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CN104903721B - I相和ii相代谢物以及母体化合物的分析 - Google Patents

I相和ii相代谢物以及母体化合物的分析 Download PDF

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CN104903721B CN201380066637.4A CN201380066637A CN104903721B CN 104903721 B CN104903721 B CN 104903721B CN 201380066637 A CN201380066637 A CN 201380066637A CN 104903721 B CN104903721 B CN 104903721B
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Abstract

一种设备，包括：第一色谱柱，流体地联接到样品源和第一色谱流动相溶液源；第二色谱柱，流体地联接到该第一柱；第二流动相溶液源，流体地联接在该第一和该第二柱之间；以及检测器，该第一色谱柱是可配置的，用于在捕集步骤中接收该第一溶液和样品并且将多种分析物的第一部分保留在其中并且使该多种分析物的第二部分穿过其中，该第二色谱柱是可配置的，在该捕集步骤中，用于接收该多种分析物的该第二部分以及该第一和该第二溶液并且将该多种分析物的该第二部分保留在其中，该检测器被安排成在对应的第一和第二洗脱步骤中接收该第二和该第一部分。

Description

I相和II相代谢物以及母体化合物的分析
技术领域
本发明总体上涉及通过色谱的样品分析领域，并且更具体来说，涉及生物样本中的药物化合物浓度的定量分析。
背景技术
液相色谱-质谱(“LCMS”)是一种强大的分析物检测和测量技术，它已经变成了为了诊断目的用于高精度地检测小分子、氨基酸、蛋白质、肽、核酸、脂质以及碳水化合物分析物的优选方法。色谱分离过程依赖这样的事实，通过颗粒的填充床(被称为固定相)渗滤的流体的流动流束中的许多组分溶质分子可以有效地彼此分开。总体上，液相色谱中的分离是在柱中通过样品分子在固定相和流动相之间的选择性分布来实现。单独的样品组分被分离，因为每个组分对固定相具有不同的亲和力，导致每个组分不同的迁移率和每个组分从柱出现的不同的退出时间。分离效率是由溶质带穿过该床或柱时铺展的量来确定。
反相液相色谱(RPLC)被广泛地用作色谱系统中的分离模式。在RPLC技术中，在流动相中采用的一种或多种溶剂的极性比固定相更大，然而在常规(正相)色谱中，相反的情况是正确的。在反相液相色谱系统中典型地采用的流动相溶剂包括水和一种或多种水可混溶的有机改性剂，例如乙腈或甲醇。感兴趣的分析物种类典型地与流动相形成溶液。RP-HPLC固定相通常是高度疏水性或非极性的。化学种类对固定相的亲和力影响流动的流动相中的特定种类穿过固定相的速率，主要是由该种类与固定相上所存在的化学基团的相互相用造成的。这些化学基团可以通过使表面改性试剂与衬底(例如二氧化硅衬底)反应而提供在固定相上。因此，表面改性剂可以用于将特定的化学基团吸附到固定相上。常规反相液相色谱使用1.5-10μm球形二氧化硅珠粒，这些球形二氧化硅珠粒已经通过共价连接包括4、8或18个碳原子的烃链加以改性，从而得到非极性表面。
临床实验室常规地测量人类提供的体液中的药物化合物(包括药类化合物以及其他滥用的天然和合成药物)的浓度。这些化合物总体上包括低分子量分子，这些低分子量分子的亲水性极大并且难以保留在大部分反相LC系统上。代谢物的亲水性甚至更大并且甚至更难以保留在逆相LC系统上。替代性HPLC系统例如采用HILIC柱的那些，保留代谢物但不保留所有母体化合物。因此，使用色谱分离技术定量药物化合物非常具有挑战性。出于这个原因，当前滥用药物的临床定量通过以下来执行：II相代谢物和一些I相代谢物的水解(通过酸水解或者通过酶促水解)，以便将代谢物转化回到母体化合物，并且随后只有母体化合物的LCMS测量是必需的。代谢物和母体药物的总浓度合起来报告为一个单值，因为代谢物已经在水解期间被转化回到母体药物。酸水解或者酶促水解需要一个处理步骤，接着是在高温下长达2小时的培育。因此，水解程序给每个分析增加了额外的时间和成本。
根据以上讨论，在本领域中需要一种用于药物化合物的例行临床测量的快速并且可靠的色谱分离和分析方法，例如不需要附加的水解步骤的LCMS方法。还需要能够实施这些新方法的新色谱设计。令人遗憾的是，LCMS所需的常规仪器是技术上复杂的并且不是非常适合典型的医院临床实验室或医学实验室技术员。这些临床实验室尚未采用LCMS诊断，并且实际上，总体上使用替代性诊断技术，包括自动化免疫分析。可替代地，临床实验室可以把样品发送到中心参考实验室进行分析。
然而，最近，适用于例行临床和医院用途的自动化分析仪最近已在名称为“用于样品制备和分析的自动化系统(Automated System for Sample Preparation andAnalysis)”的国际专利申请(PCT)公开WO 2012/058632A1中有所描述。适配此类自动化分析仪以便进一步包括使用常规水解方法中的一种例行分析滥用药物将需要离线水解，接着将所处理的样品转移到自动化分析仪；或者机载自动化机器人水解。这些修改中的任一种的实现都将需要附加的硬件并且增加了整体系统复杂性。此外，最新研究(Wang等人，“使用葡糖苷酸代谢物的酶促水解，尿液中的处方阿片类药物的不完全恢复(IncompleteRecovery of Prescription Opioids in Urine using Enzymatic Hydrolysis ofGlucuronide Metabolites)”，《分析毒物学杂志》(Journal of Analytical Toxicology)，第30卷，2006年10月，第570-575页)已经作出以下结论：关于尿液样品中的至少阿片类药物，酸水解比酶促水解释放出更大比例的母体药物化合物并且引入了更小的可变性。为了对这些样品实施显然优选的酸水解方法，将需要附加的高昂的安全措施以防止实验室人员暴露于有害试剂。因此，在本领域中存在对可以用于使用自动化临床分析仪进行药物化合物的例行临床测量的快速并且可靠的色谱分离和分析方法的特殊需要，所述快速并且可靠的色谱分离和分析方法例如不需要附加水解步骤的LCMS方法。
发明的披露
为了解决本领域中以上指出的需要，诸位发明人提供了允许去除水解步骤的用于定量生物样品中的药物化合物的方法和设备。根据本传授内容的方法包括在单一LCMS运行中使用两根柱测量代谢物和母体化合物并且然后报告所有相关化合物的总和，以便计算初始母体化合物的浓度并且推导出与通过执行传统水解将产生的相同的值。
因此，在本发明的一个第一方面中，提供一种用于检测和定量样品中的多种分析物的液相色谱设备，其中该设备包括：第一色谱柱，它流体地联接到样品源和第一色谱流动相溶液源；第二色谱柱，它流体地联接到该第一色谱柱；第二流动相溶液源，它流体地联接在该第一和该第二色谱柱之间；以及检测器，它流体地联接到该第二色谱柱，其中该第一色谱柱是可配置的，从而在分析物捕集步骤中接收该第一流动相溶液和该样品并且将该多种分析物的第一部分保留在其中并且使该多种分析物的第二部分穿过其中，其中该第二色谱柱是可配置的，在该分析物捕集步骤中用于接收该多种分析物的该第二部分以及该第一和该第二流动相溶剂并且将该多种分析物的该第二部分保留在其中，并且其中该检测器被安排成用于分别在第一洗脱步骤中和在第二洗脱步骤中接收该多种分析物的该第二和该第一部分。在不同实施例中，制备型色谱柱可以流体地联接在样品源与第一色谱柱之间。该制备柱可以包括尺寸排阻亲和柱。
该设备的不同实施例可以进一步包括：T形接头或梯度阀，它流体地联接在第一和第二色谱柱之间并且流体地联接到第二流动相溶液源，其中该T形接头或梯度阀被配置成使得在第一部分洗脱步骤期间，第二色谱柱接收来自第一色谱柱的多种分析物的第一部分。可替代地，不同实施例可以进一步包括：T形接头，它流体地联接在第一和第二色谱柱之间并且可操作以将第一流动相溶液和样品的流动划分在第一和第二色谱柱之间；第一梯度阀，它流体地联接在T形接头与第一色谱柱之间并且也流体地联接到第二流动相溶液源；以及任选地，第二梯度阀，它流体地联接在T形接头与第二色谱柱之间并且也流体地联接到第二流动相溶液源。再者可替代地，不同实施例可以包括：第一多端口阀，它流体地联接在第二色谱柱与检测器之间并且可操作以在第一配置中，在第一部分洗脱步骤期间将多种分析物的第一部分转移到检测器；并且在第二配置中，在第二部分洗脱步骤期间将多种分析物的第二部分转移到检测器；以及在第三配置中，将第一或第二流动相溶液中的任一个转移到废弃物容器。在这些情况下，第二多端口阀可以流体地联接在第一和第二色谱柱之间，其中该第二多端口阀是可操作的，从而在第一配置中，在分析物捕集步骤期间将多种分析物的第二部分从第一色谱柱转移到第二色谱柱；并且在第二配置中，在第一部分洗脱步骤期间将多种分析物的第一部分从第一色谱柱转移到第一多端口阀。再者可替代地，不同实施例可以包括：T形接头或梯度阀，它流体地联接在第一和第二色谱柱之间并且流体地联接到第二流动相溶液源；第一多端口阀，它流体地联接在第二色谱柱与检测器之间并且可操作以在第一配置中，在第一部分洗脱步骤期间将多种分析物的第一部分转移到检测器并且在第二配置中，在第二部分洗脱步骤期间将多种分析物的第二部分转移到检测器，以及在第三配置中，将第一或第二流动相溶液中的任一个转移到废弃物容器；以及选择阀，它流体地联接在第一色谱柱与T形接头或梯度阀之间并且可操作以在第一配置中，在分析物捕集步骤期间将多种分析物的第二部分从第一色谱柱转移到第二色谱柱并且在第二配置中，在第一部分洗脱步骤期间将多种分析物的第一部分从第一色谱柱转移到第一多端口阀。
在本发明的一个第二方面中，提供了一种用于分析和定量包含多种药物母体化合物和这些药物母体化合物的多种代谢物的临床样品中的一组药物的方法，其中该方法包括：(a)分别在第一色谱柱上和在第二色谱柱上捕集药物母体化合物和代谢物的第一和第二部分；(b)从第一和第二色谱柱分别地洗脱药物母体化合物和其代谢物的第一和第二部分；(c)用检测器检测从第一和第二色谱柱中的每一个洗脱的药物母体化合物和代谢物中的每一个的浓度；以及(d)从每种对应的药物母体化合物的所检测到的浓度连同所有其对应的分析物的所检测到的浓度一起计算样品中的每种药物的总浓度。在一些实施例中，临床样品可以在步骤(a)之前穿过制备柱。在不同实施例中，第一和第二色谱柱以及第一和第二流动相溶液被配置成使得多种分析物的第一部分包括第一疏水性范围并且多种分析物的第二部分包括第二疏水性范围。优选地，第一和第二疏水性范围是不重叠的。在一些实施例中，药物母体化合物和代谢物的第一部分仅包含药物母体化合物并且第二部分仅包含代谢物。
在该方法的不同实施例中，步骤(a)可以包括：(a1)将临床样品与第一流动相溶液混合；和(a2)划分样品与第一流动相溶液的混合物，使得所述混合物的第一部分传递到第一色谱柱中，使得药物母体化合物和代谢物的第一部分被保留在其中；并且使得所述混合物的第二部分传递到第二色谱柱中，使得药物母体化合物和代谢物的第二部分被保留在其中。在这些情况下，步骤(a)可以进一步包括：(a3)将第二流动相溶液混合到样品与第一流动相溶液的混合物的第一和第二部分中的至少一个中。在不同实施例中，步骤(b)可以包括以下步骤：(b1)划分第一洗脱流动相溶液，使得第一洗脱流动相溶液的第一和第二部分分别传递到第一和第二色谱柱中。在这些情况下，步骤(b)可以进一步包括以下附加步骤：(b2)将第二洗脱流动相溶液混合到第一洗脱流动相溶液的第一和第二部分中的至少一个中。
在该方法的不同替代实施例中，步骤(a)可以包括：(a1)将临床样品与第一流动相溶液混合；(a2)使样品与第一流动相溶液的混合物传递到第一色谱柱中，使得药物母体化合物和代谢物的第一部分被保留在其中并且使得药物母体化合物和代谢物的第二部分和第一流动相溶液穿过其中；(a3)在它们穿过第一色谱柱之后，将第二流动相溶液与第一流动相溶液以及药物母体化合物和代谢物的第二部分混合；以及(a4)使所混合的第一和第二流动相溶液以及药物母体化合物和代谢物的第二部分传递到第二色谱柱中，使得药物母体化合物和代谢物的第二部分被保留在其中。然后，步骤(b)可以包括：(b1)使第一洗脱流动相溶液穿过第一色谱柱，使得药物母体化合物和代谢物的第一部分从第一色谱柱洗脱并且从那里传递到检测器，而不穿过第二色谱柱；和(b2)使第二洗脱流动相溶液穿过第二色谱柱，使得药物母体化合物和代谢物的第二部分从第二色谱柱洗脱并且从那里传递到检测器，而不穿过第一色谱柱。可替代地，步骤(b)可以包括：(b1)使洗脱流动相溶液穿过第二色谱柱，使得药物母体化合物和代谢物的第二部分从第二色谱柱洗脱并且从那里传递到检测器；和(b2)使另一个洗脱流动相溶液穿过第一和第二色谱柱两者，使得药物母体化合物和代谢物的第一部分从第一色谱柱洗脱并且促使穿过第二色谱柱，而不保留在其中，到达检测器。
在本发明的另一个方面，提供一种自动化样品制备和分析系统，包括：(a)自动化样品制备站，用于根据多种化验制备多种样品，这些化验选自包括多种独特化验的数据库；(b)样品分析站，用于自动地执行多种化验；以及(c)传送机构，用于将所制备的样品从样品制备站传送到样品分析站，其中该样品分析站包括：(i)第一色谱流动相溶液源；(ii)第二色谱流动相溶液源；(iii)第一色谱柱，它流体地联接到第一色谱流动相溶液源并且被配置成用于从样品传送机构接收所制备的样品的一部分；(iv)第二色谱柱，它流体地联接到第一色谱柱和第二色谱流动相溶液源；以及(v)检测器，它流体地联接到第二色谱柱，其中第一色谱柱和第二色谱柱是可操作的，从而在捕集步骤期间分别捕集一组药物化合物和其代谢物的第一部分和第二部分，并且将药物化合物和其代谢物的第一和第二部分分别洗脱到检测器中。
附图简要说明
从下面仅以举例方式并且参照未按比例绘制的附图所给出的说明中，本发明的以上指出的和各种其他方面将变得清楚，在附图中：
图1A-1D是根据本传授内容的一个第一色谱系统的图，展示了采样和分析物捕集以及洗脱步骤；
图1E-1G是根据本传授内容的一个第二色谱系统的图，展示了分析物捕集和洗脱步骤；
图2是一个多端口阀的一个示意性描绘，它可以用于图1E-1G中所描绘的色谱系统中。
图3A-3D是根据本传授内容的一个第三色谱系统的图，展示了采样和分析物捕集以及洗脱步骤；
图4是根据本传授内容的一个第四色谱系统的图；
图5A是根据本传授内容根据一些实施例的一个自动化样品制备和分析系统的透视图；
图5B是根据本传授内容根据不同其他实施例的另一个自动化样品制备和分析系统的透视图；
图6是自动化样品制备和分析系统的组件的整体简图；
图7A是图5A的自动化样品制备和分析系统的俯视图；
图7B是图5B的自动化样品制备和分析系统的俯视图；
图7C是图5A的自动化样品制备和分析系统的组件的透视图；
图8是图5A的自动化样品制备和分析系统的一个样品制备站和一个传送组合件的示意图；
图9A是第一系统的示意图，该第一系统包括根据本传授内容的一个实施例的自动化样品制备和分析系统的一个样品制备站和一个样品分析站；
图9B是第二系统的示意图，该第二系统包括根据本传授内容的另一个实施例的自动化样品制备和分析系统的一个样品制备站和一个样品分析站；
图10是用于操作根据本传授内容的色谱系统的通用方法的流程图；
图11是一个模块化筒柱配置的示意图，该模块化筒柱配置可以用于插入和去除根据本传授内容匹配的分析柱对；以及
图12是尿液样品中的不同分析物的一组色谱图，如使用图1中所展示的系统所观察到。
实施本发明的模式
本发明提供用于分析生物样品中的药物化合物的方法和设备并且在特定的专利申请和其要求的情况下提供本发明。对于本领域技术人员来说，对所描述的实施例的各种修改将是显而易见的，并且在此的一般原则可以应用到其他实施例。因此，本发明并不打算局限于所展示的实施例和实例。参照附图1-12结合以下讨论，本发明的具体特征和优点将变得更加清楚。
图1A-1D描绘了一个色谱系统，它总体上示出在1a，和一种根据本传授内容的一个方面用于采用该系统的方法。样品总体上将包含生物学地来源的体液在溶剂中的混合物。为了这个讨论，假定该样品包含至少两种分析物化合物：一种第一分析物化合物，包括药物分子；和至少一种其他化合物，包括药物分子的代谢物(例如I相或II相代谢物)。该样品可以包含附加分析物化合物，例如药物分子的附加代谢物以及可能存在的附加药物分子和其对应的I相和II相代谢物。
如图1A-1D中所示，示例性色谱系统1a包括一个多端口阀15，例如色谱系统中常用类型的6端口阀。这些6端口阀可以按两个不同配置中的任一个采用：一个第一配置，其中第一、第三和第五端口分别流体地联接到第二、第四和第六端口；和一个第二配置，其中第一、第三和第五端口分别流体地联接到第六、第二和第四端口。如所显示的，阀15的第一端口借助于流体管线2a流体地联接到样品源11中所含有的样品。该样品可以在第一流体泵13a的推动下传递到阀15中。该阀的另一个端口(在此实例中，第四端口)流体地联接到至少两个流动相溶剂或溶液源，在此实例中，它们是两种溶剂或溶液，表示为溶剂源4a中的“流动相A”(MPA)和溶剂源4b中的“流动相B”(MPB)。这些溶剂或溶液可以分别地或以任何混合比例穿过流体管线2b传递到阀端口中，精确比例受第一梯度阀8a控制。
多端口阀15的两个端口分别流体地联接到环形流体管线2c的两端，该环形流体管线可以用于在样品与流动相溶剂或溶液中的一个或多个混合之前暂时储存一部分样品。多端口阀15的另一个端口借助于流体管线2d流体地联接到废弃物容器17并且该阀的最后端口(在此实例中，第三端口)流体地联接到出口流体管线2e。应该指出，如在此所用的术语“流体管道”、“流体管线”、“流体管道段”以及类似术语并不打算必须将实施例在严格意义上限制在管道部分的使用，而是意指包括其他替代性形式的流体转移管线或通路，例如在板中的通道或凹槽或在固体组件中的钻孔。
系统1a的出口流体管线2e(图1A-1D)将样品部分(先前储存在环形流体管线2c中)连同流动相溶剂或混合溶剂的溶液一起传递到色谱分离柱(分析柱)18a和18b中。可以在分析柱18a和18b的上游任选地包括一个附加制备柱或“净化”柱7，例如固相萃取(SPE)或TurboflowTM柱，以便在将样品递送到两个分析柱中之前从样品混合物中去除干扰性或不需要的化合物。举例来说，可以采用制备柱7，以便从样品中去除某些类别的非分析物化合物。如果使用制备柱，那么可以在制备柱7与第一分析柱18a之间包括附加流体管道段2h。任选的制备柱或“净化”柱7示出在图1的虚线和其他图式中，从而表明，在许多实验情况下，它可能是不需要的。举例来说，对尿液基质中的许多药物样品进行分析，在这些情况下，柱7总体上是不需要的。然而，如果对血浆或全血样品执行这些化验，那么会需要柱7。
选择第一分析柱18a的特性使得当促使与特定流动相组合物(如通过特定MPA和MPB组合物并且通过它们之间的混合(如果存在)的量(如通过梯度阀8a控制)决定)混合的样品穿过第一分析柱时，只有疏水性大于一定水平或小于一定水平的化合物被保留在这根柱内。实际上，这个条件意味着，被保留在这根柱中的药物相关分析物中的大部分将是药物母体化合物或代谢物中的一个或另一个。在这些条件下，未被保留的分析物借助于流体管线2m、选择阀19、流体管线2f、梯度阀8c以及流体管线2p完全穿过第一分析柱，到达第二分析柱18b(参看图1B)。在一些实施例中，梯度阀8c可以用简单的T形接头替换。因此，组件8c可以用于表示梯度阀或可替代地，T形接头。应该指出，在不同的图中，实线用来表示在特定步骤或操作期间流体流动穿过其中的流体管道段，而点虚线用来表示其中流体流对于该步骤或操作的执行来说不是必须的流体管道段(或其他流体转移管线)。(然而，注意流体仍然可以联合可能与所指出的步骤或操作并行发生的其他操作而流动穿过点虚线流体管线。)点划线表示可以任选地从第一来源、从第二来源或同时从两个来源抽取的流体流。不同流体管线的实线点划线表示法叠加有箭头，用于表示不同图中的流动方向。
梯度阀或T形接头8c允许不同的或附加的流动相组合物递送到第二分析柱18b中。在所说明的实例中，该不同的或附加的流动相组合物可以包含分别在溶剂源4c和4d中提供的组合物MPA和MPB中的一种或其混合物。可替代地，在溶剂源4c和4d中提供的流动相组合物可以不同于在溶剂源4a和4b中提供的那些。可以提供一个梯度阀8b以便在溶剂源4c和4d中所提供的流动相组合物之间进行选择和/或混合这些流动相组合物，并且提供一个流体泵13c用于将不同的或附加的流动相组合物通过流体管道段2g递送到梯度阀(或T形接头)8c中。
通过检测器9检测从或者第一分析柱18a或者第二分析柱18b洗脱的分析物化合物，该检测器可以包括质谱仪。选择阀19使得当从第一分析柱18a洗脱的分析物化合物被转移到检测器中时，这些洗脱下来的分析物化合物的流动能够绕过第二分析柱18b。因此，旁通阀19在至少两个不同的流体布线配置之间是可选的，如在图1B与图1D之间通过对比所说明。在一个第一配置(例如，图1B)中，旁通阀19使得样品的流动能够依次穿过两个分析柱18a，18b，使得第一组分析物可以被保留在第一分析柱18a上并且来自同一个样品的第二组分析物可以被保留在第二分析柱18b上。然而，在一个第二配置(例如，图1D)中，旁通阀19引起从第一分析柱18a洗脱的分析物的流动被转向流体管线2k，由此绕过第二分析柱18b。来自两个分析柱中的每一个的输出均穿过多端口阀133和流体管线2j，被引导到检测器9。
如上文所指出，在色谱系统1a的操作下，只有未被保留在第一分析柱18a中的那些药物分析物(其大部分将是或者药物母体化合物或者药物代谢物)穿过到达第二分析柱18b。因此，选择第二分析柱18b的特性，使得在捕集步骤(图1B)期间，在穿过流体管线2f、流体管线2g中的任一个提供的流动相组合物或作为穿过两个流体管线2f和2g提供的流动相组合物的混合物的流动下，被传递到这第二分析柱中的那些分析物被保留在该分析柱上。色谱系统1a的操作除了分析物捕集步骤以外，还必须包括洗脱步骤(图1C、1D)。在从柱洗脱分析物期间采用的流动相组合物可以不同于在将分析物捕集到该柱上期间所采用的流动相组合物。
用于操作系统1a的通用方法中的基本步骤提供在图10中所展示的方法300中。在第一步步骤301中，将样品材料从一个外部容器转移到色谱系统中。在步骤302中，将至少一部分样品加载到分析柱18a，18b上，使得属于第一类型或类别(例如，或者母体药物化合物或者药物代谢物化合物)或具有特定特性或特征(例如，疏水性特性)的第一状态或条件(例如，或者高于或者低于一个阈值或水平的条件)的分析物被保留在这些柱(18a和18b)中的第一根上并且使得属于第二类型或类别或具有特定特性或特征的不同状态或条件的分析物被保留在这两根柱中的另一根(第二根)上。这个步骤可以利用两种类型或类别的分析物之间在疏水性程度方面的差异。
一般来说，任何特定分析物在两种不可混溶的溶剂(例如，一种水性溶剂和一种富含有机物的溶剂)之间平衡时将具有一个浓度分配比，它被称作分配系数。换一种方式来说，分配系数是所希望的分析物的亲水性(“亲水”)或疏水性(“憎水”)的一种度量。通常，分配系数以分配系数的对数形式报告，简称为“logP”。将容易地意识到，因为logP在本质上是对数，所以每个单位表示10倍的疏水性差异。因此，具有类似logP值的两种分析物可能具有类似的疏水性(即，化学性质)并且可以容易地通过相同的流动相和固定相分离；具有不同logP值的两种分析物往往会在同一个LC系统上产生大大不同的保留特征，并且可能需要非常不同的流动相和/或固定相来实现所希望的色谱分离。其结果是，根据类似logP值将分析物常规地组合到一起并且使用相同的流动相和质谱仪设置按分批模式运行。
虽然药物母体化合物和其代谢物两者均被认为是亲水性的，但是代谢物总体上比母体化合物甚至更具亲水性(也就是说，疏水性更小)。在步骤304中，或者第一或者第二类型或类别的分析物分别从两根柱中的第一根或第二根洗脱，由此引起第一(第二)类型或类别的不同分析物根据其对应的保留时间得到分离。在这个步骤期间，由此分离的分析物被传递到检测器(例如质谱仪)中进行定量，同时穿过这些柱中的另一个的流动停止。接着，在步骤306中，另一种类型或类别的分析物从这两根柱中的另一根洗脱，由此引起从那另一根柱洗脱的不同分析物根据其对应的保留时间得到分离。从另一根柱洗脱的这些分析物也被传递到检测器中。在一些系统实施例(例如图3中所展示的系统3)中，该系统可以包括一个物理配置，其中当这些第二洗脱分析物被转移到检测器中进行定量时，在这个步骤期间，它们穿过一根不同的分析柱(没有被保留在那根不同的柱中)。在这些实施例(例如，图3)中，这些第二洗脱分析物没有在这个步骤期间被保留在该不同的分析柱内，因为在这个步骤期间，该柱固定相和流动相经选择以使得这些分析物对流动相具有强烈优先的亲和力。最后，在步骤308中，通过对所定量的母体化合物连同所有其代谢物的定量浓度一起进行求和，计算出样品中任何特定药物的总浓度。
图1A-1D以图形方式描绘了在方法300的一个示例性实施例的实施期间的不同步骤。仅为了这个特定实例，假定只有母体化合物(例如，残留的未代谢药物)被保留在柱18a上并且只有代谢物化合物被保留在柱18b上。柱18a可以包括可购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham Massachusetts USA)的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)的AccucoreTM C18柱，并且柱18b可以包括可购自美国加利福尼亚托兰斯(Torrance,California USA)的菲罗门公司(Phenomenex,Inc.)的SynergiTM极性RP柱。具体来说，AccucoreTM柱的固定相使用具有2.6μm实心材料并且具有非常紧密的粒度分布的颗粒。这些颗粒可以被描述为被一个多孔性外层包围的实心二氧化硅。这种材料的非常紧密的粒度分布产生了具有高渗透性的柱，并且因此，关于相同的标称压力，获得的色谱分离比利用完全多孔性材料的那些更好。相比于在完全多孔性颗粒中的那些扩散路径，实心并且轮廓分明的多孔性外层提供了进入固定相的更短的扩散路径，由此减少了谱带增宽并且提高了分离效率。SynergiTM极性RP柱的固定相的底物的表面处理包括一个极性封端、醚连接的苯基相，它提供了极性和芳香族反相选择性。使用这些柱，“流动相A”(MPA)和“流动相B”的合适选择分别是10毫摩尔(10mol/m3)甲酸铵和0.05％甲酸于水中的溶液和10毫摩尔(10mol/m3)甲酸铵和0.05％甲酸于甲醇中的溶液。
如图1A中所示，在第一步中，从样品源11穿过流体管线2a提供携带分析物的样品。该样品在泵13a的推动下穿过管道2a被传递到多端口阀15的一个端口中。多端口阀15被配置成用于在这个步骤期间将包含有待分析的样品部分的混合物递送到环形管道2c中。任何过量的溶剂或样品穿过管道2d被传递到废弃物容器17中，该管道流体地联接到多端口阀的另一个端口。
在收集了一部分包含有待分析的样品部分的混合物之后，如图1B中所示重新配置阀15以便将样品材料从管道2c排出并且用于使样品穿过流体管线2e和2m、选择阀19、流体管线2f以及梯度阀或T形接头8c，转移到该对分析色谱柱18a和18b中。该样品还可以在进入第一分析柱之前穿过一根任选的净化或制备柱7以及流体管线2h。在这种“捕集”配置中，促使由溶剂源4a提供的水性流动相溶剂(MPA)(可能与一定比例的来自溶剂源4b的溶剂MPB混合)在泵13b的推动下，流动穿过梯度阀8a和管道2b，以便进入多端口阀15的一个端口并且由此与先前收集在管道2c中的混合物部分混合并且将其排出。所排出的样品和溶剂的混合物穿过管道段2e(和任选地，柱7和管道段2h)，到达色谱柱18a。
在捕集阶段或步骤(图1B)期间，对流动相溶剂加以选择，使得包含药物母体化合物的一种或多种分析物被优先分配到柱18a的固定相上。流动相和包含一种或多种药物代谢物的其余一种或多种分析物穿过柱18a，而不是被保留在柱上。这第二类别的分析物的一种或多种分析物穿过选择阀19和流体管道段2f，到达梯度阀或T形接头8c。此时，从溶剂源4c递送的第二水性流动相MPA可以在流体泵13c的推动下穿过梯度阀8b和管道段2g，以便在梯度阀或T形接头8c混合到样品和第一流动相混合物中。不同流动相组合物相这样混合到样品材料中可以增加亲水性药物代谢物化合物优先分配到柱18b的固定相上，从而保留在柱上。在这个捕集步骤期间，先前驻留在色谱柱、流体管线或其他系统组件中的任何流体离开第二柱并且传递到阀133中，该阀在这个步骤中被配置成以便将这些先前驻留流体转移到废弃物容器17中。
图1C展示了从柱18b洗脱药物代谢物化合物，例如在方法300(图10)的步骤304中所概述。在这个步骤中，来自溶剂源4a和4b的流动相溶剂的流动停止(可能是通过停止泵13b或调整或者选择阀19或者梯度阀8c的配置)，以便仅传递从管道段2g提供的流动。此外，在这个步骤期间，转换到达柱18b的流动相的流动或使其倾斜以便包含至少一定百分比的由溶剂源4d提供的有机MPB溶剂，这可能是通过将梯度阀8b配置成使得泵13c只从溶剂源4d或可能同时从两个溶剂源4c，4d抽取溶剂。对这个流动相中的水性溶剂与有机溶剂的受控相对比例加以选择，以便引起被保留的代谢物化合物分配到流动相中并且从柱18b洗脱这些化合物，以便这些化合物穿过阀133和管道段2j传递到检测器9中。
图1D展示了药物母体化合物从柱18a的后续洗脱(参看图10中的方法300的步骤306)。在这个步骤期间，来自来源4c和4d的流动相的流动停止并且选择阀19被配置成以便引导从第一分析柱18a洗脱的分析物的流动绕过流体管线2k。对流动相溶剂加以选择以便包含至少一定百分比的有机MPB溶剂，这可能是通过将梯度阀8a配置成使得泵13b只从溶剂源4b或可能同时从两个溶剂源4a，4b抽取溶剂。这个流动相流动穿过流体管线2b、多端口阀15以及流体管线2e，以便最后进入柱18a。对这个流动相中的水性溶剂与有机溶剂的受控相对比例加以选择，以便引起被保留的母体药物化合物分配到流动相中并且从柱18a洗脱这些化合物。将所洗脱的母体药物分析物通过选择阀19引导到流体管线2k中，到达多端口阀133，该多端口阀被配置成用于随后使携带这些分析物的流动相穿过流体管道段2j，传递到检测器9中。
色谱系统1a(图1A-1D)的操作的上述实例假定，母体化合物(例如，残留的未代谢药物)被保留在柱18a上并且代谢物化合物被保留在柱18b上。然而，系统1a可以从相反的意义上加以配置，使得母体化合物被保留在第二分析柱18b上并且代谢物化合物被保留在第一分析柱18a上。仅出于说明的目的，假定在以下实例中，所有这些母体化合物都被保留在柱18b上并且所有这些代谢物化合物都被保留在柱18a上。为了按后面这种方式操作该系统，柱18a可以按亲水性相互相用液相色谱(HILIC)柱形式提供并且柱18b可以按反相柱形式提供，例如上文所述的AccucoreTM C18柱或另一种C18柱。为了结合这种柱选择解释图1A-1D中的图，MPA和MPB溶剂的身份应该与上文所述的相反，也就是说，使MPA溶剂包括有机溶剂并且使MPA溶剂包括水性溶剂。
继续假定，柱18a包括HILIC柱，柱18b包括反相柱并且从溶剂源4a提供的MPA包括富含有机物的溶剂，那么参照图1B，亲水性极强的药物代谢物分析物将与HILIC柱18a的极性固定相缔合并且被保留在这根柱上。同时，药物母体化合物将流动到梯度阀8c中，在该点，从溶剂源4d提供的水性流动相(MPB)将与这些分析物混合。这种混合降低了流动相的百分比有机物含量，由此允许亲水性略微更小的母体药物分析物被保留在柱18b中。在这个捕集步骤之后，通过停止来自流体管线2f的流动并且促使从溶剂源4c提供的有机溶剂MPA流动穿过管道2g，达到梯度阀8c并且随后穿过流体管线2p到达柱18b，来进行母体化合物从柱18b的洗脱(图1C)。在这个阶段，有机溶剂MPA可以与来自溶剂源4d的水性溶剂MPB混合。随后通过停止来自流体管线2g的流动并且促使从溶剂源4b提供的水性溶剂MPB穿过柱18a来进行药物代谢物分析物的洗脱(图1D)。高度亲水性代谢物化合物随后将分配到这个水性流动相中，促成洗脱。随着这些代谢物化合物穿过流体管线2k和多端口阀133，它们随后将保持在水性流动相中并且将流动到检测器9上进行定量。
图1E-1G是根据本传授内容的第二色谱系统(色谱系统1b)的分析物捕集和洗脱步骤的图。系统1b(图1E-1G)是通过用单一多端口阀21替换包括选择阀19和梯度阀(或T形接头)8c的两个组件从系统1a(图1A-1D)修改得到的。图2是一个多端口阀的一个示意性放大图，该多端口阀可以用于色谱系统1b(图1E-1G)中。如所展示的，多端口阀21包括一个内部转子部件25，它在一个或多个承载表面上抵靠着外部定子部件27旋转。定子部件包括若干个流体端口，在所展示的实例中是六个端口，这些端口可用于流体连接到不同流体管线。在图2中，这些流体端口表示为端口p1-p6。关于结合色谱系统1b(图1E-1G)使用，希望堵塞这些端口中的两个，如可以简单地借助于将简单的端盖连接到这些端口来实现。因此，图2中的端口p1和p6用交叉影线示出为被堵塞。
多端口阀21的定子部件包括至少两个内部流体通道，它们在图2中表示为通道c1和c2。通过转子部件25抵靠着承载表面围绕阀21的中心轴根据箭头旋转，可以使内部流体通道与不同的端口p1-p6流体联接。内部通道c1被配置成使得该组六个端口中多达三个连续端口可以达到彼此流体联接。另一个内部通道c2被配置成使得仅两个相邻端口可以达到彼此联接。如果通道c1的端部中的一个旋转到与被堵塞的端口中的一个(p1或p6)对准，那么它可以用于有效地流体地联接仅两个相邻端口。
图1E-1G展示了代谢物和母体化合物在色谱系统1b内的捕集阶段和洗脱阶段的操作。图1E、1F和1G可以分别与图1B、1C和1D进行对比。色谱系统1b的采样阶段的操作未展示，因为它基本上与色谱系统1a内的类似阶段相同。
在捕集阶段(图1E)期间，多端口阀21被配置成使得流动穿过流体管线2f的样品与流动相的混合物在已经穿过第一分析柱18a之后，与从流体管线2g提供的具有不同组成的一个附加的流动相(或多个)混合。在这个阶段期间，多端口阀21被配置成使得从流体管线2f和2g提供的分开的流动被输入到内部通道c1的相对端部中，使得这些流动在通道c1内内部地混合并且随后输出到流体管线2p中。因此，阀21的这种配置复制了在色谱系统1a内的分析物捕集(图1B)期间选择阀19和T形接头8c的功能。
在洗脱代谢物分析物化合物的阶段期间(图1F)，多端口阀21被配置成使得从流体管线2g提供的流动相组合物被引导到流体管线2p并且随后到达第二分析柱18b。如通过流体管线2g提供并且如通过阀21引导的恰当流动相流动穿过第二分析柱18b，引起代谢物化合物从柱18b洗脱。这些被洗脱的代谢物化合物随后穿过阀133，到达检测器9。阀21的这种配置由此复制了图1C中所展示的操作，其中选择阀19处于关闭位置，由此仅允许从流体管线2g流动到梯度阀或T形接头8c中。
在洗脱母体分析物化合物的阶段期间(图1G)，多端口阀21被配置成使得携带从第一分析柱18a洗脱的化合物的流动相被引导到流体管线2k，从该流体管线它继续穿过阀133到达检测器9。因此，在这个阶段期间阀21的配置复制了图1D中所展示的操作，其中选择阀19被配置成以便将携带所洗脱的母体分析物化合物的流动相引导到流体管线2k中。
图3A-3D是根据本传授内容的第三色谱系统(系统3)的图。图3A-3D中所展示的系统3在很大程度上类似于图1A-1D中所示出的系统1a。然而，系统3是系统1a的一个简化版本，并且与它的不同之处在于系统3缺乏选择阀19和旁通流体管线2k。其结果是，尽管系统3的采样、捕集和代谢物洗脱阶段(图3A-3C)操作起来基本上类似于系统1a的对应的已经讨论的阶段(图1A-1C)，但是母体化合物洗脱阶段(图3D)要求从第一分析柱18a洗脱的化合物在它们到达检测器9的通路上穿过第二分析柱18b。这个步骤可以恰当地操作，其条件是在这个步骤期间，母体分析物化合物不被保留在第二分析柱18b内。这个母体洗脱步骤(图3D)的恰当操作因此要求在这个步骤期间采用的流动相组合物经选择以使得相对于第二分析柱18b内的固定相，这些母体化合物对该流动相具有强烈优先的亲和力。
图4是根据本传授内容的一个第四色谱系统的图。图4中所展示的系统39包括图1中所展示的系统1a的相同组件中的多个，这些类似组件的编号类似于它们在先前所述的图1中的编号。然而，在系统39中，两个分析柱18a，18b被配置成一种并行配置，与它们在系统1a内的连续联接截然相反。该流体联接使得在两根分析柱上捕集分析物的步骤期间，流体流动被划分到这两根柱之间。该流体流动可以通过如图4中所示的常见T形接头31在流体管道段2m和2n之间划分，或者可替代地，可以通过一个阀划分。
在捕集步骤期间，T形接头或阀31划分样品和溶剂的流动，使得样品和溶剂的一部分被递送到第一分析柱18a中并且一个第二部分被递送到第二分析柱18b中。在不同实施例中，这个流体流动可以在这两根分析柱之间实质上或大致地相等地划分。类似地，在或者捕集或者洗脱步骤期间，来自溶剂源4c和4d的单独的溶剂MPA和MPB或这些溶剂的混合物的流体流动可以借助于阀8d，8e和8f被引导到这些分析柱中的一个或另一个中，这些阀通过流体管道段2p和2q流体地联接。举例来说，在这些柱上捕集分析物期间，可以借助于阀8e和8f中的一个或另一个使从溶剂源4c和4d递送的流动相溶剂或溶剂混合物与从溶剂源4a和4b递送的流动相溶剂混合物混合，使得进入分析柱18a的流动相组合物不同于进入分析柱18b的流动相组合物。如先前所描述，流动相组合物的这种差异结合不同的柱特性一起将使得亲水性更大的分析物被保留在这些柱中的一根上，而亲水性更小的分析物被保留在这些柱中的另一根上。在系统39(图4)中，通过流体管线2f和流体管线2j将来自第一分析柱18a和第二分析柱18b的流出物引导(非同时地)到阀或T形接头8g中，在这之后，引导这两个流出物沿着一条共同路径穿过阀133，到达检测器9。还可能从两个柱同时洗脱，其条件是及时在质谱仪上共洗脱的化合物都不具有类似质量，例如同量异位素。在这种情况下，可以使用质谱仪来分离具有不同分子量的共洗脱化合物。
现在关于在一个自动化样品制备和分析系统内的实施方式来讨论药物化合物的临床分析，这些药物化合物包括药类化合物以及其他滥用的天然和合成药物。这类系统最近已经在上述国际专利申请(PCT)公开WO2012/058632A1中有所描述，并且这类系统的不同特征展示在附图5-9中。举例来说，图5A是自动化样品制备和分析系统10(在下文中称为“系统”10)的一个示例性实施例的透视图示。系统10被设计成用于从用于分析的样本自动地制备一个样品并且用于根据选自各种不同的或独特的分析物化验的一种预定分析物化验来分析所制备的样品。如下文将更详细地描述，例示性系统10被特别地设计成用于在一个自动化系统中组合表现两种截然不同的实验室功能，即，样品制备和样品分析。图5B类似于图5A，是自动化样品制备和分析系统10'的透视图示并且其中带撇号的类似数字是指类似特征。
在一个实施例中，系统10包括一个用于制备不同样品的样品制备系统12和一个用于根据所选择的分析物化验来分析所制备的样品的样品分析系统14，它包括合适的分析仪，例如液相色谱-质谱仪(“LCMS”)。样品制备系统12和样品分析系统14以如将在下文中详细描述的一种自动化方式互连，并且实际上可以被封装在一体式罩盖16内。
图6是系统10的不同组件的图形展示。样品制备系统12包括一个样品制备站20和一个样品制备控制器22，该样品制备控制器控制样品制备站20的所选择的功能或操作。样品制备站20被配置成用于接收一个或多个样本23，对样本23采样以制备用于根据各种预先选择的分析物化验进行分析的样品，以及将用于分析的所制备的样品传送到样品分析系统14中。在一些实施例中，样品制备站20被配置成用于制备样品，使得所制备的样品与根据将要由样品分析站14执行的所选分析物化验的样品分析系统14化学地相容。
进一步参看图6，在一个实施例中，样品分析系统14包括一个样品分析站24和一个样品分析控制器26，该样品分析控制器控制样品分析站24的所选择的功能或操作。样品分析站24被配置成用于通过下文更详细地描述的传送机构从样品制备站20接收所制备的样品。样品分析站24随后根据所选择的分析物化验来分析所制备的样品，从而获得关于所述样品的结果。样品结果被传输到样品制备控制器22，它可以验证结果。如果结果是有效的，那么该结果可以通过至少一个网络30被传输到一个实验室信息系统28(展示为并且在下文中称为“LIS”28)。
将容易地意识到，虽然图6似乎显示，样品制备站20和样品分析站24包括系统10的两个相对的侧面，但是这些系统可以涵盖相同的区域或覆盖区。实际上，根据本发明，在一些实施例中，样品制备站20和样品分析站24不需要被涵盖在同一个壳体或单元内。
现转而参看图7A-7B，示出了与图5A和5B的系统10，10'相关的样品制备站20和样品分析站24的布局的两个实施例的细节并且在下文中简要地加以描述。应了解，为了方便讨论，在此包括了带有撇号的类似参考数字来指代类似特征，但是不必明确地提供每一个。样品制备站20包括具有一个或多个样本架42的样本装卸台40。每个样本架42包括能够固定样本容器45的一个或多个样本架位置(参看图7A)。样本容器45被配置成用于包含所获得的生物或环境样本，这些样本可以是含有或疑似含有相关分析物的任何样本。患者样本可以包括例如血液、血清、血浆、尿液、粪便、痰液、支气管灌洗液、鼻咽灌洗液、汗液、泪液、实体组织的提取物、拭子(来自所有身体部位，包括皮肤)、脑脊髓液或唾液。环境样品可以包括例如食物、水或环境表面样品。可以分析这些患者样本或环境样品中的一种或多种分析物，这些分析物可以包括(但不限于)药物、前药、药物代谢物、具有正常生物化学活性的代谢物、肽、蛋白质、抗生素、抗生素代谢物、毒素、微生物(包括细菌、真菌和寄生虫)以及传染剂(包括病毒和朊病毒)。此外，单独或组合的任何上述样品可能会悬浮于适当的介质内，例如可能会悬浮于血培养或筛选隔室内。样本容器45本身可以包括任何合适的实验室器皿，例如器皿、小瓶、试管、板或本领域中已知的任何其他合适容器。样本架42中的一个或多个可以被标明或以其他方式标记(例如，通过将架42放置于样品制备站20内，或具有条形码或RFID天线)作为优先架42a或STAT，以便引入具有紧急样本的样本容器45。可替代地，紧急样本可以引入到样本架42中并且通过按压仪器上的优先按钮(未示出)或通过使用触摸屏显示器313设定样品优先级被鉴别为优先或STAT样品(参看图5A)。紧急样本可以包括例如急诊部患者样本或含有毒药或免疫抑制剂的患者样本。
样品制备站20进一步包括含有多个试剂架48的试剂站46。每个试剂架48包括能够固定一个或多个试剂容器52的一个或多个试剂架位置，这些试剂容器含有溶剂和/或试剂，其中一些可以包含挥发性液体。尽管不是必需的，但是样品装卸台40的样本架42和试剂站46的试剂架48的示意性实施例具有类似构造。在其他实施例中，可能有利的是包括具有与样本架42相比不同结构的试剂架48，使得含有生物样本的架42不会被无意地插入到试剂站46中。在又其他实施例中，相比于样本架42，试剂架48可以包括独特的标记，例如条形码或RFID天线。样本装卸台40可以被配置成用于容纳一个在线登记站(未示出)，它用于从离线自动化实验室追踪系统(未示出)接收样本器皿45。
试剂站46可以包括一个冷却站53，它联接到恒温器(未示出)和冷却器(未示出)，用于将试剂站46的温度维持在一个恒定的经冷却的温度下，例如介于约4℃与约10℃之间。这可以帮助减少试剂通过蒸发损失并且由此延长了其中所包含的试剂的寿命和活性。
回到图7A-7B，不同的试剂可以驻留在试剂站46内，包括能够由系统10执行的多种化验类型所需的所有试剂。举例来说，这些试剂可以包括蛋白质沉淀试剂(例如，乙腈、甲醇或高氯酸)；细胞溶解试剂(例如，硫酸锌，一种强酸)；用溶菌酶、纤维素酶、蛋白酶的酶消化；清洁剂，包括(但不限于)非离子型、两性离子型、阴离子型以及阳离子型清洁剂；蛋白质消化试剂(例如，丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸或天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、lys-c、glu-c以及胰化学酶)；内标(例如，稳定的同位素标记的分析物、重同位素标记的肽、非天然肽或分析物、结构地类似的类似物、化学地类似的类似物)；抗生素(用于微生物抗生素易感性测试或“AST”)；蛋白质稳定剂，包括缓冲剂、离液剂或变性剂；校准标准以及对照。根据不同实施例，这些试剂中的一种或多种可以预先混合以形成对一个特定化验或一组化验具有特异性的组合试剂混合物。
试剂站46可以进一步包括一个信息采集装置54，它可以是例如一个条形码阅读器或一个RFID接收器。信息采集装置54又可以接收与特定试剂容器52的试剂相关的信息或与特定试剂容器52本身相关的信息。条形码或RFID天线被印刷或定位在试剂容器52上。条形码或RFID天线可以被配置成用于提供与特定试剂相关的信息或它可以含有与查询表(“LUT”)(未示出)交叉参照的鉴别(例如一个鉴别器)，该查询表通过样品制备控制器22(图6)(例如，在样品制备控制器22上或在LIS 28上并且通过样品制备控制器22可获得)可获得并且具有关于其中所包含的试剂的详细信息。所获得的信息可以用于鉴别和/或监控对应的试剂容器52和/或其中的试剂。举例来说，该信息可以用于鉴别试剂容器52内的试剂，鉴别试剂容器52在试剂站46内的位置，鉴别和/或监控试剂容器52中剩余的试剂的数量，和/或鉴别试剂容器52内的试剂的有效期。虽然没有明确地示出，但是信息采集装置54可以安装到横跨在样本装卸台40与试剂站46之间的追踪系统(未示出)上，并且借助于一个或多个电动机(例如，步进式电动机或类似装置)，信息采集装置54可以被转到的用于接收样本架42或试剂架48的样本装卸台40或试剂站46内的一个位置。以此方式，当样本容器45和/或试剂容器52被加载到样品制备站20中时，信息采集装置54可以扫描条形码和/或RFID天线。此外，应了解，虽然只示出了一个信息采集装置54，但是可以在用于追踪样品和相关测试的系统10的其他部分中包括以类似方式或具有替代性结构的附加信息采集装置。
现在描述一种示意性样品制备方法，样本容器45内所包含的患者样品(在下文中称为“样品”)或特定样本的一部分被转移到将要准备进行分析的一个开顶式样品器皿58(也被称作反应器皿，但在下文中称为“器皿”58)中。合适的器皿58可以包括例如开顶式器皿、具有螺旋顶盖的器皿、具有一体式翻转顶盖的器皿以及具有含可刺穿的膈膜的顶部的器皿。器皿58可以储存(图7A-7B)在样品制备站20的储存站(未示出)内，并且从该储存站引入。在储存站内，器皿58可以驻留在板57或其他恰当的大容量储存容器中。因为大量的器皿58被转移并且周期性地留下空板57，所以可以通过废弃物槽55从样品制备站20舍弃板57。当对样本23(图6)进行采样时，一个或多个器皿58借助于传送组合件60(参看图8)从储存站转移到采样站56。传送组合件60可以包括机器人组合件，它在一个或多个轨道50上操作并且被配置成用于在x-y方向、x-y-z方向或旋转方向中的至少一个方向上移动。虽然未示出，但是传送组合件60可以进一步包括一个夹持器或其他类似的装置来捕获和释放器皿58，或包括与器皿架84(图7B)相关的传送手柄63(图7B)，以便在系统10内同时传送两个或更多个器皿58。
在另一个未示出的实施例中，传送组合件60可以包括机器人组合件，它被配置成用于在x-y方向、x-y-z方向或旋转方向中的至少一个方向上移动并且它可以包括一个自动化液体处置器。根据这个实施例，自动化液体处置器可以抽吸一定体积的液体并且将它分配在系统10内的两个或更多个器皿58之间，用于在系统10内在站20，24，40，46以及登记站(未示出)中的两个或更多个之间传送液体。
在又其他实施例中，传送组合件60可以进一步包括圆盘传送带，即圆形旋转盘，或在其中具有多个器皿位置的自动采样器，以便提供传送功能并且允许临时的、中间器皿储存功能。在其他实施例中，传送组合件60可以进一步包括一个信息采集装置(未示出)。这个信息采集装置可以按类似于信息采集装置54的方式操作并且被用于当器皿58在整个样品制备站20中移动时，对它们进行鉴别。
在所说明的实施例中，采样站56包括一个可旋转台44，它使每个器皿58在至少两个位置之间旋转。在一个位置中，可以从传送组合件60接收器皿58。在另一个位置中，器皿58被定位成用于通过样品移液管组合件62(图8)接收样本23(图6)的一部分。可旋转台44可以包括一个器皿顶盖打开和关闭装置64(图7B)，用于在器皿58被转移到第一和第二位置之间时打开和关闭器皿58的铰链盖(未示出)。因此，当器皿58被递送到采样站56的第一位置中时，铰链盖可以在关闭位置中。可旋转台44的旋转将器皿58移动到第二位置，借此与打开和关闭装置啮合，引起铰链盖移动到打开位置。
样品移液管组合件62(图8)可以包括一个移液管轴74，它是可移动的，例如通过一个机器人装置，沿着x-y-z方向中的一个或多个方向以及在样本装卸台40、试剂站46以及采样站56中的两个或更多个之间移动。移液管轴74可以用单一尖端构造进行构造，该尖端在抽吸之间在移液管洗涤站76(图7A)洗涤，或可替代地，该移液管轴可以被适配成用于接收一次性尖端(未示出)，该一次性尖端随后在获取一个新的一次性尖端来抽吸新样品之前喷出。在前一个实施例中，在样品被分配到器皿58中之后，通过恰当的溶剂溶液，例如通过多次抽吸和分配该溶剂，对单个尖端洗涤一次或多次。在后一个实施例中，样品制备站20可以包括一个尖端储存站75(图7A-7B)，用于储存一次性尖端并且从一个或多个一次性尖端架77供应一次性尖端。在样品被分配到器皿58中之后，在这个实施例中，一次性尖端从移液管轴喷出到一次性尖端废弃物槽78中，该一次性尖端废弃物槽联接到一个更大的废弃物储存容器(未示出)。
样品移液管组合件62(图8)可以从样本装卸台40内从样本容器45抽吸样本23(图6)的等分试样并且将样本23(图6)的等分试样分配到采样站56内的器皿58中。另外或可替代地，样品移液管组合件62(图8)可以从试剂站46内的试剂容器52中的一个中抽吸所希望的试剂的等分试样并且将所希望的试剂的等分试样分配到采样站56内的器皿58中，该器皿可以或可以不预先包含样品，即样本23(图6)的等分试样。
在一些实施例中，可能必需在抽吸之前混合样本23(图6)。举例来说，血液样本可以随时间分配，即血细胞(红血球、白血球等)与血浆分离。一些药物不相等地分布在血细胞与血浆之间(例如，红血球中40％-50％，白血球中10％-20％，并且血浆中30％-40％)。这些分布可以取决于温度、血细胞比容以及代谢物浓度。因此，为了恰当地测量特定药物或其他分析物浓度，必须获得全血的恰当采样。混合样本的一种方法可以通过用样品移液管组合件62(图8)抽吸样本23(图6)并且对它进行多次(例如，13次)分配来发生。抽吸次数可以至少取决于样本容器45的体积、抽吸体积以及分配“速度”。在其他实施例中，移液管轴74(图8)可以振荡(在至少一个维度上快速移动)或可以将样品首先引导到与采样站56隔开的混合站(未示出)，以便在采样之前轻轻地混合样本23。
在接收样本23(图6)和/或试剂(为方便起见，它在下文中现将称为“样品”)的等分试样(多个)之后，可以通过一个分开的机器人组件或打开和关闭装置64来关闭器皿58的铰链盖(未示出)。关闭铰链盖防止样品通过蒸发损失。此外，因为分配到器皿58中的液体中的一种或多种可以是挥发性的，所以可以使用密封器皿58来防止一种或多种挥发性液体的蒸发并且保持样品的既定浓度。
通过传送组合件60将器皿58内的样品从采样站56转移到一个二次处理站80(图7A)。二次处理站80包括例如混合站82、温育站(incubation station)(未示出)以及基质干扰去除站(展示为离心机88)中的一个或多个。根据一个实施例，混合站82和基质干扰去除站中的每一个都能够接纳或者器皿58或者器皿架84，使得可以同时处理两个或更多个器皿58。然而，器皿架84的使用是不需要的。
混合站82如果被包括在二次处理站80中，那么可以包括振荡器、涡流混合器或能够加速样品在器皿58内的混合的另一个设备。如所显示的，混合站82可以被配置成用于通过两个器皿架84(图7B)容纳十六个器皿58(图7A)或十二个单独的器皿58。
如果包括温育站，那么温育站还可以按在线或离线配置中的任一种并入。温育站被配置成用于在高温(举例来说，在从约27℃到约70℃范围内的规定温度下，尤其包括37℃、50℃或70℃)下加热含或不含附加试剂的样品持续一段预定的时间并且基于所选择的化验。
如果在二次处理站80内包括基质干扰去除站，那么基质干扰去除站可以按在线或离线配置(例如，在线配置是其中样品通过流体连接而不是被包含在器皿58内而在样品制备站20的一个或多个站之间移动的配置，离线配置是其中样品在器皿58内在样品制备站20的站之间传送的配置)中的任一种并入。在包括在线基质干扰去除站的实施例中，包含分析物的所制备的样品可以例如通过管道直接从基体干扰去除站流动到下一站。这第二个站可以包括例如第二基质干扰去除站(未示出)。在包括离线基质干扰去除站的实施例中，包含分析物的所制备的样品如果不是已经包含在器皿58内的话则从基质干扰去除站收集并且放置到器皿58内。
基质干扰去除站可操作以分离残留蛋白质、磷脂、盐、代谢物、碳水化合物、核酸和/或其他物质中的一种或多种，否则这些物质在将现在所制备的样品转移到样品分析站24之前会干扰所希望的分析物的后续处理或分析。在一些实施例中，基质干扰去除站将污染物从含有分析物的所制备的样品(或更简单地说，“所制备的样品”)中分离出来(例如，通过将沉淀下来的固体从所得上层清液中分离出来，其中该上层清液形成所制备的样品)。基质干扰去除站可以包括例如相分离站(未示出)、离心机(如图7A中的参考数字88所示和如图7B中的参考数字88'所示)、超声发生器(未示出)、加热站(未示出)、快速冷冻站(未示出)、亲和纯化站(未示出)或过滤站(未示出)中的一个或多个。适当时，基质干扰去除站的每个实施例可以被配置成用于容纳一个或多个器皿58，或一个或多个器皿架84，或一个或多个器皿58的内容物。
基质干扰去除站可以包括亲和萃取或纯化站，例如免疫亲和萃取或纯化系统。一个示例性免疫亲和系统可以使用富含质谱免疫化验(“MSIA”)抗体的底物。一种合适的可商购的MSIA底物包括来自固有生物探针公司(Intrinsic Bioprobes Inc.)(坦佩(Tempe)，亚利桑那州(AZ))的那些和在美国专利号6,783,672中所述的那个。一种示例性MSIA方法更详细地描述在美国专利号6,974,704中。
在样品已经穿过二次处理站80之后，所制备的样品通过传送组合件60传送到分析分级站90。分析分级站90包括用于分别接纳器皿58或器皿架84的两个或更多个器皿位置94(图7A)或两个或更多个器皿架位置94'(图7B)。在特定示意性实例中，分析分级站90，90'容纳约一百三十二个器皿58(图7A)或二十四个器皿架84(图7B)，这二十四个器皿架每个又能够接纳多达约六个器皿58，总共一百四十四个器皿58。每个器皿位置94在分析分级站90内可以是固定的，使得一旦个别器皿84被放置在分析分级站90的器皿位置94内时，其位置不会改变，但通过传送组合件60转移。
虽然没有明确地示出，但是分析分级站90可以包括一个冷却系统，用于将分析分级站90的温度维持在一个恒定的受控温度下，例如约4℃到约10℃的一个温度。以此方式，并且连同先前描述的器皿58的铰链盖一起，在所制备的样品等待分析的同时，所制备的样品的降解或蒸发速率被进一步降低。
可替代地，分析分级站90可以包括一个加热系统或如上所述的一个温育站，用于将分析分级站90的温度维持在一个用于温育的恒定的受控温度下，例如从约23℃到约70℃范围内的一个温度。一些样本类型、尤其是微生物样本可能需要在分析之前以其他方式制备的样品的延长温育。
当选择一种特定制备的样品进行分析时，含有所制备的样品的器皿58通过传送组合件60从分析分级站90转移到注射器站92。注射器站92可以包括一个注射器移液管组合件96(图8)，用于将所制备的样品的一个等分试样从器皿58转移到样品分析站24。注射器移液管组合件96(图8)包括一个移液管轴97，该移液管轴可以按类似于上文详细地描述的样品移液管组合件62的方式构造。
根据图7A-7B和图8中所示的实施例，提供一个洗涤站98，它具有一个流体地联接到其中的溶剂供应器99，用于视需要在抽吸-分配之间洗涤移液管轴97。在另一个实施例中，没有在此明确地示出，移液管轴97可以被成型成用于接收一个一次性尖端，该一次性尖端可以外加或替代洗涤站98加以提供。
注射器站92可以包括一个具有类似于采样站56的结构的可旋转台102并且可以包括一个器皿顶盖打开和关闭装置103，该器皿顶盖打开和关闭装置用于在器皿58被传送到预备位置100(图8)时打开和关闭它的铰链盖。在通过注射器移液管组合件96抽吸所制备的样品的一个等分试样之后，器皿58可以旋转远离预备位置100，由此关闭铰链盖并且使器皿58准备通过传送组合件60进行接收，以便传送和释放到一个储存设施(未示出)或一个废弃物槽106，通向器皿废弃物储存器107。一次性移液管尖端还可以从移液管轴97喷出到废弃物槽106中。
如上面详细描述的那样，在所制备的样品移动到样品分析站24之前，在样品制备站20制备样本样品23(图6)。因此，样品制备站20的单独地或共同起作用的可移动部分中的至少一些可以包括用于将所制备的样品从样品制备系统12传送到样品分析系统14的传送机构，这些可移动部分包括采样站56、传送组合件60、可旋转台44，102、注射器站92以及注射器移液管组合件96。本领域普通技术人员将理解，在不脱离本发明的原理的情况下，可以使用一个用于将所制备的样品从样品制备系统12传送到样品分析系统14的传送机构的替代实施例。在示例性实施例中，该传送机构可以包括注射器移液管组合件96，它移取所制备的样品的一个等分试样，用于分配到样品分析站24中。
现在详细描述样品分析站24，并且特别是图7A-7C和图9A-9B，样品分析站24的一个实施例可以是具有一个液相色谱站110和一个质谱仪站112的一个LCMS系统。液相色谱站110(在下文中称为“LC站”110)可以包括一个、两个或更多个注射端口104a，104b，用于从注射器移液管组合件96接纳所制备的样品的等分试样进行分析。注射端口104a，104b可以在线连接到一个或多个色谱柱，用于将所制备的样品分离成在一个或多个洗脱时间洗脱的相关分析物和多种辅助或废弃物洗脱液。如示意性实施例中所示，LC站110包括两个分离通道，即LC通道118a，118b(一个第三LC通道118c以虚线示出)。
当LC站110不被配置成以便通过先前在本文档中讨论的不含水解的方法分离化合物时，那么所有的LC分离通道都可以类似于LC通道118a进行配置。这个通道包括串联安排的一根制备柱7和一根分析柱116。否则的话，当LC站110被配置成以便通过不含水解的方法分离化合物时，该LC站可以包括一个类似于图9A中所示的LC通道118b进行配置的通道。如图9A中所展示，这个通道可以包括如先前在本文档中所述那样安排的分析柱对18a和18b。在替代实施例中，通道118b还可以包括如图9B中所展示的制备柱7。在图9A和9B中所示的实例中，通道118b类似于图3中所展示的色谱系统3进行配置。然而，这个通道可以可替代地类似于图1A-1D中所示的色谱系统1a、图1E-1G中所展示的系统1b、图4中所展示的系统39进行配置，或以根据本传授内容的任何替代性方式进行配置。两个LC通道118a，118b中的每一个以能够如在下面详细描述的那样将样品多路或交错引入到质谱仪120中的方式在上游与对应的注射器端口104a，104b相关联以及在下游与质谱仪站112的单个质谱仪120相关联。
根据一些实施例，制备柱7可以是实质上用于基质干扰去除的尺寸排阻亲和液相色谱柱。被包括在LC通道118a中的分析柱116可以是用于分析物分离的反相LC柱。示例性实施例包括美国专利号5,772,874；5,919,368；以及6,149,816中详细地描述的赛科仑(Cyclone)P 0.5×50mm涡轮流(TURBOFLOW)尺寸排阻亲和液相色谱柱(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA))，和海泼斯尔金(Hypersil GOLD)PFP 2.1×50mm,1.9μm UHPLC分析柱(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)。根据附加实施例的柱可以是例如以包装好的尖端形式、标准包装形式可获得的毛细管柱(具有大约300μm的内径)、纳米柱(具有在从约74μm到约100μm范围内的内径)，以及用于二维工作的两相柱。在其他实施例中，制备柱7可以是常规的尺寸排阻柱或可以被用作基质干扰去除装置的任何其他液相色谱柱。
LC通道118a的恰当制备柱7和分析柱116的选择可以至少部分基于这个LC通道提供相关分析物对比洗脱剂的保留时间范围的能力。常规地，制备柱7和分析柱116针对来自一个特定类型的样品的特定分析物进行匹配；然而，柱7，116的匹配可以在从一种化验类型到另一种化验类型之间变化。
LC通道118b可以容易地在如图9A中所示的其配置与和通道118a的配置类似或相同的替代性配置之间来回转换。这些转换可以通过在模块化可互换的筒柱内提供柱对7，116和柱对118a，118b来促进，每个筒柱包括被配合或匹配成以便彼此联合操作的两根柱。举例来说，图11示意性地展示了可以出于此目的使用的一个双柱色谱筒柱。图11中所示的设备的附加细节描述在共同未决的国际PCT申请号PCT/US2011/058229中，该申请公开为国际申请公开号WO 2012/058515A2并且转让给了本发明的受让人。图11中所示的双柱色谱筒柱240包括一个壳体241，该壳体具有两根至少部分地包含在其中的色谱柱：总体上表示为柱242的第一柱和总体上表示为柱244的第二柱。柱242，244优选地但不一定固定到壳体241。为了执行一种特定分析物(或多种分析物)的色谱分离，可以匹配每个筒柱中的两根柱。举例来说，在一个第一筒柱中，第一柱242可以包括净化柱或制备柱7；而同一筒柱的第二柱244包括单个分析柱116。在与第一筒柱可互换的一个第二筒柱中，第一柱242可以包括第一分析柱18a，而第二柱244包括第二分析柱18b。
第一柱242包括两个柱端配件242f，在这两个柱端的每一个处都有一个这种端配件。同样，第二柱在它的两端的每一个处包括一个端配件244f。如所已知的，柱端配件是用于流体连接到外部管道的附接点。因此，采用连接器248以便将第一柱242的两个端配件连接到流体管线以及将第二柱244的两个端配件连接到其他流体管线。这些流体管线在图11中总体上示出为流体管线247，但可以包括如图1、图3、图4或图9A-9B中所示的不同流体管线(这些流体管线在图9A-9B中未标记)。筒柱240可以包括一个无源鉴别特征(一个指示器或鉴别器)(例如，一个条形码254或一个RFID模块等等)，该特征可以用于鉴别该筒柱和它的针对外部设备/软件的相关色谱方法。举例来说，自动化样品制备和分析系统10，10'中的任一个可以包括一个条形码阅读器(未示出)或能够解释该无源鉴别特征的其他设备，该阅读器或其他设备被电子地连接到样品制备控制器22(图6)。这种特征可以使系统软件能够自动地验证所插入的筒柱内的这些柱对于目前正通过该系统执行的一个分析方案是适当的。
再次参看图7A、7B、9A和9B，样品分析站24包括一个分开的注射端口156，该注射端口与阀133相关联并且因此绕过了LC通道118a，118b。该注射端口156可以用于适当时注射分别用于执行校准或对照分析的校准标准或对照标准。在一些实施例中，校准溶液供应器158(图7B)可以设置在注射端口156附近以便于当需要校准标准时获取。为了下文质谱仪120的讨论的清楚起见，将仅讨论所制备的样品注射。然而应了解，将以类似方式分析通过注射端口156注射的样品校准标准或对照标准。
所注射的所制备样品以已知方式移动通过LC通道118a的柱7，116或以先前在本文档中描述的方式移动通过LC通道118b的柱7，18a和18b。样品和任何溶剂沿着通道118a的移动使得相关分析物中的至少一种将在不同于其他相关分析物和/或基质组分(即，洗脱液)的保留时间的保留时间洗脱离开柱7，116。将来自第一LC通道118a和第二LC通道118b两者的洗脱液和分析物引导到阀133中，其中洗脱液被引导到废弃物容器134中，而分析物被引导到质谱仪站112的电离源140中。针对一些样品的样品引入的替代方法可以包括(但不限于)也可以用于将样品引入到质谱仪120的在线方法(例如流动注射分析、直接注入(directinfusion)以及注射环路)和离线方法(例如固相萃取、血斑表面涂覆、基质辅助激光解吸/电离(“MALDI”)板涂，或普通表面上的涂覆)。
如图9A-9B中所示，大气压电离(或者电喷雾电离(“ESI”)或者大气压化学电离(“APCI”))装置(在此通常称为“雾化电离器”)用于电离由电离源140所接收的分析物。在这方面，雾化电离器包括毛细管、探针或针(在下文中称为“针”142)，在其中具有溶剂导管(未示出)并且该溶剂导管被其中的气体导管(未示出)包围。气体导管的出口定位在距溶剂导管出口近侧约0.1mm到约0.2mm。在ESI操作中，电压发生器144电耦合到针142，并且可操作以在可以位于质谱仪120处的针142与反电极之间形成高电压差。
在使用中，将溶剂以在从约400μL/min到约2000μL/min范围内的速率供应到溶剂导管；然而，本领域的普通技术人员将容易地了解，溶剂供应器随所选择的特定电离源140而变化。所用的具体溶剂取决于研究中的分析物的化学性质，并且用于选择适当溶剂的方法对于本领域内的普通技术人员而言是众所周知的。将气体、典型地惰性气体(例如N2)在从约0巴到约7巴范围内的压力下供应到气体导管。电压发生器144被激活并且向针142内的溶剂提供一个电压电势，该电压电势典型地在从约-5kV到约5kV的范围内。
在APCI操作中，电压发生器144电耦合到位于出口远侧的电晕放电电极145。施加到电晕放电电极145的高电压(如果存在)可操作以点燃等离子体，这有助于雾化溶剂的电离；然而，其他电离方法可以使用并且在本领域中是大体上已知的。等离子体引起溶剂和分析物(多种)的电离，并且一部分带电的溶剂/分析物(多种)将以分析物的气相离子(“气相离子”)形式进入质谱仪120中。在美国专利申请公开号2012/0104248A1中描述了在ESI与APCI模式之间可切换的离子源。
位于电晕放电电极145远侧的撇渣器160结合辅助气体(未示出，但被引导在出口与撇渣器160之间)起作用，用于包含这些气相离子和/或使它们聚集到质谱仪120的真空室中。该辅助气体可以按总体上从约0L/min到约15L/min范围内的速率供应。
仍然参看图9A-9B，质谱仪120的示意性实例包括与电离源140的接口146、质量过滤器148以及离子检测器150。含有质量过滤器148和离子检测器150的区域维持在真空中。这个接口146包括孔152，该孔提供进入含有质量过滤器148同时维持真空压力的更高真空室的开口。
在所展示的实例中，质量过滤器148示出为常规四极杆；然而，本领域的技术人员应了解如何确定对于指定化验选择恰当的质量过滤器形态。实际上，其他质谱仪实施例可以包括例如单一四极杆形态、飞行时间(“TOF”)、傅里叶变换(Fourier Transform；FT)、静电阱或离子阱(“OT”)形态或混合形态，例如Q-TOF、TOF-TOF、Q-Exactive、LTQ-Oorbitrap以及LTQ-FT或针对质子转移加以修改的质谱仪。
实例
图12示出了不同药物化合物和药物代谢物的一组色谱图，这组色谱图使用类似于图1中所展示的那些的实验配置和质谱仪检测器获得。每个色谱图表示在对应的尿液样品中提供的每种化合物的分子离子的检测结果。为了获得这些结果，使用AccucoreTM C18柱作为这个系列中的第一分析柱18a并且使用SynergiTM极性RP柱作为第二柱18b，如本文档中先前所指出。根据该实验配置和方法(图1)，第一洗脱分析物是来自线内第二柱的那些，接着是来自第一柱的分析物。因此，如图12中所示，保留在第二柱上的亲水性相对更大的化合物展现总体上小于四分钟的保留时间并且保留在第一柱上的亲水性相对更小的化合物展现超过四分钟的保留时间。如图12中所展示，不同的化合物基于其疏水性成功地在柱之间得到分离并且保留在任何一根柱上的化合物可以基于其对应的保留时间成功地得到分离和定量。这些包括母体化合物美沙酮(methodone)与其I相代谢物EDDP和母体化合物丁丙诺啡(buprenorphine)以及其I相代谢物去甲丁丙诺啡(norbuprenorphine)和其II相代谢物丁丙诺啡葡糖苷酸与去甲丁丙诺啡葡糖苷酸，所有这些都在第一柱上成功地彼此分离。
结论
在此所披露的这个传授内容提供针对两个问题的解决方案。首先，通过在不执行代谢物的水解的情况下测量代谢物和母体化合物两者，在此传授的方法和设备相比于常规方法节省了时间、金钱以及资源。所披露的方法去除了在使用酶来进行水解时所看到的可变性，因为不再需要活性的附加计算，由此使得这些方法更不复杂并且更容易执行。这些方法还减少了由使用强酸或强碱来执行水解所引起的降解。这些方法通过去除在高温下加热样品较长时间段(通常是过夜)的需要，进一步减少了降解。其次，在此所披露的方法解决了与次生代谢物和其母体物质相关的具有挑战性的色谱问题，用于在单次运行中测量所有组分。
本申请中所包括的讨论打算用作基本的描述。不同的图式和相关描述仅通过实例提供并且并不打算限制本发明。因此，尽管已经根据所显示和描述的不同实施例对本发明进行了描述，但本领域普通技术人员将容易认识到，可以存在对这些实施例的变更，并且那些变更将是在所要求的本发明范围之内的。读者应该知道，特定的讨论可以不明确地描述所有可能的实施例；很多替代方案是隐含的。举例来说，本领域的普通技术人员可以容易地想到，本发明的许多实际实施方案可以采用附加的阀、溶剂源、流体管线以及可能地色谱柱。可以提供这些附加组件例如以便在分析运行之间冲洗来自系统的流体，使清洗或缓冲溶液能够穿过不同流体组件或能够在经设定用于根据替代性色谱分析方法操作的路径之间进行选择。本领域的普通技术人员还可以想到阀(例如，具有不同的端口数量的阀)或流体连接(例如，按不同顺序连接到阀的流体管线)的与在此示出的那些不同的实施方式。描述和术语均不打算限制本发明的范围。

Claims (18)

1.一种用于检测和定量样品中的多种分析物的液相色谱设备，该设备的特征在于：
第一色谱柱(18a)，该第一色谱柱流体地联接到样品源(11)和第一色谱流动相溶液源(4a，4b)；
第二色谱柱(18b)，该第二色谱柱流体地联接到该第一色谱柱；
第二流动相溶液源(4d，4c)，该第二流动相溶液源流体地联接在该第一和该第二色谱柱之间；以及
检测器(9)，该检测器流体地联接到该第二色谱柱，
其中该第一色谱柱可配置为用于在分析物捕集步骤中接收该第一流动相溶液和该样品并且将该多种分析物的第一部分保留在其中并且使该多种分析物的第二部分穿过其中，
其中该第二色谱柱可配置为，在该分析物捕集步骤中，用于接收该多种分析物的该第二部分以及该第一和该第二流动相溶液并且将该多种分析物的该第二部分保留在其中，
其中该检测器被安排成分别在第一部分洗脱步骤中和在第二部分洗脱步骤中接收该多种分析物的该第一和该第二部分。
2.如权利要求1所述的液相色谱设备，进一步包括制备型色谱柱(7)，该制备型色谱柱流体地联接在该样品源与该第一色谱柱之间。
3.如权利要求1或2中任一项所述的液相色谱设备，其特征进一步在于：
T形接头或梯度阀(8c)，该T形接头或梯度阀流体地联接在该第一和该第二色谱柱之间并且流体地联接到该第二流动相溶液源，
其中该T形接头或梯度阀被配置成使得在该第一部分洗脱步骤期间，该第二色谱柱接收来自该第一色谱柱的该多种分析物的该第一部分。
4.如权利要求1或2中任一项所述的液相色谱设备，其特征进一步在于：
T形接头(31)，该T形接头流体地联接在该第一和该第二色谱柱之间并且可操作以将该第一流动相溶液和该样品的流动在该第一和该第二色谱柱之间划分；
第一梯度阀(8e)，该第一梯度阀流体地联接在该T形接头与该第一色谱柱之间并且也流体地联接到该第二流动相溶液源；以及
第二梯度阀(8f)，该第二梯度阀流体地联接在该T形接头与该第二色谱柱之间并且也流体地联接到该第二流动相溶液源。
5.如权利要求1或2中任一项所述的液相色谱设备，其特征进一步在于：
第一多端口阀(133)，该第一多端口阀流体地联接在该第二色谱柱与该检测器之间并且可操作以在第一配置中，在该第一部分洗脱步骤期间将该多种分析物的该第一部分转移到该检测器；并且在第二配置中，在该第二部分洗脱步骤期间将该多种分析物的该第二部分转移到该检测器；以及在第三配置中，将该第一或该第二流动相溶液中的任一个转移到废弃物容器。
6.如权利要求5所述的液相色谱设备，并且其特征进一步在于：
第二多端口阀(21)，该第二多端口阀流体地联接在该第一和该第二色谱柱之间，
其中该第二多端口阀是可操作的，从而在第一配置中，在该分析物捕集步骤期间将该多种分析物的该第二部分从该第一色谱柱转移到该第二色谱柱；并且在第二配置中，在该第一部分洗脱步骤期间将该多种分析物的该第一部分从该第一色谱柱转移到该第一多端口阀。
7.如权利要求1或2中任一项所述的液相色谱设备，其特征进一步在于：
T形接头或梯度阀(8c)，该T形接头或梯度阀流体地联接在该第一和该第二色谱柱之间并且流体地联接到该第二流动相溶液源；
第一多端口阀(133)，该第一多端口阀流体地联接在该第二色谱柱与该检测器之间并且可操作以在第一配置中，在该第一部分洗脱步骤期间将该多种分析物的该第一部分转移到该检测器；并且在第二配置中，在该第二部分洗脱步骤期间将该多种分析物的该第二部分转移到该检测器；以及在第三配置中，将该第一或该第二流动相溶液中的任一个转移到废弃物容器；以及
选择阀(19)，该选择阀流体地联接在该第一色谱柱与该T形接头或梯度阀之间并且可操作以在第一配置中，在该分析物捕集步骤期间将该多种分析物的该第二部分从该第一色谱柱转移到该第二色谱柱；并且在第二配置中，在该第一部分洗脱步骤期间将该多种分析物的该第一部分从该第一色谱柱转移到该第一多端口阀。
8.如权利要求1或2中任一项所述的液相色谱设备，其中该第一和该第二色谱柱以及该第一和该第二流动相溶液被配置成使得该多种分析物的该第一部分的分析物包括高于阈值的疏水值并且该多种分析物的该第二部分的分析物包括低于该阈值的疏水值。
9.一种用于分析和定量包含多种药物母体化合物和这些药物母体化合物的多种代谢物的临床样品中的一组药物的方法，该方法包括：
(a)分别在第一色谱柱上和在第二色谱柱上捕集这些药物母体化合物和这些代谢物的第一和第二部分；
(b)从该第一和该第二色谱柱分别地洗脱这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分；
(c)用检测器检测从该第一和该第二色谱柱中的每一个洗脱的这些药物母体化合物和代谢物中的每一个的浓度；以及
(d)从每种对应的药物母体化合物的所检测到的浓度连同所有其对应的分析物的所检测到的浓度一起计算该样品中的每种药物的总浓度。
10.如权利要求9所述的方法，其中该步骤(a)在该第一和该第二色谱柱上捕集这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分包括：
(a1)将该临床样品与第一流动相溶液混合；和
(a2)划分该样品和该第一流动相溶液的混合物，使得所述混合物的第一部分传递到该第一色谱柱中，使得这些药物母体化合物和代谢物的该第一部分被保留在其中；并且使得所述混合物的第二部分传递到该第二色谱柱中，使得这些药物母体化合物和代谢物的该第二部分被保留在其中。
11.如权利要求10所述的方法，其中该步骤(a)在该第一和该第二色谱柱上捕集这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分进一步包括：
(a3)将第二流动相溶液混合到该样品与该第一流动相溶液的该混合物的该第一和该第二部分中的至少一个中。
12.如权利要求10或11中任一项所述的方法，其中该步骤(b)从该第一和该第二色谱柱分别地洗脱这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分包括以下步骤：
(b1)划分第一洗脱流动相溶液，使得该第一洗脱流动相溶液的第一和第二部分分别传递到该第一和该第二色谱柱中。
13.如权利要求12所述的方法，其中该步骤(b)从该第一和该第二色谱柱分别地洗脱这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分包括以下另一个步骤：
(b2)将第二洗脱流动相溶液混合到该第一洗脱流动相溶液的该第一和该第二部分中的至少一个中。
14.如权利要求9所述的方法，其中该步骤(a)在该第一和该第二色谱柱上捕集这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分包括：
(a1)将该临床样品与第一流动相溶液混合；
(a2)使该样品与该第一流动相溶液的该混合物传递到该第一色谱柱中，使得这些药物母体化合物和代谢物的该第一部分被保留在其中并且使得这些药物母体化合物和代谢物的该第二部分和该第一流动相溶液穿过其中；
(a3)在该第一流动相溶液和这些药物母体化合物的该第二部分穿过该第一色谱柱之后，将第二流动相溶液与该第一流动相溶液以及这些药物母体化合物和代谢物的该第二部分混合；以及
(a4)使所混合的该第一和该第二流动相溶液以及这些药物母体化合物和代谢物的该第二部分传递到该第二色谱柱中，使得这些药物母体化合物和代谢物的该第二部分被保留在其中。
15.如权利要求14所述的方法，其中该步骤(b)从该第一和该第二色谱柱分别地洗脱这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分包括：
(b1)使第一洗脱流动相溶液穿过该第一色谱柱，使得这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一部分从该第一色谱柱洗脱并且从该第一色谱柱传递到该检测器，而不穿过该第二色谱柱；和
(b2)使第二洗脱流动相溶液穿过该第二色谱柱，使得这些药物母体化合物和这些代谢物的该第二部分从该第二色谱柱洗脱并且从该第二色谱柱传递到该检测器，而不穿过该第一色谱柱。
16.如权利要求14所述的方法，其中该步骤(b)从该第一和该第二色谱柱分别地洗脱这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一和该第二部分包括：
(b1)使洗脱流动相溶液穿过该第二色谱柱，使得这些药物母体化合物和这些代谢物的该第二部分从该第二色谱柱洗脱并且从该第二色谱柱传递到该检测器；和
(b2)使另一个洗脱流动相溶液穿过该第一和该第二色谱柱两者，使得这些药物母体化合物和这些代谢物的该第一部分从该第一色谱柱洗脱并且使其穿过该第二色谱柱，而不保留在其中，到达该检测器。
17.如权利要求9、10、11、14、15或16中任一项所述的方法，其中在该步骤(a)在该第一和该第二色谱柱上捕集这些药物母体化合物和代谢物的该第一和该第二部分之前，该临床样品穿过制备柱。
18.一种自动化样品制备和分析系统，包括：
(a)自动化样品制备站，用于根据多种化验来制备多种样品，这些化验选自包括多种独特化验的数据库；
(b)样品分析站，用于自动地执行该多种化验；以及
(c)传送机构，用于将所制备的样品从该样品制备站传送到该样品分析站，
其中该样品分析站包括：
(i)第一色谱流动相溶液源；
(ii)第二色谱流动相溶液源；
(iii)第一色谱柱，该第一色谱柱流体地联接到该第一色谱流动相溶液源并且被配置成用于从该样品传送机构接收所制备的样品的一部分；
(iv)第二色谱柱，该第二色谱柱流体地联接到该第一色谱柱和该第二色谱流动相溶液源；以及
(v)检测器，该检测器流体地联接到该第二色谱柱，
其中该第一色谱柱和该第二色谱柱是可操作的，从而在捕集步骤期间，分别捕集一组药物化合物和其代谢物的第一部分和第二部分；并且将这些药物化合物和其代谢物的该第一和该第二部分分别洗脱到该检测器中。
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