CN105121655B - 新型连接酶活性 - Google Patents

Abstract

提供在RNA夹板上连接具有大于8个核苷酸长度的多核苷酸的组合物和方法。连接反应在高或低ATP浓度下提供一致的结果。在对T4DNA连接酶的优化条件下，反应可迅速发生并且效率通常比T4 DNA连接酶高至少10倍，反应时间少于6小时，例如，少于1小时。

Description

新型连接酶活性

发明背景

通过互补RNA夹持的单链(ss)DNA寡核苷酸的连接是技术如RNA介导的退火、选择和连接(RASL)中的关键步骤。T4DNA连接酶已经用于RASL以及其它RNA分析和检测技术如分子倒置探针、改良的连接酶链反应和连接酶检测反应(例如，Yeakley,et al.,NatBiotechnol.,20(4):353-8(2002),Bullard and Bowater,Biochem.J.,398(1):135-44(2006)；Li,et al.,Curr Protoc Mol Biol.Apr；Chapter 4:Unit 4.13.1-9(2012)；美国公开申请号2011/0092375、美国专利号7,361,488；Nilsson,et al.,NatureBiotechnology,18:71(2000)；Nilsson,et al.,Science,265,2085-2088(1994)；Barany,PCR Methods Appl.,1:5-16(1991)；Landegren,Bioessays,15:761-765(1993)；Wiedmann,et al.,PCR Methods Appl.,3:S51-64(1994)；Nilsson,et al.,Nat Genet.,16:252-255(1997)；Baner,et al.,Nucleic Acids Res.,26:5073-5078(1993)；Hardenbol,et al.,Nature Biotechnol.,21:673-678(2003)；以及Landegren,Methods Cell Biol.,75:787-797(2004)))。

T4DNA连接酶不佳地需要例如长温育时间、高浓度的连接酶和低ATP浓度来发挥作用，以克服腺苷酸化DNA副产物的优先形成从而完成连接。

T4RNA连接酶作为连接与RNA模板或夹板(splint)杂交的DNA链的替代选择被测试(美国专利号6,368,801)。据报道，来自迁徙蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)昆虫痘病毒的NAD+依赖性连接酶对与RNA杂交的DNA具有类似于T4DNA连接酶的连接活性，但仅在Mn²⁺存在的情况下具有(Lu,et al.,Biocimica et Biophysica Acta,1701:37-48(2004))。Sriskanda,et al.,Nucleic Acid Research,26(15):3536-3541(1998)报道了来自绿草履虫(Paramecium bursaria)小球藻病毒的PBCV-1DNA连接酶，其中实验数据显示该连接酶可在DNA模板或DNA夹板上连接寡核苷酸，但不能在RNA模板或RNA夹板上连接寡核苷酸。这些结果通过晶体结构研究进行解释，其中作者显示PBCV-1连接酶迫使底物进入带切口的底物一侧上的RNA类A型螺旋，但需要在切口的一侧上的DNA类B型螺旋提供5’磷酸(Ho,et al.,J.Virol.,71(3):1931(1997)；Sriskanda,et al.,(1998)；Nair,et al.,Nat.Struct.Mol.Biol.,14:770-778(2007))。相似的结果报道于NAD依赖性大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶(Nandakumar,Mol.Cell,26:257-271(2007))和人DNA连接酶1(Pascal,et al.,Nature,432:473-478(2004))的晶体结构中，导致得出这些连接酶不能接受RNA夹持的DNA作为连接底物的结论。

发明概述

总体上，在一方面，提供组合物，其包含在缓冲液中的RNA夹板(splint)连接酶和至少一种具有至少8个核苷酸长度的多核苷酸。一方面，RNA夹板连接酶是热稳定的。另一方面，RNA夹板连接酶被固定在珠上。另一方面，夹板连接酶为PBCV-1连接酶。

组合物的实施方式可包括下列特征的一个或多个：RNA夹板连接酶和至少一种多核苷酸具有连接酶比多核苷酸为大于100:1或小于100:1、10:1或1:1的摩尔比；缓冲液包含1μM-1.5mM的ATP。

总体上，在一方面，提供连接两种多核苷酸片段的方法，多核苷酸片段为单链或具有单链区域或者为双链但适于变性，该方法包括：将至少两种多核苷酸片段如具有与RNA夹板互补的区域的DNA多核苷酸片段与RNA夹板连接酶组合；和允许这两种多核苷酸连接以形成单一多核苷酸。另一方面，多核苷酸片段是DNA片段，该DNA片段是复杂混合物的一部分，而RNA夹板具有预定的序列。可选地，DNA片段具有确定的序列，而RNA夹板是RNAs复杂混合物的一部分。

方法的实施方式可包括以下特征中的一个或多个：在含有至少1μM-1.5mM ATP缓冲液中进行连接反应；利用具有大于8个核苷酸长度的RNA夹板和各自具有大于8个核苷酸长度的多个多核苷酸，温育反应少于6个小时，以实现至少70％-90％的多核苷酸连接；温育反应少于1个小时，以实现至少70％-90％的多核苷酸连接；和/或以大于100:1或小于100:1、10:1或1:1的酶：底物摩尔比进行连接反应。在某些实施方式中，在相似条件下，RNA夹板连接酶的连接可比使用T4DNA连接酶的连接更迅速地发生；单链多核苷酸可以是用于定量PCR的模板，以使得所连接的单链多核苷酸的扩增产生比当用T4DNA连接酶替换RNA夹板连接酶时所观察到的更少的非模板多核苷酸背景扩增，和/或夹板连接酶能够在相同的反应条件下和使用相同的多核苷酸以比T4DNA连接酶快至少5倍或10倍的速率连接多核苷酸。

总体上，另一方面，提供分析mRNA的剪接历史的方法，包括：通过将ssDNA寡核苷酸与mRNA和RNA夹板连接酶组合，确认剪接点、剪接变体或剪接点处的突变。

总体上，另一方面，提供检测RNA序列的方法，包括：使具有在连接点与夹板RNA互补的区域的多核苷酸退火；使用RNA夹板连接酶连接多核苷酸、扩增连接产物；和检测和任选地定量扩增产物。

方法的实施方式可包括以下特征的一个或多个：RNA序列是微小RNA；和/或RNA夹板连接酶是PBCV-1连接酶。

附图说明

图1概述了对由DNA或RNA模板夹持的DNA连接的测定。预退火的带切口的底物如20脱氧核苷酸受体DNA、30脱氧核苷酸、FAM标记的和5’磷酸化的供体DNA以及DNA或RNA反向互补序列(夹板)，与合适的连接酶温育，然后用100mM EDTA淬灭并用甲酰胺变性。可分离片段，并且通过毛细管电泳检测FAM标记的ssDNA连接产物。

图2(A)-2(D)显示由DNA或RNA夹持的两种DNA寡核苷酸的连接(DNA-DNA连接)。明显的峰是通过与可靠的标准品共洗脱确认的未反应的pDNA(I)和连接产物(II)。100nM的标准寡核苷酸与100nM PBCV-1DNA连接酶(2(B)和2(D))或100nM T4DNA连接酶(2(A)和2(C))在20℃下反应30分钟。

组2(A)和2(B)：两个DNA寡核苷酸与DNA 2(A)和2(B)杂交，在此峰对应于完全连接。

组2(C)和2(D)：两个DNA寡核苷酸与RNA反向互补序列杂交。只在使用PBCV-1连接酶2(D)的反应中观察到对应于完全连接的峰，而使用T4DNA连接酶2(C)没有观察到连接。

图3(A)-3(B)显示使用一系列浓度(1pM-10μM)的T4DNA连接酶、T4RNA连接酶1或PBCV连接酶，在20℃下在含有1mM ATP的标准连接缓冲液中连接100nM预退火的、由DNA夹持的标准寡核苷酸底物。

3(A)DNA-DNA：由DNA夹持的连接。

3(B)DNA-DNA：由RNA反向互补序列夹持的连接。

PBCV-1DNA连接酶和T4DNA连接酶均可以相似连接活性连接由DNA夹持的DNA寡核苷酸，但只有PBCV-1连接酶可针对由RNA反向互补序列夹持的寡核苷酸底物形成可检测量的连接产物。T4RNA连接酶1对DNA夹持的连接具有轻微的活性，对RNA夹持的连接没有可检测的活性。

图4(A)-4(B)显示在20℃下在含有1mM ATP或10μM ATP和100nM预退火的带切口的底物的标准连接缓冲液中，使用一系列浓度(1pM-10μM)的T4DNA连接酶和PBCV-1连接酶连接相同的由RNA反向互补序列夹持的寡核苷酸底物。

4(A)：在1mM ATP存在的情况下由RNA反向互补序列夹持的DNA-DNA连接。

4(B)：在10μM ATP存在的情况下由RNA反向互补序列夹持的DNA-DNA连接。

在含有1mM ATP或10μM ATP的缓冲液中，PBCV-1连接酶以相似的连接活性连接由RNA夹持的DNA寡核苷酸。T4DNA连接酶仅在10μM ATP下具有提高的活性，但在相同的条件下，该活性比PBCV-1连接酶的活性至少小5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。PBCV-1连接酶可在含有高ATP浓度的缓冲液中连接可检测量的由RNA反向互补序列夹持的寡核苷酸底物，而T4DNA连接酶不可以。

图5显示在多种温度下PBCV-1连接酶RNA夹持的DNA连接活性。在16℃、25℃和37℃下进行由两种不同RNA模板夹持的DNA-DNA连接。第一种DNA寡核苷酸及其反向互补序列是图9中所述的标准模板(正方形)，还使用了具有Sriskanda,et al.,(1998)中所述的序列(圆形)的第二种模板，其显示序列对连接的作用很小或没有作用。反应条件是1μM PBCV-1连接酶、250nM RNA夹持的寡核苷酸底物在标准连接酶缓冲液中温育30分钟。

图6显示使用RNA夹板连接酶的qPCR检测的RASL测定设计。DNA探针被设计为具有与RNA靶标互补的区域和qPCR引发区域。正确退火的探针形成没有间隔的主干切口，其可通过RNA夹板连接酶连接。在探针存在的情况下的成功连接生成可通过qPCR定量的可扩增DNA序列。

图7(A)-7(B)显示在图1中所述的ssDNA寡核苷酸底物上使用PBCV-1连接酶或T4DNA连接酶以确定背景信号和反应速率的RASL测定的结果。

图7(A)：2.5nM荧光素酶mRNA夹板。

图7(B)：25nM荧光素酶mRNA夹板。

在RNA底物存在的情况下，PBCV-1连接酶以比T4DNA连接酶更快的速率给出阳性信号，如更快的Cq值所示。此外，与T4DNA连接酶相比，PBCV-1连接酶的背景相应得到显著延迟，如不提供模板RNA时更高的Cq值所示。

图8(A)-8(C)：使用PBCV-1连接酶通过RNA介导的夹板连接合成长ssDNA。

使用具有ssRNA夹板的两小片ssDNA有效地聚集121nt的ssDNA。然后，用RNase H去除RNA夹板，并用HPLC纯化ssDNA。在连接酶反应缓冲液(66mM Tris-HCl,10mM MgCl_2,1mMATP,1mM DTT,7.5％PEG 6000)中，在pH 7.6、25℃下进行包含0.25μM退火的寡核苷酸和1.45μM PBCV-1连接酶的连接反应。反应在25℃下温育30分钟(组8(B))或在16℃过夜温育(组8(C))。组8A中显示无酶的对照。

当与标准化学合成方法相比时，酶促地通过夹板连接合成长ssDNA具有高纯度、简单的纯化和成本显著降低的优点。这些结果与具有99.5％连接效率的现有亚磷酰胺技术形成反差，在现有亚磷酰胺技术中合成的150-mers粗溶液包含47％的全长产物和53％的失效序列。

图9显示实施例中使用的小球藻病毒多核苷酸连接酶(PBCV-1连接酶)的氨基酸序列和标准ss寡核苷酸底物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechMIP.shtml)。

图10显示使用PBCV-1连接酶检测微小RNAs的测定。在以一定浓度与靶标miRNA杂交之后，用PBCV-1连接酶将与微小RNA 122的5’一半互补的5’-磷酸化的32nt DNA探针和与miR-122miRNA的3’一半互补的33核苷酸DNA探针连接在一起。添加PCR引物并进行扩增。

图11：使用PBCV-1连接酶通过RNA夹板连接检测来自总大鼠肝RNA的miR-122。

DNA探针与大鼠肝总RNA中的miR-122杂交(约50pg miRNA/μg总RNA)并通过PBCV-1连接酶连接。非变性丙烯酰胺凝胶显示未消化的PCR产物(-)和用TSp45I消化的产物(+)，TSp45I特异性地在GT(C/G)AC处切割期望的产物。在两个大鼠肝RNA样品和含有0.1pg合成的miR-122的阳性对照中发现由箭头所示的在TSp45I存在的情况下正确切割的95碱基的带。不含RNA的阴性对照和不含miR-122的HeLa细胞RNA，其具有当被Tsp45I消化时不提供正确片段的较小的PCR产物。

泳道如下：

A 1μg大鼠肝RNA

B 100ng大鼠肝RNA

C 0.1pg miR-122

D 1μg HeLa RNA

E 无RNA

发明详述

一方面，本文所述的连接酶出乎意料地和高效地连接具有单链区域的DNA，其中单链区域由ssRNA夹持。在方法如RASL和RASL-seq、以及使用分子倒置探针和修饰的连接酶链反应/连接酶检测反应用于RNA分析和检测的方法中，该连接效力显著提高依靠利用两个或更多个寡核苷酸的RNA夹持的技术的效用。

除非另有特别指明，术语“RNA夹板连接酶”是指这样的酶，其能够连接两个由互补ssRNA多核苷酸夹持的ssDNA多核苷酸，并能够以并非绝对需要与底物相比过量摩尔的酶摩尔浓度以少于6小时的时间实现连接。对于非常低浓度的底物，为了方便，酶可以过量。RNA夹板连接酶的实施例是天然存在的DNA连接酶或与野生型连接酶具有至少90％、95％、98％或99％氨基酸序列同一性的密切相关的变体，其中连接酶可源自藻病毒如小球藻病毒，例如，PBCV-1连接酶(SEQ ID NO:1)，或可通过GenBank或NCBI的Blast搜索、或使用例如利用自2013年3月14日起的查询id gi|9632109|ref|NP_048900.1和其变体和突变体在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上得到的基础局部比对搜索工具的其它数据库而确认。RNA夹板连接酶包括RNA夹板连接酶与纯化标签(例如组氨酸标签、几丁质结合区域(CBD)、麦芽糖结合区域(MBP)、生物素)的蛋白质融合或DNA结合区域融合(例如sso7d、或烷基鸟嘌呤转移酶(AGT))。夹板连接酶可以是热稳定的和适合于与RNA和ds多核苷酸共存，以使得当通过升高温度使ds多核苷酸变性成ss多核苷酸随后与此处所述的RNA杂交时，连接酶保持对结合RNA夹持的ss多核苷酸的活性。

RNA夹板连接酶、单链(SS)多核苷酸和/或夹板RNA可被固定在基体如反应表面或磁珠上，以促进自动化实验方案和多重反应。

与描述对在RNA夹板上将DNA寡核苷酸连接在一起无活性的PBCV-1连接酶的出版物(Sriskanda,et al.,(1998))相反，此处已经显示当由互补RNA夹持时，尺寸大于8个核苷酸的ssDNA寡核苷酸或具有尺寸大于8个核苷酸的单链区域的双链DNA可令人惊讶地连接在一起，以形成长度为至少16个核苷酸的单个DNA，效率比T4DNA连接酶大超过10倍至1000倍。

术语“RNA夹板”包括ssRNA，该ssRNA具有大于8个核苷酸或10个核苷酸的尺寸，例如大于12或15或18或20或22或24或26或28或100个核苷酸的尺寸，或与能够至少部分与至少两个、三个或更多个单链多核苷酸杂交的RNA病毒基因组一样大的尺寸，例如具有长度为至少8或10或12或14或16或20个核苷酸或更长的尺寸，以便能够通过RNA夹板连接酶将片段相互连接。RNA夹板可具有确定的序列或可包含在RNAs的复杂混合物中。

RNA夹板可与杂交多核苷酸完全互补或与部分双链DNA的单链部分互补，或可延伸超出杂交多核苷酸上的互补区域，例如夹板可比杂交多核苷酸和/或RNA杂交区域长2、4、6、8、10个或更多个核苷酸。夹板可以是更大的RNA结构例如mRNA、tRNA、其它细胞RNA或RNA病毒基因组的一部分，以使得RNA区域与杂交多核苷酸互补，但结构的大部分与杂交多核苷酸没有互补性。

RNA夹板可来自任何来源。例如，夹板RNA可通过化学合成制备或获自mRNA样品、总RNA、微小RNAs、长非编码RNAs或其它天然存在的RNAs、核酸文库、细胞、培养物、组织、病原体、体液、尿、血清、活检样品和环境样品。可利用公开的方法使用任何其它已知或可开发的RNA来源。

术语“多核苷酸”包括DNA、RNA或部分DNA和部分RNA。当用于利用RNA夹板进行连接反应时，多核苷酸或其部分优选地为单链和可与至少部分RNA夹板部分或完全互补。本文所述的多核苷酸的一个实例是包含至少8个核苷酸的ssDNA寡核苷酸。另一个实例是具有包含至少8个核苷酸的单链区域的双链DNA。另一个实例是具有与夹板RNA互补的至少8个核苷酸单链区域的DNA/RNA杂交物。

在杂交多核苷酸具有与RNA夹板互补的区域的情况下，这可被限制于连接点，在别处具有非互补区域。实例包括用于PCR扩增的引物结合区域、用于反向分子信标设计的自互补区域、非互补连接区、或延伸超出RNA夹板长度的非互补区域。可通过长的非互补区域例如用于滚换扩增(RCA)的分子倒置探针的长的非互补区域将杂交多核苷酸连接在一起，以使得它们为具有两个不同杂交区域的单个多核苷酸。多核苷酸可杂交，以使得它们与夹板在连接部位充分地碱基配对，而没有间隔，或它们可在RNA夹板上伴随相距例如4、6、8、10个或更多个核苷酸的间隔而杂交，以使得连接在夹板RNA中产生ssRNA环出区域。

在本文中“杂交”是指本领域已知的杂交条件的选择，该条件足以用于夹板上互补或大致互补的碱基的特异性退火，从而选择性地结合待连接的多核苷酸上的单链区域。

与RNA夹板杂交的ss多核苷酸中的一个或多个、和/或RNA和/或RNA夹板连接酶可连接至底物，例如，基体如例如，磁珠、玻璃或二氧化硅底物或微观流体装置或其它反应室中的表面。珠可包括提交本申请时商业上可提供的任何类型且可进一步包括涂覆的珠，如涂覆有碳水化合物如直链淀粉或几丁质的珠。可选地，珠可涂覆有蛋白质如

(New England Biolabs Inc.)。

寡核苷酸可连接的其它固态底物直接或间接包括丙烯酰胺、纤维素、硝化纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯(polyethylene vinyl acetate)、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚环氧乙烷、玻璃、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟隆、碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、聚酐类、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、胶原蛋白、葡糖胺基葡聚糖、和聚氨基酸。固态底物可具有任何有用的形式，包括薄膜或膜、珠、瓶、碟、纤维、纺织纤维、成形聚合物、颗粒和微粒(Pease,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91(11):5022-5026(1994)；Khrapko,et al.,Mol Biol(Mosk)(USSR)25:718-730(1991)；Stimpson,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6379-6383(1995)；Guo,et al.,NucleicAcids Res.22:5456-5465(1994)；美国专利号5,871,928；美国专利号5,54,413；美国专利号5,429,807；美国专利号5,599,695；和美国专利号6,368,801))。

将多核苷酸与底物连接可便于单独或在多重反应和反应自动化中处理多个样品。用于确认连接产物的合适标记和捕获标签是本领域已知的，并描述于美国专利号6,368,801中。

在RNA夹板上连接多核苷酸的特征可包括以下一个或多个：

温度范围：可在4℃至50℃的范围内的温度，例如16℃、25℃和37℃下实现连接。

酶浓度：可以在例如，1nM-1mM酶的范围内的浓度实现连接。相对小量的RNA夹板连接酶可用于以至少70％、80％或90％效率在RNA夹板上连接ssDNA。底物与酶的比的实例包括1:10至10:1或100:1至1:100或1:1000至1000:1或1:10,000至10,000:1的范围，在6小时内，例如在5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或15分钟内完成连接。连接的完成可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶或毛细管电泳确定。T4 DNA连接酶需要10:1至100:1的酶与底物比，以获得反应产物并可采取超过12小时以进行可能未完成的连接。图3(A)-3(B)显示RNA夹板连接酶与T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶之间在活性上的显著差异的实例。

ATP浓度：在少于1.5mM ATP例如1μM-1mM ATP的范围内，例如1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM、0.1mM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM或1μM的ATP存在的情况下，可实现连接。使用此处提供的范围较高一端的ATP可能是优选的，因为如果在储存过程中或在反应条件下ATP发生一些水解，缓冲液在稳定RNA夹板连接酶反应上保持有效。此外，如果RNA夹板连接酶以腺苷酸化形式存在，反应可在没有ATP的情况下进行。

反应时间：可以在少于12小时内实现连接。可温育反应5分钟-60分钟，以实现有效连接，或温育反应如上所述更长的一段时间。

pH：可以pH 6–pH 9范围内的pH实现连接，显示在该范围内，RNA夹板连接酶的连接速率至少比T4 DNA连接酶快10倍。

在高和低浓度的ATP下T4 DNA连接酶和RNA夹板连接酶之间的反应速率之比：在方法的实施方式中，在高ATP浓度下，无论底物序列如何，RNA夹板连接酶(PBCV-1连接酶)的连接速率始终比T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶的连接速率大多达100:1。在低浓度的ATP下，在针对T4 DNA连接酶的优化条件下，RNA夹板连接酶的活性比T4 DNA连接酶大至少五倍或十倍(10:1)。

测试所有的底物，与T4 DNA连接酶相比，使用RNA夹板连接酶在连接上稳定改善：如上所述的改善的连接不依赖底物序列。这与使用底物敏感性的T4 DNA连接酶的连接反应不同。例如，虽然缓慢，但T4 DNA连接酶能够在优化的低ATP条件下利用RNA夹板(SEQ IDNO:4)连接两种寡核苷酸(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)，而当SEQ ID NO:3中第一个核苷酸从T变为G时，相同的反应条件下的T4DNA连接酶没有显示可检测的连接酶活性。相反，RNA夹板连接酶能够高效地连接这种改变的底物以及未改变的底物。

实际上，使用T4 DNA连接酶测试的最优底物和最差底物之间反应速率差异大于1000倍，即使使用报道的用于T4DNA连接酶的低浓度ATP(10μM ATP与1mM ATP)。

使用利用RNA夹板连接酶的本实施方式，在与用于T4DNA连接酶的反应条件相同的反应条件下，使用RNA夹板连接酶测试的相同最优底物和相同最差底物(就T4DNA连接酶而言)之间的反应差异小于50倍，例如(小于40倍、30倍或20倍)。

用于由RNA夹持的单链多核苷酸之间高效连接反应的RNA夹板连接酶的上述特征可用于增强RASL、RASL-seq和分子倒置探针(也称为持锁探针)的方法。其它使用可包括使用RNA夹板，通过连接短片段和随后的RNase处理(例如，使用RNase H或其突变体)以去除RNA夹板而促进形成长ssDNA(参见图8(A)-8(B))，以及检测微小RNAs(参见图10和11)。

通过RASL进行的定量mRNA分析(profiling)通常通过连接两个与感兴趣的RNA互补的ssDNA寡核苷酸(DNA探针)而完成。在标准RASL中，分离细胞mRNA，并用以在靶标mRNA序列存在的情况下退火的确定的DNA探针处理，以形成相邻的5’和3’DNA末端。可通过夹板RNA连接酶连接没有间隔或错配的正确退火的结构，以形成连接的探针。探针还包括与RNA互补区域相邻的qPCR引物区域，以使得当连接两个探针时，可通过qPCR扩增、检测和定量产物。qPCR信号的程度可与原始样品中靶标RNA序列的量关联。由于夹板RNA连接酶对正确碱基配对的序列和缺乏间隔的序列的强烈倾向，可检测靶标mRNA中剪接变体和单个碱基多态性(Yeakley,et al.,(2002))。

RASL-seq是RASL的变体，在此通过总DNA测序完成检测。在RASL-seq中，用适合于通过任何高通量DNA测序方法扩增和测序的PCR序列替换qPCR引物区域。数百种探针组可以与RASL-seq并行运行，因此可同时定量数百种基因的表达水平(Li,et al.,(2012))。

通过在mRNA互补区域之外合适的探针序列设计，可通过其它方法进行检测。一个实例是环介导等温扩增(LAMP)，其中设计探针以在连接之后形成LAMP靶标结构(Notomi,etal.,Nucleic Acids Res.,28(12):e63(2000))。然后，通过LAMP扩增检测靶标RNA的存在，使得能够在场地或定点照护诊断中实现优势如等温反应条件、快速检测和实施。在成功连接之后，可用传统的qPCR染料和如上所述的探针，或用传统方法：沉淀的焦磷酸镁的浊度检测(Mori,et.al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,289:150-154(2001))；利用金属敏感指示剂的比色检测(Tomita,et.al.,Nat.Protocols,3(5):877-82(2008)；Goto,et al.,BioTechniques,46(3):167-71(2009))；通过焦磷酸盐转换的生物发光(Gandelman,etal.,PLoS One,5:e14155(2010))；或通过归因于弱缓冲条件下扩增的pH变化进行的检测(Pourmand,et.al.,PNAS,103(17):6466-70(2006)；美国专利号7,888,015；和美国专利申请号13/799,995)进行靶标核酸扩增的检测。

用于作为测序实验方案中初步步骤的与多核苷酸杂交的和作为Y接头的替代物的接头包括环接头(参见例如US 20120244525)。这些包含可作为用于切割环以形成单链末端的位点的修饰核苷酸的环接头替代物，通过与接头单链的、但非连接的末端杂交的RNA夹板而保留该环。可在修饰和/或未修饰的核苷酸存在的情况下连接末端以在本文所述的夹板连接酶存在的情况下形成连续的环。可在将接头与靶标DNA连接之前或之后实现这个步骤。如果在使如上所述的两个DNA多核苷酸退火之后使用夹板产生连接，产物可为线性多核苷酸如线性ssDNA。该途径的优点是合成长的单链DNAs的能力。

分子倒置探针使用单线性链DNA作为探针。分子倒置探针的使用涉及设计为具有与RNA靶标序列互补的区域的DNA探针，以使得DNA的5’和3’端退火，从而产生相邻的末端，形成通过ssDNA的环连接的DNA/RNA杂交螺旋。在RNA互补物存在的情况下通过RNA夹板连接酶进行的DNA末端连接形成小的环形DNA底物，用于通过例如RCA进行检测。可通过添加RCA引物和扩增、或通过经RNAse处理去除ssRNA检测成环形的DNA，使RNA/DNA杂交区域作为RCA的引物。然后，可通过浊度、pH变化或经凝胶读出DNA产物而检测RCA产物(Li,et al.,Anal.Chem.,81(12):4906–4913(2009)；Absalan和Ronaghi,Methods in MolecularBiology,396:315-330(2007)；Hardenbol,et al.,(2003))。

依靠目前使用T4DNA连接酶的RNA夹持的其它反应实例已经描述与美国专利号6,368,801中。可通过用RNA夹板连接酶替换该酶改进这这些方法，包括连接酶链反应，在连接之后进行PCR；使用持锁探针，和使用通过连接生成的FRET检测的分子信标(Peng,et al.,Anal Chem.,82(23):9727-35(2010))。

本文引用的所有参考文献以及2012年12月21日提交的美国申请号61/745,244和2013年3月14日提交的美国申请号13/829,489通过引用并入。

实施例

实施例1：使用RNA夹板测定DNA寡核苷酸底物的连接

体外连接测定—从多种序列制备连接酶底物。用作标准品的序列为用5’-磷酸和3’-荧光团修饰的30nt脱氧核苷酸ssDNA片段(SEQ ID NO:3)，和20个脱氧核苷酸ssDNA受体片段(SEQ ID NO:2)，其具有未修饰末端退火成由DNA或RNA组成的未修饰互补链(SEQ IDNO:4)。在连接缓冲液(50mM Tris pH 6-9、10mM MgCl₂、1mM DTT和10μM ATP–1mM ATP)中在15℃-40℃下进行100nM标记的、预退火的寡核苷酸结构的连接。通过添加连接酶(T4DNA连接酶或PBCV-1连接酶)至10pM和10μM之间的终浓度开始测定，并在16℃或20℃下温育。用100mM EDTA淬灭反应，在DNA中用水稀释至1nM，并通过高通量毛细管电泳分析。

通过高通量毛细管电泳(CE)进行片段分析—通过在总FAM-标记中使用ddH₂O稀释至0.5nM–2nM而制备CE样品。在应用于使用POP7聚合物的、毛细管长度为36cm的3130×l遗传分析仪(16个毛细管阵列)或3730×l遗传分析仪(96个毛细管阵列)(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)之前，GeneScan^TM120

尺寸标准(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)在甲酰胺中以1:40稀释，且10μl的该溶液结合1μl的每个样品。通过AppliedBiosystems数据收集软件收集数据，并使用PeakScanner^TM软件(V 1.0)分析(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)。记录蓝色(FAM)通道中所有峰的保留时间和面积。通过与合成的标准品共洗脱确认寡核苷酸(30-mer起始原料，腺苷酰化的30-mer，以及50-mer连接产物)。通过每一种的峰面积除以所有三种寡核苷酸的总的峰面积确定样品中每种寡核苷酸的比例。图2(A)-2(D)中显示T4DNA连接酶和PBCV-1连接酶的结果。图3-5中的图从峰面积中确定。

实施例2：用于扩增的RASL探针的设计

RASL探针L(/5phos/CGGTAAGACCTTTCGGTACTAGATCGGAAG AGCACAC)(SEQ ID NO:5)；和R(GGAAGCCTTGGCTTTTGG AACGTTGCGTCGAGTTTTC)(SEQ ID NO:6)被设计以靶定荧光素酶RNA的3’区域(Promega,Madison,WI)。2.5nM或25nM探针与或不与2.5nM荧光素酶RNA在25μl的1×T4DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs,Ipswich,MA)中混合在一起。将混合物加热至65℃持续10分钟，从而使RNA变性，并在45℃持续60分钟，使探针退火。添加0.25μgPBCV-1连接酶或T4DNA连接酶(New England Biolabs,Ipswich,MA(M0202S,～250NEB单位))，并使连接混合物在37℃下温育60分钟。利用标准条件，使用引物(GTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:7)和GGAAGCCTTGGCTTTT G(SEQ ID NO:8))和Taq DNA聚合酶将1μl连接混合物用于q PCR分析，PCR条件为在95℃ 2分钟，随后是95℃10分钟、52℃15分钟和68℃30分钟的50个循环。图7显示了结果。

在此，在不存在模板的情况下，与T4DNA连接酶相比，使用PBCV-1连接酶的背景信号减少，在PCR扩增过程中，在检测到背景信号之前T4DNA连接酶需要至少10％和多达50％(5-15个循环)的额外的热循环。

在检测到来自RNA夹板连接的DNA扩增的阳性信号时，其在比使用T4DNA连接酶的相同DNA检测到阳性信号少10％-50％(5-15)的扩增循环之后发生。

实施例3：在不同浓度的连接酶和ATP下对比T4DNA连接酶表征PBCV-1连接酶

图4(A)-4(B)显示在含有1mM ATP的标准连接酶缓冲液或其中ATP的量减少至10μMATP的改进缓冲液中，使10pM-10μM PBCV-1连接酶或T4DNA连接酶与寡核苷酸底物(图9中所示)在37℃下反应15分钟的结果。当T4DNA连接酶浓度>1μM时，无论ATP浓度如何，大部分底物被转换成AppDNA。

图4(A)-4(B)中所示的结果表明，对于含有标准量的ATP(1mM)的缓冲液，观察到与T4DNA连接酶相比，PBCV-1连接酶的连接效率多达100倍或更多倍的增加。在增加T4连接酶活性的、仅含有10μM ATP的非优化缓冲液中，利用标准底物，PBCV-1连接酶活性与T4连接酶活性相比仍然有至少100倍的增加。

实施例4：确定单个基因的剪接变体

可制备与基因中每个外显子杂交的寡核苷酸。寡核苷酸的不同组合可混合在一起并允许连接发生。对连接产物的QPCR将允许确定不同剪接变体的频率。例如，如果基因具有10个外显子，将DNA编码外显子1与外显子2-10杂交，其中2-10的每一个具有独立的可检测标记。使用mRNA夹板进行连接并确定剪接变体的表示。

实施例5：通过夹板连接进行微小RNA检测

使用PBCV-1连接酶通过夹板连接检测miR-122。

图10概述通过连接和随后的PCR扩增检测微小RNA的测定。合成的miR-1225’pUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO:9)(0.1pg)、大鼠肝总RNA(1μg或100ng)或1μg Hela细胞总RNA与两种与miRNA-122互补的DNA探针(每种1ng)杂交，DNA探针的序列为pGTCACACTCCTCTGAGTCGGAGACACGCAGGG(SEQ ID NO:10)和CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATAAACACCATT(SEQ ID NO:11)。在85℃下使RNA和DNA寡核苷酸热变性，随后缓慢冷却。连接反应(包含1μMPBCV-1连接酶和1×T4 DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs,Ipswich,MA)以及探针和RNA来源，总体积为10μl)在16℃下温育2小时。在25μl的反应中扩增5μl的连接混合物，该反应具有两种PCR引物CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO:12)和CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQID NO:13)以及12.5μl的

DNA聚合酶主混合物(New England Biolabs,Ipswich,MA)。进行PCR反应25个循环。图11显示利用生物样品的应用结果。在该实施例中，通过利用限制酶Tsp45I消化DNA确定PCR产物的同一性。这种酶在miR-122序列中出现的GT(C/G)AC处切割DNA。将消化和未消化的PCR产物在未变性的丙烯酰胺凝胶上分离并用用溴化乙锭染色。在两个大鼠肝RNA样品和含有0.1pg合成的miR-122的阳性对照中观察到预期的95个碱基的产物带。该实验表明，通过利用PBCV-1的RNA夹板连接和随后增强灵敏度的PCR，可检测来自生物样品的微小RNAs。

Claims (19)

1.组合物，其包括：

(a)在缓冲液中的与SEQ ID NO.:1的小球藻病毒PBCV-1连接酶具有至少99％同一性且源自小球藻病毒的RNA夹板连接酶；和

(b)单链RNA夹板，具有至少8个核苷酸的长度，其中夹板RNA是天然存在的；和

(c)两种单链DNA分子，其中所述DNA分子的至少一部分在剪接点具有与所述单链RNA夹板互补的区域且与所述单链RNA夹板杂交，其中两种杂交的单链DNA分子的至少70％通过所述RNA夹板连接酶连接在一起。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述夹板RNA源自细胞或体液。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA夹板连接酶被固定在珠上。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA夹板连接酶是热稳定的。

5.根据权利要求1至4任何一项所述的组合物，其中所述组合物处于包含1μM-1.5mM的ATP的缓冲液中。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述RNA夹板连接酶是PBCV-1连接酶。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述RNA夹板连接酶被固定在珠上。

8.用于连接DNA多核苷酸片段的方法，包括：

(a)将至少两个DNA多核苷酸与一种或多种单链RNA多核苷酸组合，其中所述DNA多核苷酸的至少一部分在剪接点具有与所述一种或多种单链RNA多核苷酸互补的区域；和

(b)在缓冲液中使用源自小球藻病毒且与SEQ ID NO.:1的小球藻病毒PBCV-1连接酶具有至少99％同一性的RNA夹板连接酶将所述至少两个DNA多核苷酸彼此连接，其中在使用的连接酶与所述DNA多核苷酸和所述RNA多核苷酸的摩尔比相同的情况下，与T4 DNA连接酶相比，使用所述RNA夹板连接酶的所述两个DNA多核苷酸的连接至少快10倍。

9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括在含有1μM-1.5mM ATP的缓冲液中进行所述连接反应。

10.根据权利要求8所述的方法，其中(b)进一步包括温育少于6小时，以实现至少70％的所述多核苷酸的连接。

11.根据权利要求10所述的方法，其中(b)进一步包括温育少于1小时，以实现至少70％的所述多核苷酸连接。

12.根据权利要求8所述的方法，其中在使用的连接酶与底物的摩尔比相同的情况下，使用所述RNA夹板连接酶的所述连接反应比使用T4 DNA连接酶至少快10倍。

13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述剪接的DNA多核苷酸是用于定量PCR的模板，以使得扩增所述剪接的DNA多核苷酸产生比当用T4 DNA连接酶替换所述RNA夹板连接酶时所观察到的更少的非模板多核苷酸的背景扩增。

14.用于分析mRNA的剪接历史的方法，包括：使用根据权利要求1-7任何一项所述的组合物确认剪接点、剪接变体或在所述剪接点处的突变，在所述组合物中所述夹板RNA是mRNA。

15.用于检测RNA序列的方法，包括：

(a)使具有在连接点与夹板RNA互补的区域的至少两个DNA多核苷酸退火；

(b)在缓冲液中使用源自小球藻病毒且与SEQ ID NO.:1的小球藻病毒PBCV-1连接酶具有至少99％同一性的RNA夹板连接酶将至少两个DNA多核苷酸彼此连接，其中在扩增之前所述DNA多核苷酸的至少70％通过所述夹板连接酶连接在一起；

(c)扩增所述连接产物；和

(d)检测所述扩增产物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在使用的所述RNA夹板连接酶或T4 DNA连接酶与所述DNA多核苷酸和所述夹板RNA的摩尔比相同的情况下，与T4 DNA连接酶相比，使用所述RNA夹板连接酶的所述至少两个DNA多核苷酸的连接至少快10倍。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述夹板RNA是微小RNA。

18.根据权利要求15所述的方法，其中(d)还包括对所述扩增产物进行定量。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述夹板连接酶是PBCV-1连接酶。

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