CN104931473A - 一种测定可溶性重金属致细胞dna损伤的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其包括以下步骤：(1)将受试细胞用可溶性重金属溶液处理；(2)将处理过的受试细胞固定并进行细胞透化；(3)将透化过的受试细胞染色；(4)用高内涵成像系统进行检测并分析。本发明的测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法操作方便、灵敏度高、检测速度快，并且具有明确的针对性，对重金属的遗传毒性研究进行了补充和扩展。

Description

一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法

技术领域

本发明涉及采用高内涵成像系统测定可溶性重金属致细胞DNA的损伤的评价方法，属于环境生态毒理学技术领域。

背景技术

重金属存在于人类赖以生存的空气、土壤及水中，并且种类繁多，其中汞、镉、铅、铬、砷等具有显著的生物学毒性，可以通过食物链等途径从水和土壤中进入底栖生物、鱼、鸟类和哺乳类动物体内富集，从而产生生物放大作用。目前我国的部分土壤和水中都存在着重金属污染，研究表明重金属的毒性具有多方面多层次的特点，但是以往的研究主要集中在对污染物的理化检测上，目前也有较少的基于模式动物对重金属的生态评价。关于重金属对哺乳动物的毒性，尤其是对哺乳动物致癌、致畸和致突变作用等遗传毒性的检测方法较少，因此建立一种敏感的测试方法来评价重金属的遗传毒性是环境监测的一项重要工作。

遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的化合物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。DNA双键断裂(DSBs)是最严重的DNA损伤形式。无论何种因素诱导的DSBs都伴随有组蛋白2A家族的组蛋白2AX(H2AX)的磷酸化和簇集。DNA双键断裂时，H2AX的丝氨酸-139位置迅速磷酸化，并且在DSBs位点簇集形成焦点。Rogakou等将磷酸化的H2AX命名为γH2AX。组蛋白2AX的磷酸化致使γH2AX形成，这一现象被发现发生在细胞核内，作为对DSBs的早期应答。因此γH2AX的量化可以作为一个在体外衡量基因毒性的标准。然而用γH2AX指标来评价重金属致DNA损伤的试验在国内外都鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是建立一种基于细胞DNA损伤指标γH2AX的、采用高内涵成像系统来检测可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法。本方法操作方便、灵敏度高、检测速度快，并且具有明确的针对性，对重金属的遗传毒性研究进行了补充和扩展。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明涉及一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其包括以下步骤：

(1)将受试细胞用可溶性重金属溶液处理；

(2)将处理过的受试细胞固定并进行细胞透化；

(3)将透化过的受试细胞染色；

(4)用高内涵成像系统进行检测并分析。

其中，高内涵成像系统指的是对每个细胞进行多通道、多靶点的荧光扫描检测，由成像技术捕获图像信息后，经专用分析系统进行多指标在线分析，最终高效率地定量获取药物或外界刺激对细胞作用的综合生物学评价。其中“高”表示功能多、分析参数多以及通量大、速度快等含义。

在优选的实施方案中，本发明所述的测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法包括以下具体步骤：

(1)设置重金属测试浓度：选取受试细胞，并测定目标可溶性重金属对该受试细胞的半抑制浓度IC₅₀；根据得到的所述半抑制浓度IC₅₀值设置4个可溶性重金属浓度梯度，分别为IC₅₀，1/2IC₅₀，1/4IC₅₀,1/8IC₅₀；另外设置一个空白对照。

其中所述半抑制浓度IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50％，该浓度称为50％抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50％时所对应的浓度。其中，可以按照现有技术中已有的细胞毒性测试方法来测定目标可溶性重金属对受试细胞的半抑制浓度。

(2)细胞培养：传代培养所述受试细胞，待所述受试细胞达到80％融合率时用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶将细胞消化，接种于96孔板，接种密度为0.5-1×10⁵个细胞/ml，置于37℃、CO₂体积浓度为5％的CO₂培养箱中培养24h。其中所述细胞消化的目的是将细胞在体外培养过程中形成的多层、成团的细胞分离成单个的细胞以用于后续试验。

(3)可溶性重金属处理细胞：用步骤(1)中设置的重金属浓度梯度处理处于对数生长期的受试细胞培养物，置于37℃、CO₂体积浓度为5％的CO₂培养箱中继续培养24h。优选地，每组试验设置三个平行对照。

(4)细胞固定：将细胞从上述CO₂培养箱中取出，用磷酸盐缓冲液洗涤96孔板上细胞，再用质量浓度4％的多聚甲醛溶液固定细胞15min，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次以去除多余的多聚甲醛，每次洗涤时间不少于5min；

(5)透化细胞膜：用含0.3％曲拉通-100和1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液处理固定细胞20min以使细胞膜通透，再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，每次洗涤时间不少于5min；

(6)γH2AX染色：用10μg/ml异硫氰酸荧光素标记的γH2AX抗体对细胞进行染色，染色20min，再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次。其中所述γH2AX指的是磷酸化的γH2AX。

(7)Hoechst染色：用含10μg/ml Hoechst的磷酸盐缓冲液染色20min。其中所述Hoechst染料的作用为在不损伤细胞中DNA的情况下对细胞核直接进行染色。

(8)图片获取：用高内涵成像系统对上述处理过的受试细胞进行检测，选择异硫氰酸荧光素和Hoechst荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；

(9)图片分析：在图片扫描完成后使用高内涵分析软件进行分析，测量Hoechst通道细胞核的平均直径以设置单个细胞核的直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数；根据以上设定软件对图片进行识别，并计算单个细胞核的异硫氰酸荧光素及Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值；用Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值作为对照，比较FITC通道单个细胞核平均荧光值的变化，用其评价可溶性重金属的DNA损伤程度。根据Hoechst通道的荧光设置细胞核的直径以对单个细胞进行区分，再分析单个细胞核FITC通道荧光强度平均值，根据值的差异来比较细胞DNA受损伤的程度，同时导出单个细胞核Hoechst通道荧光强度平均值用来作为对照。

(10)统计学分析：采用SPSS16.0软件进行分析，将试验组和对照组进行显著性t检验，以p<0.05作为显著性依据。

在优选的实施方案中，所述受试细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

本发明取得了以下有益效果：

本方法是采用细胞DNA损伤作为重金属遗传毒性的检测指标，与传统的基于动植物模型来评价重金属的遗传毒性方法相比，具有靶点准确直观的特点，为重金属对细胞损伤的机理提供了指导方向。由于细胞系培养的相对稳定，该方法更易于在各实验室间重复，为评价重金属的遗传毒性提供了一个更加可靠的数据基础。高内涵系统可以高通量检测多个样品对细胞的DNA损伤，且要样品量少，可快速准确的进行多样品同时检测，为重金属的评价与管理提供了一个新的快速手段。

附图说明

图1为异硫氰酸荧光素通道的单个细胞核在不同重金属浓度下的平均荧光值结果图。其中*表示p<0.05,**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图2为Hoechst通道的单个细胞核在不同重金属浓度下的平均荧光值结果图。

具体实施方式

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

1.实验材料：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO细胞)由中国科学院昆明动物研究所提供。

2.主要实验器材：高内涵成像系统(ImageXpress MICRO，MolecularDevices公司)；CO₂培养箱(Thermo公司)；二级生物安全柜(Heal Force公司)；倒置显微镜(TS100-F-HMC型，Nikon公司)；96孔板、细胞培养瓶(美国Corning公司)。

3.实验方法：

(1)六价铬标准贮备溶液的配制：称取2.9418g预先在110℃干燥1-2h的K₂Cr₂O₇(优级纯)，用水溶解后，移入100ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。此溶液的溶度为100mM，待用。

(2)将CHO细胞种植于96孔细胞培养板，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱内培养24h，后按常规方法进行六价铬的MTT细胞毒性试验，选取5、10、20、40、60、160共6个处理浓度。根据吸光值，计算细胞抑制率CI。根据常规方法用SPSS16.0计算出六价铬对CHO细胞的半数抑制浓度IC₅₀约为100umol/L。

$\mathrm{CI}=(1-\frac{O{D}_n-O{D}_o}{O{D}_c-O{D}_o})\&times;100\%$

注：OD_n是样品多孔平均的吸光值；OD_o是空白多孔平均的吸光值；OD_c是细胞对照的多孔平均的吸光值。

(3)重金属处理细胞：用100、50、25、12.5umol/L的六价铬梯度处理处于对数生长期的CHO细胞培养物，每组设三个平行，置于37℃、体积浓度为5％CO₂培养箱中继续培养24h；

(4)细胞固定：将细胞从二氧化碳培养箱中取出，用PBS洗涤96孔板上细胞，紧接着用质量浓度4％多聚甲醛溶液(临用前配制)固定细胞15min，再用PBS洗涤2次以去除多余的多聚甲醛，每次洗涤时间5min；

(5)透化细胞膜：用含0.3％TritonX-100和1％的牛血清白蛋白的PBS溶液处理固定细胞20min以使细胞膜通透，再用PBS洗涤细胞2次，每次洗涤时间5min；

(6)γH2AX染色：用10μg/ml FITC标记的γH2AX抗体对细胞进行染色，染色20min，再用PBS洗涤细胞2次；

(7)Hoechst染色：用含10μg/ml Hoechst(对细胞核进行染色)的PBS染色20min；

(8)图片获取：用高内涵成像系统进行检测，选择FITC和Hoechst荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；

(9)图片分析：在图片扫描完成后使用高内涵分析软件进行分析，测量Hoechst通道细胞核的平均直径以设置单个细胞核的直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定软件对图片进行识别，并计算单个细胞核的FITC及Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值。用Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值作为对照，比较FITC通道单个细胞核平均荧光值的变化，用其评价可溶性重金属的DNA损伤程度。

(10)统计学分析：采用SPSS16.0软件进行分析，将试验组和对照组进行显著性t检验，以p<0.05作为显著性依据。

其中，FITC通道单个细胞核平均荧光值结果如图1所示，Hoechst通道单个细胞核平均荧光值结果如图2所示。由图1可以看出，CHO细胞在用不同浓度的六价铬处理后，FITC通道单个细胞核荧光强度与六价铬的浓度呈剂量反应关系，图1中*表示p<0.05,**表示p<0.01，***表示p<0.001。而图2中对照Hoechst通道单个细胞核荧光强度没有显著变化，表明六价铬会导致CHO细胞发生DNA损伤，并且可以通过γH2AX指标对DNA损伤程度进行半定量表征。

Claims (3)

1.一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)将受试细胞用可溶性重金属溶液处理；

(2)将处理过的受试细胞固定并进行细胞透化；

(3)将透化过的受试细胞染色；

(4)用高内涵成像系统进行检测并分析。

2.根据权利要求1所述的测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

(1)设置重金属测试浓度：选取受试细胞，并测定目标可溶性重金属对该受试细胞的半抑制浓度IC₅₀；根据得到的所述半抑制浓度IC₅₀值设置4个可溶性重金属浓度梯度，分别为IC₅₀，1/2 IC₅₀，1/4IC₅₀,1/8IC₅₀；另外设置一个空白对照；

(2)细胞培养：传代培养所述受试细胞，待所述受试细胞达到80％融合率时用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶将细胞消化，接种于96孔板，接种密度为0.5-1×10⁵个细胞/ml，置于37℃、CO₂体积浓度为5％的CO₂培养箱中培养24h；

(3)可溶性重金属处理细胞：用步骤(1)中设置的重金属浓度梯度处理处于对数生长期的受试细胞培养物，置于37℃、CO₂体积浓度为5％的CO₂培养箱中继续培养24h；

(4)细胞固定：将细胞从上述CO₂培养箱中取出，用磷酸盐缓冲液洗涤96孔板上细胞，再用质量浓度4％的多聚甲醛溶液固定细胞15min，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次以去除多余的多聚甲醛，每次洗涤时间不少于5min；

(5)透化细胞膜：用含0.3％曲拉通-100和1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液处理固定细胞20min以使细胞膜通透，再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，每次洗涤时间不少于5min；

(6)γH2AX染色：用10μg/ml异硫氰酸荧光素标记的γH2AX抗体对细胞进行染色，染色20min，再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次；

(7)Hoechst染色：用含10μg/ml Hoechst的磷酸盐缓冲液染色20min；

(8)图片获取：用高内涵成像系统对上述处理过的受试细胞进行检测，选择异硫氰酸荧光素和Hoechst荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；

(9)图片分析：在图片扫描完成后使用高内涵分析软件进行分析，测量Hoechst通道细胞核的平均直径以设置单个细胞核的直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数；根据以上设定软件对图片进行识别，并计算单个细胞核的异硫氰酸荧光素及Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值；用Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值作为对照，比较FITC通道单个细胞核平均荧光值的变化，用其评价可溶性重金属的DNA损伤程度；

(10)统计学分析：采用SPSS16.0软件进行分析，将试验组和对照组进行显著性t检验，以p<0.05作为显著性依据。

3.根据权利要求1或2所述的测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其特征在于，所述受试细胞为中国仓鼠卵巢细胞。