CN105067734B - 一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品检测与食品安全领域，涉及一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，特别是涉及一种通过固相萃取小柱进行纯化，通过高效液相色谱‑串联质谱法(HPLC‑MS/MS)进行检测的方法。该方法包括如下步骤：(1)活化、(2)调节酒样PH值、(3)上样、(4)淋洗、(5)洗脱、(6)绘制纳他霉素标准曲线、(7)计算酒样纳他霉素含量。采用本发明的方法检测葡萄酒中纳他霉素含量，快速有效，检测时间为5min，检出限为1μg/l，定量限为3.34μg/l,误差为2％～4％，而且由于采用HPLC‑MS‑MS技术，能够有效排除假阳性。

Description

一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法

技术领域

本发明属于食品检测与食品安全领域，涉及一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，特别是涉及一种通过固相萃取小柱进行纯化，通过高效液相色谱-质谱联用进行检测的方法。

背景技术

纳他霉素(Natamyin)最早发现于1955年，也称匹马菌素(Pimaricin)、游链霉素或海松素，是一种重要的多烯烃大环内酯类抗菌素。其生产途径较多，可以由纳塔尔链霉菌(Streptomyces Natalensisi)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chmanovgensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)等多种链霉菌发酵产生，是一种天然的多烯烃大环内脂类生物抗菌剂和食品添加剂。在发现初期，纳他霉素主要使用在医药方面，1960年以后才逐渐被纳入食品防腐剂的行列。在1976年、1982年和1996年分别通过FAO/WHO、美国食品与药品管理局(FDA)，中国允许作为食品添加剂使用，目前已有三十多个国家允许使用。虽然作为食品添加剂，纳他霉素具有广适性、高效性、低毒性的特点，可以应用于很多的食品中，但是，对于能否在葡萄酒中使用纳他霉素，争议很大。阿根廷(5μg/L)、南非(30mg/L)、中国(10mg/L,GB 2760-2014)明确允许在葡萄酒中添加纳他霉素。而美国、欧盟、OIV等国家和组织均禁止在葡萄酒中添加纳他霉素，而且也不得销售含有纳他霉素的葡萄酒。

葡萄酒中纳他霉素一般有两个来源：一是人为添加，在允许使用纳他霉素的南非，纳他霉素一般是作为二氧化硫和山梨酸钾的替代品在葡萄酒灌装时添加，起抗菌剂的作用，主要是防止灌装后一些残留的酵母在瓶内引起二次发酵。通常是在半甜葡萄酒Thuis或者是酸度比较低的葡萄酒中添加纳他霉素，而且允许最大使用量达到30mg/L。二是属于意外污染，环境中用于抑制酵母和霉菌的纳他霉素通过空气传播进入酒体。因为纳他霉毒在低浓度时，就可以有效地抑制酵母和霉菌，一些酒厂就会在酿酒车间的墙壁和地板上使用纳他霉素，来消灭环境中的酵母和霉菌。但是，这样做很可能会使得环境中的纳他霉素通过空气传播到酒中。

在2009年12月，包括阿根廷、南非等国出口到德国的大批葡萄酒因检出纳他霉素而被德国海关扣留。在此情况下，南非、阿根廷都已做出了相应的改变，而中国的相关规定均是指的发酵酒大类，并无对葡萄酒做出单独的规定，允许的添加量仍为10mg/L，远高于世界上其他国家的最大使用量。而据OIV报道，2013年，中国葡萄酒消费量排世界第五位，生产量排世界第七。

而目前，我国纳他霉素的检测方法执行的是国家标准(GB/T21915-2008)公布的食品中纳他霉素的方法，检测限是0.5mg/L，虽然满足中国允许在葡萄酒中纳他霉素的添加量为10mg/L，但是针对国际上对于葡萄酒中纳他霉素含量日益严格的要求(5μg/L)，该方法远远不够。而且，该方法为对所有食品的检测方法，前处理方法与检测方法也不具有针对性。虽然我国对其他食品中纳他霉素的检测方法不断更新，但其检测方法并不适用葡萄酒中纳他霉素的检测。而我国的优质国产葡萄酒已经开始逐渐走出国门，出口到世界各地，而葡萄酒中纳他霉素的检测手段的不足，使得我国葡萄酒在出口上很容易受到其他国家的贸易壁垒。总而言之，我国在葡萄酒中纳他霉素的检测与其他国家相比有较大的差距，对于我国葡萄酒产业的进一步发展，是一个很大的隐患。因此建立一种快速、准确、方便、实用的检测方法，有利于监控葡萄酒生产厂家纳他霉素的添加使用量，从而能够保障消费者食品安全与我国葡萄酒产业的健康发展。目前尚无针对葡萄酒中纳他霉素检测的相关专利。

发明内容

本发明的目的是克服葡萄酒中纳他霉素检测限不足，回收率过低的缺陷，通过摸索最佳前处理手段，最佳液相色谱分离条件和最佳质谱条件而提供一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，克服上述已有技术的不足。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)活化：分别用2～5ml甲醇、2～5ml水依次活化固相萃取小柱；

(2)调节酒样PH值：用浓度为25％的氨水调节葡萄酒酒样的pH为8；

(3)上样：将调节pH后的葡萄酒酒样注入固相萃取小柱；

(4)淋洗：使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；

(5)洗脱：使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；

(6)绘制纳他霉素标准曲线：称取1mg纳他霉素(色谱级)，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；

(7)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(5)所得溶液通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(6)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。

所述步骤(1)中，固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。

所述步骤(3)中，上样体积为1.1ml，上样速度为0.5ml/min。

所述步骤(4)中淋洗液为1:1的甲醇乙腈溶液，淋洗液体积为3ml。

所述步骤(5)中洗脱液为50％的甲醇水溶液(含2％的甲酸)，洗脱液体积为1ml。

所述步骤(6)和(7)中，高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定条件如下：

高效液相色谱HPLC测定条件：

a)色谱柱：Agilent反相C18柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；

b)流动相及梯度洗脱条件：

0-0.5分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)保持90％不变，流动相水(含0.3％乙酸)保持10％不变；

0.5-3.5分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)从90％到60％，流动相水(含0.3％乙酸)从10％到40％；

3.5-4.0分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)保持60％不变，流动相水(含0.3％乙酸)保持40％不变；

4.0-4.5分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)从60％到30％，流动相水(含0.3％乙酸)从40％到70％；

4.5-5.0分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)从30％到90％，流动相水(含0.3％乙酸)从70％到10％；

c)进样量：5μL；

d)流速：0.3ml/min；

e)柱温：30℃；

串联质谱MS/MS参考条件：

a)电离方式：电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描；

b)检测模式：MRM多反应离子检测；

c)准分子离子：666.2m/z，碎裂电压为120V；

d)定性产物离子：684.2m/z,碰撞能量CE为4eV；

e)定量产物离子：503.1m/z,碰撞能量CE为3eV；

f)载气流量：9L/min；

g)雾化器压力：3.1×10⁶pa；

h)鞘气温度：350℃；

i)鞘气流量：9L/min。

所述步骤(6)和(7)中，高效液相色谱-串联质谱测定后，根据其质谱峰定性，外标法定量。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

采用本发明的方法检测葡萄酒中纳他霉素含量，快速有效，检测时间为5min，检出限为1μg/l，定量限为3.34μg/l,误差为2％～4％，而且由于采用HPLC-MS-MS技术，能够有效排除假阳性。由此可见，本发明的方法，为检测葡萄酒中纳他霉素的含量，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足研究和生产中的需要。

附图说明

图1为本发明实施例1纳他霉素标准曲线图

图2为本发明实施例1纳他霉素标准品液相色谱图

图3为本发明实施例1纳他霉素一级质谱图

图4为本发明实施例1纳他霉素二级级质谱图

图5为本发明实施例1纳他霉素在质谱检测中的结构变化

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明。

本发明提供一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：

(1)活化：分别用2～5ml甲醇、2～5ml水依次活化固相萃取小柱；

(2)调节酒样PH值：用浓度为25％的氨水调节葡萄酒酒样的pH为8；

(3)上样：将调节pH后的葡萄酒酒样注入固相萃取小柱；

(4)淋洗：使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；

(5)洗脱：使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；

(6)绘制纳他霉素标准曲线：称取1mg纳他霉素(色谱级)，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；

(7)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(5)所得溶液过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(6)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。

固相萃取小柱纯化葡萄酒的前处理方法，很好地控制了杂质的干扰，并保证了回收率。

步骤(1)中固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。此条件下具有最好的吸附效果。

步骤(3)中，上样体积为1.1ml，上样速度为0.5ml/min。此条件下具有最好的柱承载力与回收率。

步骤(4)中淋洗液为1:1的甲醇乙腈溶液，淋洗液体积为3ml。此条件下具有最好的淋洗杂质效果。

步骤(5)中洗脱液为50％的甲醇水溶液(含2％的甲酸)，洗脱液体积为1ml。此条件下具有最好的洗脱纳他霉素效果。

步骤(6)和(7)中高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定条件如下：

高效液相色谱测定条件：

a)色谱柱：Agilent反相C18柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；

b)流动相及梯度洗脱条件：

0-0.5分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)保持90％不变，流动相水(含0.3％乙酸)保持10％不变；

0.5-3.5分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)从90％到60％，流动相水(含0.3％乙酸)从10％到40％；

3.5-4.0分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)保持60％不变，流动相水(含0.3％乙酸)保持40％不变；

4.0-4.5分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)从60％到30％，流动相水(含0.3％乙酸)从40％到70％；

4.5-5.0分钟，流动相乙腈(含0.3％乙酸)从30％到90％，流动相水(含0.3％乙酸)从70％到10％；

c)进样量：5μL；

d)流速：0.3ml/min；

e)柱温：30℃；

此条件下具有很好的分离效果。

串联质谱MS/MS参考条件：

a)电离方式：电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描；

b)检测模式：MRM多反应离子检测；

c)准分子离子：666.2m/z，碎裂电压为120V；此条件下准分子离子的丰度最大。

d)定性产物离子：684.2m/z,碰撞能量CE为4eV；此条件下能够有效排除假阳性。

e)定量产物离子：503.1m/z,碰撞能量CE为3eV；此条件下产物离子的丰度最大，定性产物离子与定量产物离子比例合适。

f)载气流量：9L/min；

g)雾化器压力：3.1×10⁶pa；

h)鞘气温度：350℃；

i)鞘气流量：9L/min。

根据其质谱峰定性，外标法定量。

实施例1

葡萄酒中纳他霉素含量的精密度和回收率检测：

准备两种葡萄酒酒样：真实葡萄酒酒样和加标回收葡萄酒酒样，加标回收葡萄酒酒样用来验证葡萄酒纳他霉素含量的测定方法的可靠性；

真实葡萄酒酒样：原始红、白葡萄酒，不做处理；

加标回收葡萄酒酒样：分别往红、白葡萄酒中加入10、20、50μg/L的纳他霉素A，制得加标回收酒样，备用。

(1)活化：分别用3ml甲醇、3ml水依次活化WAX固相萃取小柱；

(2)调节酒样PH值：分别用浓度为25％的氨水调节真实葡萄酒酒样和加标回收葡萄酒酒样的pH为8；

(3)上样：分别将调节pH后的真实葡萄酒酒样和加标回收葡萄酒酒样注入WAX固相萃取小柱；其中，上样体积为1.1.mL，上样速度为0.5mL/min；

(4)淋洗：使用3ml体积比为1：1的甲醇乙腈淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；

(5)洗脱：使用1ml 50％的甲醇水溶液(含2％的甲酸)洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液1ml，获得真实葡萄酒酒样溶液和加标回收葡萄酒酒样溶液，置于棕色的进样小瓶，备用；

(6)绘制纳他霉素标准曲线：精确称取1mg纳他霉素(色谱级)，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱测定，得到纳他霉素标准曲线，如图1所示；

(7)计算真实葡萄酒酒样纳他霉素含量：将步骤(5)所得真实酒样溶液过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，其中，液相色谱图如图2所示，一级质谱图如图3所示，二级质谱图如图4所示，纳他霉素在质谱检测中的结构变化如图5所示，所获得的检验数据通过步骤(6)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素真实含量B。

计算加标回收葡萄酒酒样纳他霉素含量：将步骤(5)所得加标回收酒样溶液过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，重复五次(n＝5)，所获得的检验数据通过步骤(6)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素加标回收含量C。

标准曲线线性回归方程为Y＝264.125913X-25.999660，线性相关系数R2＝0.99977。结果表明在5～100μg/L范围内线性良好。

计算回收率：将步骤(7)测得含量代入回收率计算公式(1)中，得到回收率，结果如表1所示，计算公式为：

回收率％＝C/(A+B)×100 公式(1)

式中：

A为加标回收酒样中纳他霉素的添加量

B为真实酒样中纳他霉素含量

C为加标回收酒样中纳他霉素含量

计算相对标准偏差：调用EXCEL软件中的STDEV函数计算加标回收酒样溶液五次重复(n＝5)的测定结果的相对标准偏差(RSD％)，结果如表1所示。

表1红、白葡萄酒中纳他霉素在三个加标水平的回收率及相对标准偏差(n＝5)

由表1可见，回收率基本分布在70～100％之间，相对标准偏差也偏低，基本在4％之内。表明该方法精密度良好，加标回收率符合要求。

检测仪器为现有的Agilent 6460液质联用仪；

检测条件为：

高效液相色谱HPLC测定条件：

a)色谱柱：Agilent反相C18柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；

b)流动相及梯度洗脱条件：

0-0.5分钟流动相乙腈(含0.3％乙酸)保持90％不变，流动相水(含0.3％乙酸)保持10％不变；

0.5-3.5分钟流动相乙腈(含0.3％乙酸)从90％到60％，流动相水(含0.3％乙酸)从10％到40％；

3.5-4.0分钟流动相乙腈(含0.3％乙酸)保持60％不变，流动相水(含0.3％乙酸)保持40％不变；

4.0-4.5分钟流动相乙腈(含0.3％乙酸)从60％到30％，流动相水(含0.3％乙酸)从40％到70％；

4.5-5.0分钟流动相乙腈(含0.3％乙酸)从30％到90％，流动相水(含0.3％乙酸)从70％到10％；

c)进样量：5μL；

d)流速：0.3ml/min；

e)柱温：30℃；

串联质谱MS/MS参考条件：

a)电离方式：电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描；

b)检测模式：MRM多反应离子检测

c)准分子离子：666.2m/z，碎裂电压为120V

d)定性产物离子：684.2m/z,碰撞能量CE为4eV

e)定量产物离子：503.1m/z,碰撞能量CE为3eV

f)载气流量：9L/min；

g)雾化器压力：3.1×10⁶pa；

h)鞘气温度：350℃；

i)鞘气流量：9L/min；

根据其质谱峰定性，外标法定量。

Claims (2)

1.一种葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：

(1)活化：分别用2～5ml甲醇、2～5ml水依次活化固相萃取小柱；

(2)调节酒样PH值：用浓度为25％的氨水调节葡萄酒酒样的pH为8；

(3)上样：将调节pH后的葡萄酒酒样注入固相萃取小柱；

(4)淋洗：使用体积为3ml的1:1的甲醇乙腈溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；

(5)洗脱：使用体积为1ml的含有2％的甲酸的50％的甲醇水溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；

(6)绘制纳他霉素标准曲线：称取1mg色谱级纳他霉素，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇水溶液稀释，该甲醇水溶液中含有2％的甲酸，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；

(7)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(5)所得溶液通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(6)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量；

所述步骤(1)中，固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱；

所述步骤(6)和(7)中，高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定条件如下：

高效液相色谱HPLC测定条件：

a)色谱柱：Agilent反相C18柱，规格尺寸2.1mm×50mm，颗粒尺寸1.8μm；

b)流动相及梯度洗脱条件：

0-0.5分钟，流动相A为含有0.3％乙酸的乙腈，保持90％不变，流动相B为含有0.3％乙酸的水，保持10％不变；

0.5-3.5分钟，流动相A为含有0.3％乙酸的乙腈，从90％到60％，流动相B为含有0.3％乙酸的水，从10％到40％；

3.5-4.0分钟，流动相A为含有0.3％乙酸的乙腈，保持60％不变，流动相B为含有0.3％乙酸的水，保持40％不变；

4.0-4.5分钟，流动相A为含有0.3％乙酸的乙腈，从60％到30％，流动相B为含有0.3％乙酸的水，从40％到70％；

4.5-5.0分钟，流动相A为含有0.3％乙酸的乙腈，从30％到90％，流动相B为含有0.3％乙酸的水，从70％到10％；

c)进样量：5μL；

d)流速：0.3ml/min；

e)柱温：30℃；

串联质谱MS/MS条件：

a)电离方式：电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描；

b)检测模式：MRM多反应离子检测；

c)准分子离子：666.2m/z，碎裂电压为120V；

d)定性产物离子：684.2m/z,碰撞能量CE为4eV；

e)定量产物离子：503.1m/z,碰撞能量CE为3eV；

f)载气流量：9L/min；

g)雾化器压力：3.1×10⁶pa；

h)鞘气温度：350℃；

i)鞘气流量：9L/min。

所述步骤(6)和(7)中，高效液相色谱-串联质谱测定后，根据其质谱峰定性，外标法定量。

2.根据权利要求1所述的葡萄酒中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中，上样体积为1.1ml，上样速度为0.5ml/min。