CN104918629B

CN104918629B - Sp肽或其衍生物在制备降低il‑13水平的药物中的应用

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Publication number: CN104918629B
Application number: CN201380070423.4A
Authority: CN
Inventors: 程云; 虞瑞鹤; 赵万洲; 李红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2033-02-07
Also published as: CN104918629A; WO2014121492A1

Abstract

本发明提供了一种SP肽或其衍生物在制备降低患者IL‑13水平的药物中的应用，所述肽或其衍生物为如式I所示的SP肽或其药学上可接受的盐或酯。本发明的研究证实，所述肽或其衍生物可有效降低患者IL‑13水平。Xaa1‑Gln‑Xaa2‑Xaa3‑Thr‑Ser‑Gly‑Xaa4 (式I)其中，Xaa1为缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，Xaa2为Thr或Ser，Xaa3为Tyr、Phe或Trp，而且Xaa4为缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。

Description

SP肽或其衍生物在制备降低IL-13水平的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及SP肽或其衍生物在制备降低IL-13水平的药物中的应用，尤其涉及该SP肽或其衍生物在制备降低肝病患者、肺病患者或肾病患者IL-13水平的药物中的应用。

背景技术

本发明人在中国专利CN1194986C和CN1216075C中披露了一种7P肽或其衍生物(简称7P肽或其衍生物，本发明中称为SP肽或其衍生物)，是一种最初根据丙型肝炎病毒而设计的免疫原性肽，并证明所述7P肽或其衍生物具有诱导细胞因子r-IFN，IL-4，IL-10水平升高和抗体产生的功能，r-IFN是Th1分泌的细胞因子，是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，针对HCV(丙型肝炎病毒)的清除具有相当重要的意义，因此该7P肽或其衍生物具有预防和/或治疗丙型肝炎的作用。进一步的，本发明人在专利申请CN101822816A中公开了所述7P肽或其衍生物在预防和治疗肺炎中的用途，并且具体记载该7P肽及其衍生物通过降低TNF-α水平对肺炎的治疗。所以，已经有的研究报道可以知道，7P肽具有降低肺炎患者的TNF-α水平，以及具有提高丙型肝炎患者细胞因子IL-4水平的作用。

IL-13已知是一种在过敏性哮喘中诱发哮喘发生的细胞因子，其可在肺组织高表达，并诱导炎症、粘液高分泌、上下皮纤维化、嗜酸粒细胞活化/趋化因子的产生和气道高反应，而上述7P肽或其衍生物与IL-13水平之间关系目前尚没有报道。

发明内容

本发明提供了SP肽或其衍生物在制备降低IL-13水平的药物中的应用，拓宽了该SP肽或其衍生物的潜在药用领域。

本发明还提供了一种降低患者IL-13水平的方法，通过向患者施用含有治疗有效量的所述肽或其衍生物的药物，能有效改善患者的疾病状况。

本发明提供的如式I所示的肽(SP肽)或其衍生物在制备降低IL-13水平的药物中的应用：

Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4 (式I)

其中，

Xaa1为缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，

Xaa2为Thr或Ser，

Xaa3为Tyr、Phe或Trp，而且

Xaa4为缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro；

所述衍生物包括所述肽在药学上可接受的盐或酯。

发明人的研究证明，施用有效剂量的所述肽或其衍生物能够有效降低患者IL-13水平，尤其能降低肝病患者、肺病患者或肾病患者IL-13水平。所以，在本发明的方案中，所述药物可以为肝病、肺病或肾病治疗用药，例如，针对临床诊断为肝纤维化疾病的肝病患者、临床诊断为肺纤维化的肺病患者或临床诊断为肾间质纤维化的肾病患者的治疗用药。

上述式I所示的肽或其衍生物的基本结构和组成即为发明人在之前的研究中所得到的7P肽或其衍生物，在本发明中也称为SP肽或其衍生物。根据在先专利公开的记载，所述SP肽或其衍生物可通过本领域技术人员已经了解或熟知的固相合成法或液相合成法合成，也可通过基因工程融合表达并提纯获得。

在本文中，所述“药学上可接受的酯”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的酯。通常，酯化修饰后能降低机体中的蛋白酶对肽的水解。对本发明的肽的末端氨基、羧基或侧链基团进行修饰可以形成药学上可接受的酯。对氨基酸侧链基团的修饰包括但不限于苏氨酸、丝氨酸侧链羟基与羧酸发生的酯化反应。优选氨基酸末端基团用蛋白质化学领域的技术人员已知的保护性基团保护起来，如乙酰基、三氟乙酰基、Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、C_1-3烷基、C_6-12芳烷基等。有关该SP肽的药用酯在PCT/CN2006/001176中有详细说明，因此将该在先公开申请文件中的相关内容并入本案作为参考。在本发明的具体实施方式中，发明人发现，本发明的肽不经修饰也足以在生理条件下用于治疗或预防哮喘，因此式I多肽可以是不经任何修饰的肽段，例如，N末端的化学基团仍旧为第一个氨基酸上的α-氨基(-NHB_2B)，C末端的化学基团是C末端氨基酸的羧基(-COOH)。

在本文中，所述“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐，即，本领域熟知的药用盐形式。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将所述的肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙和镁等，季铵阳离子(如四甲基铵、四乙基铵等)、以及铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等的阳离子。优选的碱加成盐包括磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(tris)和乙酸盐。这些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变多肽的活性。

总之，根据本发明的方案，所述降低IL-13水平的药物可以是直接采用所述肽(SP肽)，也可以是SP肽的药用盐或药用酯形式的药物制剂。

进一步的，所述肽或其衍生物为式Ⅱ所示的肽或其药学上可接受的盐或酯：

Gly-Gln-Thr-Tyr-Thr-Ser-Gly (式Ⅱ)

根据本领域公知的氨基酸表示方式，式Ⅱ所示的肽还可以缩写为GQTYTSG。

在本发明的方案中，所述肽或其衍生物可根据施用对象的不同以及施用途径的不同采用适当的制剂形式，例如：注射剂、(注射用)冻干粉、喷雾剂、口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、缓释剂(可控制药剂有效成分缓慢释放的剂型)或控释剂(可控制药剂有效成分释放的剂型)等制剂，所述制剂中可包含常规的药学上可接受的载体或赋形剂，所述“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料，例如：生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。本发明的方案中优选以注射方式施用由所述肽或其衍生物制成的药物，即，使用注射针剂或冻干粉针剂是优选的，以生理盐水作为载体溶解即可。

本发明的研究发现，IL-13水平的升高也是导致肝脏、肾脏以及肺等器官出现纤维化症状的诱因之一，所以，利用上述含有治疗有效量的SP肽或其衍生物的药物(所述肽或其衍生物作为有效成分)降低患者IL-13水平，引用在临床治疗中可以起到对肝病患者、肺病患者或肾病患者的症状缓解及治疗的效果。

在此研究结果的基础上，本发明提供的一种降低患者IL-13水平的方法，包括，向患者施用含有治疗有效量的上述式I所示的肽或其衍生物的药物，所述衍生物包括所述肽在药学上可接受的盐或酯。

本发明进一步提供了一种通过降低患者IL-13水平实现对肝纤维化疾病、肺纤维化疾病或肾间质纤维化疾病治疗的方法。

根据本发明的优选方案，所述治疗用药中作为有效成分的肽或其衍生物可以为上述式Ⅱ所示的肽或其药学上可接受的盐或酯。

本发明的实施方案中，可以向患者施用含有治疗有效量为200-3000μg所述肽或其衍生物的药物，进一步可以是300-2000μg的所述肽或其衍生物的药物。本文中所述治疗有效量是针对一般成人体重、单次施用的药剂中所述有效成分的量。

在本发明的一个实施方式中，以注射方式施用含有治疗有效量的所述肽或其衍生物的药物。更好地是对患者以单位制剂的剂量给药，所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，常见的单位制剂如一单位(片)片剂、一单位(针)针剂或粉针剂等。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如，在制备药物的过程中，一般认为成人体重为50-90kg，可以最初可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中国临床药理学与治疗学》,2004Sep；9(9):1069-1072)来确定。在本发明的实施方式中，可以使用按照人和大鼠的体表面积折算系数0.018来换算人和大鼠的剂量。根据本发明实施方式，所述单位制剂中SP肽或其衍生物以20-300μg/kg大鼠剂量施用至大鼠时治疗效果较好，当以40-200μg/kg大鼠剂量，例如180μg/kg、90μg/kg，以及45μg/kg大鼠剂量施用至大鼠时治疗效果更佳。制药商可以根据上述换算方法得到用于人的单位制剂中的有效成分含量，用以应用于其制药过程中。在本发明的技术方案中，根据等效剂量换算关系以及人的常规体重，并且综合用药安全、成本和药效，优选的，所述单位制剂中含有200-3000μg剂量的所述肽或其衍生物，更优选含有300-2000μg剂量的所述肽或其衍生物。

研究结果显示，SP肽或其衍生物能够有效降低肝病患者、肺病患者或肾病患者IL-13水平，尤其是降低肝纤维化患者，肺纤维化患者，或肾间质纤维化患者的IL-13水平，临床表现为有效改善了这些患者的病变症状。

在本发明的实施例中使用本领域常规手段诱导出肝纤维化、肺纤维化、或肾间质纤维化症状的大鼠模型(其中，所述肝纤维化可以为BSA免疫佐剂诱导的肝纤维化，所述肺纤维化可以为博莱霉素诱导的肺纤维化，所述肾间质纤维化可以为单侧输尿管梗阻诱导的肾间质纤维化)，从数据可以看出，施用所述肽或其衍生物的组(SP肽高、中、低剂量组)，相比于模型组，均表现出显著降低的IL-13水平，以及显著改善的组织病变程度。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明而作为本发明说明书的一部分。

附图说明

图1显示了SP肽对各组大鼠的肝脏血清中IL-13水平的影响。

图2显示了各组大鼠的肝组织纤维化病变程度综合评分。

图3显示了SP肽对各组大鼠的肾脏血清中IL-13水平的影响。

图4显示了各组大鼠的肾间质纤维化病变程度综合评分。

图5显示了SP肽对各组大鼠的肺血清中IL-13水平的影响。

图6显示了SP肽对各组大鼠的肺组织匀浆中羟脯氨酸水平的影响。

图7显示了各组大鼠的肺纤维化病变程度综合评分。

具体实施方式

实施例1SP肽降低肝病动物IL-13水平以及改善肝纤维化作用

1.实验材料

1.1动物：

大鼠60只，体重18g～22g，雌雄各半，购自南通大学实验动物中心。

1.2药物、试剂及仪器：

使用通过固相肽合成方法，由413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)合成的以下序列的肽：GQTYTSG(以下称为SP肽)，具体的合成步骤请参见PCT/CN2006/001176中实施例1的记载，使用时用生理盐水溶解。

阳性对照药：氢化可的松注射液，商购获得，标称人日用量5mg/kg·d。

BSA免疫佐剂购自Sigma公司。

大鼠IL-13ELISA Kit,购自上海蓝基生物科技有限公司。

酶标仪：美国热电雷勃MK3。

1.3分组及药物剂量

将上述60只大鼠随机分为6组，大鼠每组10只，分别为：

1)空白对照组(施用生理盐水)；

2)模型组(施用CCl₄花生油和使用生理盐水配制的BSA免疫佐剂)；

3)阳性药物组(施用CCl₄花生油和使用生理盐水配制的BSA免疫佐剂，以及氢化可的松注射液，剂量为5mg/kg·d)；

4)SP肽高剂量组、5)SP肽中剂量组、6)SP肽低剂量组(施用CCl₄花生油和使用生理盐水配制的BSA免疫佐剂，以及剂量分别为180μg/kg·d，90μg/kg·d，45μg/kg·d的SP肽，用生理盐水配置成需要浓度的SP肽溶液)。

2.试验方法

2.1实验方案：

将BSA免疫佐剂用生理盐水配置为0.8wt％浓度，现配现用。同时配置40％(v/v)CCl₄花生油。

按照以下方式对各组大鼠进行给药，给药期间，每天向各组大鼠正常喂食。

在第1天，对除空白对照组外的其余各组大鼠，腹腔注射40％CCl₄花生油溶液0.3ml/100g大鼠体重，同时皮下注射0.8％BSA免疫佐剂0.3ml/100g大鼠体重。空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水，共进行5周。然后对各组动物分别随机取1只，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉后称体重，取肝脏，观察其形态及病理学改变，其中除空白对照组外其余组的大鼠均表现出明显的肝纤维化，说明造模成功。

从第36天起，对空白对照组和模型组大鼠皮下注射生理盐水(大鼠每100g体重给予0.1ml生理盐水)，隔天给药一次；对SP肽高、中、低剂量组皮下注射相应剂量的SP肽，大鼠每100g体重给药0.1ml的SP肽溶液，隔天给药一次；对阳性药物组大鼠腹腔注射氢化可的松，大鼠每100g体重给药0.1ml，隔天给药一次。各组动物按照上述方式共给药15次。

最后一次给药结束后第2天，将空白对照组，模型组，SP肽高、中、低剂量组，以及阳性药物组的大鼠，分别腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，取血收集血清，根据试剂盒的操作要求检测血清中IL-13含量，将IL-13标准品用试剂盒中的稀释液进行倍比稀释，然后按照试剂盒说明书进行操作。计算出标准曲线，从标准曲线上读出所测样本的数值，再乘以稀释倍数，即得出样本血清中IL-13的水平值。

收集完血清后,将大鼠肝使用冰生理盐水清洗组织表面，滤纸吸干，置于10％中性福尔马林溶液中固定24小时，常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，光学显微镜下进行病理组织学检查，包括：检查肝细胞结构是否完整、肝小叶是否正常，以及肝细胞间连接是否紧密，肝细胞索排列是否规则等。

根据肝组织病变由轻到重的程度分别标记为1分，2分，3分，4分，无明显病变为0分，极轻度病变为0.5分，累加所有分数，并计算出每组每只动物的均分(±SD)，分值越高提示病变程度越重。对病变评分结果进行两个样本比较的秩和检验，与模型组进行比较。

2.2数据处理：对所有数据进行数据处理，对病理学评分采用秩和检验，其他数据采用t检验，并统计分析结果。

3.结果

3.1大鼠肝脏血清中IL-13水平

图1表示了SP肽对各组大鼠的血清中IL-13水平的影响，以平均值表示，其中给药量如上述1.3中所述。从图1可以看出，由BSA免疫佐剂引起的复合性免疫损伤肝纤维化大鼠模型组的血清中IL-13水平相比空白对照组显著升高，根据下面病理组织学检查可知，IL-13水平升高诱发了大鼠肝组织纤维化病变；而SP肽高、中、低剂量组大鼠的血清中IL-13相比模型组均有显著降低(*P＜0.05或**P＜0.01)；并且SP肽高剂量组相比阳性药物组有更好的效果，SP肽中、低剂量组与阳性药物组效果相当。

3.2肺组织切片结果分析

空白对照组大鼠肝细胞结构完整，肝小叶正常，肝细胞索排列规则，肝细胞间连接紧密。

模型组大鼠肝细胞破坏严重，胞浆发空，核固缩或溶解，肝小叶结构破坏，有假小叶形成，从汇管区到肝中央静脉可见成纤维细胞数量增加，肝细胞内可见大量的空泡结构，同时还有细胞浊肿、水样变等细胞变性坏死表现。

阳性药物组大鼠肝细胞破坏减轻，从汇管区到肝中央静脉可见成纤维细胞数量有所减少。

SP肽高、中、低剂量组大鼠肝细胞破坏明显减轻，肝小叶结构破坏明显减少，从汇管区到肝中央静脉可见成纤维细胞数量显著减少。

3.3将各组大鼠的肝组织病变轻重程度按照上述评分规则，使用秩和检验方法获得各病理学检查指标的综合评分结果，如图2所示，病理组织学检查表明，SP肽给药的各组大鼠，均表现出肝组织纤维化病变的显著减轻，相比于模型组均有统计学显著性差异(*P＜0.05或**P＜0.01)。

实施例2SP肽降低肾病动物IL-13水平以及改善肾间质纤维化作用

1.实验材料

1.1动物：同实施例1.

1.2药物、试剂及仪器：同实施例1。

1.3分组及药物剂量

将上述60只大鼠随机分为6组，大鼠每组10只，分别为：

1)空白对照组(施用生理盐水)；

2)模型组(手术使大鼠单侧输尿管梗阻)；

3)阳性药物组(手术使大鼠单侧输尿管梗阻，施用氢化可的松注射液，剂量为5mg/kg·d)；

4)SP肽高剂量组、5)SP肽中剂量组、6)SP肽低剂量组(手术使大鼠单侧输尿管梗阻，施用剂量分别为180μg/kg·d，90μg/kg·d，45μg/kg·d的SP肽，用生理盐水配置成需要浓度的SP肽溶液)。

2.试验方法

2.1实验方案：

手术使大鼠单侧输尿管梗阻包括：将大鼠用乙醚吸入麻醉后，于右侧中腹部切开，剥离右侧输尿管，使之处于游离状态，分别在肾盂处和输尿管上三分之一处用丝线分别结扎，后切断结扎处的输尿管，逐层缝合皮肤。

在第1天，对除空白对照组外的其余各组大鼠(模型组，SP肽高、中、低剂量组，阳性药物组)，采用手术使大鼠单侧输尿管梗阻。然后常规饲养24天，对各组动物分别随机取1只，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉后称体重，取肝脏，观察其形态及病理学改变，其中除空白对照组外其余组的大鼠均表现出明显的右肾间质纤维化，说明造模成功。

从第25天起，对空白对照组和模型组大鼠皮下注射生理盐水(大鼠每100g体重给予0.1ml生理盐水)，隔天给药一次；对SP肽高、中、低剂量组皮下注射相应剂量的SP肽，大鼠每100g体重给药0.1ml的SP肽溶液，隔天给药一次；对阳性药物组大鼠腹腔注射氢化可的松，大鼠每100g体重给药0.1ml的阳性药物；隔天给药一次。各组动物按照上述方式共给药15次。

收集完血清后,将大鼠肾脏使用冰生理盐水清洗组织表面，滤纸吸干，置于10％中性福尔马林溶液中固定24小时，常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，光学显微镜下进行肾脏病理组织学检查，包括：检查肾盂及肾小管结构是否正常、肾小体体积是否变化等。

根据肾脏组织病变由轻到重的程度分别标记为1分，2分，3分，4分，无明显病变为0分，极轻度病变为0.5分，累加所有分数，并计算出每组每只动物的均分(±SD)，分值越高提示病变程度越重。对病变评分结果进行两个样本比较的秩和检验，与模型组进行比较。

3.结果

3.1大鼠肾脏血清中IL-13水平

图3表示了SP肽对各组大鼠的血清中IL-13水平的影响，以平均值表示，其中给药量如上述1.3中所述。从图3可以看出，由单侧输尿管梗阻引起的右肾间质纤维化大鼠模型组的血清中IL-13水平相比空白对照组显著升高，根据下面病理组织学检查可知，IL-13水平升高诱发了大鼠右肾间质纤维化病变。而SP肽高、中、低剂量组大鼠的血清中IL-13相比模型组均有显著降低(*P＜0.05或**P＜0.01)；并且SP肽高、中、低剂量组相比阳性药物组均具有更好的效果。

3.2肾组织切片结果分析

空白对照组大鼠肾盂及肾小管结构正常、肾小体体积无明显变化。

模型组大鼠肾脏内表面肾盂的移行上皮被扩张，表现为极薄而扁平，单行排列，其内侧的平滑肌和结缔组织明显增多；肾小体体积变小，呈扁椭圆型，血管球数量明显减少，并呈单层样分布在囊壁内；肾小管正常结构少见，多数被大量的间质成分所取代。

阳性药物组大鼠表现为肾盂内侧的平滑肌和结缔组织相比于模型组有所减少。

SP肽高、中、低剂量组大鼠的肾组织相比于模型组表现为轻度的纤维化和肾小管增厚，有一定的浸润细胞增多。

3.3将各组大鼠的肾组织病变轻重程度按照上述评分规则，使用秩和检验方法获得各病理学检查指标的综合评分结果，如图4所示，病理组织学检查表明，SP肽给药的各组大鼠，均表现出大鼠肾间质纤维化病变的显著减轻，相比于模型组均有统计学显著性差异(*P＜0.05或**P＜0.01)。

实施例3SP肽降低肺病动物IL-13水平以及改善肺纤维化作用

1.实验材料

1.1动物：同实施例1。

1.2药物、试剂及仪器：

使用的SP肽，阳性药物同实施例1。

大鼠IL-13ELISA Kit,购自上海蓝基生物科技有限公司。

酶标仪：美国热电雷勃MK3。

博莱霉素，商购获得。

1.3分组及药物剂量

将上述60只大鼠随机分为6组，大鼠每组10只，分别为：

1)空白对照组(施用生理盐水)；

2)模型组(施用含博莱霉素的生理盐水)；

3)阳性药物组(施用含博莱霉素的生理盐水，以及氢化可的松注射液，剂量为5mg/kg·d)；

4)SP肽高剂量组、5)SP肽中剂量组、6)SP肽低剂量组(施用含博莱霉素的生理盐水，以及剂量分别为180μg/kg·d，90μg/kg·d，45μg/kg·d的SP肽，用生理盐水配置成需要浓度的SP肽溶液)。

2.试验方法

2.1实验方案：

以1kg动物体重给予5mg博莱霉素的剂量造模，博莱霉素用生理盐水现配现用。

第1天，对除空白对照组外的其余各组大鼠(模型组，SP肽高、中、低剂量组，阳性药物组)，禁食不禁水12小时，将大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35ml/100g)后，仰卧于固定台上，暴露气管，每只大鼠用l mL注射器向气管内一次性注入博莱霉素生理盐水溶液，大鼠每100g体重给予0.25mL。空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。实验期间各组大鼠均正常喂食，6天后对各组动物分别随机取1只，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉后称体重，取左肺组织，观察其形态及病理学改变，其中除空白对照组外其余组的大鼠均表现出明显的肺纤维化，说明造模成功。

从第8天起，对空白对照组和模型组大鼠皮下注射生理盐水(大鼠每100g体重给予0.1ml生理盐水)，隔天给药一次；对SP肽高、中、低剂量组皮下注射相应剂量的SP肽，大鼠每100g体重给药0.1ml的SP肽溶液，隔天给药一次；对阳性药物组大鼠腹腔注射氢化可的松，大鼠每100g体重给药0.1ml，隔天给药一次。各组动物按照上述方式共给药15次。

收集完血清后,将打开胸腔取出整个肺脏，使用冰生理盐水清洗组织表面，滤纸吸干，取右肺组织置于10％中性福尔马林溶液中固定24小时，常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，光学显微镜下进行肺组织病理组织学检查，包括：检查肺内结构是否清晰，是否有水肿、无炎症及纤维化表现，肺泡间隔是否增厚等。

肺组织匀浆的制备：取左肺组织10％匀浆，以3000rpm离心l0分钟，取上清液，根据试剂盒的操作要求检测肺组织中羟脯氨酸(HyP)水平，根据试剂盒的操作要求检测肺组织中羟脯氨酸(HyP)水平。

根据肺组织组织病变由轻到重的程度分别标记为1分，2分，3分，4分，无明显病变为0分，极轻度病变为0.5分，累加所有分数，并计算出每组每只动物的均分(±SD)，分值越高提示病变程度越重。对病变评分结果进行两个样本比较的秩和检验，与模型组进行比较。

3.结果

3.1大鼠肺部血清中IL-13水平

图5表示了SP肽对各组小鼠的血清中IL-13水平的影响，以平均值表示，其中给药量如上述1.3中所述。从图5可以看出，博莱霉素引起的肺纤维化大鼠模型组的血清中IL-13水平相比空白对照组显著升高，根据下面病理组织学检查可知，IL-13水平升高诱发了大鼠肺纤维化病变。而SP肽高、中、低剂量组小鼠的血清中IL-13水平相比模型组均有显著降低(*P＜0.05或**P＜0.01)，表明SP肽可通过降低IL-13进行大鼠肺纤维化的治疗。并且SP肽高剂量组相比阳性药物组有更好的效果，SP肽中剂量组与阳性药物组效果相当。

图6表示了SP肽对各组小鼠的肺组织匀浆中羟脯氨酸水平的影响，以平均值表示，其中给药量如上述1.3中所述。从图6可以看出，博莱霉素引起的肺纤维化大鼠模型组的肺组织匀浆中羟脯氨酸水平相比空白对照组显著升高，羟脯氨酸水平是肺纤维化病变的重要生化指标。而SP肽高、中、低剂量组小鼠肺组织匀浆中羟脯氨酸水平相比模型组均有显著降低(*P＜0.05或**P＜0.01)；并且SP肽高剂量组相比阳性药物组有更好的效果，SP肽中剂量组与阳性药物组效果相当。

3.2肺组织切片结果分析

空白对照组大鼠肺内结构清晰，无水肿、无炎症及纤维化表现，肺泡间隔未见增厚。

模型组大鼠肺泡腔及肺间质内有大量炎性细胞浸润，肺泡水肿，肺泡间隔明显增宽，成纤维细胞增生，胶原纤维增生呈带状，肺组织以胶原沉积、纤维化改变为主。

阳性药物组大鼠肺泡炎、纤维化程度均较模型组轻，肺泡间隔增厚程度均较模型组轻，炎症细胞浸润少，病变范围小。

SP肽高、中、低剂量组大鼠的肺泡炎症状及纤维化程度均较模型组轻，肺内结构较清晰，肺泡间隔增厚程度较轻，炎性细胞浸润范围小。

3.3将各组大鼠的肺组织病变轻重程度按照上述评分规则，使用秩和检验方法获得各病理学检查指标的综合评分结果，如图7所示，病理组织学检查表明，SP肽给药的各组大鼠，均表现出大鼠肺纤维化病变的显著减轻，相比于模型组均有统计学显著性差异(*P＜0.05或**P＜0.01)。

Claims

1.如式Ⅱ所示的肽或其药学上可接受的盐在制备降低IL-13水平的药物中的应用：

Gly-Gln-Thr-Tyr-Thr-Ser-Gly (式Ⅱ)

其中所述药物为博莱霉素诱导的肺纤维化疾病或单侧输尿管梗阻诱导的肾间质纤维化疾病的治疗用药。

2.根据权利要求1所述的应用，所述药物为单位制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，所述药物为注射制剂。

4.根据权利要求2所述的应用，所述单位制剂为注射制剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其中所述单位制剂中含有治疗有效量为200-3000μg的所述肽或其药学上可接受的盐。

6.根据权利要求3所述的应用，所述注射制剂中含有治疗有效量为200-3000μg的所述肽或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求2所述的应用，其中所述单位制剂中含有治疗有效量为300-2000μg的所述肽或其药学上可接受的盐。

8.根据权利要求3所述的应用，其中所述注射制剂中含有治疗有效量为300-2000μg的所述肽或其药学上可接受的盐。