说明，在被NoVΔB2攻击的BHK-21细胞中指定病毒siRNA的积累经常在3′端伴随有紧紧相邻的反义病毒siRNA。相比之下，NoV的vsRNA没有展现具有2-nt3′突出的互补vsRNA的对或连续vsRNA的富集。这些结果表明，克隆的NoVΔB2vsRNA展现典型siRNA的性质(参见图1B和表3)。首先，两个NoVΔB2文库中都富集含有20-nt完美碱基配对的双螺旋区域的22-ntvsRNA群体，所述双螺旋区域具有2-nt3′突出(参见图1B，峰“-2”和siRNAa/b)。对于相对显著更大量的NoV的vsRNA没有发现22-nt典型siRNA对的富集(参见图1B)。其次，检测到只针对NoVΔB2vsRNA的具有20-nt5′端突出的互补22-ntvsRNA对的更主要群体(参见图1B，峰“20”和siRNAa/g)。这些发现一起表明，相同的病毒dsRNA前体在由NoVΔB2感染而不是由NoV感染的细胞中被依赖于Dicer地加工成连续的22-nt病毒siRNA双螺旋。

比较野生型NoV和NoV突变体对RNAi抑制和诱导RNAi响应的体外研究：与通过表达B2的NoV有效感染BHK-21细胞相比，NoVΔB2仅仅维持低水平的感染(参见图4A-B)。然而，在用稳定表达的编码NoVB2或埃博拉病毒病毒粒子蛋白35(VP35)的转基因工程改造的BHK-21细胞中，恢复了NoVΔB2的更高积累水平(参见图4A-B)，所述埃博拉病毒病毒粒子蛋白35通过不同机制抑制哺乳动物细胞中的实验性RNAi。这些结果显示，通过从病毒基因组或异位转基因表达的同源或异源VSR抑制RNAi是哺乳动物细胞中的稳健病毒感染所必不可少的。因此结论是NoVΔB2仅在RNAi抑制方面有缺陷，且由NoVΔB2诱导的RNAi响应(特征为生产病毒siRNA)在BHK-21细胞中具有强效的抗病毒活性。

利用野生型NoV和NoV突变体对BALB/c乳小鼠中的RNAi响应的体内研究.对BALB/c乳小鼠(6-8天大)腹膜内(i.p.)注射NoVΔB2和NoV病毒。在感染后的不同时间，处死小鼠，且采集小鼠后肢和前肢的肌肉组织，用于使用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA)根据制造商方案提取RNA。收集总RNA以用于病毒检测和定量。

野田村病毒RNA-1在不存在编码用于病毒粒子装配的病毒外壳蛋白的RNA2的情况下自主地复制。野生型NoVRNA-1在一些昆虫和哺乳动物培养物中自我复制到比NoVRNA-1ΔB2更高的水平。然而，NoVB2在完整NoV对任何细胞类型的真正感染中的角色尚未被记载。与NoV对BHK-21细胞的有效感染相比，NoVΔB2仅维持低水平的感染(参见图4，泳道4)。相比之下，HeLa细胞的NoV感染的效率明显更低，且在HeLa细胞中检测不到NoVΔB2感染。BHK-21细胞中NoVB2的稳定异位表达显著增强NoVΔB2感染，但没有明显改变NoV感染(参见图4，泳道5和8)。在稳定表达埃博拉病毒病毒粒子蛋白35(VP35)的BHK-21细胞中进一步检查了利用野生型和突变型NoV株的感染，VP35最可能通过不同于B2的机制抑制哺乳动物细胞中人工诱导的RNAi。如在B2表达细胞中所发现的，在表达VP35的BHK-21细胞中也有效地拯救了NoVΔB2感染(参见图4，泳道6)。因此，用任一种VSR抑制RNAi是在BHK-21细胞中产生稳定病毒感染所必需的，表明在响应于病毒感染而产生Dicer依赖性病毒siRNA的培养哺乳动物细胞中的RNAi的抗病毒功能。

体内NoV感染也需要B2对RNAi的抑制。NoV对于通过腹膜内(IP)注射感染的7天大的小鼠是致命的。通过经过滴定以在稳定表达B2的BHK-21细胞中复制到类似水平的NoV和NoVΔB2剂量比较乳小鼠的感染(参见图4)。不同于NoV的致命感染，乳小鼠在IP注射NoVΔB2之后在所进行的观察期间(4周)一直保持健康(参见图5C)。定量RT-PCR分析检测到NoV和NoVΔB2两者在接种1天后(p.i.)从腹腔扩散到前腿和后腿(参见图5A-B)。在接种1天后，NoV和NoVB2在小鼠中积累到类似水平。然而，虽然NoV感染小鼠中的病毒基因组RNA与核糖体RNA的丰度大致相同，但是NoVΔB2在感染小鼠中以至少100倍低的水平积累(参见图5A-B)。因此，NoV的体内毒性和大量积累依赖于RNAi被其自身B2蛋白所抑制，表明RNAi在哺乳动物中的体内抗病毒功能。

定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析证实了在接种后24小时后，NoV和NoVΔB2两者都从被注射的腹腔扩散到前肢和后肢组织(参见图5A)。尽管将更高剂量的NoVΔB2接种到每只小鼠中(补充材料)，但是NoV积累水平与NoVΔB2积累水平之间的差异在1dpi时很小，不过在感染后期逐渐变得更显著。到4dpi，NoVRNA水平与核糖体RNA(rRNA)的水平相当，但NoV积累是NoVΔB2积累的1000多倍(参见图5A-B)。因此，不同于在NoV感染5天后观察到的100％死亡率，被NoVΔB2攻击的乳小鼠在接种后长达4周的实验期间保持健康(参见图5C)。对来自于4dpi时的乳小鼠中的已知先天抗病毒路径的84种关键基因的表达的定量RTPCR分析没有检测到NoVΔB2感染与NoV感染之间的显著差异(参见表4)。

表4.在用NoV或NoVΔB2感染后，乳小鼠中的小鼠抗病毒先天免疫基因的表达水平的变化.

*所示的值是与模拟接种相比，乳小鼠用NoV或NoVΔB2感染后的三个独立实验的平均倍数变化。

这表明NoVΔB2的快速体内清除不受已知先天抗病毒路径中的某一种调节。此外，发现在B2的位置59携带有单个Arg到Gln突变(已知消除B2的体外VSR活性(3,24))的NoV突变体(NoVmB2)在乳小鼠体内像NoVΔB2一样没有毒性，且从4dpi开始逐渐被清除(参见图5A)。因此，NoV的体内感染和毒性需要B2的RNAi抑制子活性。

Northern印迹杂交在被NoVDB2接种的乳小鼠中检测到病毒siRNA的离散种类的积累(参见图5D，右图)，如病毒感染之后在植物和无脊椎动物宿主中所发现的。小鼠病毒siRNA作为主要的22-nt带迁移，伴随有较弱的21-nt信号，且在2dpi时变为可检测的，且一直持续到7dpi，即使NoVΔB2的积累在2dpi和7dpi时都很低(参见图5A-B)。相比之下，来自于被NoV感染的小鼠的vsRNA显现为不均匀尺寸的条带(参见图5D，右图)。这些结果与来自于接种NoVΔB2的BHK-21细胞的深度测序结果一致(参见图1A，下图)。值得注意的是，22-nt病毒siRNA在用NoVmB2接种的乳小鼠中变得容易检测到(参见图5D，左图)。这些发现表明，由RNA介导的针对NoVΔB2的体内防御与病毒siRNA的高水平的积累有关。

因此，由NoVΔB2和NoVmB2感染小鼠中对RNAi的病毒抑制的缺失而引起的快速病毒清除一致性地伴随有22-nt病毒siRNA的大量产生。对来自于NoV接种4天后的乳小鼠和来自于NoVΔB2接种1天或2天后的乳小鼠的小RNA深度测序。NoVvsRNA显示无尺寸偏好，且针对典型siRNA未富集NoV的22-ntvsRNA(参见图6A-B)，这表明了NoV感染小鼠中的病毒siRNA生物发生的B2抑制。注意到从小鼠克隆的NoVvsRNA相比来自于细胞培养物的NoVvsRNA(3％)含有更丰富的负链(16％)(参见表3)，这可能表明在存在B2的情况下NoVdsRNA的较弱体内酶切。相比之下，～85％的来自于小鼠的NoVΔB2小RNA的长度是21-nt到23-nt，其中22nt为两条链的主要尺寸(参见图6A和图2B)。发现更高密度的病毒siRNA在NoVΔB2感染小鼠和BHK-21细胞中靶向RNA-1的RNA-3转录区和RNA1和2的5′-末端区(参见图6C)。NoVΔB2感染小鼠中病毒siRNA的相对丰度(0.3％)(参见表3)类似于在经历FHVΔB2清除的果蝇中病毒siRNA的相对丰度(0.5％到0.9％)。来自于2dpi时小鼠的NoVΔB2siRNA被大致相等地分为正链和负链(参见图6A)，且两个NoVΔB2文库中的65％的22-nt病毒siRNA可以形成具有2-nt3′突出的典型siRNA双螺旋(参见图6B和表3)。通过Northern印迹法检测的NoVΔB2的22-nt病毒siRNA因此具有从dsRNA病毒复制中间物加工的典型病毒siRNA的性质，这证实NoVΔB2感染诱导了小鼠中的典型抗病毒RNAi响应。总之，研究结果揭示，在无对RNAi的病毒抑制的情况下，小鼠能够起始强力的抗病毒RNAi响应，其足以有效提供免除致死病毒感染的完全保护。

乳小鼠中的RNAi介导的抗病毒免疫性的表征：病毒siRNA是RNAi介导的抗病毒免疫性的重要组分。病毒siRNA既是病毒感染的宿主免疫力检测的产物，也是所诱导的免疫力的特异性决定子。因此，将被测序的病毒siRNA定位到病毒基因组中会有助于鉴别通过宿主Dicer复合物引发识别和加工的病毒dsRNA，和预测由RISC抗病毒效应复合物所靶向的病毒序列。使用乳小鼠的NoV感染作为模型进行实验，以分析由哺乳动物免疫系统体内生产的病毒siRNA的沉默活性，和表征RNAi的病毒抑制。应指出，虽然RNAi作为特异性基因敲除技术广泛用于实验室和临床试验中，但是除了小鼠卵母细胞和小鼠ES细胞中的一些研究，关于siRNA在哺乳动物中的天然角色和生物发生知之甚少。因此，对于在生理条件下由Dicer产生的siRNA的优势长度、对末端的特异性核苷酸的偏好和其它性质的表征将有利于设计最佳的实验RNAi。

利用负链病毒siRNA和RNA-1转录的研究：通过聚焦NoVΔB2文库中的较少可能会含有非特异性降解产物的负链病毒siRNA群体来进一步检查哺乳动物病毒siRNA的性质。类似于在果蝇中由FHVΔB2引发的病毒siRNA生物发生。在BHK-21细胞中的NoVΔB2的两种基因组RNA的5′末端区中检测到病毒siRNA靶向的热点(参见图6C)。相比之下，BHK-21细胞生产更低密度的靶向RNA-1的5′末端区的病毒siRNA，但是生产更高密度的靶向RNA-1的3′末端区和RNA-1的RNA-3转录起始区的siRNA(参见图6C)，这两者都没有在响应FHVΔB2的果蝇中被检测到。这些观察表明了昆虫和哺乳动物宿主在识别于野田村病毒基因组和亚基因组RNA合成期间所生产的不同dsRNA中间物方面的差异。按照预期，仓鼠miRNA对于5′端核苷酸具有很强的尿苷偏好(参见图6C)。然而，对于任一种21-、22-或23-nt类别中的病毒反义siRNA的5′端没有检测到核苷酸偏好(参见图6D)。反之，在22-nt类别中鉴别到对于全部NoVΔB2反义siRNA的3′端核苷酸的强烈的腺嘌呤富集(对于两个文库来说是～58％)，而在21-nt和23-nt类别中并没鉴别到(图1D，上图)。然而，当仅考虑22-ntNoVΔB2反义siRNA这种独特种类时，3′端腺嘌呤偏好是无法检测到的(参见图6D，下图)，表明3′腺苷酰作用对于哺乳动物病毒siRNA的丰度的可能影响，如先前对于哺乳动物和植物miRNA所观察到的。

在本文所提供的实验中发现，在培养仓鼠细胞和乳小鼠中的RNA病毒感染诱导典型的抗病毒RNAi响应，其特征在于生产了具有典型siRNA的明确定义的性质的病毒siRNA。这些发现说明，dsRNA病毒复制中间物被依赖于Dicer地加工成连续siRNA是针对两种不同正链RNA病毒感染的保守的哺乳动物免疫反应(参见表5)。从乳小鼠和BHK-21细胞检测到靶向NoVΔB2RNA1的5′末端区的一组相同的定相的病毒siRNA对(参见表5)，且在类似的相对丰度下从被NoVΔB2感染的小鼠胚胎干细胞克隆。从用NoVΔB2感染后的乳小鼠或BHK-21细胞克隆的靶向NoVΔB2RNA-1的5′末端区(1‐180nt)的定相的正链(+)和负链(‐)22-ntvsRNA的读段数。通过Perl脚本从总vsRNA鉴别集合(assembly)，所述Perl脚本利用被分配给阵列中所包括的每一21‐nt或23‐ntvsRNA的罚分搜索具有2‐nt3′突出的连续22‐ntvsRNA双螺旋的最长集。

表5.靶向NoVΔB2RNA1的5′末端区的定相vsRNA

¹定位到病毒负链RNA1的vsRNA的位置从3’到5’给出。

²定位到病毒正链RNA1的vsRNA的位置从5’到3’给出。

—表明在文库中没有发现此位置上的定相vsRNA。

*表明与在被NoVΔB2感染的小鼠胚胎干细胞中检测到的定相vsRNA相同的定相vsRNA。

__**表明在文库中或在被NoVΔB2感染的小鼠胚胎干细胞中没有发现此位置上的定相vsRNA。

然而，与B2蛋白抑制长dsRNA被加工成siRNA的已知体外活性一致，在野生型NoV感染期间通过深度测序或Northern印迹法检测的病毒小RNA不具有典型siRNA的性质。NoVΔB2感染小鼠中的病毒siRNA的Northern印迹检测表明，使用不能抑制siRNA生物发生的体内感染模型和/或病毒可以有助于靶向其它哺乳动物病毒的siRNA的检测。此外，体外和体内NoV感染都需要其B2蛋白的RNAi抑制子活性。具体来说，乳小鼠生产大量的病毒siRNA，且在取代B2中的单个氨基酸以消除其RNAi抑制子活性之后，变得对NoV的致命感染完全有抗性。因此，在哺乳动物中由病毒感染诱导的典型RNAi响应具有强效的抗病毒活性。在果蝇、线虫和哺乳动物中在紧密相关的FHV和NoV对抗病毒RNAi的诱导和抑制方面的显著相似性凸显了RNAi在动物界的抗病毒防御中的进化保守角色。与至今在哺乳动物中报道的抗病毒免疫机制相比，通过抗病毒RNAi的病毒清除具有不同的效应机制且不要求细胞死亡。然而，这种哺乳动物免疫机制展现已知与先天免疫和适应性免疫相关的性质，因为其涉及微生物相关分子模式dsRNA的快速宿主识别和由病原体来源的siRNA所确定的特异性机制。

利用被脑心肌炎病毒感染的mESC的研究：哺乳动物RNAi机制(1种Dicer，4种Ago)对内源微小RNA(miRNA)路径的重要贡献使遗传上确定哺乳动物vsRNA的DICER依赖性变得复杂。多能小鼠胚胎干细胞(mESC)耐受DICER(DCR)或ARGONAUTE(AGO)功能的完全消除，且支持由长dsRNA引发的RNAi，这可能是因为其缺乏IFN响应；因此，在这些细胞中检测到DCR依赖性内源siRNA。mESC有理由构成用于在遗传上验证在真正哺乳动物感染背景下病毒siRNA积累和VSR功能两者的潜在有价值模型。

用脑心肌炎病毒(EMCV)的纯化病毒粒子感染若干mESC细胞系，EMCV是一种哺乳动物正义单链RNA(ssRNA)细小核糖核酸病毒，其在8小时感染周期内生产高水平的dsRNA。所有细胞都在不同程度上积累由EMCV编码的VP1衣壳，其中细胞系E14显示最高水平(参见图7A和图8A-B)。在两个独立感染中，从E14mESC分离15-nt到50-nt的长RNA，并对其进行ILLUMINA深度测序(参见表6)。

表6.来自于ILLUMINA深度测序分析的定量数据

感染后6小时(hpi)，总读段中的0.4％和0.7％定位到EMCV基因组，其中33％和27％处在DCR产物的21-nt到23-nt尺寸范围内(参见图7B和表6)。为了比较，功能性地靶向mESC多能因子Nanog、Oct4和Sox2的miR-134、miR-296和miR-470分别代表总读段的0.11％、0.02％和0.05％。

非均匀24-nt到44-nt尺寸范围内的剩余EMCV读段几乎只沿病毒正链定位(参见图7C)，所述正链在正义RNA病毒复制期间不相称地超过负链而积累，且因此主要是病毒分解产物。相比之下，36％和28％的21-nt到23-nt读段定位到EMCV5′未翻译区的开头200-nt内的两条病毒链上，因此展现与所有其它读段的～10:1比率形成对比的～2:1(+):(-)链比率(参见图7C和表6)。在EMCVRNA3′端还观察到不太显著的对称读段分布，而剩余的21-nt到23-nt读段来源于离散的正链区域(参见图7C)。

对称的5′和3′EMCV读段定位到在正链和负链合成期间dsRNA复制中间物(RI)起始的区域。类似于在病毒感染的植物和无脊椎动物中观察的由RI衍生的siRNA，EMCV5′端的大量(+)和(-)读段形成了相邻且完美互补的具有2-nt3′突出的双螺旋(参见图7D)。此外，所有由EMCV得到的21-nt到23-nt读段定义以～22-nt周期性从5′端起始的优势定相寄存器，其中互补(+)链和(-)链偏差2nt(参见图7D和图8C-E)。使用寡核苷酸探针的Northern分析证实在EMCV感染细胞中积累了预测的5′端22-ntsiRNA(参见图7E)。具有2-nt3′突出的定相完美双螺旋是长dsRNA的连续剪切的特有产物。因此在Dcr敲除(Dcr^-/-)mESC中探索了由EMCV衍生的vsRNA的DCR依赖性(参见图9A和图10A)，因为多效性和降低的分裂率，所述Dcr敲除(Dcr^-/-)mESC中所积累的EMCV少于对照Dcr^Flx/Flx细胞。因此预校准病毒接种物以在两种细胞类型中产生相当的感染水平(参见图9A和图10A)。如所预期在受感染Dcr^Flx/FlxmESC中检测到，由EMCV衍生的5′端vsRNA在Dcr^-/-mESC中低于Northern检测极限(参见图9A)，这证实了其是真正的siRNA。此外，在野生型(WT)mESC中，通过来自于标记FLAG和血凝素(HA)的人AGO2(FLAGHA-hAGO2)免疫沉淀物(IP)的RNA的Northern分析(参见图9B和图10B)和通过来自于还含有细胞miRNA的内源mAGO2IP的RNA的深度测序(参见图9C-D和图10C-D)检测到这些。大量的正链读段也与已经在总RNA测序中观察到的若干峰一致(参见图9C，*)，其中一个定位到内部核糖体进入位点(IRES：nt577到680)且另一个定位到预测的dsRNA双折叠(foldback)(nt1497到1670)(参见图10E)。因此，EMCV感染的mESC的AGO2负载图包括源于RI的DCR依赖性siRNA双螺旋，以及经由未经确认的机制从正链二级结构产生的其它21-nt到23-ntvsRNA。

mESC的使用允许对在遗传相同但是处于不同分化状态的细胞中的病毒siRNA积累的研究。在第10天，通过多能性标志物Nanog和Oct4的表达的损失和外胚层特异性标志物Fgf5的EMCV5′表达的增多证实了由E14衍生的胚状体的分化(参见图9E和图10F)。在6hpi时，与EMCV感染的第0天E14细胞相比，EMCV感染的第10天E14细胞中的5′端siRNA低于Northern检测极限，尽管这些E14细胞的感染水平类似(参见图9E和图10F)。因此，由EMCV得到的读段占在第10天感染细胞中的全部深度测序读段的0.15％，这与第0天感染细胞相比是接近5倍的降低(参见图9F)。第10天细胞中的21-nt到23-nt读段与第0天细胞相比也是10倍的减少，但仍然是可检测的(包括在开头5′末端200nt中)，代表所有由EMCV得到的读段中的16％(参见图9G和表6)。因此，不同于miRNA，EMCVsiRNA积累通过分化而被显著降低，但没有被消除(参见图9E)。

在RNAi受损的宿主细胞中的VSR缺陷型病毒的遗传拯救：siRNA的抗病毒活性的证明需要RNAi受损的宿主细胞中的VSR缺陷型病毒的遗传拯救，这是一种用EMCV无法实现的方法，因为对于其潜在的VSR还有待鉴别。由二分正义ssRNA野田村病毒(NoV)编码的dsRNA结合B2蛋白在实验哺乳动物RNAi期间抑制DCR活性，这是由其在果蝇中的NoV相关兽棚病毒(FHV)中的直系同源物所共有的一种性质。在稳定的B2表达BHK-21细胞中将NoV或其B2缺陷型配对物NoVΔB2滴定到类似的水平，随后用其感染E14mESC。在3dpi时积累的NoVΔB2显著少于NoV，且只有前者的感染能够产生由病毒得到的21-nt到23-nt深度测序读段(参见图11A-B和图12A-B)，而总体miRNA水平在两种感染中保持不变(表6)。由NoV得到的读段在尺寸上不均匀，主要沿RNA-1正链定位(参见图11C、图12C和表6)。相比之下，来自于NoVΔB2的那些(长度几乎仅为21nt到23nt)主要来源于RNA1(+)链和(-)链的5′和3′端(参见图11C-D)，其类似于果蝇中的FHVDB2siRNA模式。此外，NoVΔB25′端读段具有～22-nt周期性且形成具有2-nt到3-nt3′突出的相邻的完美双螺旋，其暗示DCR依赖性EMCVsiRNA(参见图11E-F)。在被NoVΔB2感染的BHK-21体细胞和新生小鼠四肢中检测到一组相同的定相完美双螺旋，但在用NoV感染时没有检测到(参见图11F)。同样地，来自于B2高水平的NoV的读段没有显示mESC中的这些特征中的任一种，虽然其丰度高得多(参见图11E-F和图12D-E)。因此，呼应由FHV编码的B2VSR在果蝇中的作用，由NoV编码的B2蛋白在mESC中抑制由RI衍生的dsRNA的DCR依赖性加工。此外，这种受B2限制的机制在mESC和乳小鼠中几乎同等地运作。

FHVB2抑制siRNA加工和并入到AGO中。因此，为了探究NoV感染的mESC中的抗病毒RNAi且为了避免AGO1、AGO3或AGO4的功能冗余，使用四重Ago1,2,3,4KOmESC细胞系E7，其中异位表达的hAgo2转基因可通过他莫昔芬应用而去除。在他莫昔芬处理5天后证实hAgo2消耗(参见图13A)，此时mESC被NoV或NoVΔB2感染3天。在两个独立实验中，被他莫昔芬诱导的mESC中的NoV和NoVΔB2RNA1水平分别是未处理的mESC中的～2倍和～8倍(参见图13B)。Northern分析进一步显示，类似于Ago2缺陷型果蝇细胞中的FHVΔB2积累，AGO2缺陷型mESC中的NoVΔB2积累得到拯救；AGO2消耗对毒性NoV的较低影响证实了真实感染中的B2VSR活性(参见图13C)。与用EMCV获得的那些组合，结果证明抗病毒RNAi在哺乳动物细胞中运作。

体内在Argonaute中装载的病毒siRNA的表征：因为siRNA指导RISC复合物中的序列特异性RNAi，所以知晓病毒siRNA是否像在培养的小鼠ES细胞中所观察地那样在体内被装载入Ago复合物中是重要的。数据显示，在被NoVΔB2感染的小鼠中在1和2dpi时所产生的总病毒siRNA富含具有2-nt3′突出的双螺旋，且未展现对于5′端的任何核苷酸的偏好，其可能反映在抗病毒RNAi的诱导早期的病毒siRNA的群体结构。假设病毒siRNA在装载入Argonaute复合物中之后将显示明显差异，因为同源病毒RNA的正链和负链在靶标病毒清除之前和之后存在不同的可接近性和丰度。克隆在用NoVΔB2感染1、2、3、4、7、15或28天后来自于乳小鼠的后肢组织的全部小RNA群体和Ago共免疫沉淀(co-IP)的小RNA群体，测序并比较。将Millipore(Billerica,MA)的抗-panAgo单克隆抗体用于co-IP和将Illumina的TruSeq小RNA样品制备试剂盒用于构建小RNA文库。在文库构建的最后一步在通过PCR的每一文库的扩增中所使用的引物的5′端添加的独特条码允许在IlluminaHiSeq2000的一个泳道中测序多达12个文库。对于每一文库产生～10百万总读段。因为两个被测序的小鼠小RNA文库分别含有0.11％(1dpi)和0.27％(2dpi)病毒读段，所以预测每一文库都包括～10,000到30,000病毒读段，其对于分析来说是足够深度的。使用计算算法在时间进程中比较文库之间的病毒读段的下列性质：(i)与全部小RNA读段和全部小鼠成熟miRNA读段相比的病毒读段的相对丰度；(ii)长度分布模式、链比、在病毒读段的每一位置处的核苷酸偏好；(iii)在病毒正链和负链RNA1和2上的21-nt到23-nt病毒siRNA的密度；和(iv)具有2-nt3’突出的病毒siRNA的互补对的富集。研究表明截至7dpi时NoVΔB2基本被清除。将针对在感染的晚期时点收集的样品中的病毒基因组RNA和感染性病毒粒子进行额外探索。

构建来自于3、7和15dpi时的被NoVΔB2接种的乳小鼠的全部小RNA和来自于3dpi小鼠的通过抗-panAgo单克隆抗体共免疫沉淀的全部小RNA，并测序。这些小鼠中的总病毒siRNA的分析首先揭示，具有5′端尿苷(1U)的病毒siRNA(21～23nt)的富集从3dpi时的41.8％、7dpi时的56.5％增加到15dpi时的60.5％(参见图15)，其都高于1dpi(31.1％)和2dpi(39.6％)时。发现在NoVΔB2清除后在15dpi时病毒siRNA在小鼠体内仍然可检测到，但是总病毒siRNA逐渐减少(参见图15)，其中21-23nt负链分别等于3、7和15dpi时的全部小鼠miRNA的1.2％、0.7％和0.5％。因此，15dpi时的病毒siRNA保持高于总miRNA群体的≥0.1％，这是对于功能相关miRNA所提出的截止表达水平。因为多个miRNA结合位点的存在增强靶标基因的miRNA沉默，所以siRNA的基因组范围的靶向将预测高度有效的抗病毒RNAi。有趣地，与22-nt病毒siRNA相比，乳小鼠中的21-nt病毒siRNA的相对含量在1dpi到15dpi的时间进程内增加(参见图15)。结果表明了病毒siRNA在AGO中的选择性装载和/或稳定性，因为1U是哺乳动物miRNA的保守特征且21-nt是哺乳动物敲低实验中的合成siRNA的优选长度。此外，深度测序证实了病毒siRNA的体内Ago装载和Ago复合物中的1U病毒siRNA的特异性富集(参见图15)。还发现在全部输入和Ago共免疫沉淀的复合物中的两种病毒基因组RNA上的热点病毒siRNA的类似分布模式(参见图15)。因此，检查了提议的小RNA文库以确定21-nt病毒siRNA是否在晚期时点在Ago复合物中变得更丰富，以及另外的21-nt病毒siRNA是归因于优势22-nt种类的5′端或3′端的1-nt修剪还是对应于在抗病毒RNAi后期生产的新种类。从抗病毒RNAi的不同阶段的小鼠体内的病毒siRNA的群体结构、相对丰度和持续性、选择性装载和稳定性产生系统性观点。

靶向被FHVΔB2感染的果蝇细胞中的病毒基因组RNA-1的5′末端区的病毒siRNA的密度是最高的。在被NoVΔB2感染的小鼠ES细胞中发现病毒siRNA热点的类似分布模式。有趣地，发现在被NoVΔB2感染的BHK-21细胞和乳小鼠中，靶向RNA-1的亚基因组RNA3编码区的病毒siRNA的密度高于5′端病毒siRNA。内部来自于负链RNA1模板的RNA-3转录起始引发比子代正链RNA1合成更有效的对所得病毒dsRNA的Dicer识别和加工是可能的。确定被不生产RNA-3或生产降低水平的RNA-3的NoV突变体感染的乳小鼠中的病毒siRNA图谱，先前已针对NoV/FHV表征该图谱。

siRNA赋予针对继发病毒感染的同源物依赖性抗性：研究结果表明，哺乳动物抗病毒RNAi由响应于NoVΔB2感染而从头产生的病毒siRNA介导。用于证实病毒siRNA的RNA沉默活性的一项研究是用于确定其是否赋予抗继发性感染的即刻同源物依赖性抗性，这在植物中被称为交叉保护。作为概念验证实验的部分，如上所述用NoVΔB2接种6天大的小鼠，且在两天后用致命剂量的NoV攻击小鼠。NoV和NoVΔB2仅有3个核苷酸不同，使得大部分的来源于NoVΔB2的siRNA应能够靶向用于RNAi的NoV。发现用作为对照的缓冲液(模拟物)或UV照射的NoVΔB2预接种的所有5只乳小鼠在用NoV二次接种4天后、在5dpi死亡之前积累了高病毒滴度且出现后肢麻痹(参见图16)。相比之下，用NoVΔB2预接种的10只乳小鼠都不支持2、3和4dpi时NoV的可检测的感染(图3)，或者在NoV攻击后直到4周时都未展现任何病征，表明用NoVΔB2预接种为乳小鼠提供针对野生型NoV的继发性致命感染的即时保护。

以下提供了用于确定在用NoVΔB2接种1、3、4、6和8天后乳小鼠是否得到保护免于wtNoV感染的实验。三只6天大的小鼠用NoVΔB2或UV失活的NoVΔB2接种并用于在5个时点中的每一个时用NoV攻击接种。在NoV接种4天和6天后，处死一只小鼠并冷冻前肢和后肢的肌肉组织以用于提取RNA和蛋白质，而第三只小鼠被保留到NoV接种后4周时，介时也将其处死以用于提取RNA和蛋白质。每个实验重复另外两次。通过qRT-PCR，使用β-肌动蛋白mRNA作为内部对照测量每个时点的病毒滴度。使用Western印迹法检测单一接种小鼠和双重接种小鼠中的B2蛋白，其用于(i)证实NoV和NoVΔB2的基因型，(ii)监测感染小鼠中的NoVΔB2的潜在复原，和(iii)特异性地确定用NoVΔB2预接种的小鼠中的NoV积累。实验设计保证从独立的生物学重复获得存活率和病毒负载数据两者，但是如果在重复之间检测到显著变化的话，那么在每个重复中的小鼠数量增加。这些实验确定在NoVΔB2预接种24小时后乳小鼠中是否诱导了消除性免疫，和/或当NoVΔB2被清除时的预免疫接种8天后，消除性免疫是否保持有效。通过Northern印迹法分析由小RNA引起的病毒siRNA积累，且通过深度测序确定NoVΔB2感染小鼠中的病毒siRNA的时程分析以便证实保护作用与病毒siRNA的丰度相关联。

确定哺乳动物RNAi抗病毒免疫是否引发序列特异性RNAi：表征病毒siRNA的RNA沉默活性的另一种方法是用于确定病毒感染是否引发细胞mRNA报告基因的同源物依赖性RNA沉默，其在植物和无脊椎动物中被称为病毒诱导的基因沉默(VIGS)。病毒siRNA积累到NoVΔB2感染小鼠中的总细胞miRNA群体的～1-2％，且很可能作为体内递送的合成siRNA介导特异性RNAi。最近发现没有B2表达的BHK-21细胞中的FHVRNA复制诱导翻译抑制和细胞质颗粒的形成，这可能由病毒siRNA介导，因为Argonaute-2位于类似颗粒中。

通过基于腺相关病毒(AAV)的载体将含有100-nt病毒序列的荧光素酶mRNA插入3′非翻译区中，并分析NoVΔB2感染的乳小鼠中的序列特异性RNAi。已经工程改造了具有来自于血清型8的衣壳的AAV载体以经由单次肌肉注射实现由改良型巨细胞病毒(CMV)启动子所驱动的荧光素酶的终身稳定的体内表达。将AAV载体(pVIP-CMV-Luciferase-W-SV40)中的荧光素酶ORF的终止密码子之后的独特BamHI位点用于克隆来自于病毒RNA1的5′末端区和RNA-3编码区的100-nt序列或来自于作为对照组的eGFP编码序列的100-nt序列。高密度的病毒siRNA靶向病毒RNA1的这些区域，如NoVΔB2接种的乳小鼠中的深度测序所示。传感器AAV病毒粒子在根据描述用AAV骨架载体以及辅助载体pHELP和pAAV2/8SEED共转染的293T细胞中生产，纯化和滴定。将40μl体积的1×10¹¹个基因组拷贝的每一株AAV注射到预先用NoV或NoVΔB2接种的小鼠的腓肠肌中。生物发光成像确定病毒序列的存在是否特异性地抑制在产病毒siRNA小鼠中从递送的嵌合荧光素酶mRNA表达荧光素酶。

AAV递送系统解决了关于体内生产的小鼠病毒siRNA的沉默活性的几个关键问题。首先，将传感器AAV粒子和对照AAV粒子注射到未感染的小鼠(以确认报告基因表达)中或用乳小鼠中的NoVΔB2感染2、4、7、15或28天后的小鼠中。比较这些小鼠中的荧光素酶表达以确定荧光素酶传感器是否被沉默和被沉默多长时间，以及沉默活性是否与病毒siRNA群体的丰度和群体性质相关联，和/或与乳小鼠中通过NoVΔB2接种所诱导的对wtNoV的消除性免疫相关联。其次，新的AAV系统从载体施用后维持高水平的荧光素酶表达，持续超过60周。在载体施用后确定了保持荧光素酶表达被抑制的时间，且确定了荧光素酶沉默与病毒清除和/或病毒siRNA的积累水平和群体性质的关联性。第三，比较含有正链或负链病毒序列的传感器荧光素酶mRNA的沉默以确定正链和负链病毒siRNA在沉默细胞mRNA方面是否同样地有效。第四，通过比较NoV感染与NoVΔB2感染之间的荧光素酶表达来确定B2表达是否干扰小鼠中的VIGS。RNA病毒的正链mRNA似乎对哺乳动物中的合成siRNA很敏感，虽然植物病毒siRNA的两种极性都能靶向互补性细胞mRNA以实现沉默。VSR通常不阻断植物中的VIGS，可能因为与复制中的病毒RNA相比，细胞mRNA对RNAi更敏感。

靶向RNA1的5’末端区的两个连续的22-ntsiRNA对(列于下文)落在来自接种NoVΔB2的乳小鼠的最丰克隆中。2-nt3′突出以红色突出显示，且数字表示RNA-1中的每一个siRNA的第一个和最后一个核苷酸在病毒正链(上部，从5′端数起)或负链(下部，从3′端数起)中的对应位置，其中每一个siRNA的读段在括号中给出。

(14)4-UUGAAUCCAAAACUCAAAAUGC-2526-UGAACUACGAGACAAUCAUCAA-47(229)(SEQIDNO：47)

375)2-AUAACUUAGGUUUUGAGUUUUA-2324-CGACUUGAUGCUCUGUUAG-45-45(716)(SEQIDNO：48)

作为确定小鼠中的由病毒siRNA指导的RNA沉默的机制的第一步，通过将病毒正链RNA1的5′端50核苷酸序列(5’-GUAUUGAAUCCAAAACUCAAAAUGCUGAACUACGAGACAAUCAUCAACGG-3’(SEQIDNO:49)(突出显示的序列与以上所示的两种负链病毒siRNA是互补的))插入到AAV-荧光素酶传感器中来构建AAV-Luc-R₁50。相同长度和核苷酸组成的随机化序列也插入到AAV荧光素酶传感器的相同位置以作为对照。来自于AAV-Luc-R₁50而不是来自于对照传感器的荧光素酶的沉默指示感染小鼠中的第一(nt2-23)和/或第二(nt24-45)负链病毒siRNA的特异性沉默活性。进一步将突变引入到AAV-Luc-R150中的50-nt病毒序列中。

确定AGO在小鼠中由RNAi介导的免疫性中的作用.哺乳动物AGO的Argonaute亚族中的四个成员(Ago1-4)在miRNA沉默方面具有重叠的功能。虽然Ago2是唯一具有切割体活性的AGO且对于产生针对合成siRNA的实验响应来说是必不可少的，但是miRNA在哺乳动物中与所述切割体活性无关地被随机分组到个别Argonaute中。当Argonaute在小鼠中被组成性地切除时，只有Ago2的丧失引起了胚胎致死性，而Ago1、Ago3或Ago4的单一、双重或三重丧失对动物发育都没有显著影响。植物和无脊椎动物中的由RNAi介导的抗病毒免疫所必需的AGO保持切割体活性，表明Ago2的抗病毒作用。然而，在检查9种不同AGO基因的25种单一、双重和三重基因敲除突变体之后，发现仅有两种AGO在拟南芥中控制针对正链RNA病毒黄瓜花叶病毒的抗病毒沉默，表明AGO功能在防御响应中的特异性。本文呈现的研究中的病毒siRNA的体内Ago装载的检测表明AGO在哺乳动物中的体内功能，这是使用已被认可的NoV/小鼠模型来研究的。

用NoVΔB2感染针对Ago1、Ago3和Ago4的单一基因敲除乳小鼠(KO)以及针对Ago1/3的双重KO和针对Ago1/3/4的三重KO，且确定相比野生型同窝出生对照小鼠，是否有任何KO品系丧失病毒抗性，积累较高的病毒滴度和/或产生病征。因为只有Ago2在三重KO品系中有功能性，所以可以推断是否单独的Ago2对于小鼠中的抗病毒RNAi是足够的，就像在mES细胞中所发现的那样。使用Ago2被敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)确定是否单独Ago2或其切割体活性的丧失足以拯救在小鼠ES细胞中所发现的NoVΔB2感染。如果在病毒易感性方面观察到差异，那么在这些小鼠中表征总病毒siRNA和Ago所装载的病毒siRNA的群体，以发现一种、两种或三种AGO的丧失是否对病毒siRNA的生物发生具有影响。此外，使用KO品系确定(i)乳小鼠中的NoVΔB2接种是否诱导针对wtNoV的消除性免疫，和(ii)嵌合荧光素酶mRNA传感器在NoVΔB2感染的乳小鼠中是否被沉默。

表征乳小鼠的wtNoV感染期间的RNAi抑制：研究了用于理解在感染情况下和通过感染诱导同源病毒siRNA的产生的情况下的RNAi的病毒抑制的体内模型。调查结果表明NoVB2抑制长的病毒dsRNA在体内被加工成siRNA，就像体外研究中所表明的一样。然而，所观察到的B2结合siRNA双螺旋的体外活性是否存在生理作用仍然是不清楚的。构建由来自NoV感染3天后乳小鼠的后肢组织的NoVB2蛋白或小鼠Argonaute的特异性抗体来共免疫沉淀的小RNA的文库，并测序(参见图17)。发现B2在体内与来源于NoV的小RNA形成复合物，其显示正链和负链的大致相等比率且富含22-nt小RNA。值得注意的是，在B2复合物中发现的22-nt病毒RNA展现siRNA(具有2-nt3′-突出的20nt完美双螺旋区域)的典型性质，但不显示1U偏好(参见图17)。NoV感染小鼠中的Argonaute复合物也含有22-nt病毒siRNA(参见图17)，然而，与来自于NoVΔB2感染小鼠的那些(参见图15)相比，所述22-nt病毒siRNA在用miRNA含量标准化之后丰度为>30倍的降低且不显示1U偏好。这些发现表明在体内B2隔绝病毒siRNA双螺旋且抑制其被装载入Argonaute复合物中。NoV感染小鼠中的B2复合物中存在病毒siRNA双螺旋还证实了长dsRNA加工的B2抑制是不完全的，暗示病毒对抗防御中RNAi抑制的双重模式的重要性。

NoVB2对RNAi的双重抑制模式除了需要其dsRNA结合活性以外，还需要B2直接与病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)和/或宿主Dicer/RISC复合物的任何组分相互作用。果蝇细胞中的研究(参见图14)表明所述蛋白质-蛋白质相互作用可以促进B2在新生病毒dsRNA复制中间产物被抗病毒Dicer识别之前或期间，接近所述新生病毒dsRNA复制中间产物。作为病毒复制复合物的结构组分的VSR在某些植物病毒中是已知的，且与宿主剪切复合物的直接相互作用可以表明用于强力抑制宿主酶切的病毒适应策略。产生针对NoVRdRP和外壳蛋白的抗体，且使用Western印迹法、co-IP和蛋白质组学方法确定B2在体内是否与任何其它病毒蛋白质或与小鼠RNAi路径的组分相互作用，所述组分包括Dicer、TRBP、PACT和AGO，对于所述组分来说可获得市售抗体。使用编码在dsRNA结合方面有缺陷的突变型B2(R59Q突变体)的NoVmB2确定dsRNA结合对于可能的蛋白质-蛋白质相互作用来说是否是重要的。将突变引入到NoV的基因组中以确定B2的在N端dsRNA结合结构域以外的特异性C末端区对于蛋白质相互作用和其如上所述的RNAi双重抑制模式来说是否是重要的。

抗体也与病毒RdRP一起使用以通过免疫荧光染色滴定BHK-21和BHK-B2细胞中的感染性NoV和NoVΔB2，因为NoV是非致细胞病变的。然而，B2的dsRNA结合活性也参与对IFN依赖性抗病毒响应的抑制，虽然鱼野田村病毒的dsRNA结合B2蛋白不阻断鱼细胞中的干扰素的诱导。在293T细胞中，在仙台病毒感染之前使用B2表达质粒与从天然INFβ启动子表达荧光素酶的报告质粒p-125Luc的共转染诱导IFN信号转导。替代性策略是生产表达wtB2或突变型B2(R59Q)的稳定293T细胞，然后分析稳定细胞中IFN信号转导的抑制，其中通过Western印迹法证明wtB2蛋白和突变型B2蛋白的表达水平。

确定已知dsRNA传感器在抗病毒RNAi中的作用.众所周知，不同的RNA病毒在哺乳动物中被3个RIG-I样受体(RLR)(包括RIG-I、MDA5和LGP2)的密切相关家族靶向，所述受体检测细胞溶质中的病毒特异性dsRNA。在这种形式的先天免疫中，通过RLR的C端结构域识别病毒dsRNA引发了MAVS依赖性信号级联，其导致1型IFN的产生。病毒dsRNA还在内体中由Toll样受体3(TLR3)识别。有趣地，不产生IFN的秀丽隐杆线虫(C.elegansnematodes)编码一族3个RLR，被称为Dicer(剪切体)相关解螺旋酶(DRH)1到3，其中DRH-1和DRH-3对于通过分别调控一级和二级病毒siRNA的生物发生而实现的抗病毒RNAi来说是重要的。基于其在哺乳动物中的dsRNA感应活性和在线虫中的抗病毒RNAi活性，假设哺乳动物dsRNA感应RLR在由RNAi介导的抗病毒免疫的起始中有作用。

通过腹膜内注射(I.P.)将NoVΔB2接种到7天大的RIG-I和MAVS敲除小鼠中，使用野生型C57BL/6小鼠(WT)作为对照(参见图18)。如先前在Balb/c小鼠中所发现的，在WTC57BL/6小鼠中存在快速病毒清除。NoVΔB2在MAVS敲除小鼠中也被逐渐清除，但是在7dpi时在RIG-I敲除小鼠中积累到高于在C57BL/6小鼠中的水平，是其>300倍。C57BL/6小鼠和MAVS敲除小鼠中的病毒清除也与21-23nt病毒siRNA的大量生产有关。引人注意地，即使没有剪切的B2抑制，RIG-I敲除小鼠在典型病毒siRNA的生产方面展现严重缺陷，预期来自于稳健病毒复制的病毒dsRNA复制中间产物被加工成大量的siRNA。这些发现揭示了在小鼠针对NoVΔB2感染的抗病毒RNAi响应期间，RIG-I在病毒siRNA的生物发生中的一种新颖的与MAVS无关的活性。

研究了已知的小鼠dsRNA传感器在抗病毒RNAi中的作用和机制。在用NoV、NoVΔB2或NoVmB2接种1、4、7、14和28天后比较RIG-I、MAVS、LGP2、MDA5、TLR3单一基因敲除小鼠中的病毒感染和病毒siRNA生产。这些分析还将表明C57BL/6小鼠是否不断地生产更高含量的21-nt病毒siRNA(参见图18)。确定MDA5和RIG-I双重基因敲除小鼠对NoV和其突变体是否展现增强的易感性。因为病毒siRNA在感染6小时后(hpi)可以检测到，所以比较0、6、12、18、24、30、36、42和48hpi时的野生型和基因敲除小鼠MEF中NoV和其突变体的早期生长表现型。已知在与dsRNA结合蛋白伴侣TRBP和PACT的复合物中发现了人类Dicer以用于实现RNAi的最佳活性，且先前研究检测到PACT与RIG-I之间以及Dicer与LGP2之间的蛋白质相互作用。因此，在体外和体内感染模型中，使用Western印迹法、co-IP和蛋白质组学方法来检查RIG-I以观察其是否与Dicer和/或TRBP/PACT相互作用以募集非自身病毒dsRNA，用于剪切成siRNA。此外，使用这些基因敲除品系确定(i)乳小鼠中的NoVΔB2接种是否仍然可以诱导针对wtNoV的消除性免疫，和(ii)嵌合荧光素酶mRNA传感器在NoVΔB2感染的乳小鼠中是否仍然可被沉默。

确定1型IFN是否调控抗病毒RNAi.因为RIG-I是一种IFN刺激基因(ISG)，所以IFN信号通路有可能调控病毒siRNA的生物发生中RIG-I的新颖活性。在典型的I型IFN诱导的信号通路中，介由IFN-α受体(IFNAR)的IFN结合激活Janus激酶1和酪氨酸激酶2，其磷酸化潜在的细胞质STAT1和STAT2。被磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚物，移位到核中，且组装成ISG因子3复合物以激活ISG的转录，其中一些ISG可以通过控制病毒siRNA的生物发生和活性而建立细胞抗病毒状态。

通过在IFNAR、STAT1和STAT2敲除乳小鼠中进行NoV/NoVΔB2感染研究来确定IFN信号转导在抗病毒RNAi中的作用，其中使用野生型C57BL/6小鼠(WT)作为对照。如果IFN信号转导组分的丧失增强小鼠对NoV或NoVΔB2的易感性，那么将进一步确定敲除的基因是否影响病毒siRNA的生物发生、群体结构和Ago负载或沉默活性。使用Northern和Western印迹分析监测RIG-I诱导方面的潜在差异。如果IFNAR/STAT1/STAT2敲除增强NoVΔB2/NoV易感性而不改变病毒siRNA的生物发生或活性，那么IFN信号转导将不在抗病毒RNAi中起调控作用。如果这些分析确实表明IFN信号转导在抗病毒RNAi中的调控作用，那么将在用1型IFN处理之前和之后分析野生型和基因敲除小鼠品系的MEF中的NoV和NoVΔB2的生长。如果IFN预处理以RIG-I依赖性方式加强抗病毒RNAi，那么有可能病毒siRNA的增强生产可以解除B2抑制且使得野生型MEF对NoV产生抗性。

表征成年小鼠对NoV感染的抗性：虽然NoV致命性地感染乳小鼠，但是更年长小鼠(例如出生后21天大的小鼠)在病毒接种后存活下来，仅有轻微的或无瘫痪或其它病征。对6周大的小鼠接种NoV，且发现NoV在2dpi和4dpi时在小鼠后肢组织中复制到适当水平，但是截至6dpi时在相同组织中被可再现地清除(参见图19)。Northern分析表明年幼成年小鼠中的NoV清除与负链病毒siRNA的生产有关，所述负链病毒siRNA显现为4dpi时在22核苷酸处的强烈离散带(参见图19)。比较起来，NoVΔB2在成年小鼠中诱导病毒siRNA的更低水平的积累，因为其复制到极低水平且因此将生产更少的dsRNA分子用于剪切。因此，虽然wtNoV对于病毒siRNA的生产被抑制的乳小鼠是致命的，但是其在年幼成年小鼠中通过与大量的病毒siRNA的生产有关的过程被快速清除(参见图19)。在4dpi时对NoV感染的成年小鼠中的全部小RNA测序，且结果显示NoV感染确实引发典型病毒siRNA的大量生产，等于全部细胞miRNA读段的0.2％(参见图19)。引人注意地，NoV的全部22-nt负链siRNA的71.5％对应于两对先前鉴别的RNA1的5′端siRNA，这类似于在NoVΔB2感染的小鼠ES细胞中检测到的模式。比较起来，NoVΔB2的同样2对5′端siRNA在乳小鼠中的丰度小得多，分别代表着在3dpi、7dpi和15dpi时来自于乳小鼠的NoVΔB2的全部22-nt负链siRNA的11.7％、1.9％和1.5％。这些结果表明宿主Dicer在乳小鼠和成年小鼠两者中加工相同组的病毒siRNA，但是在成年小鼠中剪切主要在释放2对siRNA的三个位置发生，即使NoV编码B2基因。大量病毒siRNA的产生表明NoV无法抑制成年小鼠中的病毒siRNA生物发生，这不同于在乳小鼠中。

首先，通过分析来自用NoV或NoVΔB2感染1、2、3、4、6、8、14或28天后的6周大小鼠的全部小RNA，来确定年幼成年小鼠中的病毒siRNA的群体结构、相对丰度和持久性。同一组的RNA样品还用于qRT-PCR分析以证明接种之后在成年小鼠中的时程病毒积累。其次，使用含有NoVRNA1的5′端50-nt序列的传感器mRNA确定病毒siRNA在NoV感染的成年小鼠中在指导序列特异性RNAi方面是否具有活性。取决于在NoV被完全清除时的晚期时点的病毒siRNA的丰度，分析特异性RNAi。第三，研究成年小鼠是否通过指导病毒siRNA的增强的RIG-I依赖性生物发生而赋予NoV抗性。用NoV接种6周大的RIG-I、MDA5、LGP2、MAVS、IFNAR、STAT1和STAT2敲除小鼠以及wtC57BL/6小鼠，并如上所述进行表征。这些实验说明在基因敲除小鼠品系中观察到增强的NoV易感性，且其与典型病毒siRNA的丧失或产量的很大程度下降有关，且MAVS在控制成年小鼠中的NoV或NoVΔB2方面所起到的作用比在乳小鼠中所观察到的要更重要(参见图18)。可能成年小鼠中的1型IFN生产和IFN信号转导的诱导比先前在乳小鼠中所观察到的强得多。通过Northern和Western印迹分析或总RNA-seq分析来表征在用NoV或NoVΔB2感染之前和之后乳小鼠和成年小鼠中的RLR和IFNβ的可能的差异性诱导。第四，在NoV感染的成年小鼠和NoVΔB2感染的小鼠ES细胞两者中用于靶向RNA1的5′末端区的siRNA的极其大量的生产暗示了一个替代性想法，即NoV在成年小鼠感染期间丧失其B2功能，但这与增强的抗病毒RNAi假设并不互相排斥。举例来说，成年小鼠可能指导B2蛋白的降低的表达或增强的周转，或者所述B2变得没有活性，无法在成年小鼠感染期间抑制剪切和/或隔绝病毒双螺旋siRNA。比较乳小鼠与成年小鼠之间的NoVRNA1、RNA3和B2蛋白质的积累，并测序。小RNA与来自于NoV接种1、2、3和4天后的成年小鼠的B2共免疫沉淀以查明B2是否在成年小鼠中隔绝完美双螺旋病毒siRNA。将确定B2与病毒RdRP或其它宿主RNAi组分的相互作用在成年小鼠中是否被改变。

研究结果总结：首先，研究结果证明在哺乳动物中在感染期间产生典型病毒siRNA。发现用NoV的B2缺陷型突变体(NoVΔB2)感染培养的幼仓鼠肾21(BHK-21)细胞引发了病毒siRNA的积累，如通过深度测序所示。这些病毒siRNA主要是22-nt(对于负链来说更明显)，富含含有20-nt完美碱基配对的双螺旋区域且具有2-nt3′突出的22-ntRNA对的群体，且包括具有表明从相同病毒dsRNA前体连续加工siRNA的模式的更占优势的群体。相比之下，来自于被野生型NoV感染的BHK-21细胞的病毒小RNA并未展现典型siRNA的性质，表明B2表达抑制病毒siRNA的生物发生。深度测序也揭示了在被EMCV或NoVΔB2感染而不是被野生型NoV感染的小鼠胚胎干(ES)细胞中主要产生22-nt连续(也称为“定相”)病毒siRNA。此外，靶向EMCV的siRNA在Dicer被敲除的小鼠ES细胞中变得不可检测到，因此证实了病毒siRNA的Dicer依赖性生物发生。值得注意的是，在腹膜内注射NoVΔB2两天后的乳小鼠肢体组织中22-nt病毒siRNA优势积累到丰富的水平，且容易通过深度测序或Northern印迹杂交检测到。相比之下，BHK-21细胞中的靶向NoVΔB2的siRNA低于Northern印迹法的检测极限。体内生产的这些病毒siRNA也展现典型siRNA的性质，且被大致相等地分为正链和负链，表明其是从病毒dsRNA复制中间产物加工而来的，如对于果蝇中的FHVsiRNA所示。通过NoVΔB2和EMCV感染哺乳动物细胞所引发的典型病毒siRNA的生产表明在哺乳动物中存在针对不同RNA病毒感染的保守抗病毒RNAi响应。研究结果还表明，之前不成功的哺乳动物病毒siRNA的稳健检测需要使用体内感染模型和/或不能抑制siRNA生物发生的病毒。

其次，EMCVsiRNA被装载到在小鼠ES细胞中稳定表达的人Argonaute-2(hAgo2)中和小鼠Ago2中，如通过Northern印迹法和深度测序所示。

第三，发现不同于NoV，NoVΔB2感染在BHK-21细胞和小鼠ES细胞两者中存在缺陷，但是在稳定表达NoV的B2或已知抑制哺乳动物细胞中的实验性RNAi的异源VSR的BHK-21细胞中被有效地拯救，NoVΔB2感染在4种小鼠内源Argonaute被敲除的表达hAgo2的小鼠ES细胞中也存在缺陷，但是在hAgo2也被耗尽之后得到有效地拯救。这些研究结果一起表明，在不存在RNAi抑制的情况下，所诱导的特征在于生产22-nt病毒siRNA的哺乳动物抗病毒RNAi响应以Argonaute依赖性方式强力地抑制病毒感染。此外，虽然乳小鼠肢体组织中的NoV与NoVΔB2积累水平之间的差异在接种1天后(dpi)很小，但是其在感染后期逐渐变得更显著，使得到4dpi时NoV的积累以高于1,000倍超过NoVΔB2的积累。发现之前在RNAi抑制方面显示缺陷的表达突变型B2(R59Q)的NoV突变体(NoVmB2)在乳小鼠中也在由Northern印迹法检测到的大量病毒siRNA的生产有关的过程被减弱且快速清除。因此，无RNAi的病毒抑制的情况下，小鼠能产生足够强效地终止病毒感染的抗病毒RNAi响应。来自于4dpi的乳小鼠中的已知先天抗病毒路径的84种关键基因的表达的定量RT-PCR分析没有检测到NoVΔB2感染与NoV感染之间的较大差异，表明NoVΔB2的快速体内清除不受已知的由IFN调控的路径中的一种路径介导。

来源于ssRNA病毒的小RNA的生物发生和分布模式因此在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞的感染之间是保守的；昆虫感染病毒和哺乳动物感染病毒的直系同源VSR也以遗传上不能区别的方式抑制DCR作用。因此，除可能的调控功能以外的防御功能很可能支撑哺乳动物中催化性RNAi的进化持续性。这些结果提供关于哺乳动物抗病毒RNAi为何迄今仍然难以被发现的线索。首先，先前研究始终涉及毒性病毒，其中一些可能编码VSR，类似于NoV编码的B2，VSR防止siRNA(抗病毒RNAi的诊断分子)的生产。其次，来源于病毒的siRNA的水平在未分化的mESC或BHK-21细胞中比分化的mESC或BHK-21细胞中高至少一个数量级。这很可能与长dsRNA引发的RNAi在来源于胚胎组织或成年组织的未分化细胞中的独特功效有关，这可能被其通常降低的针对长dsRNA产生非序列特异性免疫反应(包括IFN反应)的能力支持。或者或巧合地，DCRsiRNA加工活性可能在细胞分化期间降低，这可能是经由其内部自抑制解螺旋酶结构域的修饰而降低。在此背景下，在mESC和乳小鼠中观察到的NoVΔB2siRNA的相同分布、相对丰度和生化特征表明，在各种哺乳动物组织中富含的多能祖细胞可能形成体内抗病毒RNAi的主要的且最强有力的部位。然而，尽管可能激活了IFN反应，在身体成肌细胞中或甚至在完全分化的肌管和神经细胞中报道了由长dsRNA引发的RNAi。

本文中已经描述了许多实施方案。然而，应理解可以在不脱离本公开书的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其它实施方案在下列权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种减毒病毒，其缺乏哺乳动物受试对象的RNAi的功能性病毒RNA抑制子(VSR)。

2.根据权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒在用于VSR多肽的编码序列中包含一个或多个突变。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的减毒病毒，其中所述一个或多个突变选自缺失、插入、取代或上述任一者的组合。

4.根据权利要求3所述的减毒病毒，其中所述一个或多个突变是缺失。

5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的减毒病毒，其中所述减毒病毒不能抑制受试对象中的siRNA生物发生。

6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的减毒病毒，其中所述病毒选自野田村病毒、埃博拉病毒、HIV-1、HIV-2、麻疹病毒、流感病毒、乳头状瘤病毒、细小核糖核酸病毒和嗜肝DNA病毒。

7.一种包含根据前述权利要求中任一权利要求所述的减毒病毒的疫苗。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其中被接种疫苗的受试对象在暴露于所述疫苗时产生典型siRNA。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其中所述典型siRNA以Argonaute依赖性方式产生。

10.根据权利要求7或权利要求8所述的疫苗，其中典型病毒siRNA预防或降低哺乳动物受试对象的细胞被病毒感染的可能性。

11.根据权利要求10所述的疫苗，其中所述病毒选自野田村病毒、埃博拉病毒、HIV-1、HIV-2、麻疹病毒、流感病毒、乳头状瘤病毒、细小核糖核酸病毒和嗜肝DNA病毒。

12.一种VSR抑制剂，其降低或抑制哺乳动物受试对象的RNAi的病毒RNA抑制子的活性。

13.根据权利要求12所述的VSR抑制剂，其中所述抑制剂可以用于治疗或预防哺乳动物受试对象中的病毒感染。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的VSR抑制剂，其中当所述抑制剂被施予具有病毒感染的受试对象时，所述受试对象的典型病毒siRNA的生产增加。

15.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的VSR抑制剂，其中通过施用所述抑制剂减轻病毒感染的严重度。

16.根据权利要求12至15中任一权利要求所述的VSR抑制剂，其中所述抑制剂是针对哺乳动物受试对象的RNAi的病毒RNA抑制子的抗体。

17.根据权利要求12至15中任一权利要求所述的VSR抑制剂，其中所述抑制剂是针对哺乳动物受试对象的RNAi的病毒RNA抑制子的siRNA。

18.一种重组复制型病毒载体，其包含根据权利要求1所述的减毒病毒且进一步包含目的异源基因。

19.根据权利要求18所述的重组复制型病毒载体，其中所述目的异源基因编码异源抗原性多肽。