CN105078946A - 沙美特罗在治疗二型糖尿病、胰岛素抵抗药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供沙美特罗在治疗二型糖尿病、胰岛素抵抗药物上的应用。本发明提出沙美特罗具有降低血糖、抗糖尿病的功效，以及具有提高3T3-L1胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖消耗量的药物作用效果。通过ELISA法测定PPARγ蛋白表达量发现沙美特罗具有提高PPARγ蛋白表达量的功能。本发明证明沙美特罗对于二型糖尿病具有明显的疗效。

Description

沙美特罗在治疗二型糖尿病、胰岛素抵抗药物上的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及沙美特罗在治疗胰岛素抵抗，抗二型糖尿病药物上的应用和治疗二型糖尿病的药物。

技术背景

二型糖尿病成为最主要的糖尿病类型，患病人口增长迅速且日趋年轻化，胰岛素抵抗是二型糖尿病的主要发病原因。市场上主要治疗胰岛素抵抗的胰岛素增敏剂药物主要是噻唑烷二酮类(TZD)抗糖尿病药，噻唑烷二酮类药物作为可以治疗胰岛素抵抗的抗糖尿病药物，是由于此类化合物是PPARγ受体的激动剂，PPARγ激活后可以调节CAP蛋白的表达，Cbl/CAP连接蛋白又会激活其下游蛋白Crk、TC10等分子，它们最终将促进葡萄糖转运子将葡萄糖由胞外装运到胞内，以达到降低血糖目的。但由于此类药物会引发心衰、水肿及肝功能障碍等不良反应，因此研究新型胰岛素增敏剂类抗糖尿病药物是很必要的。

现有技术中，沙美特罗(Salmeterol)，具有强大的抑制肺肥大细胞释放过敏反应介质作用，可抑制吸入抗原诱发的早期和迟发相反应，降低气道高反应性。主要用于哮喘(包括夜间哮喘和运动性哮喘)、喘息性支气管炎和可逆性气道阻塞。本发明通过大量的实验研究，发明了沙美特罗在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用。

发明内容

针对现有市场上胰岛素增敏剂类药物较少的不足，本发明为治疗二型糖尿病、胰岛素抵抗更多的选择，发明沙美特罗在治疗或预防糖尿病的药物中的应用。

本发明研究表明，沙美特罗(Salmeterol)，CAS号：89365-50-4，化学名称：4-(1-羟基-2-(6-(4-苯基丁氧基)己基氨基)乙基)-2-(羟甲基)苯酚，分子式：C₂₅H₃₇NO₄，分子量：415.57，分子结构：

3T3-L1细胞建立胰岛素抵抗模型，油红O染色鉴定细胞模型后，沙美特罗作用于建模成功的胰岛素抵抗的3T3-L1细胞，24h后测定细胞葡萄糖的消耗量，当药物浓度为1.5nmol/L时与正常组、阳性最有药物浓度组的葡萄糖消耗量已不存在差异性，且葡萄糖消耗量最高。因此，可以确定沙美特罗具有提高3T3-L1胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖消耗量的药物作用效果(参见图1)。

SD雄性大鼠采用高糖高脂饲料饲喂，小剂量STZ(链脲佐菌素)注射诱导的方法构建二型糖尿病大鼠模型。沙美特罗作用于模型大鼠四周后药物组的血糖值均降到了正常值范围内(参见附图2)，肝脏和血液中的葡萄糖含量均降到了正常值范围内(附图3)，甘油三酯和总胆固醇含量已趋于正常值(附图4、5)，游离脂肪酸和胰岛素含量值已于正常组之间不存在差异性(见表1)，与模型组之间存在差异性，表明沙美特罗具有降低血糖、抗糖尿病的功效。ELISA法测定PPARγ蛋白表达量发现沙美特罗具有提高PPARγ蛋白表达量的功能(见表2)。

表1沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠游离脂肪酸和胰岛素含量影响

表2SD大鼠各组织中PPARγ蛋白与总蛋白含量的比值

附图说明：

图1为沙美特罗对胰岛素抵抗3T3-L1细胞模型葡萄糖消耗量影响柱状图；

图2为沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠血糖影响变化折线图；

图3为沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠肝脏和血液中的葡萄糖含量影响柱状图；

图4为沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠甘油三酯含量影响柱状图；

图5为沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠总胆固醇含量影响柱状图。

具体实施方式：

下面通过具体的实验，证明沙美特罗具有治疗胰岛素抵抗，抗糖尿病的功效。

实施例1：

1、3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型构建：

(1)将生长状态良好的3T3-L1细胞消化后，以3*10⁴个/mL细胞密度接种到6孔板中，2mL/孔，基础培养基培养。36h换液一次，换液两次后细胞即可达到90％-100％细胞密度，继续用基础培养基培养，使细胞处于接触抑制状态。

(2)汇合(接触抑制)两天后(DAY0)，换细胞诱导培养基一培养两天，根据细胞培养基的颜色决定是否换液，一般24-36h换一次培养液。

(3)诱导培养基一培养两天后(DAY2)，换诱导培养基二，培养两天根据细胞培养基颜色决定是否换液，一般24-36h换一次培养液，换液时一定要缓慢、轻柔避免出现细胞漂浮现象。

(4)诱导培养基二培养两天后(DAY4)，换回基础培养基培养，36-48h换一次培养液，换液时一定要缓慢、轻柔避免出现细胞漂浮现象，一般培养4-5天左右(DAY8)，即完成细胞诱导分化。

2、胰岛素抵抗3T3-L1细胞模型染色鉴定：

(1)固定：将诱导完成的3T3-L1细胞6孔板中细胞培养液缓缓吸出，0.01MPBS缓慢清洗两遍后加入1％多聚甲醛细胞固定液，固定15min。

(2)染色：吸出1％多聚甲醛细胞固定液，0.01MPBS缓慢清洗两遍，加入油红O染色剂2mL染色20min。

(3)冲洗：吸出染色剂，超纯水冲洗三次，镜检观察细胞状态拍照记录。

3、沙美特罗作用于3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型：

(1)将诱导分化建模成功的3T3-L1细胞分为模型组、溶剂对照组、罗格列酮0.5nmol/L浓度组、罗格列酮1.0nmol/L浓度组、罗格列酮1.5nmol/L浓度组、药物0.5nmol/L浓度组、药物1.0nmol/L浓度组、药物1.5nmol/L浓度组、药物2.0nmol/L浓度组、药物2.5nmol/L浓度组，与未进行诱导分化的正常组一共分为11组，每组设三个复孔。

(2)将阳性药物及794ap储存液溶解后，用液体细胞培养基按照上述分组的浓度稀释至特定浓度，溶剂对照组加入对应体积0.5％DMSO，正常组、模型组则加入对应体积液体细胞培养基。所有实验组细胞用基础培养基置于二氧化碳细胞培养箱中培养。

(3)细胞培养12h、24h、36h时分别吸正常组细胞培养基用葡萄糖测定试剂盒进行葡萄糖含量测定并记录。

(4)在葡萄糖消耗量最高峰的培养时刻分别吸取不同组细胞培养基进行葡萄糖含量测定并记录。

(5)以上实验重复两次，将记录的实验数据用SPSS软件进行数据分析。

根据图1沙美特罗对胰岛素抵抗3T3-L1细胞模型葡萄糖消耗量影响柱状图，可以看出：可知沙美特罗最优药物浓度可以很好地促进胰岛素抵抗模的细胞正常分解葡萄糖，且与阳性药物罗格列酮之间已不存在差异性。

实施例2：

1、SD大鼠二型糖尿病模型的构建：

(1)80只SPF级别的雄性SD大鼠，体重为120±20克，基础大鼠鼠粮试喂养3天后，随机挑选出7只作为模型对照组,仍旧饲喂基础鼠粮，其它的大鼠开始饲喂高糖高脂鼠粮，所有大鼠均自由饮用自来水。每天更换饮水，每两天清理粪便，每三天称量一次体重并记录。

(2)饲喂两周后，断食不断水，空腹10h后尾静脉采血针取血，测定大鼠血糖，并记录结果。此后每周测定一次空腹血糖，仍每三天测定并记录体重。

(3)饲喂6周后，模型组大鼠断食不断水空腹14h后按照25mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)注射液。

(4)注射STZ三天后，断食不断水空腹10h后测定大鼠血糖，如此测定两次后若血糖均高于11.1mmol/L则认定SD大鼠II型糖尿病模型构建成功。

2、沙美特罗作用于二型糖尿病SD大鼠模型

(1)分组：将构建成功的II型糖尿病模型大鼠按照血糖由高到低一条龙的分组方式分成7组，依次为模型组、阳性组、1mg/kg药物浓度组、3mg/kg药物浓度组、5mg/kg药物浓度组、7mg/kg药物浓度组、溶剂对照组，与原来正常组一起一共分成8组。

(2)药物溶解：罗格列酮和794ap溶解性较差，用0.5％CMC-Na溶剂配置成均匀混悬液，以便灌胃。

(3)灌胃：从第八周开始，阳性组以3mg/kg剂量灌胃罗格列酮，四组药物浓度组分别灌胃1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg剂量的794ap，溶剂对照组按照3mg/kg剂量计算出的体积灌胃药物溶剂0.5％CMC-Na。每日同一时间点进行灌胃，正常饲喂基础鼠粮，饮用自来水。

(4)灌胃后每三日测定一次体重，每五日测定一次血糖并记录数据。

(5)灌胃灌胃三周后进行口服葡萄糖耐受实验，断食不断水空腹12h测定尾静脉血液血糖值，而后按照2g/kg剂量灌胃0.5g/mL葡萄糖溶液，灌胃葡萄糖溶液0.5h、1h、2h、3h后测定血糖值，记录数据，比较模型组与正常组糖耐受区别。

(6)灌胃四周后，断食不断水空腹8h后乙醚麻醉SD大鼠，剪断左股动脉取血于10mL采血管中，颈椎脱臼法处死大鼠，摘取胰脏、肝脏用生理盐水冲洗净血液，置于4％的多聚甲醛中固定备用。取肝脏、胰脏、骨骼肌、附肾或附睾脂肪组织、用生理盐水洗净血液，滤纸擦净水分，置于1.5mLEP管中，标记好组别与组织名称，密封好迅速丢入液氮中，然后转置超低温冰箱中-75℃保存备用。

(7)血清制备：将取血的采血管静置于室温2h后，静置于37℃恒温箱中30min，再置于离心机中转速3500rpm/min，20min离心，取出采血管，吸取上清液，以每管300μL分装到1.5mLEP管中，标记好组别与组织名称后，置于超低温冰箱中-75℃保存备用。

(8)10％肝脏、胰脏组织匀浆制备：称取0.5g肝脏、胰脏组织于研钵中，剪碎后充分研磨使组织浆化，倒入5mL0.9％冷生理盐水搅拌混合倒入50mL离心管中，再用5mL0.9％冷生理盐水冲洗研钵倒入离心管中(操作在冰盘上进行)。将离心管置于高速低温离心机中，4℃，3000rpm/min，15min离心后取上清液分装于4mL的EP管中后置于超低温冰箱中-75℃保存备用。

(9)脏器病理切片及HE染色，将固定好的肝脏和胰脏进行修整，在自来水中冲洗24小时，放入75％酒精中，经过脱水、透明，再进行浸蜡、包埋后，用切片机对包埋的蜡块进行切片，展片后进行HE染色，然后进行封片。显微镜下观察切片并拍照。

(10)取制备好血清、肝脏和胰脏组织匀浆按照葡萄糖测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒说明书对葡萄糖、TCH、TG生化指标进行测定。

(11)每个动物实验组随机选取三个样本每个样本设置两个复孔，取制备好血清按照大鼠游离脂肪酸酶联免疫分析试剂盒说明书、大鼠胰岛素酶联免疫分析试剂盒说明书进行操作，测得大鼠血清中游离脂肪酸和胰岛素含量。

结合附图2沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠血糖影响变化折线图可以看出在灌胃沙美特罗第20-25天时，二型糖尿病模型大鼠的血糖已基本趋于血糖正常值范围内，且与阳性药物罗格列酮组之间已不存在差异性。结合图3沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠肝脏和血液中的葡萄糖含量影响柱状图，可以看出最优沙美特罗药物浓度组中葡萄糖含量与阳性药物大致相等，且与正常组的葡萄糖含量之间已不存在差异性。结合图4沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠甘油三酯含量影响柱状图可以看出沙美特罗药物组使肝脏、血清中TG值都有所下降，且与阳性罗格列酮组之间已不存在差异性。结合图5沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠总胆固醇含量影响柱状图，可以看出沙美特罗药物组使主要存在于血清中TCH值都有所下降，且与阳性罗格列酮组之间已不存在差异性。结合表1沙美特罗对二型糖尿病模型大鼠游离脂肪酸和胰岛素含量影响，可以看出沙美特罗药物组FFA均高于模型组，且存在差异性，与正常组织间已不存在差异性。INS含量均低于模型组，且存在差异性，与正常组织间已不存在差异性。

实施例3：

1、血清、肝脏、骨骼肌、脂肪组织中总蛋白提取：

(1)每动物实验组随机挑出一个样本，每个样本设置复孔，将保存好的血清、肝脏、骨骼肌、脂肪组织样本从-80℃取出备用。

(2)取出动物组织直接快速放入置于冰盘上的研钵中，加入液氮，快速将组织块敲碎、研磨，待组织将要变软时再加入液氮再研磨，如此反复三次。

(3)研磨成粉末状，称40mg到1.5mLEP管中加入细胞裂解液400μL，振荡器混合均匀置于冰上。

(4)每10min振荡一次，每次40s，如此持续6-8次，此过程中要保证低温，蛋白质不变性。

(5)冰上裂解后，放入低温高速冷冻离心机中4℃，12000rnp/min，离心15min。取出离心管，取上清液每管100μL分装，立即使用或置于-80℃中冷冻保存备用。

2、BCA法测定血清、肝脏、骨骼肌、脂肪组织中总蛋白含量

(1)标准品稀释：取10μLBSA标准品加上90μLPBS将标准品浓度稀释至0.5mg/mL后再按照以下表格配置标准品、样品并加样。

表3标准品稀释表

Table3Attenuationofstandards

(2)样本稀释：取20μL提取蛋白的上清液加入到80μLPBS样品稀释液中混合均匀即得到稀释5倍的样本，之后将样品按下表加样。

表4标准品稀释表

Table4Applicationofsamples

(3)按照(1)、(2)中所示对标准品、样品进行加样，每个样本设三个复孔。

(4)以BCA试剂与Cu试剂体积比50:1配置工作液，每孔加入200μL工作液，封口膜封好96孔板放入37℃的恒温箱中静置20min，562nm波长，测OD值。

(5)实验数据处理，SPSS软件处理数据算出组织蛋白提取液中总蛋白浓度。

3、ELISA方法测定血清、肝脏、骨骼肌、脂肪组织中PPARγ蛋白表达量

(1)按照步骤2中测定最适稀释倍数对样本进行稀释加样，设置复孔，PPARγElisa试剂盒说明书进行操作。

结合表2SD大鼠各组织中PPARγ蛋白与总蛋白含量的比值可以得出PPARγ蛋白的相对含量由高到低的组织分别为脂肪、骨骼肌、肝脏，沙美特罗最优药物浓度组在三种组织中PPARγ蛋白相对表达量都远远高于模型组，且与阳性药物罗格列酮组之间与不存在差异性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.沙美特罗在治疗二型糖尿病药物上的应用。

2.沙美特罗在治疗胰岛素抵抗药物上的应用。

3.一种抗糖尿病药物，其特征在于，包含沙美特罗，其中沙美特罗作为抗糖尿病的主要活性成分。