CN105142657A - 软骨结合型融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本文提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含与生长因子受体的细胞外域特异性结合的第一结构域和与软骨基质组分特异性结合的第二结构域；以及包含这些融合蛋白的药物组合物。还提供了使用本文所公开的融合蛋白和药物组合物来治疗肌肉骨骼疾病的方法。

Description

软骨结合型融合蛋白

相关申请

本申请要求2013年3月29日提交的美国临时申请61/806,599的优先权，该美国临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景技术

创伤性关节损伤(例如韧带、肌腱以及软骨的撕裂)引发关节组织内的多因子变性级联，包括抑制组织修复、上调细胞外基质分解代谢、细胞死亡以及关节变性的慢性周期。虽然关节损伤的一些方面可以通过手术组织移植程序来修复，但这些方法可能仅部分地恢复了关节的生物力学稳定性。包括手术疗法和姑息疗法在内的当前的治疗方法不足以阻止关节运动的永久性改变。这种改变影响了物理力和细胞或组织力学变化的效应(即力学生物学效应)，包括细胞信号转导的改变，这促成了关节病理生理机制。不存在保护关节组织防止由这些力学生物学效应所引起的改变的细胞信号转导的后果的现有药物疗法。因此，产生关节变性病的风险在对关节造成创伤性损伤之后的数年内显著增加。

根据CDC，在2003年，关节炎和其它风湿性病况花费了美国1278亿美元(808亿美元是医疗护理支出以及470亿美元是损失的收入)或1.2％的国内生产总值。由创伤性关节损伤所引起的关节变性病占关节炎的总负担的超过10％。因此，对由创伤性关节损伤所引起的关节变性病的有效治疗的需要显著未得到满足。以下公开内容解决了这种需要并且提供了其它益处。

发明内容

以提供可接受的和有效的疗法的方式将药物直接递送到患病或受损伤的关节仍是一项显著的挑战，如由近期出版物中的以下语句所说明：

“关节内疗法是具有挑战性的，这是因为所注射的物质从关节间隙中被快速排出；这样的消除对于小分子和大分子这两者来说都是如此，所述小分子经由滑膜毛细血管离开，所述大分子由淋巴系统清除。一般来说，可溶性物质具有仅以小时来度量的关节内停留时间。”

(Evans等,Nat.Rev.Rheumatol.2014年1月；10(1):11-22)

对应对这一挑战存在长期的和没有得到满足的需求是由在差不多八年前出版的另一篇报道中所突出的相同问题来说明的：

“在未来的IA[关节内]治疗中应当作为目标的主要改进是更长的作用持续时间，这是因为由于与施用相关的不适/疼痛以及可能的感染风险而期望限制每年IA注射的次数。”

(Gerwin等,Adv.DrugDeliv.Rev.2006年5月20日；58(2):226-42)

因此，本文提供了可以被直接递送到患病或受损伤的以提供可接受的和有效的疗法的药物活性蛋白质。这些药物活性蛋白质是融合蛋白，所述融合蛋白包含与生长因子受体(例如IGF-1受体)的细胞外域特异性结合的第一结构域和与软骨基质组分(例如硫酸化糖胺聚糖和胶原)特异性结合的第二结构域；以及包含这些融合蛋白的药物组合物。这些融合蛋白和药物组合物特别可用于治疗关节变性病，如骨关节炎。还提供了使用本文所公开的融合蛋白和药物组合物来治疗肌肉骨骼疾病的方法。

在一个方面，本公开提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结构域与生长因子受体的细胞外域特异性结合，并且所述第二结构域与软骨基质组分特异性结合，并且在所述融合蛋白内(即在存在于所述融合蛋白中时)，每一个结合结构域均表现出特异性结合活性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含单条多肽链。在某些实施方案中，在所述融合蛋白内(即在存在于所述融合蛋白中时)，每一个结合结构域均表现出原生结合活性。

在某些实施方案中，所述第一结构域是IGF-1受体结合结构域。在某些实施方案中，所述IGF-1受体结合结构域具有包含人类IGF-1的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述IGF-1受体结合结构域具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述第二结构域是sGAG(硫酸化糖胺聚糖)结合结构域。在某些实施方案中，所述sGAG结合结构域具有以下各项的sGAG结合结构域的序列、或与以下各项的sGAG结合结构域同源或基本上同源的序列：富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸重复蛋白(proline-arginine-richendleucine-richrepeatprotein，PRELP)、软骨粘合素(CHAD)、抑瘤素M、胶原IX、BMP-4、纤维连接蛋白、RAND1、RAND2、RAND3、RAND4、RAND5、RAND6、AKK15、RLR22、R1Q17、SEK20、ARK24、AKK24、AL1、AL2、AL3、LGT25、Pep184、Pep186、Pep185、Pep239、Pep246、ATIII、或FibBeta。在某些实施方案中，所述sGAG结合结构域包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:2-13和54-70(参见表1)。在一个具体的实施方案中，所述sGAG结合结构域包含SEQIDNO:2。在一个具体的实施方案中，所述sGAG结合结构域由SEQIDNO:2组成。

在某些实施方案中，所述第二结构域是胶原结合结构域。在某些实施方案中，所述胶原结合结构域具有以下各项的胶原结合结构域的序列、或与以下各项的胶原结合结构域的序列同源或基本上同源的序列：胞外基质蛋白、软骨寡聚基质蛋白、PRELP、软骨粘合素、纤维调节素、核心蛋白聚糖或无孢蛋白。在某些实施方案中，所述胶原结合结构域包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:14-16和21-27(参见表2)。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含选自SEQIDNO:17-20、28-53以及71-87的氨基酸序列(参见表3)。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:18中所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白由SEQIDNO:18中所示的氨基酸序列组成。

在某些实施方案中，在存在于所述融合蛋白中时，每一个结合结构域均表现出原生结合活性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含少于40,000个、35,000个、30,000个、25,000个、20,000个、15,000个、10,000个、7,500个、5,000个、2,500个、1,000个、500个、或250个氨基酸。

在某些实施方案中，在注射到哺乳动物的关节的关节内间隙中之后，所述融合蛋白在关节的软骨组织内保留如下的一段时间，这段时间是与所述融合蛋白的不同之处仅在于第二结合结构域是不与软骨基质组分特异性结合的突变结构域的融合突变蛋白保留的时间的至少：1.5倍、2倍、3倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、二十倍、四十倍、五十倍、六十倍、七十倍、八十倍、九十倍、或一百倍。在某些实施方案中，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在软骨组织中保留的融合蛋白的量是每克组织至少约5pmol、约10pmol、约20pmol、或约50pmol。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的以下1)、2)、3)或4)的丢失相比时，所述关节表现出以下各项的丢失减少：1)来自软骨组织的sGAG、2)细胞含量、3)总软骨组织、或4)骨质量。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的产生相比时，所述软骨组织中sGAG的产生增加。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的水平相比时，所述软骨组织中sGAG的水平升高。

在某些实施方案中，在将所述融合蛋白注射到哺乳动物的关节的关节内间隙中之后，所述融合蛋白在所述关节的软骨组织内保留至少8天、至少9天或至少10天的时间。在某些实施方案中，所述关节是受损的关节，并且在软骨组织中保留的融合蛋白的量是每克组织至少约5pmol、约10pmol、约20pmol、或约50pmol。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是患病的关节或受损的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的丢失相比时，所述关节表现出来自软骨组织的sGAG的丢失减少。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的产生相比时，所述软骨组织中sGAG的产生增加。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的水平相比时，所述软骨组织中sGAG的水平升高。

在另一个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文所公开的一种或多种融合蛋白和糖皮质激素。合适的糖皮质激素包括而不限于阿氯米松(alclometasone)、倍氯米松(beclometasone)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、氯泼尼松(chloroprednisone)、环索奈德(ciclesonide)、皮质醇(cortisol)、可的松普林(cortisporin)、可的伐唑(cortivazol)、地夫可特(deflazacort)、地塞米松(dexamethasone)、氟氢缩松(fludroxycortide)、氟尼缩松(flunisolide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟可龙(fluocortolone)、氟米龙(fluorometholone)、氟替卡松(fluticasone)、己酸丙酮氢可他酯(hexacetonhydrocortamate)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲泼尼松(meprednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、莫米松(mometasone)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、泼尼立定(prednylidene)、孕甾二烯(pregnadiene)、孕甾三烯(pregnatriene)、孕甾烯(pregnene)、普洛托迪(proctosedyl)、利美索龙(rimexolone)、四氢皮质酮(tetrahydrocorticosterone)、曲安西龙(triamcinolone)和乌倍他索(ulobetasol)以及其药学上可接受的盐、水合物和酯。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以每克组合物1μg-1000μg的浓度存在。在某些实施方案中，所述糖皮质激素与脂肪酸缀合并且所述与脂肪酸的缀合任选地是经由酯键。在某些实施方案中，所述脂肪酸包含棕榈酸。

在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在微粒载体中。在某些实施方案中，所述微粒载体是脂质体。在某些实施方案中，所述微粒载体是多层囊泡。在某些实施方案中，所述微粒载体包含高熔融温度脂质。在某些实施方案中，所述脂质包含二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)或氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以微粒载体脂质的0.1摩尔％-20摩尔％的浓度存在于微粒载体中。

在某些实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有SEQIDNO:18中所示的氨基酸序列的融合蛋白和地塞米松21-棕榈酸酯，其中所述地塞米松21-棕榈酸酯被包含在含有HSPC的多层囊泡中。

在某些实施方案中，在将本文所公开的融合蛋白/糖皮质激素组合物注射到受损的关节或患病的关节的关节内间隙中之后，获得软骨基质合成读数或软骨降解读数，并且所述读数相对于在不含糖皮质激素的匹配组合物的匹配注射之后所获得的对照读数显示出改善作用。

在另一个方面，本公开提供了一种治疗关节损伤或关节疾病的方法，所述方法包括向关节的关节内间隙中施用治疗有效量的本文所公开的融合蛋白或组合物。在某些实施方案中，所述关节损伤或关节疾病选自骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨降解、急性炎症性关节炎、感染性关节炎、骨质疏松症、药物毒性相关的软骨缺损、或创伤性软骨损伤。

在另一个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物在生物相容性水凝胶中包含本文所公开的一种或多种融合蛋白。

在某些实施方案中，所述水凝胶包含透明质酸(HA)、HA衍生物、纤维素衍生物、以及肝素样结构域聚合物中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述水凝胶包含甲基纤维素。可以利用任何分子量的甲基纤维素，例如约5kDa至约500kDa。可以在水凝胶中利用任何量的甲基纤维素。在某些实施方案中，甲基纤维素的量是水凝胶的约1重量％至约10重量％。

在某些实施方案中，所述水凝胶包含HA(例如透明质酸钠)。可以利用任何分子量的HA，例如约10kDa至约1.8MDa。可以在水凝胶中利用任何量的HA。在某些实施方案中，HA的量是水凝胶的约1重量％至约10重量％。

在某些实施方案中，所述水凝胶包含肝素样结构域聚合物，所述肝素样结构域聚合物包含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、或肝素。可以在水凝胶中利用任何量的肝素样结构域聚合物。在某些实施方案中，肝素样结构域聚合物的量是水凝胶的约0.05重量％至2重量％。

在某些实施方案中，所述水凝胶在高于一定的温度(例如高于35℃)时具有热固性。在某些实施方案中，所述水凝胶在低于一定的温度(例如低于35℃)时是流体或具有剪切致稀性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公开的水凝胶约1μg至约1000μg的浓度存在。在某些实施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公开的水凝胶约100μg至约10,000μg的浓度存在。

在某些实施方案中，所述水凝胶还包含糖皮质激素。合适的糖皮质激素包括而不限于阿氯米松、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、环索奈德、皮质醇、可的松普林、可的伐唑、地夫可特、地塞米松、氟氢缩松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟可龙、氟米龙、氟替卡松、己酸丙酮氢可他酯、氢化可的松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、泼尼立定、孕甾二烯、孕甾三烯、孕甾烯、普洛托迪、利美索龙、四氢皮质酮、曲安西龙和乌倍他索以及其药学上可接受的盐、水合物和酯。还可以利用修饰的糖皮质激素。在某些实施方案中，所述糖皮质激素与脂肪酸(例如棕榈酸)经由酯键缀合。在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在微粒载体中，如脂质体或多层囊泡。脂质体微粒可以包含高熔融温度(T_m)脂质，例如DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、DPPC(二棕榈酰基磷脂酰胆碱)或HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)。在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在脂质体微粒中并且以所述脂质体脂质的0.1摩尔％-20摩尔％存在。在某些实施方案中，糖皮质激素被包含在脂质体微粒中并且所述脂质体脂质占所述水凝胶的0.01重量％-10重量％。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以足够的浓度存在于水凝胶中，所述浓度足以在将所述药物组合物(例如水凝胶)注射到关节中时，刺激软骨基质合成或刺激细胞存活或防止软骨基质降解或防止细胞死亡。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以每克水凝胶1μg-1000μg的浓度存在。

在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙中之后，所述关节的软骨基质合成或降解读数相对于在单独注射融合蛋白或融合蛋白加上糖皮质激素的组合之后的读数显示出改善作用。

在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙中之后，所述糖皮质激素以至少约8天(例如9天、10天、11天或12天)的半衰期存在于所述关节中。

在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙中之后，所述融合蛋白在所述关节的关节内间隙中保留的时间比在单独注射时融合蛋白或糖皮质激素保留的时间要长。

在另一个方面，本公开提供了一种治疗肌肉骨骼疾病的方法，所述方法包括向关节的关节内间隙中施用治疗有效量的本文所公开的一种或多种融合蛋白。在某些实施方案中，所述肌肉骨骼疾病包括骨关节炎、类风湿性关节炎、损伤后软骨降解、急性炎症性关节炎、感染性关节炎、骨质疏松症、或是药物毒性的结果。

附图说明

图1描绘了本文所公开的融合蛋白与(A)硫酸乙酰肝素和(B)硫酸软骨素结合的图表，这些图表示出了GF-Fus3(SEQID:18)与乙酰肝素和硫酸软骨素结合，而GF-Fus1(SEQID:1)或GF-Fus4(SEQID:33)则不与乙酰肝素和硫酸软骨素结合。

图2描绘了本文所公开的融合蛋白与胶原结合的图表，所述图表示出了GF-Fus5(SEQID:34)比GF-Fus6(SEQID:35)更大程度地与胶原结合。

图3描绘了两个图表，这两个图表示出了GF-Fus1、GF-Fus2(SEQID:32)、GF-Fus3、GF-Fus4、GF-Fus5、GF-Fus6融合蛋白和野生型IGF对牛软骨细胞(A)和BXPC-3细胞(B)中AKT磷酸化的刺激，证实了所有融合蛋白均将pAKT上调到与由野生型IGF所引起的上调相当的水平。数据是平均值±SEM。

图4描绘了sGAG丢失随时间(天)变化的图表，该图表示出了GF-Fus1、GF-Fus2和GF-Fus3以及野生型IGF减少了来自牛软骨外植体的sGAG丢失。数据是平均值±SEM。

图5描绘了³⁵S-硫酸盐向牛软骨外植体中的掺入的两个图表，这两个图表示出了相比于疾病对照，通过连续添加GF-Fus1、GF-Fus2、GF-Fus3以及野生型IGF(黑色条柱)获得了增加。在从培养基中去除之后4天或8天时(白色条柱)，GF-Fus3刺激了蛋白多糖生物合成的最大程度的增加。在第8天(图5A)和第12天(图5B)结束的培养的最后48小时期间测量³⁵S-硫酸盐的掺入。数据是平均值±SEM。无处理对照(健康)的³⁵S-硫酸盐掺入率在第8天和第12天时分别是132.2±3.6和140.3±11.0(平均值±SEM)pmol/hr/μgDNA。

图6是sGAG丢失％随时间(天)变化的图表，该图表示出了GF-Fus1、GF-Fus3、GF-Fus5以及GF-Fus6当在每一次更换培养基时供给这些融合蛋白时减少了来自牛软骨外植体的sGAG丢失％。数据是平均值±SEM。

图7是sGAG丢失％随时间(天)变化的图表，该图表示出了当仅在第0天-第4天向培养基中添加时，与GF-Fus1相比，GF-Fus3使来自牛软骨外植体的sGAG丢失％更大程度地减少。数据是平均值±SEM。

图8呈现了³⁵S-硫酸盐向牛软骨外植体中的掺入的两个图表，这两个图表示出了相比于疾病对照，当在每一次更换培养基时添加时GF-Fus1、GF-Fus3、GF-Fus5以及GF-Fus6使这种掺入增加。GF-Fus3在仅在第0天-第4天添加时刺激了³⁵S-硫酸盐掺入的最大程度的增加。在第8天(图8A)和第12天(图8B)结束的培养的最后48小时期间测量³⁵S-硫酸盐的掺入。数据是平均值±SEM。无处理对照(健康)的³⁵S-硫酸盐掺入率在第8天和第12天时分别是0.117±0.0099和0.083±0.0047(平均值±SEM)nmol/hr/μgDNA。

图9：(A)是接受GF-Fus3和抗Infl-1(地塞米松)单独处理和组合处理的牛外植体的sGAG丢失％随时间(天)变化的图表并且(B)是所述牛外植体的³⁵S-硫酸盐掺入随时间(天)变化的图表。相比于疾病对照，使用GF-Fus3与抗Infl-2(地塞米松-21-棕榈酸酯)的组合获得了最大程度的sGAG丢失％减少和³⁵S-硫酸盐掺入增加。在第8天和第12天(图9B)结束的培养的最后48小时期间测量³⁵S-硫酸盐的掺入。数据是平均值±SEM。无处理对照(健康)的³⁵S-硫酸盐掺入率在第8天和第12天时分别是153.5±9.1和123.2±8.8(平均值±SEM)pmol/hr/μgDNA。

图10呈现了以下的图表：(A)GF-Fus2从凝胶4中的累积释放；(B)GF-Fus2从凝胶3中的累积释放；(C)GF-Fus2从凝胶4中的每个时间点的释放；(D)GF-Fus2从凝胶3中的每个时间点的释放；(E)野生型IGF从凝胶4中的累积释放；(F)野生型IGF从凝胶3中的累积释放；(G)野生型IGF从凝胶4中的每个时间点的释放；(H)野生型IGF从凝胶3中的每个时间点的释放。GF-Fus2和野生型IGF在第0天-第3天从凝胶3和凝胶4这两者中以相似的速率释放，而在第4天之后没有进一步释放。数据是平均值±SEM。

图11A、B以及C是抗Infl-2(地塞米松-21-棕榈酸酯)从本文所公开的使用命名规则凝胶X-Y的水凝胶制剂中的累积释放随时间(天)变化的图表，其中X对于凝胶1和凝胶2来说分别是1或2，并且Y是1-5以指示纳米粒子类型。抗Infl-2的释放速率是不同的以使得在第9天时最快的释放制剂(凝胶2-3)与最慢的释放制剂(凝胶1-1和1-3)之间的累积释放相差4倍。数据是平均值±SEM。

图12呈现了来自以下各项的sGAG丢失％的图表：(A)人类踝关节距骨圆顶软骨外植体；(B)人类踝关节后侧距骨软骨外植体；(C)从距骨头以及胫骨踝和腓骨踝汇集的人类踝关节软骨外植体；以及(D)人类膝关节股骨-髌骨沟软骨外植体。在与细胞因子(疾病)一起培养16天(16D)期间将外植体用GF-Fus3和抗Infl-1(地塞米松)单独处理和组合处理。无细胞因子对照(健康)。抗Infl-1在单独以及与GF-Fus3组合这两种情况下均减少了所有组织的sGAG丢失％。数据是平均值±SEM。

图13呈现了如由³⁵S-硫酸盐掺入所测定的在使用GF-Fus3和抗Infl-1(地塞米松)单独处理和组合处理16天(16D)的情况下硫酸化基质生物合成的图表。在与细胞因子(疾病)一起培养16天的最后48小时期间测量对以下各项的掺入：(A)人类踝关节距骨圆顶软骨外植体；(B)人类踝关节后侧距骨软骨外植体；(C)从距骨头以及胫骨踝和腓骨踝汇集的人类踝关节软骨外植体；(D)人类膝关节股骨-髌骨沟软骨外植体；以及(E)人类膝关节髁软骨外植体。相比于疾病对照，GF-Fus3在单独以及与抗Infl-1(地塞米松)组合这两种情况下均增加了基质生物合成。健康对照的13A-E中的组织的掺入率分别是89.3±13.0pmol/hr/μgDNA、83.1±9.8pmol/hr/μgDNA、72.6±8.8pmol/hr/μgDNA、88.8±13.8pmol/hr/μgDNA、以及82.2±9.9pmol/hr/μgDNA。数据是平均值±SEM。

图14呈现了如由³⁵S-硫酸盐掺入所测定的在细胞因子(疾病)存在下用GF-Fus1和GF-Fus3中的每一种与抗Infl-1(地塞米松)的组合处理8天和16天(分别是8D和16D)的情况下以下各项的硫酸化基质生物合成的图表：(A)人类踝关节距骨圆顶软骨；(B)人类踝关节后侧距骨软骨；(C)人类踝关节距骨头以及胫骨踝和腓骨踝软骨；以及(D)人类膝关节股骨-髌骨沟软骨。在与细胞因子(疾病)一起培养16天的最后48小时期间测量³⁵S-硫酸盐掺入。健康对照的14A-D中的组织的掺入率分别是89.3±13.0pmol/hr/μgDNA、83.1±9.8pmol/hr/μgDNA、72.6±8.8pmol/hr/μgDNA、以及88.8±13.8pmol/hr/μgDNA。相比于疾病对照，使用GF-Fus1和GF-Fus3中的每一种进行的16天处理(黑色条柱)刺激了³⁵S-硫酸盐掺入，但是只有GF-Fus3在处理8天时(白色条柱)刺激了³⁵S-硫酸盐掺入。(E)如由³⁵S-硫酸盐掺入所测定的在不存在细胞因子的情况下用GF-Fus1和GF-Fus3中的每一种与抗Infl-1的组合处理8天和16天的情况下的硫酸化基质生物合成。在16天培养的最后48小时期间测量人类膝关节髁软骨外植体掺入。包括无细胞因子(健康)、细胞因子(疾病)以及单独的抗Infl-1作为对照。相比于疾病对照以及相比于单独的抗Infl-1，使用GF-Fus1和GF-Fus3中的每一种进行的16天处理(黑色条柱)刺激了³⁵S-硫酸盐掺入，但是只有GF-Fus3在处理8天时(白色条柱)刺激了³⁵S-硫酸盐掺入。数据是平均值±SEM。

图15是描绘了以下各项的一系列图表：(A)软骨裂解物中的地塞米松浓度；(B)半月板裂解物中的地塞米松浓度；(C)韧带裂解物中的地塞米松浓度；(D)髌骨加上周围滑膜的裂解物中的地塞米松浓度；(E)血清中的地塞米松浓度；(F)灌洗液中的地塞米松浓度；(G)软骨裂解物中的IGF浓度；(H)半月板裂解物中的IGF浓度；(I)韧带裂解物中的IGF浓度；(J)髌骨加上周围滑膜的裂解物中的IGF浓度；(K)血清中的IGF浓度；以及(L)灌洗液中的IGF浓度。在0.1小时处标绘即时时间点样品。数据是平均值±SEM。缺失点低于检测限度。

图16是通过³⁵S-硫酸盐掺入所测量的在细胞因子(疾病)存在下用GF-Fus1、GF-Fus3-His或GF-Fus3处理4天和12天(分别是4D(白色条柱)和12D(黑色条柱))的情况下硫酸化基质生物合成的图表。包括单独的细胞因子处理(疾病)作为对照。GF-Fus3刺激了与GF-Fus3-His相当的软骨基质合成。数据是平均值±SEM。

图17描绘了两个凝胶图像，这两个凝胶图像示出了在来自具有1级软骨的63岁女性(17A)和具有3级软骨的76岁女性(17B)的滑液中融合蛋白的稳定性。在37℃在滑液中孵育所示的时间之后将45ng的GF-Fus3上样到左侧的五个泳道中。将没有在滑液中孵育的储备GF-Fus3标准品(ng)上样到右侧的五个泳道中。在小于7.5kDa处的微弱的条带证实等于或少于1ng的极少蛋白质降解(即少于2％的上样蛋白降解)。

具体实施方式

本公开提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含与生长因子受体(例如IGF-1受体)的细胞外域特异性结合的第一结构域和与软骨基质组分(例如蛋白多糖亚基，如硫酸化糖胺聚糖(sGAG)、硫酸软骨素以及胶原)特异性结合的第二结构域；以及包含这些融合蛋白的药物组合物。还提供了使用本文所公开的融合蛋白和药物组合物治疗肌肉骨骼疾病，例如关节炎(例如骨关节炎)、创伤性关节损伤以及相关病况的方法。

I.定义

如本文所用的术语“长链[R³]-IGF-1”、“LR3”、“IGF(LR3)”以及“GF-Fus1”作为同义词用以指具有以下氨基酸序列的IGF-1变体多肽：FPAMPLSSLFVNGPRTLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQIDNO:1)。

术语“多肽”与“蛋白质”可互换地用以指氨基酸残基的聚合物并且不限于最小长度。肽、寡肽、二聚体、多聚体等还由以肽键连接的线性排列的氨基酸构成，并且无论是以生物学方式、以重组方式还是以合成方式产生的以及无论是由天然存在的氨基酸还是由非天然存在的氨基酸构成的，均被包括在这个定义内。全长蛋白质和其片段这两者均由该定义所涵盖。所述术语还包括多肽的共翻译和翻译后(C末端肽切割)修饰，例如像二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解切割(例如由弗林蛋白酶或金属蛋白酶切割)等。此外，出于本公开的目的，术语“多肽”和“蛋白质”包括相对于原生序列带有修饰，如缺失、添加、以及取代(在性质上一般是保守的，如将由本领域技术人员所知)的变体和衍生物，只要该蛋白质维持所需的活性即可。这些修饰可以是有意的，如经由定点诱变，或可以是意外的，如经由产生所述蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增或其它重组DNA方法所引起的误差。

术语“同源性”、“同一性”以及“相似性”指的是两个肽之间或两个最佳比对的核酸分子之间的序列相似度。同源性和同一性可以各自通过比较可以被比对以进行比较的每一个序列中的位置来确定。举例来说，它是基于使用默认位置中的标准同源性软件，如BLAST2.2.14版。当在所比较的序列中的等同位置由相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置处是同一的；当等同位点由相似的氨基酸残基(例如在空间和/或电子性质上相似，例如像保守氨基酸取代)占据时，则所述分子可以被称为在该位置处是同源的(相似的)。措辞同源性/相似性或同一性百分比分别指的是由所比较的序列所共有的位置处相似的或相同的氨基酸数目的函数。“无关”或“非同源”的序列与如本文所公开的序列共有少于40％的同一性，然而优选地少于25％的同一性。

如本文所用的术语“序列同一性”意指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗内是相同的(即基于逐个核苷酸或逐个残基)。术语“序列同一性百分比”是通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列，确定这两个序列中存在相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或残基的位置数目以得到匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数(即窗口尺度)，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算的。

如本文所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中所述多核苷酸或氨基酸构成在具有至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗内，时常在具有至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的比较窗内与参考序列相比具有至少85％序列同一性，优选地至少90％至95％序列同一性，更通常至少99％序列同一性的序列，其中所述序列同一性百分比是通过在比较窗内比较参考序列与可能包括总共为参考序列的20％或更少的缺失或添加的序列来计算的。参考序列可以是更大序列的子集。术语“相似性”在用于描述多肽时是通过将一个多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代与第二多肽的序列比较来确定的。

如本文所用的术语“同源的”或“同源物”是可互换使用的，并且在用于描述多核苷酸或多肽时，表示两个多核苷酸或多肽或其指定序列在例如使用BLAST2.2.14版以用于比对的默认参数(参见本文)最佳比对和比较时在至少70％的核苷酸，通常约75％至99％，并且更优选地至少约98％至99％的核苷酸中是相同的，具有适当的核苷酸插入或缺失或者氨基酸插入或缺失。如本文所用的术语“同源物”或“同源的”还指的是关于结构和/或功能的同源性。对于序列同源性，如果序列是至少50％同一的、至少60％同一的、至少70％同一的、至少80％同一的、至少90％同一的、至少95％同一的、至少97％同一的、或至少99％同一的，那么它们是同源物。本发明的基因或肽的同源物的确定可以由本领域技术人员容易地确定。

术语“基本上同源的”指的是至少90％同一的、至少95％同一的、至少96％同一的、至少97％同一的、至少98％同一的或至少99％同一的序列。同源序列可以是不同物种的相同功能基因。本发明的基因或肽的同源物的确定可以由本领域技术人员容易地确定。

对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果有必要，指定亚序列坐标，并且指定序列算法的程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下各项来进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.MoI.Biol.48:443-53(1970))、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-48(1988))、这些算法的计算机化实现(例如威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组的威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)、或目视检查。(一般参见Ausubel等(编著),《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),第4版,JohnWileyandSons,NewYork(1999))。

有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式的成对比对由一组相关的序列建立多序列比对以显示序列同一性百分比。它还绘制树图或树状图，显示出用于建立比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle(J.MoI.Evol.25:351-60(1987))的渐进比对方法的简化方案。所使用的方法类似于由Higgins和Sharp(Comput.Appl.Biosci.5:151-53(1989))所述的方法。所述程序可以比对最多300个序列，这些序列各自具有5,000个核苷酸或氨基酸的最大长度。多重比对程序开始于两个最相似的序列的成对比对，从而产生两个比对序列的集群。然后将这个集群与下一个最相关的序列或比对序列的集群比对。通过两个单个序列的成对比对的简单扩展来比对两个集群的序列。通过一系列渐进式的成对比对来实现最终的比对。通过指定特定的序列以及它们的序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标以及通过指定程序参数来运行程序。举例来说，可以使用以下参数将参考序列与其它测试序列相比较以确定序列同一性百分比关系：默认空位权重(3.00)、默认空位长度权重(0.10)、以及加权的末端空位。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST算法，它由Altschul等(J.MoI.Biol.215:403-410(1990))所描述。(还参见Zhang等,NucleicAcidRes.26:3986-90(1998)；Altschul等,NucleicAcidRes.25:3389-402(1997))。用于执行BLAST分析的软件可经由美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的互联网网站公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足一定的正值阈值分数T。T被称为相邻字分数阈值(Altschul等(1990)(同上))。这些初始相邻字命中用作种子以启动搜索来寻找含有它们的更长HSP。所述字命中然后沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对分数为止。在每个方向上字命中的延伸在下列情况时停止：累积比对分数相对于它所实现的最大值减少了量X；由于一个或多个负得分的残基比对的累加而使累积分数降至0或以下；或到达任何一个序列的末端。BLAST算法参数W、T以及X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用11的字长(W)、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-9(1992))、50的比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，它提供了有关两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然存在匹配的概率的指示。举例来说，如果测试氨基酸与参考氨基酸比较时的最小和概率小于约0.1，更通常小于约0.01，并且最通常小于约0.001，那么所述氨基酸序列被认为与参考氨基酸序列相似。

“保守氨基酸取代”由一个氨基酸被另一个具有相似的结构和/或化学特性的氨基酸所置换而产生，如亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸置换、天冬氨酸被谷氨酸置换、或苏氨酸被丝氨酸置换。因此，具体氨基酸序列的“保守取代”指的是对于多肽活性来说并非关键的那些氨基酸被取代或氨基酸被具有相似的特性(例如酸性、碱性、带正电荷或带负电荷、极性或非极性等)的其它氨基酸取代，以使得即使关键的氨基酸被取代也不会降低所述肽的活性(即所述肽穿透BBB的能力)。提供了在功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。举例来说，以下六组各自含有彼此是保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(还参见Creighton,《蛋白质》(Proteins),W.H.FreemanandCompany(1984)。)在一些实施方案中，使单个氨基酸或小百分比的氨基酸发生改变、添加或缺失的个别取代、缺失或添加也可以被认为是“保守取代”，条件是所述变化没有降低肽的活性。插入或缺失通常在约1个至5个氨基酸的范围内。保守氨基酸的选择可以基于肽中所要被取代的氨基酸的位置来选择，例如所述氨基酸是否在肽的外部并且暴露于溶剂或是在内部并且不暴露于溶剂。

在某些实施方案中，可以基于现有氨基酸的位置，即它对溶剂的暴露(即所述氨基酸是否暴露于溶剂或与没有暴露于溶剂的内部定位的氨基酸相比，是否存在于肽或多肽的外表面上)来选择将取代所述现有氨基酸的氨基酸。这些保守氨基酸取代的选择是本领域公知的，例如如Dordo等,J.MoIBiol,1999,217,721-739；以及Taylor等,J.Theor.Biol.119(1986)；205-218；以及S.French和B.Robson,J.MoI.Evol.19(1983)171中所公开。因此，可以选择适用于蛋白质或肽的外部上的氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸取代，例如但不限于可以使用以下取代：Y被F取代、T被S或K取代、P被A取代、E被D或Q取代、N被D或G取代、R被K取代、G被N或A取代、T被S或K取代、D被N或E取代、I被L或V取代、F被Y取代、S被T或A取代、R被K取代、G被N或A取代、K被R取代、A被S、K或P取代。

在替代性实施方案中，还可以选择所涵盖的适用于蛋白质或肽的内部上的氨基酸的保守氨基酸取代，例如可以使用蛋白质或肽的内部上的氨基酸(即没有暴露于溶剂的氨基酸)的合适的保守取代，例如但不限于可以使用以下保守取代：其中Y被F取代、T被A或S取代、I被L或V取代、W被Y取代、M被L取代、N被D取代、G被A取代、T被A或S取代、D被N取代、I被L或V取代、F被Y或L取代、S被A或T取代以及A被S、G、T或V取代。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代也被涵盖在变体的术语内。

如本文所用的术语“衍生物”指的是已经过化学修饰，例如但不限于通过诸如泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)、脂质化、糖基化、或添加其它分子的技术化学修饰的多肽。当分子含有通常不是所述分子的一部分的另外的化学部分时，它也是另一分子的“衍生物”。这些部分可以提高分子的溶解性、吸收性、生物半衰期等。所述部分或者可以减小分子的毒性、消除或削弱分子的任何不希望有的副作用等。能够介导这些作用的部分公开在《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences),第18版,A.R.Gennaro编著,MackPubl.,Easton,PA(1990)中，该文献以引用的方式整体并入本文。

术语“插入”或“缺失”通常在约1个至5个氨基酸的范围内。所允许的变化可以通过以合成方式产生肽，同时使用重组DNA技术在序列中系统地形成核苷酸的插入、缺失或取代而以实验方式来确定。

术语“取代”在提及肽时指的是相对于不同实体，例如另一氨基酸或氨基酸部分的氨基酸变化。取代可以是保守取代或非保守取代。

“共价键合”意指通过共价化学键直接或间接(例如经由接头)连接。

如本文所用的术语“融合蛋白”指的是两种或更多种蛋白质的重组蛋白。融合蛋白可以例如通过使编码一种蛋白质的核酸序列与编码另一种蛋白质的核酸连接以使得它们构成可以在细胞中被翻译成带有所有预期的蛋白质的单个多肽的单个开放阅读框而产生。蛋白质排列的顺序可以不同。融合蛋白可以包括表位标签或半衰期延长物。表位标签包括生物素、FLAG标签、c-myc、血球凝集素、His₆、地高辛(digoxigenin)、FITC、Cy3、Cy5、绿色荧光蛋白、V5表位标签、GST、β-半乳糖苷酶、AU1、AU5、以及抗生物素蛋白。半衰期延长物包括Fc域和血清白蛋白。

术语“受试者”和“个体”以及“患者”在本文可互换使用，并且指的是动物，例如人类或非人类动物(例如哺乳动物)，向所述动物提供使用如本文所公开的药物组合物进行的治疗，包括防治性治疗。如本文所用的术语“受试者”指的是人类和非人类动物。术语“非人类动物”和“非人类哺乳动物”在本文可互换使用并且包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、母牛，以及非哺乳动物，如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，所述受试者是人类。在另一个实施方案中，所述受试者是实验动物或作为疾病模型的动物替代物。

“治疗”受试者的疾病或病况或“治疗”患有疾病或病况的患者指的是对个体进行药物治疗，例如施用药物，以使得所述疾病或病况的至少一个症状减轻、稳定或被预防。

“特异性地结合”或“特异性结合”意指化合物或抗体在样品中识别并结合所需的多肽，但是基本上不识别并结合其它分子，所述样品例如生物样品，天然地包括本发明的多肽。特异性结合可以由至少约1×10^-6M或更小的解离常数来表征。在其它实施方案中，解离常数是至少约1×10^-7M、1×10^-8M或1×10^-9M。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。

如本文所用的术语“读数”指的是任何定性测量或定量测量。在某些实施方案中，所述读数是定性测量。在某些实施方案中，所述读数是定量测量。

应当了解的是，本发明不限于本文所述的具体方法、方案以及试剂等并且因而可以变化。本文所使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。根据以下详细说明、附图以及权利要求书，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。

II.融合蛋白

在一个方面，本公开提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含与生长因子受体的细胞外域特异性结合的第一结构域和与软骨基质组分特异性结合的第二结构域。

所述第一结构域可以靶向任何所需的受体(例如生长因子受体)。在某些实施方案中，所述第一结构域靶向牵涉到肌肉骨骼疾病的生长因子受体(例如IGF-1受体)。所述第一结构域可以包含生长因子受体的天然配体或人工配体。所述第一结构域可以根据需要是所靶向的生长因子受体的激动剂或拮抗剂。在某些实施方案中，所述第一结构域包含IGF-1受体配体(例如人类IGF-1受体配体)。在一个具体的实施方案中，所述第一结构域包含人类IGF-1序列。在一个具体的实施方案中，所述第一结构域包含长链[R³]-IGF-1序列(例如SEQIDNO:1中所示的人类长链[R³]-IGF-1序列)。在一个具体的实施方案中，所述第一结构域包含与SEQIDNO:1中所示的人类长链[R³]-IGF-1序列具有至少80％氨基酸同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的多肽。

第二类型的结构域可以靶向任何软骨基质组分，包括而不限于sGAG(例如硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸皮肤素以及硫酸角质素)和/或胶原或透明质酸。可以用于第二结构域中的合适的sGAG结合结构域包括而不限于以下各项的sGAG结合结构域：表皮生长因子(EGF)、富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸重复蛋白(PRELP)、软骨粘合素、抑瘤素M、胶原IX、BMP-4、纤维连接蛋白、RAND1、RAND2、RAND3、RAND4、RAND5、RAND6、AKK15、RLR22、R1Q17、SEK20、ARK24、AKK24、AL1、AL2、AL3、LGT25、Pep184、Pep186、Pep185、Pep239、Pep246、ATIII、或FibBeta。可以用于第二结构域中的合适的胶原结合结构域包括而不限于以下各项的胶原结合结构域：血小板反应蛋白、胞外基质蛋白、软骨寡聚基质蛋白、PRELP、软骨粘合素、纤维调节素、核心蛋白聚糖或无孢蛋白。示例性sGAG结合结构域和胶原结合结构域示于本文的表1和2中。

在某些实施方案中，所述第二结构域与第一结构域的N-末端融合。在其它实施方案中，所述第二结构域与第一结构域的C-末端融合。所述融合蛋白还可以包含结构域之间的接头。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含与软骨基质组分特异性结合的多于一个结构域。所述多于一个软骨基质结合结构域可以包含相同的结合结构域或作为另外一种选择，可以各自包含不同类型的软骨基质结合(即第二)结构域。

在某些实施方案中，所述第二结构域包含具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的sGAG结合结构域：SEQIDNO:2-13和54-70(参见表1)。在某些实施方案中，所述第二结构域包含与选自由以下各项组成的组的氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的sGAG结合结构域：SEQIDNO:2-13和54-70(参见表1)。

在某些实施方案中，所述第二结构域包含具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的胶原结合结构域：SEQIDNO:14-16和21-27(参见表2)。在某些实施方案中，所述第二结构域包含与选自由以下各项组成的组的氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的胶原结合结构域：SEQIDNO:14-16和21-27(参见表2)。

在某些实施方案中，所述第一结合结构域以小于1000nM(例如小于100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM、或0.0001nM)的Kd与受体(例如生长因子受体)结合。应当指出的是，更低的Kd对应于更高的结合亲和力。在某些实施方案中，所述第二结合结构域以小于1000nM(例如小于100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM、或0.0001nM)的Kd与软骨基质组分(例如sGAG或胶原)结合。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:17-20、28-53、71-87(参见表3)。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:18中所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白由SEQIDNO:18中所示的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含与选自由以下各项组成的组的氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的氨基酸序列：SEQIDNO:17-20、28-53、71-87(参见表3)。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含组氨酸标签。如本文所用的组氨酸标签或6×组氨酸标签包含与融合蛋白的c-末端融合的具有序列GGSGGHHHHHH(SEQIDNO:89)的肽。

在某些实施方案中，本文所公开的融合蛋白在注射到哺乳动物的关节的关节内间隙(例如滑液)中之后在关节的软骨组织内保留至少8天(例如8天、9天、10天、11天或12天)的时间段以使得可以在所述时间段所获取的软骨组织活检中发现可检测水平的融合蛋白。在某些实施方案中，保留在软骨组织中的融合蛋白的可检测水平(量)可以是每克组织至少约5pmol(例如约10pmol、20pmol、30pmol、40pmol、或50pmol)。

在某些实施方案中，当向关节施用时，在与已经被注射了无毒对照蛋白(如血清白蛋白)的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的丢失相比时，本文所公开的融合蛋白使得来自关节软骨组织的sGAG的丢失减少。在某些实施方案中，在向受损的关节施用时，在与已经被注射了无毒对照蛋白的受损关节的软骨组织中sGAG的产生相比时，本文所公开的融合蛋白使得关节软骨组织中sGAG的产生增加。在某些实施方案中，在向关节施用时，在与已经被注射了无毒对照蛋白的受损关节的软骨组织中sGAG的含量相比时，本文所公开的融合蛋白使得软骨组织中sGAG的含量增加。

表1：示例性糖胺聚糖(GAG)结合结构域序列

如本文所用的“RAND”描述了具有特定的正电荷模式的序列的随机生成。上述蛋白质至少描述于例如Martino等,Sciencev343,885(2014)；Tillgren等,J.BiolChem.v284第42期(2009)；Andersson等,Eur.J.Biochem.271,1219-1226(2004)；Hileman等,BioEssays20:156-167,(1998)；以及Guo等,PNASv89,3040-3044(1992)中。

表2：示例性胶原结合结构域序列

表3：示例性融合蛋白序列

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含非天然氨基酸，包括合成非原生氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸。含有D-氨基酸的肽与含有L-氨基酸的形式相比表现出提高的体外或体内稳定性。因此，包含D-氨基酸的肽的构造在希望或需要更大的体内或细胞内稳定性时可以是特别有用的。更确切地说，D-肽对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性，从而提供了所连接的药物和缀合物的更好的口服跨上皮和透皮递送、膜永久性复合体的提高的生物利用度(对于进一步论述，参见下文)、以及延长的血管内和间质寿命(在希望有这些特性时)。D-异构体肽的使用还可以增强所连接的药物和其它运载分子的透皮和口服跨上皮递送。此外，D-肽不能被有效加工用于向辅助性T细胞的II类主要组织相容性复合体限制性提呈，并且因此不太可能诱导整个生物体的体液免疫应答。肽缀合物因此可以使用例如细胞穿透性肽序列的D-异构体形式、切割位点的L-异构体形式以及治疗性肽的D-异构体形式来构建。

在某些实施方案中，所述融合蛋白是逆反式多肽。“逆反式多肽”指的是在至少一个位置上具有肽键方向逆转，即氨基末端和羧基末端相对于氨基酸的侧链逆转的多肽。因此，逆反式类似物具有逆转的末端和逆转的肽键方向，而大致保持侧链的拓扑结构如同原生肽序列中的那样。逆反式肽可以含有L-氨基酸或D-氨基酸、或L-氨基酸和D-氨基酸的混合物，最多全部的氨基酸均是D-异构体。部分逆反式肽类似物是其中只有一部分的序列是逆转的并且被对映体氨基酸残基置换的多肽。由于这种类似物的逆反部分具有逆转的氨基末端和羧基末端，因此侧接逆反部分的氨基酸残基分别被侧链类似的α-取代的偕位二氨基甲烷和丙二酸酯置换。已经发现细胞穿透性肽的逆反形式与天然形式在易位穿过膜方面同样有效地起作用。逆反式肽类似物的合成描述于Bonelli,F.等,IntJPeptProteinRes.24(6):553-6(1984)；Verdini,A和Viscomi,G.C,J.Chem.Soc.PerkinTrans.1:697-701(1985)；以及美国专利号6,261,569中，这些文献以引用的方式整体并入本文。用于部分逆反式肽类似物的固相合成的方法已经有所描述(EP97994-B)，该文献也以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含氨基酸插入、缺失和/或取代(例如保守氨基酸取代)。

III.药物组合物

在一个方面，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所公开的一种或多种融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

药物组合物可以根据常规的药学实践来配制(参见例如《雷明顿：药学科学和实践》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),第20版,2000,A.R.Gennaro编著,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia；以及《制药技术百科全书》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology),J.Swarbrick和J.C.Boylan编著,1988-1999,MarcelDekker,NewYork，所述文献以引用的方式整体并入本文)。

在某些实施方案中，根据本公开的药物组合物被配制成在施用之后立即或在施用之后的任何预定时间或时间段释放活性剂(例如融合蛋白)。后者类型的组合物一般被称为控释制剂，包括(i)在一段较长的时间内在体内产生基本上恒定浓度的本发明的一种或多种药剂的制剂；(ii)在预定的延迟时间之后在一段较长的时间内在体内产生基本上恒定浓度的本发明的一种或多种药剂的制剂；(iii)在预定的时间段期间通过在体内维持一种或多种药剂的相对恒定的有效水平来维持所述一种或多种药剂的作用，而随之使与所述一种或多种药剂的血浆水平波动(锯齿形动力学模式)相关的不希望有的副作用减到最低程度的制剂；(iv)将一种或多种药剂的作用局限于，例如将控释组合物在空间上放置在患病组织或器官附近或患病组织或器官中的制剂；(v)实现方便给药，例如每周一次或每两周一次施用组合物的制剂；以及(vi)通过使用载体或化学衍生物使一种或多种药剂的作用定向以将治疗剂递送到特定的靶细胞类型的制剂。

可以采取许多策略中的任一种来获得控释，其中释放速率要超过所讨论的融合蛋白的代谢速率。在某些实施方案中，通过适当选择各种制剂参数和成分，包括例如各种类型的控释组合物和包衣来获得控释。因此，使用适当的赋形剂将融合蛋白配制成在施用后以受控方式释放融合蛋白的药物组合物。实例包括水凝胶、胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、分子复合体、微球体、纳米粒子、贴剂、脂质体或其组合。

在某些实施方案中，所述融合蛋白被配制到生物相容性水凝胶中。可以利用可以向关节施用并且实现本文所公开的融合蛋白的所需释放曲线的任何水凝胶。在某些实施方案中，所述水凝胶包含透明质酸(HA)、HA衍生物、纤维素衍生物、以及肝素样结构域聚合物中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述水凝胶包含甲基纤维素。可以利用任何分子量的甲基纤维素，例如约5kDa至约500kDa。可以在水凝胶中利用任何量的甲基纤维素。在某些实施方案中，甲基纤维素的量是水凝胶的约1重量％至约10重量％。

在某些实施方案中，水凝胶包含HA(例如透明质酸钠)。可以利用任何分子量的HA，例如约10kDa至约1.8MDa。可以在水凝胶中利用任何量的HA。在某些实施方案中，HA的量是水凝胶的约1重量％至约10重量％。

在某些实施方案中，所述水凝胶包含肝素样结构域聚合物，所述肝素样结构域聚合物包含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、或肝素。可以在水凝胶中利用任何量的肝素样结构域聚合物。在某些实施方案中，肝素样结构域聚合物的量是水凝胶的约0.05重量％至2重量％。

在某些实施方案中，所述水凝胶在高于一定的温度(例如高于35℃)时具有热固性。在某些实施方案中，所述水凝胶在低于一定的温度(例如低于35℃)时是流体或具有剪切致稀性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公开的水凝胶约1μg至约1000μg的浓度存在。在某些实施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公开的水凝胶约100μg至约10,000μg的浓度存在。在某些实施方案中，所述水凝胶还包含糖皮质激素。

在另一个方面，本公开提供了一种组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含本文所公开的融合蛋白和糖皮质激素。合适的糖皮质激素包括而不限于阿氯米松、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、环索奈德、皮质醇、可的松普林、可的伐唑、地夫可特、地塞米松、氟氢缩松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟可龙、氟米龙、氟替卡松、己酸丙酮氢可他酯、氢化可的松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、泼尼立定、孕甾二烯、孕甾三烯、孕甾烯、普洛托迪、利美索龙、四氢皮质酮、曲安西龙以及乌倍他索。这些化合物可以呈这些化合物的任何和所有药学上可接受的盐、水合物以及酯的形式，包括乙酸酯(包括二乙酸酯)、丙酮化合物(包括己酸丙酮化合物)、糠酸酯、磷酸酯以及丙酸酯(包括二丙酸酯)。在某些实施方案中，所述糖皮质激素与脂肪酸(例如棕榈酸)经由酯键缀合。在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在微粒载体中，如脂质体或多层囊泡。脂质体微粒可以包含高熔融温度(T_m)脂质，例如DSPC、DPPC或HSPC。在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在脂质体微粒中并且以所述脂质体脂质的0.1摩尔％-20摩尔％存在。在某些实施方案中，糖皮质激素被包含在脂质体微粒中并且所述脂质体脂质占所述水凝胶的0.01重量％-10重量％。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以足够的浓度存在于水凝胶中，所述浓度足以在将所述药物组合物(例如水凝胶)注射到关节中时，刺激软骨基质合成或刺激细胞存活或防止软骨基质降解或防止细胞死亡。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以每克水凝胶1μg-1000μg的浓度存在。

在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙(例如滑液)中之后，所述关节的软骨基质合成或降解读数相对于在单独注射融合蛋白或融合蛋白加上糖皮质激素的组合之后的读数显示出改善作用。

在某些实施方案中，在将组合物注射到关节的关节内间隙(例如滑液)中之后，糖皮质激素以至少约8天(例如9天、10天、11天、或12天)的半衰期存在于关节中。

在某些实施方案中，在将组合物注射到关节的关节内间隙(例如滑液)中之后，融合蛋白在关节的关节内间隙中保留的时间长于在单独注射时融合蛋白或糖皮质激素保留的时间。

IV.治疗方法

在一个方面，本公开提供了治疗肌肉骨骼病况(例如骨关节炎)的方法，所述方法是通过向受试者施用本文所公开的融合蛋白和药物组合物来实现的。

在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗肌肉骨骼病况的方法，所述方法包括向受试者的关节腔中施用治疗有效量的本文所公开的融合蛋白或其药物组合物。合适的肌肉骨骼病况包括而不限于骨关节炎、一种或多种软骨缺损、类风湿性关节炎、损伤后软骨降解、急性炎症性关节炎、感染性关节炎、骨质疏松症、或其它药物干预的副作用。

在某些实施方案中，本文所述的治疗方法还包括选择患有肌肉骨骼病况的这样的受试者。这种选择是由熟练的专业人员通过多种可供使用的方法，例如评估本文所述的症状来进行的。

成功的治疗是通过肌肉骨骼病况的一种或多种症状的改善来证实的。向有需要的受试者施用本文所公开的融合蛋白预期会预防或延缓肌肉骨骼疾病的产生。术语“预防”用于指的是其中受试者尚未患有正被预防的特定病况的情形，这意味着该病况没有以任何明显的形式表现。预防涵盖了预防或减缓症状的发作和/或严重程度(包括受试者已经患有另一病况的一种或多种症状的情况)。一般在有产生病况或身体功能障碍风险的受试者中进行预防。这些受试者被认为是需要预防的。

在某些实施方案中，本文所述的预防方法还包括选择有患肌肉骨骼病况风险的这样的受试者，之后向所述受试者施用融合蛋白，从而预防所述肌肉骨骼病况。这种选择是由熟练的专业人员通过许多可供使用的方法来进行的。举例来说，评估风险因素或诊断已知会引起所述病况或功能障碍的疾病或已知会引起所述病况的治疗或疗法。有已知会导致所述病况的疾病或损伤或相关家族史的受试者一般被认为有增大的风险。

如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指的是治疗性处理和防治(即预防)措施这两者，其中目的在于预防或减缓疾病的产生，如减少肌肉骨骼病况的至少一种效应或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，那么治疗一般是“有效的”，如该术语在本文中所定义。或者，如果肌肉骨骼病况的进展减少或停止，那么治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括在不存在治疗的情况下原本将预期的症状进展或恶化的停止或至少减缓。有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的降低、稳定的(即没有恶化的)疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分还是完全)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指使存活期与在没有接受治疗的情况下的预期存活期相比延长。

如本文所用的术语“有效量”指的是包含本文所公开的一种或多种融合蛋白的药物组合物减少疾病或病症的至少一种或多种症状的量，并且指的是药理学组合物足以提供所需作用的量。如本文所用的短语“治疗有效量”意指组合物足以按适用于任何药物治疗的合理的利益/风险比治疗病症的量。术语“治疗有效量”因此指的是如本文所公开的组合物足以实现与肌肉骨骼病况相关的症状或临床标志物的治疗性或防治性显著减少的量。

症状的治疗性或防治性显著减少是与对照或没有接受治疗的受试者相比，所测量的参数的例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。所测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如生物标志物的水平升高或降低，以及与疾病或病症的症状或标志物的临床上接受的量表相关的参数。然而，将理解的是，如本文所公开的组合物和制剂的总每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需要的确切量将根据诸如所治疗的疾病类型的因素而变化。

对于患有肌肉骨骼病况的受试者的治疗，术语“治疗有效量”指的是在患者中安全并且足以预防或延迟所述肌肉骨骼病况产生以及进一步减轻所述肌肉骨骼病况的量。所述量因此可以治愈所述肌肉骨骼病况的至少一种症状或使得所述肌肉骨骼病况的至少一种症状减轻。用于治疗疾病的有效量取决于疾病的类型、所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、施用方式等等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可以由本领域的普通技术人员仅使用常规的实验来确定。治疗的功效可以由本领域的普通技术人员来判断，例如，可以在肌肉骨骼疾病动物模型中评估功效。当使用实验动物模型时，在与未经过处理的动物相比，显示出肌肉骨骼疾病的症状减少时，证实有治疗功效。

如本文所用的术语“施用”和“引入”在本文可互换使用并且指的是将诸如一种或多种融合蛋白的治疗剂置于受试者体内，这是通过使得在所需部位递送这样一种或多种药剂的方法或途径来实现的。融合蛋白可以通过任何适当的途径来施用，所述途径引起对受试者的有效治疗。

如本文所公开的一种或多种融合蛋白或其组合物可以通过本领域已知的或本文所述的任何途径来施用，例如口服、肠胃外(例如静脉内或肌内)、腹膜内、经直肠、皮下、经鼻、经阴道、吸入、皮肤(贴剂)或眼部途径。在某个实施方案中，通过直接关节内注射来施用融合蛋白或其组合物。本文所公开的融合蛋白或组合物可以任何剂量或给药方案来施用。

融合蛋白或组合物可以单次剂量或多次剂量向患者施用。当施用多次剂量时，这些剂量可以彼此相隔例如一小时、三小时、六小时、八小时、一天、两天、一周、两周或一个月。举例来说，本文所公开的融合蛋白或组合物可以施用例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、15周、20周或更长时间。应当了解的是，对于任何具体的受试者，应当随时间推移根据个人需要和施用组合物或监督组合物施用的人员的专业判断对具体的给药方案进行调整。举例来说，如果较低的剂量没有提供足够的治疗活性，那么可以提高本文所公开的融合蛋白或组合物的剂量。

虽然主治医师最终将决定适当的量和给药方案，但是融合蛋白的治疗有效量可以0.0001mg/kg、0.01mg/kg、0.010.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、或1,000mg/kg的剂量提供。有效剂量可以从通过体外或动物模型测试生物测定或系统所获得的剂量响应曲线外推得到。

用于具体患者或受试者的剂量可以由本领域的普通技术人员使用常规的考虑因素(例如借助于适当的常规的药理学方案)来确定。医师可以例如首先开立相对低的剂量，随后提高剂量直到获得适当的响应为止。向患者施用的剂量足以随时间推移实现患者的有益治疗响应、或例如减少症状、或其它适当的活性，这取决于应用。剂量是由具体制剂的功效、以及融合蛋白的活性、稳定性或半衰期和患者的病况以及待治疗的患者的体重或体表面积决定的。剂量大小还由在具体的受试者中伴随具体载体、制剂等的施用的任何不良副作用的存在、性质以及程度决定。任选地根据本领域公知的方法在一种或多种适当的体外和/或体内疾病动物模型，如肌肉骨骼疾病模型中测试治疗组合物以确认功效、组织代谢以及估算剂量。具体来说，剂量最初可以通过在相关的测定中处理组对比非处理组(例如经过处理的细胞或动物模型对比未经过处理的细胞或动物模型的比较)的活性、稳定性或其它合适的量度来确定。以由相关制剂的LD50和/或融合蛋白的任何副作用的观测结果所确定的速率施用制剂。施用可以经由单次给药或分次给药来实现。

在确定待施用以治疗或防治疾病的融合蛋白的有效量时，医师评价循环血浆水平、制剂毒性、以及疾病的进展。

化合物的功效和毒性可以在细胞培养物或实验动物中通过标准医药程序来确定，例如ED50(剂量在50％的群体中是有效的)以及LD50(剂量对50％的群体是致命的)。毒性作用与治疗作用的剂量比是治疗指数，并且它可以被表示为LD50/ED50比。表现出大治疗指数的药物组合物是优选的。

本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对于具体的受试者、组合物以及施用方式来说有效实现所需的治疗响应而对受试者没有毒性的活性成分的量。

所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用的具体融合蛋白的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用的具体化合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康情况以及先前病史、以及医学领域公知的类似因素。

V.其它实施方案

根据上述说明，将显而易见的是，可以对本文所述的本发明作出变化和修改以将它用于各种用途和情况。这些实施方案也在以下权利要求书的范围内。

本公开还涵盖了一种制品，所述制品是用于提供本文所公开的融合蛋白的带标签的容器。制品包含包装材料和被容纳在所述包装材料内的本文所公开的融合蛋白的药剂。

制品中的药剂是适用于提供本文所公开的融合蛋白的任何组合物。因此，所述组合物可以包含如本文所公开的一种或多种多肽或其突变体或衍生物或能够表达这种肽的DNA分子。

制品含有呈单位剂量或多剂量形式的足以用于治疗本文所示的病况的量的药剂。所述包装材料包含表明其中所容纳的药剂的用途的标签。

所述标签还可以包括使用说明书和可能为销售所需的相关信息。所述包装材料可以包括用于储存药剂的一个或多个容器。

如本文所用的术语包装材料指的是诸如玻璃、塑料、纸材、箔等材料，所述材料能够将药剂保持在固定装置内。因此，例如，所述包装材料可以是用于容纳药剂的塑料或玻璃小瓶、层压封套以及类似容器。

在优选的实施方案中，所述包装材料包括标签，所述标签是描述了制品的含量以及当中所含的药剂的用途的有形表示。

VI.实施例

以下实施例不应当被视为限制了本公开的范围。

实施例1：用于蛋白质表达和纯化的方法

用于在293F细胞中瞬时产生蛋白质的方法

使用标准重组DNA技术将编码所需蛋白质序列的核酸克隆到pCep4载体(英杰公司(Invitrogen))中。通过在37℃在以2000rpm振荡下在存在氨苄西林(ampicillin)选择的情况下在1L卢里亚肉汤(LuriaBroth)中将转化的NEB5-α感受态大肠杆菌(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs))培养过夜来使克隆的载体扩增。将细胞通过以5000g旋转20分钟来收获并且使用质粒超大量试剂盒(PlasmidMegaKit)(快而精公司(Qiagen))来从细菌沉淀物中提取载体DNA。通过将20mL的200mML-谷氨酰胺(来源？)和10mL的10％普朗尼克(Pluronic)F-68添加到1L的F17培养基()中来制备293F细胞培养基。对于瞬时转染，在37℃和5％CO₂下使1L的293F细胞生长到150-200万个/毫升的密度。将1mg的总蛋白和2.5mL的聚乙烯亚胺溶液(1mg/mL)在50mL的细胞培养基中混合，涡旋，并且在孵育15分钟之后添加到细胞中。在转染后24小时和72小时之时向转染的细胞中供给蛋白胨(经由0.22μm过滤器灭菌的于F17培养基中20％w/v的原液)达到0.5％的最终浓度。在细胞活力下降到低于80％(一般一周)之后，通过以4000g离心20分钟来收获细胞。经由0.22μm过滤器过滤所得的上清液。

用于由稳定转染的CHO池产生蛋白质的方法

使用标准重组DNA技术将在DNA2.0处合成的编码所需蛋白质序列的核酸克隆到pMP10K(内部专有载体)中。在37℃在以2000rpm振荡下在存在氨苄西林选择的情况下在10mL卢里亚肉汤中使克隆的载体扩增过夜。使用离心微量制备试剂盒(SpinMiniprepKit)(快而精公司)从细菌中提取载体DNA。在37℃、5％CO₂下在带挡板的摇瓶中在CDCHO无血清培养基()中使悬浮适应的CHOK1细胞生长到不超过200万个/毫升的密度。在转染当天，将细胞在I无血清培养基()中重悬到80,000个细胞/毫升的密度并且将500μL的细胞分配在24孔组织培养板中(每次转染一个孔)。然后使用2.75μL的LTX(LifeTechnologies^TM)将细胞用1μg的总DNA转染，包括10ng的选择pNeo载体(带有新霉素(neomycin)选择标记)。在转染后三小时之时，添加补充有10％FBS的1mL的HAMS-F12()培养基并且使细胞在37℃、5％CO₂孵育箱中恢复48小时。然后将细胞培养基更换为HAMS-F12加上0.5mg/mL的并且将细胞在选择下孵育四天。将培养基更换为CDCHO加上并且将细胞孵育2至3周直到集落形成并且所有未转染的细胞已经死亡为止。然后将所选择的转染细胞扩充到25mL的烧瓶中直到存在足够的细胞为止以用25mL的0.3×10⁶个细胞/毫升对125mL的摇瓶进行接种。通过以0.3×10⁶个细胞/毫升接种继续使细胞扩充直到达到所需的体积为止。当细胞密度达到超过5×10⁶个细胞/毫升时，以总体积的10％添加CellBoost5(赛默科技公司(ThermoScientific))。当活力下降到低于60％时，通过以6000g离心来收获细胞。经由AcroPak^TM10000.8/0.2μm胶囊(颇尔公司(PallCorporation))过滤上清液。

在充镍树脂上的蛋白质纯化

使用FPLC^TM(通用电气医疗生命科学公司(GEHealthcareLifeSciences))纯化6×组氨酸标记的蛋白质。将5mM咪唑和500mM的NaCl添加到待纯化的经过过滤的含有蛋白质的上清液中。将Ni-NTA超流()充镍树脂的新鲜填充的25mL柱(1.6cm的内径)用所提供的运行缓冲液(PBS加上0.5MNaCl，pH7.4)平衡。将上清液以10毫升/分钟加到所述柱上。将所述柱用6倍柱体积的PBS、500mMNaCl洗涤。用300mM的咪唑从柱中洗脱结合的蛋白质。在PBS中将含有蛋白质的级分牵拉和透析过夜。

IGF(LR3)-PRELP的蛋白质纯化

使用以下两个色谱步骤将IGF(LR3)-PRELP从0.2μM过滤的上清液中纯化：阳离子交换和阴离子交换。在第一色谱步骤中，将SPFF^TM阳离子交换柱(内径：1.6cm，床高：10cm，通用电气医疗科学公司(GEHealthcareSciences))用0.5×PBS(pH7.4)平衡。将经过过滤的上清液用蒸馏水1:1稀释，并且加到阳离子交换柱上。将结合的物质用0.5×PBS(pH7.4)洗涤，并且使用逐步梯度(1×PBS+500mMNaCl，pH7.4)洗脱。所有色谱步骤均是以500厘米/小时的流速来进行的。将含有蛋白质的洗脱级分汇集，用蒸馏水稀释到10mS/cm的电导率，并且使用1MTris碱将pH值调节到8.0。

在第二色谱步骤中，将QSFF^TM阴离子交换柱(内径：1.6cm，床高：10cm，通用电气医疗科学公司)用0.5×PBS(pH8.0)平衡。将阳离子交换池(pH值和电导率经过调节)以300厘米/小时的流速加到阴离子交换柱上。将流过物收集，浓缩并且针对2×PBS(pH7.4)透析。

SDS-PAGE分析

使蛋白质在还原和非还原条件下在4％-12％SDS-PAGE凝胶上进行电泳并且通过使用SimplyBlue^TMSafeStain()染色来可视化。将凝胶在水中微波处理1分钟，然后在染色剂中微波处理2分钟以加快染色过程。通过在水中微波处理2分钟来使凝胶脱色。使用这种方法来确定纯化的蛋白质是否具有正确的尺寸以及它是否是纯的。

尺寸排阻色谱

使用尺寸排阻色谱(SEC)来评估蛋白质的纯度和单体状态。将50μg的蛋白质在含450mMNaCl的10mM磷酸盐缓冲液中以0.35毫升/分钟进样到SuperSW3000柱(4.6mm内径×30cm)(东曹生命科学公司(TosohBioscience))上。在配备有自动进样器、二元泵以及二极管阵列检测器的Agilent1100HPLC上进行所有测量。使用软件(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))分析数据。

实施例2：融合蛋白与硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的结合

可以通过测量蛋白质结合ELISA板上所涂覆的多糖的能力来确定融合蛋白与多糖硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素结合的特异性。将肝素结合板(碧迪生命科学公司(BDBiosciences))涂覆以50μl的2-10μg/mL浓度的硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素()并且在室温下孵育过夜。将板用PBS洗涤并且在37℃用250μl的含0.2％明胶的PBS封闭1小时。然后将板用PBS洗涤并且拍干。将稀释系列的50μl蛋白质添加到孔中并且在37℃孵育2小时。蛋白质稀释系列起始于100nM并且包括10个于PBS、0.2％明胶中的另外的三倍稀释液以及一个空白对照(只有PBS、0.2％明胶)。将板在PBS中洗涤之后，添加50μl抗人类IGF-1(Abcam公司)(于PBST中，1:250)并且将板在室温下在旋转下孵育1小时。将板用PBST洗涤并且将100μl1:1000的抗兔-HRP(CellSignaling)(于PBST中)添加到每一个孔中并且将板在室温下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤并且与100μl的TMB底物一起在室温下孵育5-10分钟并且通过添加100μl的停止溶液来使反应停止。在450nm测量吸光度并且使用GraphPad(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司(GraphPadSoftware,SanDiego,CA))分析所得的数据。

使用上述方法来确定两种融合蛋白，即GF-Fus3(6×组氨酸标记)和GF-Fus4(6×组氨酸标记)的特异性。没有融合的结合结构域的GF-Fus1(6×组氨酸标记)用作阴性对照。如图1中所示，GF-Fus3与涂有硫酸乙酰肝素(图1A)和硫酸软骨素(图1B)的板结合，而GF-Fus4没有结合。

实施例3：融合蛋白与胶原II的结合

可以通过测量蛋白质结合ELISA板上所涂覆的胶原的能力来确定蛋白质对II型胶原的特异性。将96孔板在4℃用100μl的II型胶原(华盛顿州雷德蒙的Chondrex产品公司(ChondrexProducts,Redmond,WA))以1×所提供的缓冲液涂覆过夜。将板用PBS、0.05％Tween-20(PBST)洗涤并且在室温下用100μl的无蛋白质封闭缓冲液(Pierce，赛默科技公司)封闭1小时。然后将板用PBST洗涤并且拍干。将稀释系列的50μl蛋白质添加到孔中并且在室温下孵育1小时。蛋白质稀释系列起始于100μM并且包括10个于PBS中的另外的三倍稀释液以及一个空白对照(PBS)。将板在PBS中洗涤之后，添加50μl抗人类IGF-1(Abcam公司)(于PBST中，1:250)并且将板在室温下在旋转下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤并且在室温下添加100μL的1:1000抗兔-HRP(细胞信号转导技术公司(CellSignalingTechnology))(于PBST中)，持续1小时。将板用PBST洗涤并且与100μl的TMB底物一起在室温下孵育5-10分钟并且通过添加100μl的停止溶液来使反应停止。在450nm测量吸光度并且使用GraphPad分析所得数据。

如上文所述测量两种预期的II型胶原结合融合蛋白，即GF-Fus5(6×组氨酸标记)和GF-Fus6(6×组氨酸标记)的结合。如图2中所示，GF-Fus5和GF-Fus6这两者均与II型胶原结合，GF-Fus6结合得更强。

实施例4：在高密度培养物中融合蛋白刺激的原代牛软骨细胞 的AKT磷酸化的刺激

如上文所述制备包含IGF-1和软骨基质结合结构域的融合蛋白。制备六种融合蛋白：GF-Fus1(6×组氨酸标记)、GF-Fus2(6×组氨酸标记)、GF-Fus3(6×组氨酸标记)、GF-Fus4(6×组氨酸标记)、GF-Fus5(6×组氨酸标记)、以及GF-Fus6(6×组氨酸标记)。为了确保融合蛋白的生长因子部分在融合蛋白中具有活性，测试每一种构建体刺激AKT磷酸化的能力。包括野生型IGF-1(wtIGF)作为对照。使用多种剂量的每一种融合蛋白刺激牛软骨细胞，并且通过ELISA测量pAKT水平。

软骨细胞分离和配体刺激

将牛软骨细胞从2周-4周大的小牛的股骨髁中分离。通过去除围绕股骨的所有组织，用骨锯或钢锯去除股骨头，并且在组织钳中夹紧来固定膝关节。将关节在无菌条件下打开，取出髌骨、胫骨以及腓骨。使用解剖刀，将软骨从股骨髁上切去并且放在含有青霉素-链霉素(1×，Gibco公司，15140-122)的无菌PBS(pH值＝7.4)中。随后去除PBS并且在搅拌下添加链霉蛋白酶溶液(每5g组织50mL)，持续1小时，该溶液由高葡萄糖DMEM(生命科技公司(LifeTechnologies)，目录号：11965-092)、胎牛血清(10％v/v，生命科技公司，目录号：16140071)、HEPES(100mM，Gibco公司，15630-080)、非必需氨基酸(1×，西格玛公司(Sigma)，M7145)、青霉素-链霉素(1×，Gibco公司，15140-122)、脯氨酸(400μM，西格玛公司，P5607-256)、XIV型蛋白酶(2mg/mL，西格玛公司，目录号：P5147)组成。在用无菌PBS(pH值＝7.4)冲洗两次之后，在搅拌下添加胶原酶溶液(每5g组织50mL)，持续18小时，该溶液由高葡萄糖DMEM(生命科技公司，目录号：11965-092)、胎牛血清(10％v/v，生命科技公司，目录号：16140071)、HEPES(100mM，Gibco公司，15630-080)、NEAA(1×，西格玛公司，M7145)、青霉素-链霉素(1×，Gibco公司，15140-122)、0.25mg/mL的胶原酶P(罗氏公司(Roche)，目录号：11249002001)组成。将细胞过滤，洗涤并且在含有胎牛血清(10％v/v，生命科技公司，目录号：16140071)的软骨细胞培养基(低葡萄糖DMEM(1×，Gibco公司，11885-084)、青霉素-链霉素(1×，Gibco公司，15140-122)、非必需氨基酸(1×，西格玛公司，M7145)、以及HEPES(100mM，Gibco公司，15630-080))中重悬。

对于配体刺激，将软骨细胞用100μL含胎牛血清(10％v/v，生命科技公司，目录号：16140071)的软骨细胞培养基以200,000个细胞/孔接种到96孔组织培养板中。或者，将BXPC-3细胞，即胰腺腺癌细胞系(CRL-1687^TM)用100μL含L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素-链霉素(1×，15140-122)、胎牛血清(10％v/v，生命科技公司，目录号：16140071)的BXPC-3培养基(RPMI-1640，例如30-2001^TM)以30,000个细胞/孔接种到96孔组织培养板中。在24小时之后，将软骨细胞和BXPC-3细胞这两者用每孔100μL的无菌PBS(pH值＝7.4)冲洗并且将100μl的软骨细胞培养基或BXPC-3培养基(不含胎牛血清)添加到相应的细胞类型中。再过24小时之后，通过将25μL的表4中所列浓度5倍浓度的融合蛋白添加到孔中已有的100μL培养基中以用表4中所示的剂量的融合蛋白来刺激细胞。在刺激10分钟之后，去除融合蛋白并且将孔在冰冷PBS(pH值＝7.4)中冲洗。添加50微升/孔的细胞提取缓冲液(英杰公司，目录号：FNN0011)并且在4℃在振荡下孵育30分钟。然后将裂解物冷冻在-80℃。

表4：使用wtIGF、GF-Fus1、GF-Fus2、GF-Fus3、GF-Fus4、GF-Fus5、以及GF-Fus6进行软骨细胞刺激的配体剂量

通过ELISA对pAKT进行定量

在室温下将Corning高结合型384孔黑色ELISA板(目录号：3577)用30μL于PBS(pH值＝7.4)中的4μg/mL捕获抗体(抗AKT1总捕获抗体，Upstate公司，目录号：05-591MG)涂覆16小时，洗涤并且在室温下用每孔50μl的含2％牛血清白蛋白(西格玛公司，目录号：A3294)的PBS(pH值＝7.4)封闭1小时。将20μL解冻的裂解物或重组pAKT标准品(400ng活性重组人类AKT(Upstate公司，目录号：14-276)在含有50％v/v细胞提取缓冲液(英杰公司，目录号：FNN0011)、1％牛血清白蛋白(西格玛公司，目录号：A3294)、0.05％Tween20的PBS(pH值＝7.4)中的10个2倍系列稀释液)施加于经过涂覆的板中并且在室温下孵育2小时。在使用100微升/孔的0.05％Tween-20/PBS(pH值＝7.4)洗涤3次后，使用生物素化的磷酸化AKT(Ser473)(587F11)(细胞信号转导公司，目录号：5102)、链霉抗生物素蛋白-HRP(R&D系统公司，目录号：DY998，部件编号：890803)、SuperSignalELISAPico化学发光底物(赛默科技公司，目录号：37069)，使用光度计以检测在425nm的光发射来检测结合的磷酸化AKT。

结果

如图3A中所示，GF-Fus1、GF-Fus2以及GF-Fus3以与野生型IGF相似的程度刺激AKT的磷酸化。所获得的EC₅₀值(表5A中所示)证实在这一测定中这些融合蛋白在功能上等同于野生型IGF。在图3B中，GF-Fus1、GF-Fus3、GF-Fus4、GF-Fus5以及GF-Fus6以与野生型IGF相似的程度刺激AKT的磷酸化。所获得的EC₅₀值(表5B中所示)证实在这一测定中这些融合蛋白在功能上等同于野生型IGF。

表5A：融合蛋白的EC₅₀

表5B：融合蛋白刺激BXPC-3细胞的EC₅₀

实施例5：在使用外植的牛软骨进行的体外关节病模型洗脱实 验中GF-Fus3和GF-Fus2的持续活性

如下文所述在体外关节病模型洗脱实验中，使用外植的牛软骨评估含有来自PRELP的肝素结合结构域的融合蛋白的基质结合臂和生长因子臂这两者的活性。

方法

从2周-4周大的小牛的股骨髌骨沟中获取牛软骨外植体(3mm直径，1.2mm厚度)。通过去除围绕股骨的所有组织，用骨锯或钢锯去除股骨头，并且在组织钳中夹紧来固定膝关节。将关节在无菌条件下打开，取出髌骨、胫骨以及腓骨。使用3mm直径的一次性活检穿孔器，从股骨-髌骨沟中钻取约80mm×3mm直径的全厚度的软骨核心。使用无菌的小刀在软骨-骨骼界面处切下核心。然后将核心插入1.2mm厚的无菌不锈钢板中的3mm直径的孔中并且使用无菌刀片切成与板齐平以去除多余的核心长度，从而产生具有完整的浅表区软骨的具有3mm直径、1.2mm厚度的软骨外植体。

将外植体在96孔板中培养在300μL的培养基中，所述培养基由低葡萄糖DMEM(1×，Gibco公司，11885-084)、青霉素-链霉素(1×，Gibco公司，15140-122)、抗坏血酸(20μg/mL，西格玛公司，A4403)、脯氨酸(400μM，西格玛公司，P5607-256)、非必需氨基酸(1×，西格玛公司，M7145)、以及HEPES(100mM，Gibco公司，15630-080)组成。在每一种处理条件下使用来自三只动物的外植体(n＝每只动物2-3个)以达到每种条件8-9个的总外植体数。每2天更换一次培养基。在第6天和第10天时，将培养基补充以5μCi/mL的³⁵S-硫酸钠(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，NEX041H001MC，1mCi)。

时间点取在第8天和第12天：将外植体组织在于PBS中的1mM未标记的硫酸钠中洗涤四次，每次30分钟(总共2小时)。称取每一个外植体的湿重并且冷冻在-20℃直到消化为止。使用蛋白酶K(罗氏公司，目录号：3115879001)进行组织消化并且在60℃将每一个外植体在于50mMTris-HCL、1mM氯化钙(pH值＝8.0)缓冲液中的1mL100μg/mL的蛋白酶K中消化过夜。使用标准测定方法，如Hoemann,2004,《分子医学方法：软骨和骨关节炎》(MethodsinMolecularMedicine:CartilageandOsteoarthritis),Totowa,NJ:胡玛出版公司(HumanaPressInc.)；第127-52页中所述的那些对sGAG含量和DNA含量进行测量。通过将20μL的消化物与250μL的闪烁流体(珀金埃尔默公司，目录号：1200-439)混合并且使用WALLAC1450MICROBETATRILUX闪烁计数器计数来对消化的软骨外植体的³⁵S-硫酸盐的含量进行定量。

实验设计汇总在本文的表6中。以如下浓度给予处理：wtIGF-1：13.3nM＝100ng/mL(IGF-1，R&D系统公司，291-G1)；GF-Fus1(6×组氨酸标记)：13.3nM＝135ng/mL；GF-Fus2(6×组氨酸标记)：13.3nM＝140ng/mL；以及GF-Fus3(6×组氨酸标记)：13.3nM＝181ng/mL。所有处理均包括IL-1并且给予4天或整个培养持续时间。所测量的结果是在终点时塞状物的³⁵S-硫酸盐掺入、DNA含量和sGAG含量、以及所有培养基更换时释放到培养基中的sGAG。对照是无处理组(健康)或单独1ng/mLIL-1组(疾病)。

表6：实验设计

图4描绘了随时间(天)变化如通过丢失到培养基中的总sGAG的累积百分比所测量的软骨基质丢失的图表。通过将培养基中的累积sGAG除以在培养期间在培养基中存在的总sGAG加上在培养结束时保留在外植体中的sGAG来计算丢失百分比。相对于疾病对照，每一种IGF融合蛋白均以类似于野生型IGF的水平使软骨基质丢失减少。在第8天和第12天时终止的培养的最后48小时期间新软骨基质的合成(即通过³⁵S-硫酸盐掺入来测量硫酸化蛋白多糖合成)分别示于图5A和5B中。与疾病对照相比，在整个8天和12天(黑色条柱)的培养持续时间内在每次更换培养基时供给融合蛋白时，所有的融合蛋白(GF-Fus1、GF-Fus2以及GF-Fus3)和野生型IGF提高了软骨基质的合成。然而，在去除融合蛋白之后的4天或8天时对软骨基质合成的刺激对于PRELP肝素结合结构域与LR3-IGF的融合体(GF-Fus3，图5A和5B)来说是最高的。

实施例6：在使用外植的牛软骨进行的体外关节病模型洗脱实 验中胶原结合生长因子的活性：

制备结合II型胶原的融合蛋白(GF-Fus5、GF-Fus6)(这两者均是6×组氨酸标记的)。使用上文在实施例5中所述的方法和结果量度对融合蛋白进行表征，改动之处在于本文表7中所汇总的处理。所有条件均使用从单一动物获取的外植体。

表7：实验设计

图6示出了随时间(天)变化的软骨基质丢失(sGAG丢失％)，其中相对于疾病对照，所测试的IGF融合蛋白(GF-Fus1、GF-Fus3、GF-Fus5、以及GF-Fus6)中的每一种均使来自牛外植体的软骨基质丢失减少。图7示出了随时间(天)变化的sGAG丢失，其中相对于无处理对照，通过使用所测试的IGF融合蛋白中的每一种处理12天使得来自牛外植体的软骨基质丢失减少。此外，对于GF-Fus3，处理4天和处理12天使sGAG丢失减少了相等的量。然而，对于GF-Fus1(没有Prelp肝素结合结构域的融合蛋白)，与处理12天相比，处理4天引起了更高的sGAG丢失。图8A和8B分别示出了在第8天和第12天时牛软骨外植体中的软骨基质合成(³⁵S-硫酸盐掺入)。相对于疾病对照，通过使用所测试的IGF融合蛋白中的每一种处理8天(图8A)和12天(图8B)(黑色条柱)使软骨基质合成增加。对于GF-Fus3，处理4天和处理12天使蛋白多糖生物合成增加了相等的量，这表明在不含GF-Fus3的培养基中培养的8天内持续的对软骨基质合成的刺激(图8B)。

实施例7：GF-Fus3与地塞米松(抗Infl-1)的组合在使用外植 的牛外植体的体外关节病模型中的活性

使用如实施例5中所述的方法来对GF-Fus3(6×组氨酸标记)与地塞米松的组合进行表征。实验设计汇总在本文的表8中。所有条件均使用从单一动物获取的外植体。

表8：实验设计

图9A示出了随时间(天)变化的软骨基质丢失(sGAG丢失％)。与单独施用的GF-Fus3或地塞米松相比，GF-Fus3与地塞米松的组合更有效地抑制牛外植体中IL-1诱导的基质丢失。图9B示出了在第8天和第12天终止的培养的最后48小时期间软骨基质的合成(³⁵S-硫酸盐掺入)。与单独施用的GF-Fus3或地塞米松相比，GF-Fus3与地塞米松的组合更有效地刺激牛外植体中软骨基质的合成。术语抗Infl-X指的是地塞米松的不同型式，其中X＝1是地塞米松，X＝2是地塞米松-21-棕榈酸酯，并且X＝3是磷酸地塞米松。

实施例8：在存在或不存在透明质酸的情况下GF-Fus2从甲基 纤维素水凝胶中的持续释放

评估GF-Fus2和wt-IGF从水凝胶制剂中的体外持续释放。利用甲基纤维素水凝胶，即凝胶3(含6.1％(w/w)甲基纤维素A15(西格玛公司，M7140)的HBS)和透明质酸甲基纤维素水凝胶，即凝胶4(含1.8％(w/w)透明质酸钠(Lifecore公司，HA1M)和6.1％甲基纤维素的HBS缓冲液)。确切地说，将凝胶以50μL总体积浇注在流式细胞管中，每一种凝胶含有1μg的蛋白质。将凝胶在37℃在搅拌下在人工滑液(SF)(lgDMEM+青霉素-链霉素+2.5％的牛血清白蛋白，赛默科技公司，目录号：37525)中孵育14天。在30分钟之后以及之后在以下时间测定人工滑液(每种条件6次重复实验)：第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第9天、第11天、第14天。使用抗IGFELISA(R&D系统公司)测定蛋白质释放。结果示于图10A-H中。在第0天-第3天，GF-Fus2和野生型IGF从凝胶3和凝胶4这两者中以相似的速率释放，在第4天之后没有进一步释放，这表明在前3天内这些蛋白质从凝胶3和凝胶4中的持续递送。

实施例9：地塞米松-21-棕榈酸酯(抗Infl-2)从具有嵌入的脂 质纳米粒子的水凝胶中的释放

制备嵌入有含有地塞米松-21-棕榈酸酯的脂质纳米粒子的水凝胶并且测量地塞米松-21-棕榈酸酯从这些纳米粒子中的释放。

利用甲基纤维素水凝胶，即凝胶1(含9％(w/w)甲基纤维素A15(西格玛公司，M7140)的HBS缓冲液(5mMHEPES、144mMNaCl，pH6.5))和透明质酸甲基纤维素水凝胶，即凝胶2(含2％(w/w)透明质酸钠(Lifecore公司，HA1M)和7％甲基纤维素的HBS缓冲液)。使用表9中所示的脂质组成来制备地塞米松-21-棕榈酸酯脂质纳米粒子。

表9：地塞米松-21-棕榈酸酯脂质纳米粒子组成(每毫升粒子HBS悬浮液的毫克数)

*从乙醇中重结晶

确切地说，通过在65℃在120毫米汞柱下在过夜干燥下从氯仿溶液中旋转蒸发来形成脂质膜。在65℃在手动旋动下使膜在无菌HBS缓冲液(5mMHEPES、144mMNaCl，pH6.5)中水化并且以最大速度涡旋30秒。通过将所得的多层囊泡(MLV)与冰冷却的1.1×凝胶原液混合以除了具有10512-4的MC凝胶(它含有每克凝胶97.2μg)以外实现每克凝胶100μg的地塞米松-21-棕榈酸酯浓度来形成地塞米松-21-棕榈酸酯凝胶。

将凝胶分配到预先称重的高压消毒的带有经过乙醇处理的聚乙烯盖的2ml聚丙烯圆柱壳小瓶(NationalScientific公司，C4011-77P)中并且允许在底部形成“小圆块(knob)”，然后在37℃硬化超过24小时。每种凝胶每种脂质纳米粒子类型分配5×约300mg的凝胶，总共有50个凝胶。将由以下组分组成的700μL的人工滑液添加到50个小瓶中的每一个中：1×青霉素-链霉素(Gibco公司，目录号：15140-122)；2.5％BSA(赛默科技公司，目录号：37525)；以及lg-DMEM(生命科技公司，目录号：11885)，并且在37℃在轻微搅拌下孵育凝胶。在第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第9天，将人工滑液上清液取出并且冷冻储存在-80℃并且添加700μl新鲜的人工滑液。

通过解冻，超声处理并且用脂酶消化来分析上清液。简单地说，在与上清液并行处理的人工滑液中产生在320nM至5nM范围内并且包括零点的地塞米松和地塞米松-21-棕榈酸酯标准曲线。将100μL的这些标准品和来自每一个凝胶的上清液用0.5％Triton-X-100处理。将经过处理的样品和标准品在50℃烘箱中放置30分钟，然后在室温下在超声发生器中放置5分钟。将样品和标准品用4μg/mL的脂酶，即粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)(EMD化工公司(EMDChemical)，目录号：437707)处理。将板密封并且在37℃孵育过夜。如下使用来自Neogen公司(目录号：101519)的地塞米松ELISA试剂盒分析消化物：根据说明书使用酶缀合物、洗涤缓冲液以及K-Blue底物。在人工滑液中在与上述相同的范围内产生地塞米松的新标准曲线并且保持未处理作为对照。将额外的人工滑液添加到标准品中以使得经过处理的标准品和未经过处理的标准品的总体积是相同的。将样品和标准品在EIA缓冲液(Neogen公司，目录号：301277)中1:20稀释，或首先将样品在人工滑液中1:100稀释，然后将样品和标准品在EIA缓冲液中1:20稀释。在室温下将样品和标准品连同酶缀合物一起放入ELISA板中，持续45分钟。将板用每孔300μL的洗涤缓冲液洗涤3次并且在每一次洗涤之后翻转并且拍干。添加100μL的K-blue底物并且在室温下将板孵育30分钟。将100μL的TMB停止溶液(Kirkegaard&Perry实验室公司(Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc)，目录号：50-85-06)添加到每一个孔中并且在PerkinElmerEnvision板读数器上在450nm对板进行读数。将来自1:100和1:20稀释的样品以及单独1:20稀释的样品的数据针对标准曲线进行回归。除非读数低于1ng/mL，否则使用来自1:100稀释的数据。

图11A、B以及C描绘了随时间(天)变化抗Infl-2(地塞米松-21-棕榈酸酯)从如本文所公开的使用命名规则凝胶X-Y的包含脂质纳米粒子类型1、2、3、4或5的水凝胶制剂凝胶1或凝胶2中的累积释放的图表，其中X对于凝胶1和凝胶2分别是1或2，并且Y是1-5以指示纳米粒子类型。抗Infl-2从这些水凝胶中的释放速率示于本文的表10中。

最慢释放制剂(凝胶1-1和凝胶1-3)在第9天时抗Infl-2的累积释放是最快释放制剂(凝胶2-3)的约1/4。因此，可以通过改变凝胶的组成以及纳米粒子的类型，调节抗Infl-2的释放速率。

表10：地塞米松-21-棕榈酸酯从水凝胶中的释放速率

实施例10：将测定 ¹²⁵ I标记的GF-Fus3、GF-Fus1以及野生型 IGF向牛关节软骨中的摄取程度

使用先前在以下文献中所述的方法评价GF-Fus3、GF-Fus1以及野生型IGF在牛关节软骨和人类关节软骨中的分配系数、结合亲和力以及结合位点数：Garcia等,ArchBiochemandBiophys415(2003)69-79；Bhakta等,JBiolChem275:8(2000)5860-5866；Byun等,ArchofBiochemandBiophys499(2010)32-39。

简单地说，使用真皮穿孔器从软骨切片中挖去具有3mm直径×400mm-2000mm厚度的牛软骨或人类软骨圆盘。随后将这些圆盘从关节上不同的获取部位均匀地分配到各组中并且放置在新鲜的PBS(pH值＝7.4，含有蛋白酶抑制剂，罗氏公司，目录号：04693124001)中。在临用前，如下将¹²⁵I-IGF-I(或¹²⁵I标记的GF-Fus3或GF-Fus1)纯化以去除降解的片段或游离放射性。将¹²⁵I-蛋白质加到0.6cm×30cm葡聚糖凝胶G50柱上并且用由含0.01M乙酸、0.1％BSA的PBS(pH值＝7.4)组成的缓冲液洗脱以确保去除任何小分子量的放射性标记。汇集对应于真正的标记的IGF-1或融合蛋白的空隙体积级分。

然后将恒定量的¹²⁵I标记的蛋白质(平均33pM，比活度：2000Ci/mmol)以及分级量的相应未标记的蛋白质(0-200nM)添加到每一组圆盘中。在37℃下48小时的孵育阶段之后，将样品短暂冲洗，然后单独地在γ计数器中连同残留缓冲液一起计数。测量每一个圆盘的湿重和干重以确定水含量。如实施例5中所述对干燥样品进行蛋白酶-K消化以评估糖胺聚糖含量。

实施例11：马科动物骨关节炎模型

将在马科动物骨关节炎模型中对本文所公开的融合蛋白的疾病缓解活性进行表征。合适的模型系统包括而不限于McIlwraith等,BoneJointRes2012；1:297-309中所阐述的模型，该文献以引用的方式整体并入本文。将受试者通过在关节中关节内注射被配制用于持续保留或立即释放的含有或不含糖皮质激素的IGF融合蛋白注射剂来处理。注射体积将是0.1mL-15mL，注射体积中地塞米松棕榈酸酯的浓度是约10nM-10mM。IGF融合蛋白的浓度将是1nM-1mM。将给予1-10次注射。如果给予多次注射，那么注射之间的时间将是3天至6个月。

为了确定临床结果，将每两周对两个前肢进行临床检查，包括：按照0至5分的量表分级的跛行(0分是无跛行并且5分是非承重跛行)；以及按照0至4分的量表分级的关节积液(0分是没有积液并且4分是最严重的水平)。

成像可以包括：放射照片以观测可以包括放射性溶解、关节中的骨质增生以及骨赘增生在内的特征；CT成像以观测可以包括桡侧腕骨的小梁区中硬化骨的体积的变化；以及MR成像以观测可以包括滑液体积、滑膜增生、更高的关节囊增厚、关节囊水肿、桡侧腕骨水肿以及桡侧腕骨硬化的变化。

将以在每3天一次至每月一次范围内的频率采集滑液以评估以下结果：滑液蛋白、PGE2、CS846、CPII、sGAG、ColCEQ、C1,2C、骨钙素以及Col-1的水平。还将评估CS846、CPII、sGAG、骨钙素、C1,2C以及Col-1的血清水平。

实施例12：在使用外植的人类软骨进行的体外关节病模型洗脱 实验中GF-Fus3的持续活性以及地塞米松(抗Infl-1)的抗分解代 谢活性

如下文所述在体外关节病模型洗脱实验中，使用外植的人类软骨评估GF-Fus3(6×组氨酸标记)的软骨结合臂和生长因子臂这两者的活性。此外，确定地塞米松在单独以及与GF-Fus3和GF-Fus1(6×组氨酸标记)这两者组合这两种情况下的抗分解代谢活性，所述GF-Fus1没有软骨结合臂。这种人类软骨关节病模型模拟了在损伤之后或在慢性疾病中出现的由炎性细胞因子驱动的关节损伤的分解代谢阶段。还在不存在炎性细胞因子的情况下对处理进行测试以评估它们在炎症减少或消除时对软骨组织的作用。

方法

在死后24小时内从人类尸体供体的膝关节和踝关节获取人类软骨外植体。由病理学家在无菌条件下对关节进行解剖以根据修改的柯林斯量表(Collinsscale)(Kuettner等,不同人类关节中的软骨变性(Cartilagedegenerationindifferenthumanjoints),OsteoarthritisCartilage.2005；13(2):93-103)评估大体软骨形态并且仅使用0级或1级关节。使用解剖刀从股骨-髌骨沟和髁获取全厚度的膝关节软骨表面。使用解剖刀从距骨圆顶、距骨圆顶下的近端区域、距骨头、胫骨踝以及腓骨踝获取全厚度的踝关节软骨。使用4mm直径的一次性活检穿孔器，从软骨表面钻取全厚度的软骨核心，同时保持浅表区完整，并且在培养中用作外植体。

将外植体在96孔板中培养在300μL的低葡萄糖DMEM(1×，Gibco公司，11885-084)中，所述培养基添加有青霉素-链霉素(1×，Gibco公司，15140-122)、抗坏血酸(20μg/mL，西格玛公司，A4403)、脯氨酸(400μM，西格玛公司，P5607-256)、非必需氨基酸(1×，西格玛公司，M7145)以及HEPES(100mM，Gibco公司，15630-080)。对于每一种处理条件使用来自2-3个供体的外植体(每个供体4-6个外植体)，每种条件12-18个的总外植体数。供体年龄是：67岁男性的踝关节、71岁男性的踝关节、76岁女性的踝关节、59岁男性的膝关节、34岁男性的膝关节、以及63岁女性的膝关节。每2天更换一次培养基。在第14天时，将培养基补充以5μCi/mL的³⁵S-硫酸钠(珀金埃尔默公司，NEX041H005MC，5mCi)。

时间点如下取在第16天。将外植体组织在于PBS中的1mM未标记的硫酸钠中洗涤四次，每次30分钟(总共2小时)。称取每一个外植体的湿重并且冷冻在-20℃直到消化为止。使用蛋白酶K(罗氏公司，目录号：3115879001)进行组织消化并且在60℃将每一个外植体在于50mMTris-HCL、1mM氯化钙(pH值＝8.0)缓冲液中的1mL500μg/mL的蛋白酶K中消化过夜。使用标准测定方法，如Hoemann,2004,《分子医学方法：软骨和骨关节炎》(MethodsinMolecularMedicine:CartilageandOsteoarthritis),Totowa,NJ:胡玛出版公司(HumanaPressInc.)；第127-52页中所述的那些对sGAG含量和DNA含量进行测量。通过将20μL的消化物与250μL的闪烁流体(珀金埃尔默公司，目录号：1200-439)混合并且使用WALLAC1450MICROBETATRILUX闪烁计数器计数来对消化的软骨外植体的³⁵S-硫酸盐的含量进行定量。

结果

以如下浓度给予处理：GF-Fus1：13.3nM＝135ng/mL；以及GF-Fus3：13.3nM＝181ng/mL；地塞米松：100nM＝39.2ng/mL。生长因子和类固醇处理条件包括细胞因子TNF-α(R&D系统公司，目录号：210-TA，25ng/mL)、IL-6(R&D系统公司，目录号：206-IL，50ng/mL)以及IL-6Rα(R&D系统公司，目录号：227-SR，250ng/mL)，它们在每一次更换培养基时供给。在前8天(8天)或整个16天培养持续时间(16天)内将GF-Fus1和GF-Fus3添加到新鲜的培养基中，而在所有情况下均在整个16天内添加地塞米松。对照是无细胞因子(健康)或单独的细胞因子(疾病)。在第16天由软骨外植体测量的结果是³⁵S-硫酸盐掺入、DNA、和sGAG含量、以及所有培养基更换时释放到培养基中的sGAG。

图12A-D显示与疾病条件相比，在添加和没有添加GF-Fus3这两种情况下，地塞米松(抗Infl-1)均减少了人类踝关节软骨和膝关节软骨的基质分解代谢，这表明在人类软骨降解的高度转化模型中在细胞因子驱动的疾病期间保护软骨防止损伤的潜能。此外，从踝关节和膝关节中的多个解剖部位(距骨圆顶，图12A；后侧距骨，图12B；距骨头以及胫骨踝和腓骨踝，图12C；以及股骨-髌骨沟，图12D)获取的软骨外植体的一致结果表明了基质丢失的这种减少作用的稳健性。图13A-E显示与疾病条件相比，在添加地塞米松和没有添加地塞米松这两种情况下，GF-Fus3上调了新的硫酸化踝关节和膝关节软骨基质的合成，这表明了利用功能性承载基质分子进行软骨修复的潜能。这种作用同样在从踝关节和膝关节中的多个解剖部位(距骨圆顶，图13A；后侧距骨，图13B；距骨头以及胫骨踝和腓骨踝，图13C；股骨-髌骨沟，图13D；以及股骨髁，图13E)获取的软骨间是稳健的。图14A-D显示只有GF-Fus3在不含每一种对应的蛋白质的培养基中将人类踝关节和膝关节软骨外植体的潜在软骨修复活性持续了8天，而GF-Fus1没有(即GF-Fus3条件的白色条柱和黑色条柱是相当的，而GF-Fus1不是这样)。这种作用在距骨圆顶(图14A)、后侧距骨(图14B)、距骨头以及胫骨踝和腓骨踝(图14C)以及股骨-髌骨沟(图14D)间是稳健的，其中在所有情况下，疾病+抗Infl1+GF-Fus1(8天)类似于疾病对照，而疾病+抗Infl1+GF-Fus3(8天)显示出与连续递送的蛋白质(即疾病+抗Infl1+GF-Fus1(16天)和疾病+抗Infl1+GF-Fus3(16D))相比等同或优越的效能。

在不存在活动性疾病或新近的急性损伤的情况下，关节内细胞因子水平可能降低。因此，在无细胞因子的环境中，使用人类膝关节髁软骨外植体评估单独的地塞米松以及地塞米松与GF-Fus1和GF-Fus3的组合的活性。图14E显示在不存在细胞因子的情况下，地塞米松减少硫酸化基质的生物合成，但是GF-Fus1或GF-Fus3与地塞米松的组合在整个16天培养(黑色条柱)期间使硫酸化基质生物合成恢复到等于或高于健康对照的水平。此外，当在培养的最后8天内去除GF-Fus1(没有软骨结合结构域)和GF-Fus3(融合有软骨结合结构域)时(白色条柱)，只有GF-Fus3将硫酸化基质的生物合成维持在相当于连续16天处理的水平(不同于GF-Fus1)，这可能是因为它在人类软骨外植体内的结合、保留、以及活性增强。

实施例13：在关节内注射到大鼠膝关节中之后与GF-Fus3或 wtIGF混合的脂质粒子封装的地塞米松、脂质粒子封装的地塞米松 -21-棕榈酸酯、以及立即释放磷酸地塞米松的持续保留

测量在关节内注射到大鼠膝关节中之后3种地塞米松衍生物(参见方法)的保留。地塞米松和地塞米松-21-棕榈酸酯被封装在脂质粒子中并且与非封装的可溶性磷酸地塞米松制剂相比较，这种制剂是目前销售的地塞米松的可注射分子结构。将GF-Fus3(一种工程化的软骨结合型IGF融合蛋白，没有His标签)与地塞米松-21-棕榈酸酯粒子悬浮液和磷酸地塞米松溶液混合以确定脂质粒子的存在是否会使GF-Fus3在大鼠膝关节中的保留发生变化。将野生型IGF与地塞米松粒子悬浮液混合作为对照以与GF-Fus3的保留相比较(表12)。

方法

所有材料的来源列于表11中。通过在110微米汞柱下在60℃在过夜干燥下从氯仿溶液中旋转蒸发来制备表12中组1、组2以及组4的制剂。在68℃在手动旋动加上以最大速度涡旋45秒-60秒下使膜在无菌HBS-6.5缓冲液(5mMHEPES、144mMNaCl，pH6.5)中水化。将所得的脂质粒子悬浮液与在2×PBS中2×表12中所列的最终浓度的适当的蛋白质溶液1:1混合。通过制成10×表12中的浓度的磷酸地塞米松在蒸馏水中的无菌溶液来制备组3的制剂。将这种制剂与HBS-6.51:4混合，随后与在2×PBS中的适当的2×蛋白质溶液1:1混合。

表11：材料

表12：注射制剂

通过关节内注射到右侧膝关节中向路易斯大鼠(Lewisrat)(>275克)施用50μL的表12中的药物制剂。每种条件每个时间点注射六只大鼠，总共96只大鼠。对于组1-3，在注射之后立即以及1小时、4小时、24小时以及96小时之时将动物处死。对于组4，仅在注射之后1小时之时将动物处死。使用异氟烷使动物麻醉并且经由降主动脉放血到真空采血管中以采集血清。使用100μL的盐水对右侧膝关节进行灌洗。采集软骨、半月板、十字韧带、以及带有周围滑膜的髌骨，速冻，并且储存在-80℃。在液氮中冷却之后，将软骨、半月板、韧带以及带有周围滑膜的髌骨样品在Covaris组织管(目录号：520001)中使用CovarisCryoPrep仪器磨碎。使磨碎的样品悬浮在组织提取试剂(生命科技公司，目录号：FNN0071)(50μL(对于软骨)、100μL(对于韧带)、200μL(对于半月板)、以及400μL(对于髌骨))中并且在4℃在旋转振荡器上混合12-18小时。将裂解物以4000g离心并且取出澄清的上清液。

如实施例9中所述，按照制造商的说明书，将每一种组织类型的澄清的裂解物、灌洗液以及血清样品的等分试样用Triton-X-100和脂酶处理，同时添加碱性磷酸酶(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号：P0114)作为脂酶。将经过处理的裂解物在组织提取试剂中1倍、10倍、100倍、1000倍、以及10,000倍稀释。将经过处理的灌洗液和血清在人工滑液中1倍、10倍、100倍、1000倍、以及10,000倍稀释。如实施例9中所述通过地塞米松ELISA(Neogen公司，目录号：101519)分析所有稀释液。

将澄清的裂解物样品的等分试样在含Tween20(西格玛-奥德里奇公司，目录号：274348，在所有稀释液中的最终浓度：5％v/v的Tween20、10％的组织提取试剂)的PBS中10倍、100倍、1000倍、10,000倍、以及100,000倍(只有即时时间点时的灌洗液)稀释。将灌洗液和血清样品的等分试样在含Tween20(在所有稀释液中的最终浓度：5％v/v的Tween20、10％的人工滑液)的PBS中10倍、100倍、1000倍、10,000倍、以及100,000倍(只有即时时间点时的灌洗液)稀释。通过人类IGF-1ELISA(R&D系统公司，目录号：DY291)分析所有稀释液。遵循试剂盒方案，有以下不同之处：使用384孔黑色微孔板和SuperSignalELISAPico化学发光底物(赛默科技公司，目录号：37069)并且在光度计上在450nm对板进行读数。

结果

对于软骨、半月板、韧带以及髌骨加上滑膜裂解物来说，组1制剂的地塞米松保留在即时时间点时是组3的至多1/10，但是在所有后续的时间点时是组3的超过10倍(图15A-D，除了在半月板中4小时的时间点(图15B)以外)。在这些组织中，组2在1小时以及随后的时间点时是组3的至少10倍(除了在半月板中4小时的时间点(图15B)之外)。在这些组织中，组1在即时时间点时也是组2的约1/10，但是在所有后续时间点时与组2相同或更高(图15A-D)。

组1制剂在即时时间点时在血清中是不可检测的并且从1小时-24小时是组2或组3的约1/10(图15E)。在滑膜灌洗液中，组1在1小时和4小时之时是组2的10倍并且在滑膜灌洗液中在4小时之时是组3的1000倍(图15F)。

这些结果显示与组3中的立即释放可注射制剂相比，当通过组1和组2中的脂质粒子递送时，地塞米松在软骨、半月板、韧带以及髌骨加上滑膜中的保留增加。此外，与未官能化的地塞米松组2粒子(地塞米松)和组3立即释放制剂(磷酸地塞米松，抗Infl-3)这两者相比，组1中的棕榈酸酯官能化的地塞米松前药(地塞米松-21-棕榈酸酯)减少了在即时时间点时的突释，如由与组2或组3相比，在即时时间点时在软骨、半月板、韧带以及髌骨加上滑膜中组1的水平更低以及在血清中组1的水平不可检测或更低所证实。这种更低的突释可能促使在1小时和4小时之时在滑膜灌洗液中组1地塞米松水平的持续保持。

对于组1和组3，仅在24小时和96小时之时，在软骨组织中检测到IGF，而对于组2，在24小时之时，仅在6只动物中的1只中检测到IGF(图15G)。在1小时和4小时之时，在软骨中，组1和组3分别是组2的约4倍和100倍。在半月板、韧带、髌骨+滑膜以及滑膜灌洗液中，对于组1和组3，在24小时之时检测到IGF，但是对于组2没有检测到(图15H-J和图15L)。在1小时和4小时之时，在这些组织中组1和组3的IGF水平是组2的2-100倍。在即时时间点时，组2的血清IGF水平是组1和组3的约10倍，其中组2的水平在1小时和4小时之时仍是可检测的，而组1和组3低于检测限度(图15K)。在所有组织中在所有时间点时，对于组1和组3观测到相似的IGF保留水平。

这些结果显示对于含有GF-Fus3(软骨结合型工程化IGF融合蛋白)的组1和组3来说，与含有野生型非结合的IGF的组2相比，IGF优先保留在大鼠的膝关节内。对于组1和组3，IGF在软骨中保留的时间长于在半月板、韧带、以及髌骨加上滑膜中保留的时间，这可能是因为与其它组织相比，软骨的GAG含量显著更高，所述软骨优先保留GF-Fus3中的肝素结合结构域。在组1和组3之间没有看到差异，这证实了脂质粒子的存在没有影响GF-Fus3的保留。

实施例14：在使用外植的牛软骨进行的体外关节病模型洗脱实 验中具有纯化标签和没有纯化标签的GF-Fus3的等同的软骨保留和 合成代谢刺激

制备具有6×组氨酸标签的GF-Fus3和没有6×组氨酸标签的GF-Fus3(分别是GF-Fus3-His和GF-Fus3)。如上文在实施例5中所述制备和培养牛软骨外植体并且如表13中所述在培养基中包括融合蛋白处理。所有外植体均来自于同一动物。

表13：实施例14的实验设计

结果

图16显示从GF-Fus3-His中去除6×组氨酸标签没有使对软骨基质生物合成的刺激发生变化。此外，与先前实施例一致，与疾病对照相比，使用GF-Fus1、GF-Fus3-His以及GF-Fus3连续处理12天刺激了软骨基质生物合成。与疾病对照相比，GF-Fus3-His和GF-Fus3在处理4天的情况下对基质生物合成的刺激是非软骨结合型GF-Fus1的超过2倍。

实施例15：GF-Fus3在来自患有最小程度的和严重的软骨变性的供体的人类滑液中是稳定的

对受损软骨的持续治疗活性将需要靶向软骨的融合蛋白在受损关节的滑膜腔内稳定。因此，确定GF-Fus3在来自患有软骨降解的供体的人类滑液中孵育的情况下的稳定性。

方法

在死亡24小时内从两个人类供体(参见表14)获取滑液，快速冷冻并且储存在-80℃。在密封的200μLPCR管中将2μL的GF-Fus3(在PBS中0.45mg/mL，生命科技公司，目录号：10010-031)添加到18μL的滑液中(最终GF-Fus3浓度是45μg/mL)并且在37℃孵育0小时、24小时、48小时、72小时、或96小时。将样品在PBS中1:10稀释并且将10μL(45ng的GF-Fus3)与3.3μL的NuPAGELDS样品缓冲液(生命科技公司，目录号：NP0007)混合。将GF-Fus3标准品以100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、以及1600ng/mL制备并且将10μL的每一种溶液与3.3μL的NuPAGELDS样品缓冲液混合。将所有样品和标准品上样到4％-12％NuPAGEBis-Tris凝胶(生命科技公司，目录号：NP0321BOX)上，并且在NuPAGEMESSDS电泳缓冲液(生命科技公司，目录号：NP0002)中进行电泳。使用iBlot试剂盒(生命科技公司，目录号：IB301001)将蛋白质转移到硝化纤维素膜。在室温下在搅拌下将膜在Odyssey封闭缓冲液(LI-COR公司，目录号：927-40000)中封闭1小时。将膜在含0.05％Tween20的PBS(PBS-T)中洗涤两次并且在4℃在2μg/mL抗IGF-1抗体(密理博公司(Millipore)，目录号：05-172)中孵育过夜。将膜在PBS-T中洗涤三次并且在室温下与IRDye800CW山羊抗小鼠抗体(LI-COR公司，目录号：827-08364，1:2000稀释)一起孵育1小时。将膜用PBS-T洗涤三次，并且在LI-COROdysseyCLx上成像。

表14：人类滑液供体

年龄	修改的柯林斯软骨等级	性别
			63	1	女性
76	3	女性

结果

对于患有1级(最小程度)和3级(严重)软骨变性的供体(分别是图17A和17B)，在37℃下GF-Fus3在滑液中的96小时孵育引起了极少的蛋白质降解。当上样45μg的孵育蛋白时，在图17A和17B这两者中小于7.5kDa的微弱条带是可见的，但是在这两种情况下这个条带的强度小于或等于1ngGF-Fus3标准品，这表明在滑液孵育期间2％或更少的初始蛋白质降解。

等同方案

本领域技术人员仅使用常规的实验就将认识到或能够确定本文所描述的一项或多项发明的具体实施方案的多个等同方案。这些等同方案意在由以下权利要求书所涵盖。在任何独立权利要求和任何从属权利要求中所公开的实施方案中的一个或多个的任何组合也预期落入本发明的范围内。

以引用方式并入

本文所提到的每一篇专利、未决的专利申请、以及公布在此以引用的方式整体并入本文。

Claims (34)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中在存在于所述融合蛋白中时，所述第一结构域与生长因子受体的细胞外域特异性结合，并且所述第二结构域与软骨基质组分特异性结合。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含单条多肽链。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一结合结构域是IGF-1受体结合结构域。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二结合结构域是GAG(糖胺聚糖)结合结构域。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二结合结构域是胶原结合结构域。

6.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述GAG结合结构域包含以下各项的GAG结合结构域的序列、或与以下各项的GAG结合结构域同源或基本上同源的序列：富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸重复蛋白(PRELP)、软骨粘合素、抑瘤素M、胶原IX、BMP-4、纤维连接蛋白、RAND1、RAND2、RAND3、RAND4、RAND5、RAND6、AKK15、RLR22、R1Q17、SEK20、ARK24、AKK24、AL1、AL2、AL3、LGT25、Pep184、Pep186、Pep185、Pep239、Pep246、ATIII、或FibBeta。

7.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述GAG结合结构域包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:2-13和54-70。

8.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述GAG结合结构域包含SEQIDNO:2。

9.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述IGF-1受体结合结构域包含人类IGF-1的氨基酸序列。

10.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述IGF-1受体结合结构域包含含SEQIDNO:1的氨基酸序列。

11.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述胶原结合结构域包含以下各项的胶原结合结构域的序列、或与以下各项的胶原结合结构域的序列同源或基本上同源的序列：CNA35、CNA344、血小板反应蛋白、胞外基质蛋白、软骨寡聚基质蛋白、PRELP、软骨寡聚蛋白、软骨粘合素、纤维调节素、核心蛋白聚糖或无孢蛋白。

12.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述胶原结合结构域包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:14-16和21-27。

13.如权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:17-20、28-53以及71-87。

14.如权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白，其中在存在于所述融合蛋白中时，每一个结合结构域均表现出原生结合活性。

15.如权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含少于40,000个、35,000个、30,000个、25,000个、20,000个、15,000个、10,000个、7,500个、5,000个、2,500个、1,000个、500个、或250个氨基酸。

16.如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中在注射到哺乳动物的关节的关节内间隙中之后，所述融合蛋白在所述关节的软骨组织内保留一段时间，所述时间是与如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白的不同之处仅在于所述第二结合结构域是不与所述软骨基质组分特异性结合的突变结构域的融合突变蛋白保留的时间的至少：1.5倍、2倍、3倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、二十倍、四十倍、五十倍、六十倍、七十倍、八十倍、九十倍、或一百倍。

17.如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在所述软骨组织中保留的融合蛋白的量是每克组织至少约5pmol、约10pmol、约20pmol、或约50pmol。

18.如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在注射后的8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的以下1)、2)、3)或4)的丢失相比时，所述关节表现出以下各项的丢失减少：1)来自所述软骨组织的sGAG、2)细胞含量、3)总软骨组织、或4)骨质量。

19.如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在注射后的8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，所述软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的产生相比时，所述软骨组织中sGAG的产生增加。

20.如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的关节，并且在注射后的8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，所述软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的水平相比时，所述软骨组织中sGAG的水平升高。

21.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至20中任一项所述的融合蛋白，所述组合物还包含糖皮质激素，其中任选地，所述糖皮质激素选自由以下各项组成的组：阿氯米松、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、环索奈德、皮质醇、可的松普林、可的伐唑、地夫可特、地塞米松、氟氢缩松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟可龙、氟米龙、氟替卡松、己酸丙酮氢可他酯、氢化可的松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、泼尼立定、孕甾二烯、孕甾三烯、孕甾烯、普洛托迪、利美索龙、四氢皮质酮、曲安西龙和乌倍他索以及其药学上可接受的盐、水合物和酯。

22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述糖皮质激素以每克所述组合物1μg-1000μg的浓度存在。

23.如权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述糖皮质激素与脂肪酸缀合并且所述与所述脂肪酸的缀合任选地是经由酯键。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述脂肪酸包含棕榈酸。

25.如权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述糖皮质激素被包含在微粒载体中。

26.如权利要求25所述的组合物，其中所述微粒载体是脂质体。

27.如权利要求25所述的组合物，其中所述微粒载体是多层囊泡。

28.如权利要求26或27所述的组合物，其中所述微粒载体包含高熔融温度脂质。

29.如权利要求28所述的组合物，其中所述脂质包含二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、或氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。

30.如权利要求26或27所述的组合物，其中所述糖皮质激素以所述微粒载体脂质的0.1摩尔％-20摩尔％的浓度存在于所述微粒载体中。

31.一种组合物，所述组合物包含具有SEQIDNO:18中所示的氨基酸序列的融合蛋白以及地塞米松21-棕榈酸酯，其中所述地塞米松21-棕榈酸酯被包含在含有HSPC的多层囊泡中。

32.如权利要求21至31中任一项所述的组合物，其中在将所述组合物注射到受损关节或患病关节的关节内间隙中之后，获得软骨基质合成读数或软骨降解读数，并且所述读数相对于在不含糖皮质激素的匹配组合物的匹配注射之后所获得的对照读数显示出改善作用。

33.一种治疗关节损伤或关节疾病的方法，所述方法包括向关节的关节内间隙中施用治疗有效量的如权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白或如权利要求21至32中任一项所述的组合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述关节损伤或关节疾病选自骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨降解、急性炎症性关节炎、感染性关节炎、骨质疏松症、药物毒性相关的软骨缺损、或创伤性软骨损伤。