CN104804088A

CN104804088A - 一种抗vegf的单克隆抗体

Info

Publication number: CN104804088A
Application number: CN201410036740.0A
Authority: CN
Inventors: 张发明; 席甘
Original assignee: Waterstone Pharmaceuticals Wuhan Co Ltd
Current assignee: Waterstone Pharmaceuticals Wuhan Co Ltd
Priority date: 2014-01-26
Filing date: 2014-01-26
Publication date: 2015-07-29

Abstract

本发明涉及抗体工程领域，公开了一种新型抗人血管内皮生长因子（huVEGF）的单克隆抗体。具体的，本发明提供了重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。该单克隆抗体具有与人VEGF特异结合的特性。本发明还提供了编码该抗体的DNA分子及该抗体的制备方法。

Description

一种抗VEGF的单克隆抗体

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种识别人血管内皮生长因子（huVEGF）表位的鼠单克隆抗体，更具体的，设计该单克隆抗体的重链和轻链可变区的三个高变区氨基酸序列。

背景技术

1971年Folkman首先观察到当肿瘤体积超过1-2mm³，需要新血管的形成来维持生长，从而最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，并指出抗血管生成是控制肿瘤生长的新途径。已有研究表明，几乎所有实体瘤的生长和转移都依赖于肿瘤新血管的生成。

1989年Ferrara N发现了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，后来被证明是目前发现的最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的血管生长中发挥着重要作用。对肿瘤的浸润和转移有重要影响，在肿瘤的血管发生过程中发挥极其重要的作用。VEGF既可以用于肿瘤治疗的理想靶点，也可以作为进行肿瘤诊断和判断预后的标志物。

VEGF是相对分子质量34000-42000的高度糖基化碱性同源二聚体糖蛋白，其编码基因位于染色体的6q21.3，全长14kb，含有8个外显子和7个内含子，可形成9种异构体，主要包括VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆。其中多数组织以表达VEGF₁₆₅为主。

Genetech公司针对VEGF的人源化单克隆抗体阿瓦斯丁自2004年上市以来被证明对于转移性直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤均有显著的抑制效果。2006年，其优化后的抗体片段雷珠被美国FDA批准用于治疗老年黄斑变形，成为治疗老年性黄斑病变、糖尿病引起的眼底病的首选药。

由于VEGF及其受体的多样性，不同抗原表位或者不同亲和力的VEGF抗体可能有不同的肿瘤生长抑制效果。因此研究不同的VEGF抗体将有助于VEGF抗体药物的升级。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人血管内皮生长因子（huVEGF）的单克隆抗体，能够特异性的识别huVEGF，对huVEGF有很高的亲和力。

本发明提供了一种针对huVEGF的鼠源单克隆抗体。

本发明还提供了优选的VEGF抗体重链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列：

CDRH1（SEQ ID NO.1：TYGMS），CDRH2（SEQ ID NO.2：TISNGGSYTFYPDSVKG），CDRH3 （SEQ ID NO.3：HGSVTTRGFDY）。

本发明还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列：

CDRL1（SEQ ID NO.4：KASQSVSNDVV），CDRL2（SEQ ID NO.5：YASNRYT），CDRL3（SEQ ID NO.6：LQDYSSPFT）。

本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

附图说明

图1为显示间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力的图谱；

图2为显示16-5对VEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用的图谱；

图3为显示16-5对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用的图谱。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选

（1）小鼠的免疫

将VEGF₁₆₅蛋白溶解在l×PBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋自溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。

（2）细胞融合

从免疫小鼠内收获脾细胞，将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与该脾细胞悬液按1:10-100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养。

（3）阳性克隆的筛选

待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株，命名为16-5。

（4）单克隆抗体可变区序列的获得

利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株16-5的总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScriptⅡReverse Transcriptase(lnvitrogen)反转录成cDNA。经PCR扩增获得抗体重链和轻链的DNA片段，连于克隆载体，挑取克隆进行测序。

（5）单克隆抗体的纯化

单抗16-5采用Hi-Trap protein A HP（GE Healthcare）亲和层析柱从杂交瘤细胞上清中纯化，SDS-PAGE电泳证明所得产物纯度大于90%。纯化后的16-5直接用于以下实验。

实施例2小鼠单克隆抗体特性测定

（1）单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定

取16-5杂交瘤细胞株培养上清，采用Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit（Pierce公司）利用ELISA法测定抗体重链、轻链类型。经鉴定，16-5亚型为IgGa2b/kappa。

（2）间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力

用0.5μg/ml的人VEGF标准品包被酶标版，每孔100μl。37℃温育2小时，用含1%Tween-20的PBS洗涤后，封闭2小时。将单抗16-5以起始浓度为1μg/ml做三倍稀释，以商品化单抗avastin作为比对，37℃温育1小时。5次洗涤后，分别加入100μl HRP标记的相应二抗，37℃温育1小时。5次洗涤后，加入50μl显色液，37℃温育15分钟，50μl2M硫酸终止反应，OD₄₅₀读数。

经过四参数拟合后，16-5的EC50为40pM。

表1：间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力

附图1显示了间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力。

（3）单克隆抗体的特异性检测

分别用人VEGF和鼠VEGF各0.5μg/ml包板，4℃过夜；分别加入16-5和avastin单抗溶液100μl/孔，37℃温育1小时。洗涤后，分别加入100μl HRP标记的相应二抗，37℃温育1小时。洗涤后，加入50μl显色液，37℃温育15分钟，50μl2M硫酸终止反应，OD₄₅₀读数。结果见下表2。

表2：单克隆抗体的特异性检测

16-5	Avastin
		0.195nM	N/A

可见，16-5可同时与人VEGF和鼠VEGF交叉反应，而Avastin仅与人VEGF反应。16-5可用小鼠做动物模型。

（4）单克隆抗体作用表位的初步分析。

竞争ELISA法测定16-5同Avastine的抗原表位是否重合：往包被人VEGF抗原的酶标板上加入初始浓度为10ug/ml的16-5，同时加入或不加入浓度为100ug/ml Avastine。最终根据OD₄₅₀读数判断16-5同Avastine的决定簇是否相同。结果见表3。

表3：竞争ELISA法测定16-5同Avastine的抗原表位

对应各个浓度的5#单抗稀释液中，加入100ug/ml的Avastine单抗时，同样浓度下的16-5的显色值没有区别（特别是低浓度的16-5单抗，其显色值依然没有受到加入100ug/mlAvastine单抗的影响），说明两者识别的抗原表尾间无重叠。

实施例3小鼠单克隆抗体的活性研究

（1）ELISA法测定16-5对VEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用

用VEGFR1包板后，加入40ug/ml VEGF-his与不同浓度的16-5，以avastin做比较。OD₄₅₀读数后，分析单克隆抗体对VEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用。

附图2显示了16-5对VEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用。

如图2所示，OD₄₅₀读数越低，说明单克隆抗体对VEGF与VEGFR1结合的阻抗越明显。在我们所选的2个浓度中，鼠抗16-5显示出了比avastin更强的抑制作用。没加单克隆抗体时，OD₄₅₀为1.5。

（2）ELISA法测定16-5对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用

用VEGFR2包板后，加入40ug/ml VEGF-his与不同浓度的16-5，以avastin做比较。OD₄₅₀读数后，分析单克隆抗体对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用。

附图3显示了16-5对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用。

如图3所示，OD₄₅₀读数越低，说明单克隆抗体对VEGF与VEGFR2结合的阻抗越明显。在我们所选的3个浓度中，高浓度时鼠抗16-5显示出了比avastin更强的抑制作用。较低浓度时鼠抗16-5显示出了比avastin相对较弱的抑制作用。没加单克隆抗体时，OD₄₅₀为1.0。所以，鼠抗16-5和avastin在高浓度下，都显现出了较强的抑制作用。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，它具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的重链可变区：CDRH1（SEQ ID NO.1：TYGMS），CDRH2（SEQ ID NO.2：TISNGGSYTFYPDSVKG），CDRH3（SEQ ID NO.3：HGSVTTRGFDY）。

2.根据权利要求1所述的抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，它还/或具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的轻链可变区：CDRL1（SEQ ID NO.4：KASQSVSNDVV），CDRL2（SEQID NO.5：YASNRYT），CDRL3（SEQ ID NO.6：LQDYSSPFT）。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，其重链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；其轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。