CN105021748A - 一种茶叶挥发性香气成分分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于全二维气相色谱-飞行时间质谱技术的挥发性香气成分研究方法，该方法包含以下步骤：1)茶叶挥发性成分的制备，2)全二维气相色谱-飞行时间质谱分析，3)挥发性成分软件定性分析。该方法拥有灵敏度高，重复性好等优点，可以同时分析上百种挥发性成分，适用于茶叶特征香气的物质相关的基础研究及茶叶分类研究。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种茶叶挥发性香气成分的分析方法，具体涉及了一种同时蒸馏萃取与全二维气相色谱-飞行时间质谱分析茶叶中挥发性香气成分方法。
背景技术
茶叶的独特香气是构成茶叶风味的重要元素，早在上世纪30年代，国外学者就对红茶的香气成分展开研究。随着色谱及质谱技术的进步，目前，报道过的茶叶香气成分累积超过600种。复杂的化学构成是茶叶的独特香气成因的物质基础，而对于同种香气成分，不同浓度下的气味也不尽相同。因此，如果越多的香气成分能被同时定性和定量分析，就可以更深一步了解香气的成因与变化，从而为提高茶叶品质提供技术支持。传统的基于一维气相色谱质谱技术的分析方法，无法同时检测和分析如此多的香气成分。全二维气相色谱-飞行时间质谱技术拥有峰容量大，分辨率高，分析速度快和族分离的特点，在复杂体系分离分析中有着一维技术无法比拟的优势。另外绝大部分香气成分的含量较低，不易直接检测，需要富集浓缩。同时蒸馏萃取技术结合了水蒸气蒸馏与有机溶剂萃取两种方法的优点，使用少量样品就可以得到足量香气成分，同时操作简便，重复性好。
发明内容
本发明要解决的问题：鉴于传统一维技术峰容量小及分辨率低的问题，本发明提供了一种同时蒸馏萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱分析的茶叶内香气成分分析方法，可以同时检测上百种有效化学成分。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案。
(1)使用同时蒸馏萃取方法提取挥发性成分。将5-20g茶叶样品粉末、0.1-0.3mg联苯(内标)及200-400ml水放入第一个烧瓶中，将50-70ml二氯甲烷放入第二个烧瓶中，连接同时蒸馏萃取装置，两个烧瓶分别加热，回流提取1-3h，然后收集第二个烧瓶中样本，加无水硫酸钠除水，而后在旋蒸仪中浓缩至1-2ml，而后储存待分析。
(2)使用全二维气相色谱-飞行时间质谱来分析制得样品。
(3)针对全二维气相色谱-飞行时间质谱分析的原始数据，通过Pegasus4D软件色谱峰识别及色谱峰定性，然后通过内标半定量分析各种挥发性香气成分。其中用于峰识别的信噪比设为50。
本发明中，全二维气相色谱-飞行时间质谱由LECO公司提供；其中第一维色谱柱为DB-5MS，规格为30m×250μm×0.25μm。其中第二维色谱柱为RTX-200MS，规格为1.6m×180μm×0.20μm。
使用内标为联苯，在样本提取前加入0.1-0.3mg于第一烧瓶中。
本发明中，全二维气相色谱-飞行时间质谱条件：第一维柱温箱初始温度：60℃；第一维程序升温：60℃保持3min，然后以7℃/min升温至290℃并保持5min；第二维柱温箱初始温度：70℃；第二维程序升温：70℃保持3min，然后7℃/min升温至300℃并保持5min；恒压模式：进样口压力，200kPa；进样口温度：280℃；进样模式：分流，分流比10：1；溶剂切割时间：2min；调制周期：5s；离子源：EI，能量70eV；离子源温度：220℃；传输线温度；270℃；质核比范围：33-600；采集频率：50Hz；检测电压：1.6kV。
本发明对于现有技术达到有益效果。
本方法与其它方法比较，使用全二维气相色谱-飞行时间质谱对香气成分分析，可以同时分离检测上百种化合物，结合飞行时间质谱的高分辨率特点，通过质谱正、反相似度度筛查，提高定性准确度。该方法通过方法学检验，重复性好。用于三类茶叶香气成分分析，找到多种化合物在不同茶叶中的含量存在显著性差异。
具体实施例
通过下属实施例有助于理解本发明，但不限制本发明内容。
实施例1：方法重复性考察
为考察整体方法的重复性，实验步骤如下
(1)使用同时蒸馏萃取方法提取挥发性成分。将15g茶叶样品粉末、0.1mg联苯(内标)及300ml水放入第一烧瓶中，将60ml二氯甲烷放入第二烧瓶中，连接同时蒸馏萃取装置，两个烧瓶分别加热，回流提取2h，然后收集第二烧瓶中样本，加1g无水硫酸钠除水，而后在旋蒸仪中浓缩至1ml，而后储存待分析。共有11个相同样本被提取。
(2)使用全二维气相色谱-飞行时间质谱来分析制得的11个样品。全二维气相色谱-飞行时间质谱由LECO公司提供。全二维气相色谱-飞行时间质谱条件：第一维柱温箱初始温度：60℃；第一维程序升温：60℃保持3min，然后以7℃/min升温至290℃并保持5min；第二维柱温箱初始温度：70℃；第二维程序升温：70℃保持3min，然后7℃/min升温至300℃并保持5min；恒压模式：进样口压力，200kPa；进样口温度：280℃；进样模式：分流，分流比10：1；溶剂切割时间：2min；调制周期：5s；离子源：EI，能量70eV；离子源温度：220℃；传输线温度；270℃；质核比范围：33-600；采集频率：50Hz；检测电压：1.6kV。
(3)针对全二维气相色谱-飞行时间质谱分析的原始数据，通过Pegasus4D软件进行色谱峰识别及色谱峰定性，然后通过内标半定量分析各种挥发性香气成分。其中用于峰识别的信噪比设为50。
用上述发明方法提取分析样本并得到各色谱峰的原始峰面积。通过内标峰面积校正各色谱峰的原始峰面积，然后计算各色谱峰的保留时间以及峰面积的相对标准偏差(RSD)。首先从整体角度考察重复性，计算在不同峰面积RSD区间下的相应色谱峰的峰面积分布，结果如表1所示。然后随机选取8种香气成分及内标考察特定物质的重复性，结果如表2所示。结果显示，峰面积RSD值小于20％的相应色谱峰的峰面积占总峰面积的85.4％。而选择出的8种香气成分其峰面积RSD值均小于10％，其一维及二维保留时间RSD值均小于1％。
从分离分析角度表明该方法有良好重复性。
表1：在不同峰面积RSD值区间内各色谱峰的峰面积分布
| RSD范围 | 0-10％ | 10-20％ | 20-30％ | >30％ |
| 所占峰面积的百分比 | 27.1％ | 58.3％ | 7.3％ | 7.3％ |
表2：茶叶中部分香气成分重复性数据
实施例2：挥发性香气成分定性
为定性茶叶中挥发性香气成分，实验步骤如下
(1)使用同时蒸馏萃取方法提取挥发性成分。将15g茶叶样品粉末、0.1mg联苯(内标)及300ml水放入第一烧瓶中，将60ml二氯甲烷放入第二烧瓶中，连接同时蒸馏萃取装置，两个烧瓶分别加热，回流提取2h，然后收集第二烧瓶中样本，加1g无水硫酸钠除水，而后在旋蒸仪中浓缩至1ml，而后储存待分析。共有1个质量控制样本(混有绿茶、乌龙茶与红茶)被提取。
(2)使用全二维气相色谱-飞行时间质谱来分析制得的样品。全二维气相色谱-飞行时间质谱由LECO公司提供。全二维气相色谱-飞行时间质谱条件：第一维柱温箱初始温度：60℃；第一维程序升温：60℃保持3min，然后以7℃/min升温至290℃并保持5min；第二维柱温箱初始温度：70℃；第二维程序升温：70℃保持3min，然后7℃/min升温至300℃并保持5min；恒压模式：进样口压力，200kPa；进样口温度：280℃；进样模式：分流，分流比10：1；溶剂切割时间：2min；调制周期：5s；离子源：EI，能量70eV；离子源温度：220℃；传输线温度；270℃；质核比范围：33-600；采集频率：50Hz；检测电压：1.6kV。
(3)针对全二维气相色谱-飞行时间质谱分析的原始数据，通过Pegasus4D软件进行色谱峰识别及色谱峰定性，然后通过内标半定量分析各种挥发性香气成分。其中用于峰识别的信噪比设为50。
用上述发明方法分析质量控制样本，并通过Pegasus4D软件处理。当峰识别信噪比设为50时，大约3000个色谱峰被辨别出来。对这些色谱峰，利用NIST05标准质谱来定性，如满足以下两个指标：质谱正、反相似度大于800，以及保留指数偏差的绝对值(计算保留指数-数据库保留指数)小于20，则可以初步判定该色谱峰所代表化合物。鉴定化合物如下表3所示。通过一次分析可以检测到450种有效挥发性成分(有3000个左右的峰被识别出来，定性了450种)，这远强于传统的一维气相色谱质谱技术的检测能力。对于上述实验步骤1中提取到的样本，采用一维气相色谱质谱分析。分析条件同步骤2中大致一样，唯一区别在于去掉第二维气相色谱柱，将第一维气相色谱与质谱直接相连。分析完成后，处理方式同步骤3。当峰识别信噪比设为50时，只有550个峰被识别出来，远低于全二维气相色谱质谱的分析结果。
表3，鉴定出茶叶挥发性香气成分
实施例3：
为寻找在绿茶、乌龙茶和红茶间有差异的香气成分，实验步骤如下
(1)使用同时蒸馏萃取方法提取挥发性成分。将15g茶叶样品粉末、0.1mg联苯(内标)及300ml水放入第一烧瓶中，将60ml二氯甲烷放入第二烧瓶中，连接同时蒸馏萃取装置，两个烧瓶分别加热，回流提取2h，然后收集第二烧瓶中样本，加1g无水硫酸钠除水，而后在旋蒸仪中浓缩至1ml，而后储存待分析。共有12个绿茶、12个乌龙茶与9个红茶样本被提取。
(2)使用全二维气相色谱-飞行时间质谱来分析制得的所有33个样品。全二维气相色谱-飞行时间质谱由LECO公司提供。全二维气相色谱-飞行时间质谱条件：第一维柱温箱初始温度：60℃；第一维程序升温：60℃保持3min，然后以7℃/min升温至290℃并保持5min；第二维柱温箱初始温度：70℃；第二维程序升温：70℃保持3min，然后7℃/min升温至300℃并保持5min；恒压模式：进样口压力，200kPa；进样口温度：280℃；进样模式：分流，分流比10：1；溶剂切割时间：2min；调制周期：5s；离子源：EI，能量70eV；离子源温度：220℃；传输线温度；270℃；质核比范围：33-600；采集频率：50Hz；检测电压：1.6kV。
(3)针对全二维气相色谱-飞行时间质谱分析的原始数据，通过Pegasus4D软件进行色谱峰识别及色谱峰定性，然后通过内标半定量分析各种挥发性香气成分。其中用于峰识别的信噪比设为50。然后利用统计学方法寻找三类茶叶样本中含量有差异的化合物。
采用上述方法，对绿茶，乌龙茶及红茶香气成分进行分析，三类茶叶样本各12,12及9例，共33例。将所得各色谱峰的峰面积经内标峰面积校正之后，通过统计学方法共筛选出74中化合物，如表4所示，它们至少在两类茶叶中存在显著性差异，即p值小于0.05。
表4，三类茶叶样本找到差异的香气成分
该方法拥有灵敏度高，重复性好等优点，可以同时分析上百种挥发性成分，适用于茶叶特征香气的物质相关的基础研究及茶叶分类研究。
Claims (5)
1.一种茶叶中挥发性香气成分分析方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)使用同时蒸馏萃取方法提取挥发性成分：将5-20g茶叶样品粉末及200-400ml水放入第一个烧瓶中，将50-70ml二氯甲烷放入第二个烧瓶中，连接同时蒸馏萃取装置，两个烧瓶分别加热，回流提取1-3h，然后收集第二个烧瓶中样本，加无水硫酸钠除水，而后在旋蒸仪中浓缩至1-2ml，而后储存待分析；
(2)使用全二维气相色谱-飞行时间质谱来分析制得样品；
(3)针对全二维气相色谱-飞行时间质谱分析的原始数据，通过Pegasus4D软件进行色谱峰识别及色谱峰定性，然后通过内标半定量分析各种挥发性香气成分。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：其中第一维色谱柱为DB-5MS，规格为30m×250μm×0.25μm。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：其中第二维色谱柱为RTX-200MS，规格为1.6m×180μm×0.20μm。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：使用内标为联苯，在样本提取前加入0.1-0.3mg于第一烧瓶中。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：全二维气相色谱-飞行时间质谱条件：第一维柱温箱初始温度：60℃；第一维程序升温：60℃保持3min，然后以7℃/min升温至290℃并保持5min；第二维柱温箱初始温度：70℃；第二维程序升温：70℃保持3min，然后7℃/min升温至300℃并保持5min；恒压模式：进样口压力，200kPa；进样口温度：280℃；进样模式：分流，分流比10：1；溶剂切割时间：2min；调制周期：5s；离子源：EI，能量70eV；离子源温度：220℃；传输线温度；270℃；质核比范围：33-600；采集频率：50Hz；检测电压：1.6kV。
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