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CN104797703A - 产生显著均质的聚糖结构的巴斯德毕赤酵母菌株 - Google Patents

产生显著均质的聚糖结构的巴斯德毕赤酵母菌株 Download PDF

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CN104797703A CN201380055395.9A CN201380055395A CN104797703A CN 104797703 A CN104797703 A CN 104797703A CN 201380055395 A CN201380055395 A CN 201380055395A CN 104797703 A CN104797703 A CN 104797703A
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Abstract

本文公开了用于表达具有基本上均质的N-聚糖的外源蛋白的新型巴斯德毕赤酵母菌株。所述菌株经遗传工程化以包含被转录为编码突变OCH1基因产物(即α-1,6-甘露糖基转移酶或“OCH1蛋白”)的mRNA的突变OCH1等位基因。突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域，但缺乏将OCH1蛋白靶向至高尔基体所必需的N-末端序列。本文公开的所述菌株是健全的、稳定的和可转化的，并且突变OCH1等位基因和产生基本上均质的N-聚糖的能力在冷冻和解冻循环后且在随后的转化后得到世代维持。

Description

产生显著均质的聚糖结构的巴斯德毕赤酵母菌株
交叉参考相关申请
本申请要求2012年10月23日提交的美国临时申请号61/717,423的优先权利益，该临时申请的整个内容通过引用并入本文。
发明背景
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是用于产生广泛多样的重组蛋白的非常成功的系统。若干个因素促成了其迅速的认可，包括：(1)来源于巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的醇氧化酶I(AOX1)基因的启动子，其独特地适合用于异种基因的受控表达；(2)巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作所需的技术与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的技术的相似性；和(3)巴斯德毕赤酵母对呼吸性生长的强烈偏好，这是相对于发酵性酵母促进其在高细胞密度下的培养的生理性状。
作为酵母，巴斯德毕赤酵母是容易操作和培养的单细胞微生物。然而，其还是真核生物并能够发生由较高等真核细胞进行的翻译后修饰例如蛋白水解加工、折叠、二硫键形成和糖基化。因此，在细菌系统中会终止为无活性包涵体的许多蛋白质在巴斯德毕赤酵母中被产生为生物活性分子。巴斯德毕赤酵母系统还通常被认为比来源于较高等真核生物例如昆虫和哺乳动物组织培养细胞系统的表达系统更快速、更简化和较不昂贵地使用，并且通常产生更高的表达水平。
巴斯德毕赤酵母具有进行许多通常与较高等真核生物相关的翻译后修饰的潜能。这些包括信号序列(前-和前原-型两者)加工、折叠、二硫键形成以及O-和N-连接的糖基化。巴斯德毕赤酵母和其它真菌对分泌的异种(较高等)真核生物蛋白质的糖基化可以是成问题的。在哺乳动物中，O-连接的寡糖由多种糖包括N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸组成。相反，较低等的真核生物包括巴斯德毕赤酵母，可添加仅由甘露糖(Man)残基组成的O-寡糖。
巴斯德毕赤酵母中的N-糖基化也与较高等真核生物中的不同。在所有的真核生物中，N-糖基化起始于ER中，将脂质连接的寡糖单元即Glc3Man9GlcNAc2(Glc＝葡萄糖；GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺)转移至识别序列Asn-X-Ser/Thr上的天冬酰胺。该寡糖核心单元随后被修剪为Man8GlcNAc2。正是在这一点上较低等和较高等真核生物糖基化模式开始不同。哺乳动物高尔基体进行一系列修剪和添加反应来产生包含Man5-6GlcNAc2(高甘露糖类型)、几种不同糖类的混合物(复合型)或两者的组合(杂种型)的寡糖。在由巴斯德毕赤酵母分泌的异种蛋白上已观察到两种不同的N-糖基化模式。一些蛋白被分泌为具有在大小和结构上与核心单元(Man8-11GlcNAc2)相似的碳水化合物结构。其它从巴斯德毕赤酵母分泌的异种蛋白接受远更多的碳水化合物并显得是过度糖基化的。
由酵母添加至蛋白质的N-连接的高甘露糖寡糖代表了制药工业对异种分泌蛋白的使用中的问题。例如，当被静脉内引入哺乳动物中时，它们可以是非常抗原性的并且还可引起蛋白质通过肝脏从血液的快速清除。
在尝试修饰巴斯德毕赤酵母的N-糖基化途径的过程中，产生了一种菌株(此后被称作为“M5-Blast”)，如Jacobs等人,2009,NatureProtocols 4:58-70中所描述的。M5-Blast是改良的巴斯德毕赤酵母GS115菌株，其中内源甘露糖基转移酶基因OCH1被引入包含α-1,2-甘露糖苷酶基因的盒破坏。然而，M5-Blast菌株经历基因组重排，其在冷冻和解冻循环、于不同温度和条件下的生长之后并从利用其它质粒的随后转化中引入外源基因之后，重新产生内源OCH1基因并且同时去除α-1,2-甘露糖苷酶基因。
公开内容概述
本文公开了用于表达具有基本上均质的N-聚糖的外源蛋白的新型巴斯德毕赤酵母菌株。更具体地，所述菌株经遗传工程化以包含被转录为编码突变OCH1基因产物(即α-1,6-甘露糖基转移酶或“OCH1蛋白”)的mRNA的突变OCH1等位基因。突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域，但具有改变OCH1蛋白至高尔基体或在高尔基体中的定位的N-末端序列。所述菌株不包含任何其它的产生编码功能性OCH1蛋白的mRNA的OCH1等位基因。这样的菌株是健全的、稳定的和可转化的，并且突变OCH1等位基因和相关的表型(即产生基本上均质的N-聚糖的能力)在冷冻和解冻循环后且在随后的转化后得到世代维持。
本公开内容还表征了构建所述菌株的方法以及通过该菌株表达蛋白的方法。
本文中描述的任何特征或特征的组合均包括在本发明的范围之内，条件是任何这样的组合中包括的特征不是相互矛盾的，如根据上下文、本说明书和本领域技术人员的知识将是明显的。本发明的另外的优势和方面在下文的详细描述和权利要求中是明显的。
附图简述
图1.用于从M5-Blast毕赤酵母基因组去除OCH1N-末端片段同源性的删除策略图。侧接OCH1N-末端片段的同源臂被用于产生包含lox71-lox66重组位点的双交叉互换构建体。间插序列可通过cre介导的重组来去除。
图2.用于从M5-Blast基因组DNA扩增双交叉互换构建体的侧接臂的PCR引物。
图3.用于将lox位点添加至同源臂的末端的PCR反应。
图4.M5-Blast基因组DNA延伸物在现有的lox71-MazF-NatR-lox66盒上的添加。
图5.用于产生用于M5-Blast毕赤酵母转化的双交叉互换片段的最终序列的重叠组装和扩增。该最终的构建体具有侧接选择/反选择盒的>500bp的同源臂。
图6.用来产生用于双交叉互换重组事件的DNA片段的PCR引物对。
图7.M5-Blast基因组的LEU5-甘露糖苷酶HDEL区在双交叉互换重组事件后的理论排列。
图8.LEU5与甘露糖苷酶HDEL之间的基因组DNA在cre重组之后的理论排列。
图9.用于验证可已来源于转化至M5-Blast菌株中的PCR产物的区域的DNA序列的PCR引物81487118-80765854。
图10.在不同巴斯德毕赤酵母菌株中表达的重组蛋白的N-聚糖分析。
图11.在实施例6中描述的研究1中获得的曲妥珠单抗的N-聚糖分析。
图12.通过ELISA比较Man5-型曲妥珠单抗(研究1)与商购赫赛汀的Her2结合亲和力。
图13.来自‘Trans’菌株的培养基蛋白上的总N-聚糖库的DSA-FACE分析。A.麦芽-葡萄糖参照的结果。图B至F显示N-聚糖的结果，如下所示：B.微量级的GS Trans菌株；C.微量级的M5 Trans菌株；D.生物反应器中的GS Trans菌株；E.生物反应器中的M5 Trans菌株；F.来自牛RNA酶B的参照N-聚糖。
图14.来自‘CalB’菌株的培养基蛋白上的总N-聚糖库的DSA-FACE分析。A.麦芽-葡萄糖参照的结果。图B至F显示N-聚糖的结果，如下所示：B.微量级的GS CalB菌株；C.微量级的M5 CalB菌株；D.生物反应器中的GS CalB菌株；E.生物反应器中的M5 CalB菌株；F.来自牛RNA酶B的参照N-聚糖。
图15.来自‘CalA’菌株的培养基蛋白上的总N-聚糖库的DSA-FACE分析。A.麦芽-葡萄糖参照的结果。图B至F显示N-聚糖的结果，如下所示：B.微量级的GS CalA菌株；C.微量级的M5 CalA菌株；D.生物反应器中的GS CalA菌株；E.生物反应器中的M5 CalA菌株；F.来自牛RNA酶B的参照N-聚糖。
表1-6示于第34-45页。表7-8见于第30页(实施例7)。
表1列出了描述于实施例1的SuperM5菌株中的OCH1基因座的DNA序列(SEQ ID NO:1)。
表2列出了巴斯德毕赤酵母中野生型OCH1的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)。
表3列出了可从上游OCH1区段删除的核苷酸。
表4列出了M5-Blast巴斯德毕赤酵母菌株的OCH1基因座(+/-2kb)的DNA序列。
表5列出了上游OCH1区段的氨基酸序列和核苷酸序列。
表6列出了下游OCH1区段的氨基酸序列和核苷酸序列。
表7.从研究2获得的曲妥珠单抗的N-聚糖分析(实施例6)。
表8.在BIAcore上分析的曲妥珠单抗的动力学参数(实施例6)。
详述
经遗传工程化的巴斯德毕赤酵母菌株
本公开内容表征了新型的经遗传工程化的巴斯德毕赤酵母菌株，其是健全的、稳定的和可转化的，并且其产生具有基本上均质的N-聚糖结构的蛋白质。
如本文中进一步描述的，所述菌株被遗传工程化以包含被转录为编码突变OCH1基因产物(即α-1,6-甘露糖基转移酶或“OCH1蛋白”)的mRNA的突变OCH1等位基因。突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域，但具有改变OCH1蛋白至高尔基体或在高尔基体中的定位的N-末端序列。所述菌株不包含任何其它的产生编码功能性OCH1蛋白的mRNA的OCH1等位基因。
所述菌株可被另外地遗传工程化以包含编码和表达α-1,2-甘露糖苷酶的核酸，所述α-1,2-甘露糖苷酶将M8N-聚糖、Man8GlcNAc2转化为M5N-聚糖、Man5GlcNAc2。
由于遗传修饰，本文中公开的菌株产生基本上均质的N-聚糖。
“基本上均质的”N-聚糖意指假定包含特定目标糖蛋白群体的制剂，其中在该群体内的蛋白分子上的至少50％、60％、75％、80％、85％、90％或甚至95％的N-聚糖是相同的。
“主要的N-聚糖结构”或“主要的糖形”意指蛋白的(即连接至蛋白的)特定N-聚糖结构或糖形构成该蛋白的所有N-聚糖结构或糖形的最大百分比。在某些具体的实施方案中，主要的糖形占蛋白上的所有糖形群体的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多。期望的N-聚糖结构的实例包括例如Man8GlcNAc2(或"M8")或Man5GlcNAc2("M5")。另外的期望的N-聚糖结构包括GnM5(GlcNAcMan5GlcNAc2)、GalGnM5(GalGlcNAcMan5GlcNAc2)、GalGnM3(GalGlcNAcMan3GlcNAc2)、GnM3(GlcNAcMan3GlcNAc2)、Gn2M3(GlcNAc2Man3GlcNAc2)和Gal2Gn2M3(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)。这些N-聚糖的结构已描述于例如Jacobs等人,2009,Nature Protocols4:58-70中，将该文献通过引用并入本文。
在具体实施方案中，本发明的菌株包含突变OCH1等位基因和编码和表达α-1,2-甘露糖苷酶的核酸两者，以使得所述菌株产生以M5为主要糖形的均质N-聚糖。这些菌株在本文中也被称作为SuperM5或SuperMan5菌株。SuperM5菌株的实例描述于下文的实施例部分中。
本发明的菌株是“健全的”，这意指该菌株(除非另外指出为营养缺陷型或天然缺陷型菌株，例如蛋白酶缺陷型、AOX1突变体等)具有大致与未经修饰的巴斯德毕赤酵母菌株例如菌株GS115相同的生长速率和相同的生长条件。例如，本发明的菌株可在升高的温度(例如30℃、37℃或甚至42℃)下生长并且不是温度敏感性的。例如，本文中公开的SuperM5菌株是健全的并且不是温度敏感性的。
本发明的菌株还是稳定的，这意指遗传修饰和因遗传修饰而引起的表型(即产生均质的N-聚糖)在冷冻和解冻循环后且在随后的转化后经世代(例如至少10、20、30、40或50代(细胞分裂))维持。例如本文中公开的SuperM5菌株世代维持突变OCH1等位基因并且能够持续产生基本上均质的M8(或其它的下游N-聚糖)而不发生逆转。
遗传工程化-突变OCH1等位基因
本发明的菌株被遗传工程化以包含被转录为编码突变OCH1基因产物(即α-1,6-甘露糖基转移酶或“OCH1蛋白”)的mRNA的突变OCH1等位基因。所述突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域，但具有改变OCH1蛋白至高尔基体或在高尔基体中的定位的N-末端序列。
巴斯德毕赤酵母的野生型OCH1基因具有编码404个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:2)的开放阅读框。类似其它的真菌高尔基体糖基转移酶，巴斯德毕赤酵母OCH1蛋白是I I型膜蛋白，具有短胞质尾区(Met1至Tyr21(SEQ ID NO:25)或Ala2至Tyr21)、膜锚定结构域(Phe22至Ser44，即FYMAIFAVSVICVLYGPSQQLSS(SEQ ID NO:89))、干区和包含催化结构域的大的C-末端区。参见例如Kim等人,J.Biol.Chem.281:6261-6272(2006)；Nakayama等人,EMBO 11(7):2511-2519(1992)；和Tu等人,Cell.Mol.Life Sci.67:29-41(2010)。
野生型OCH1蛋白通常位于顺面-高尔基体中。据信野生型OCH1蛋白的高尔基体定位通过由胞质尾区、膜锚定结构域和干区组成的N-末端区来决定。具体地，膜锚定结构域(包括其氨基酸组分和长度)在蛋白的高尔基体靶向中起着重要的作用。参见例如Tu等人(同上)。
本公开内容的突变型OCH1蛋白具有相较于野生型OCH1蛋白改变突变型OCH1蛋白的高尔基体定位的N-末端序列。由于此改变的N-末端序列，突变型OCH1蛋白既不适当地靶向至或保持在高尔基体内，也不适当地靶向至或保持在高尔基体内正确的腔室内。术语“靶向”意指将蛋白质转运至细胞中或细胞外的适宜目的地的生物机制。在具体的实施方案中，本公开内容的突变型OCH1蛋白缺乏允许突变型OCH1蛋白的高尔基体靶向的N-末端序列，以使得所述突变型OCH1蛋白不被靶向至高尔基体并且被转运至另一个细胞位置或被分泌至细胞之外。
在一些实施方案中，N-末端序列中的改变是突变即一种或多种氨基酸在OCH1蛋白的膜锚定结构域中的添加、删除或取代的结果。在具体的实施方案中，膜锚定结构域中的一个或多个氨基酸已被删除。在具体的实施方案中，膜锚定结构域的至少2、3、4、5、6、7个或更多的氨基酸(连续的或其它方式的)已被删除。例如，膜锚定结构域的前5个氨基酸(FYMAI,SEQ ID NO:90)的一些或全部被删除。
在其它实施方案中，N-末端序列中的改变是突变即一种或多种氨基酸在OCH1蛋白的胞质尾区中的添加、删除或取代的结果。在具体的实施方案中，胞质尾区中的一个或多个氨基酸已被删除；例如胞质尾区的至少2、3、4、5、6、7个或更多的氨基酸(连续的或其它方式的)已被删除。胞质尾区中的删除的实例见于表3中。在其它实施方案中，将一种或多种氨基酸的删除与胞质尾区中一种或多种氨基酸的添加进行组合。
在其它实施方案中，N-末端序列中的改变是OCH1蛋白的干区中的一个或多个氨基酸的突变；例如紧接在膜锚定结构域之后的前10、20、30、40、50或60个氨基酸中的一个或多个氨基酸的删除的结果。
在某些实施方案中，N-末端序列中的改变是OCH1蛋白的胞质尾区、膜锚定结构域和/或干区中的突变的组合的结果。
在具体的实施方案中，N-末端序列中的改变是胞质尾区和膜锚定结构域中的突变的组合的结果。例如，胞质尾区中的一个或多个氨基酸和膜锚定结构域中的一个或多个氨基酸已被删除。OCH1蛋白的N-末端区中的删除的实例列于表3中。
在其它实施方案中，除一个或多个结构域中的删除以外，还将一种或多种氨基酸添加至蛋白的N-末端，只要所得的突变N-末端序列仍然不能将OCH1蛋白恰当地靶向或定位在高尔基体中。例如，所得的突变N-末端序列仍然缺乏功能性膜锚定结构域。突变序列是否包含膜锚定结构域可基于氨基酸组成和长度容易地确定。高尔基体糖基转移酶的膜锚定结构域通常由16-20个氨基酸组成，所述氨基酸是疏水性的并且通常包含芳香氨基酸，并且所述膜锚定结构域具有紧接在跨膜的两个末端之外的亲水性的通常带正电荷的氨基酸。参见例如Nakayama等人(1992)(同上)。突变型OCH1蛋白的一个实例示于SEQ ID NO:3中，其具有替代野生型OCH1蛋白的前26个氨基酸的其前10个氨基酸。
本文中公开的突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域。
野生型OCH1蛋白的催化结构域位于360个氨基酸的C-末端片段之内(即SEQ ID NO:2的氨基酸45至404之内)。在一些实施方案中，突变型OCH1蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸45-404、55-404、65-404、75-404、85-404、95-404或105-404基本上相同的C-末端片段。“基本上相同”意指当在其全长上进行比对时，序列具有至少90％、95％、98％、99％或更多的同一性。在大多数实施方案中，突变型OCH1蛋白的催化结构域与野生型结构域的不同不超过10个氨基酸、8个氨基酸、5个氨基酸、3个氨基酸或2个氨基酸。在特定实施方案中，突变型OCH1蛋白的催化结构域与野生型OCH1蛋白的催化结构域相同。当一个或多个氨基酸是不同的时，优选所述不同代表保守氨基酸置换。保守置换的实例包括非极性(疏水性)残基例如I、V、L或M对另一种的置换；一种极性(亲水性)残基对另一种极性残基的置换，例如R置换K、Q置换N、G置换S或反之亦然；和碱性残基例如K、R或H对另一种的置换或一种酸性残基例如D或E对另一种的置换。
突变型OCH1蛋白还基本上保留了野生型OCH1蛋白的催化活性，即野生型OCH1蛋白的至少约75％、80％、85％、90％、95％或更多的α-1,6-甘露糖基转移酶活性。特定OCH1突变蛋白的活性还可通过使用本领域中已知的体外或体内测定来容易地确定。参见例如Nakayama(1992)(同上)。
如上文所描述的，本发明的菌株包含被转录为编码突变型OCH1蛋白的mRNA的突变OCH1等位基因并且不包含任何其它的产生编码功能性OCH1蛋白的mRNA的OCH1等位基因。这样的菌株可通过多种方法来进行工程化。
在一些实施方案中，巴斯德毕赤酵母菌株的染色体上的OCH1基因座上的野生型OCH1等位基因已被修饰或突变以提供突变OCH1等位基因(如本文下述实施例中所显示的)，或已被突变OCH1等位基因取代(例如通过同源重组)。修饰应当是这样的以使得所得的菌株对于突变OCH1等位基因是稳定的。即是说，突变等位基因经世代(例如至少10、20、30、40、50代或更多代的细胞分裂)维持在菌株中适合用于小体积玻瓶培养和工业规模的生物反应器培养，而不恢复为编码功能性OCH1蛋白的OCH1等位基因。
在其它实施方案中，突变OCH1等位基因通过表达载体被引入其野生型OCH1等位基因(如果是单倍体则一个野生型OCH1等位基因，如果是二倍体则两个野生型OCH1等位基因)已被破坏的巴斯德毕赤酵母菌株中从而没有功能性OCH1蛋白从天然OCH1等位基因或天然OCH1基因座产生。表达载体可以是被设计来将突变OCH1等位基因整合至宿主基因组中的整合性载体；或者是在菌株中独立于染色体复制的复制性载体(例如质粒)。
无论是通过突变或替换野生型OCH1等位基因来在天然OCH1基因座产生突变OCH1等位基因还是通过表达载体在其野生型OCH1等位基因(如果是单倍体则一个野生型OCH1等位基因，如果是二倍体则两个野生型OCH1等位基因)已被破坏的菌株中提供突变OCH1等位基因，重要的是所得的突变菌株不世代(例如至少10、20、30、40、50代或更多代的细胞分裂)产生功能性OCH1蛋白。“功能性OCH1蛋白”意指野生型OCH1蛋白或野生型OCH1蛋白的功能性等同物即靶向至高尔基体并且基本上保留野生型OCH1蛋白的催化活性(即野生型OCH1蛋白的α-1,6-甘露糖基转移酶活性的至少约80％、85％、90％、95％或更多)的蛋白。为了避免逆转，菌株中的同源序列应当被去除以避免发生产生野生型OCH1等位基因的同源重组。
突变OCH1等位基因无论是存在于宿主染色体上还是存在于染色体外的载体上，都被转录为mRNA。换句话说，所述菌株被工程化以使得突变OCH1等位基因的编码序列有效连接至启动子以实现转录。启动子可以是内源启动子例如内源OCH1启动子、不同于OCH1等位基因的启动子(例如AOX1启动子、GAP启动子)等；或可以是在巴斯德毕赤酵母中具有功能的外源启动子。转录水平可与野生型OCH1等位基因在未经修饰的巴斯德毕赤酵母菌株(例如GS115)中的转录水平是相同的、可比其更高或更低。
具有如上所述的对OCH1等位基因的遗传修饰的巴斯德毕赤酵母菌株包括单倍体菌株和双倍体菌株。对于具有整合至宿主染色体中的OCH1突变等位基因的双倍体菌株，所述菌株可对于OCH1突变等位基因是纯合的或杂合的。
具有如上所述的对OCH1等位基因的遗传修饰的巴斯德毕赤酵母菌株是健全和稳定的，并且产生具有基本上均质的以Man8GlcNAc2为主要的N-聚糖的N-聚糖结构的蛋白。
遗传工程化—编码和表达α-1,2-甘露糖苷酶的核酸
除了如上所述的对OCH1等位基因的遗传修饰以外，所述菌株还可被工程化以包含编码且能够表达α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸分子，所述α-1,2-甘露糖苷酶将Man8GlcNAc2转化为Man5GlcNAc2，从而将Man5GlcNAc2提供为主要的N-聚糖形式。
α-1,2-甘露糖苷酶(MS-I)是已被良好表征的酶家族。已知大多数MS-I酶定位于高尔基体或内质网中，虽然一些被分泌并具有细胞外活性。参见Gonzalez等人,Mol Biol Evolution 17:292-300(2000)。定位于ER和高尔基体的那些酶的拓扑学通常包含内腔催化结构域和N-末端跨膜区。参见Herscovics,Biochimie 8:757-62(2001)。N-末端区由干区(最靠近于内腔催化结构域)、跨膜结构域和胞质尾区组成。在分泌的MS-I酶中，外-催化跨膜区也被称作为引导序列，用作酶分泌的信号。多种α-1,2-甘露糖苷酶的详细表征可见于Becker等人(European J.Cell Biol 79:986-992(2000))，其研究了来自小鼠和酿酒酵母(S.cerevisiae)的MS-I酶及其催化结构域；Schneikert and Herscovics(Glycobiology 4:445-450(1994))，其表征了鼠MS-I的催化活性及其催化结构域；Gonzalez等人(J.BiolChem 274:21375-86(1999))，其检查了几种MS-I酶(包括来自秀丽隐杆线虫(C.elegan)的两种酶、人MS-I和酿酒酵母MS-I(来自ER))的活性和结构域；和Maras等人(J.Biotechnology 77:255-263(2000))，其表征了属于分泌性MS-I类别的里氏木霉(T.reesei)α-1,2-甘露糖苷酶，其由催化结构域和N-末端引导序列组成。
编码α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸分子可来源于用于本发明的任何物种，包括但不限于编码例如鼠α-1,2-甘露糖苷酶(Herscovics等人J.Biol.Chem.269:9864-9871,1994)、兔α-1,2-甘露糖苷酶(Lal等人J.Biol.Chem.269:9872-9881,1994)或人α-1,2-甘露糖苷酶(Tremblay等人Glycobiology 8:585-595,1998)的哺乳动物基因，编码例如曲霉菌属(Aspergillus)α-1,2-甘露糖苷酶(msdS基因)、里氏木霉(Trichoderma reesei)α-1,2-甘露糖苷酶(Maras等人,J.Biotechnol.77:255-263,2000)或酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶的真菌基因，以及其它基因例如来自秀丽隐杆线虫(GenBank登录号CAA98114和CAB01415)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(GenBank登录号AAF46570)的那些基因(参见例如Nett等人,Yeast 28:237-252,2011,将其通过引用并入本文)。
α-1,2-甘露糖苷酶的“功能性部分”或“酶活性片段”意指天然存在的或野生型α-1,2-甘露糖苷酶的基本上保留全长蛋白的酶活性的多肽片段。此背景中的“基本上”意指至少约75％、80％、85％、90％、95％或更多的全长蛋白酶活性得到保留。例如α-1,2-甘露糖苷酶的催化结构域(不存在任何N-末端跨膜或信号序列)构成α-1,2-甘露糖苷酶的“功能性片段”。本领域技术人员可基于本领域中可获得的信息和本领域中已知的技术的组合容易地鉴定和制做α-1,2-甘露糖苷酶的功能性片段。还可使用本领域中已知的体外或体内测定来验证特定多肽片段的活性。
在一些实施方案中，编码α-1,2-甘露糖苷酶或功能性片段的核苷酸序列来源于里氏木霉α-1,2-甘露糖苷酶编码序列。在具体实施方案中，核苷酸序列编码由Maras等人J.Biotechnol.77:255-63(2000)描述的里氏木霉α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段(例如全长蛋白的C-末端催化结构域)。
在大多数实施方案中，所述菌株被工程化以使得α-1,2-甘露糖苷酶或功能性片段被靶向至ER。在具体的实施方案中，ER-靶向通过在α-1,2-甘露糖苷酶或功能性片段中包含ER-靶向序列来实现。ER-靶向序列即是将蛋白靶向至ER以使得所述蛋白定位于或保持在ER中的序列的实例包括酿酒酵母SEC12的N-末端片段、由GLS1编码的酿酒酵母α-葡糖苷酶I的N-末端序列和由MNS1编码的酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶的N-末端片段。参见例如Nett等人(2011)(同上)。在具体的实施方案中，通过在α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段的C-末端上包含ER-滞留信号HDEL(SEQ ID NO:91)来将α-1,2-甘露糖苷酶或功能性片段靶向至ER。
可通过表达载体将编码α-1,2-甘露糖苷酶或功能性片段的核酸引入巴斯德毕赤酵母菌株中。表达载体可以是被设计来将α-1,2-甘露糖苷酶编码序列整合至宿主基因组中的整合性载体；或者是在菌株中独立于染色体进行复制的复制性载体(例如质粒)。在整合性载体的情况下，载体可被设计来实现核酸至野生型OCH1等位基因中的整合(例如通过单或双交叉互换同源重组)和同时的所述野生型OCH1等位基因的破坏。
SuperM5菌株
本公开内容提供了健全的、稳定的和可转化的并且产生具有基本上均质的Man5GlcNAc2N-聚糖的蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株。这些菌株在本文中也被称作为SuperM5或SuperMan5菌株。
SuperM5菌株被遗传工程化以包含被转录为编码突变型OCH1蛋白的mRNA的突变OCH1等位基因，所述突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域，但缺乏将OCH1蛋白靶向至高尔基体所必需的N-末端序列。所述菌株不包含任何其它的产生编码功能性OCH1蛋白的mRNA的OCH1等位基因。所述菌株被另外地遗传工程化以包含编码和表达α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸，所述α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段被靶向至ER并将Man8GlcNAc2转化为Man5GlcNAc2。
SuperM5菌株的实例描述于实施例1中。该菌株的OCH1基因座的核苷酸序列示于表1和SEQ ID NO:1中。通过使用Jacobs等人(2009)描述的M5-Blast菌株来构建，SuperM5菌株在健全的生长、稳定性和所产生的M5聚糖的均质性方面优良于M5-Blast。
遗传工程化-引入另外的酶
所述菌株可被另外地修饰以表达糖基化途径中其它的下游酶(或其功能性片段)从而产生杂种-和复合-型的N-聚糖。这样的另外的酶包括尤其例如GlcNAc转移酶I(GnT-I)、β-1,4-半乳糖基转移酶1(GalT)、甘露糖苷酶I I(Man-I I)和GnT-I I中的一种或多种。参见Jacobs等人(2009)；Gerngross的美国专利7,029,872。
GnT-I催化β-1,2-连接的GlcNAc残基至Man5GlcNAc2中三甘露糖基核心的α-1,3-甘露糖的添加。GnT-I活性的引入可通过用包含编码用于本发明的GlcNAc-转移酶I(GnT-I)的核酸序列的载体进行转化来实现。这样的核酸序列可来源于任何物种，例如兔、大鼠、人、植物、昆虫、线虫和原生动物例如蜥蜴利什曼原虫(Leishmaniatarentolae)。在具体的实施方案中，核苷酸序列编码人GnT-I。GnT-I或其功能性部分被靶向至高尔基体，这可通过在GnT-I蛋白或其功能性部分中包含酵母高尔基体定位信号来实现。在某些实施方案中，将人GnT-I的催化结构域融合至酿酒酵母Kre2p(具有已知的顺面/内侧高尔基体定位的糖基转移酶)的N-末端结构域。
GalT催化β-1,4-连接的半乳糖残基至β-1,2-GlcNAc的添加，其使用UDP-Gal作为供体底物。GalT活性的引入可通过用包含编码GalT或其功能性片段的核酸序列的载体进行转化来实现，所述核酸序列可来源于人、植物(例如鼠耳芥(Arabidopsis thaliana))、昆虫(例如黑腹果蝇)。GalT或其功能性部分被遗传工程化以包含高尔基体滞留信号并被靶向至高尔基体。示例性高尔基体滞留信号由酿酒酵母Kre2蛋白的前100个氨基酸组成。
Man-II用于从GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖去除末端α-1,3-和α-1,6-甘露糖。末端β-1,2-连接的GlcNAc残基在α-1,3-臂上的存在对于此活性是必需的。Man-II活性的引入可通过用编码经工程化以包含高尔基体定位信号的Man-II蛋白或其功能性片段的核酸载体转化菌株来实现。作为实例，适当的核酸可编码在阅读框内融合至酿酒酵母Mnn2p的高尔基体定位结构域的黑腹果蝇Man-II的催化结构域。
GnT-II催化第二β-1,2-连接的GlcNAc残基至三甘露糖基核心的游离的α-1,6-甘露糖的添加。GnT-II活性的引入可通过用包含编码GnT-I I蛋白或其功能性片段的核苷酸序列的载体进行转化来实现。已从许多物种包括哺乳动物物种克隆了GnT-II基因并可将其用于本发明。作为实例，适当的核苷酸序列编码融合至酿酒酵母Mnn2p的N-末端部分的大鼠GnT-II的催化结构域。
对所述菌株的其它操作
本文中公开的菌株可包含通过多种适当的操作(例如交叉或重组工程化)来实现的另外的特征，包括例如具有突变的营养缺陷型基因(例如his-)以促进克隆和选择，具有蛋白酶缺陷用于限制产物降解(例如pep4-、prb1-和/或sub2-)，具有缓慢的甲醇利用表型(例如mutS)。
在具体的实施方案中，本公开内容提供了下列菌株：
SuperMan5，巴斯德毕赤酵母，och1-，杀稻瘟菌素抗性，来自里氏木霉的甘露糖苷酶I(＝His+)；
SuperMan5(his-)，巴斯德毕赤酵母，och1-，his4-，杀稻瘟菌素抗性，里氏木霉的甘露糖苷酶I；
SuperMan5(mutS)，巴斯德毕赤酵母，och1-，杀稻瘟菌素抗性，来自里氏木霉的甘露糖苷酶I(缓慢甲醇利用)；
SuperMan5(pep4-)，巴斯德毕赤酵母，och1-，杀稻瘟菌素抗性，来自里氏木霉的甘露糖苷酶I(蛋白酶缺陷)；
SuperMan5(prb1-)，巴斯德毕赤酵母，och1-，杀稻瘟菌素抗性，来自里氏木霉的甘露糖苷酶I(蛋白酶缺陷)；
SuperMan5(pep4-，sub2-)，巴斯德毕赤酵母，och1-，杀稻瘟菌素抗性，来自里氏木霉的甘露糖苷酶I(蛋白酶缺陷)；
SuperMan5(pep4-，prb1-)，巴斯德毕赤酵母，och1-，杀稻瘟菌素抗性，里氏木霉的甘露糖苷酶I(蛋白酶缺陷)。
菌株的用途
具有一个或多个N-糖基化位点的异源蛋白可通过用编码所述异源蛋白的表达载体转化本发明的菌株而在本发明的菌株中表达，以获得在其N-聚糖结构上为基本上均质的异源蛋白的制剂。
实施例1-SuperM5菌株的产生
本实施例描述从描述于Jacobs等人(2009),Nature Protocols4:58-70(通过引用并入本文)中的M5-Blast菌株产生SuperM5菌株。
M5-Blast菌株是改良的巴斯德毕赤酵母GS115菌株，其中通过单交叉互换同源重组插入包含α-1,2甘露糖苷酶基因的载体(pGlycoSwitchM5-Blast载体)来破坏内源甘露糖基转移酶基因OCH1。由于单交叉互换同源重组，整合的甘露糖苷酶表达盒侧接了约450bp的来自OCH1ORF的同源序列。该M5-Blast菌株的OCH1基因组基因座的序列示于SEQ ID NO:53中。测序显示在pGlycoSwitchM5-Blast载体序列与OCH1 ORF 3'片段之间的接合处上有10bp的丢失，从而导致来自OCH1 C-末端片段上游的pGlycoSwitchM5-Blast载体的3个期望的终止密码子中的一个的丢失，并且将第二和第三终止密码子移码至与该片段不同的阅读框。因此，实际的ORF向上游延伸了28bp至载体主链中的框内ATG密码子。野生型蛋白的Phe27变成了新ORF的Phe11，并且新的预测信号序列部分地由原来的信号锚定序列和来自载体主链的新的融合序列组成。该新的ORF的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中(其中前25个氨基酸是预测的新信号序列)。
OCH1基因组基因座在单交叉互换同源重组事件后的N-末端区与用于通过双交叉互换同源重组去除此N-末端区的构建体一起图示于图1中。所述构建体包含由lox71-lox66对侧接的选择和反选择标记，从而允许随后的通过cre介导的重组去除选择/反选择盒。具有同源臂双交叉互换选择/反选择盒的序列示于SEQ ID NO:58中，并且其产生描述于本实施例的下文中。
为了在产生交叉互换构建体之前确认靶向区的序列，设计了PCR引物来扩增包含甘露糖苷酶ORF的上游区域的～1650bp的DNA。通过使用Phusion聚合酶(NEB)，PCR引物80670918和80670919从M5-Blast基因组DNA扩增适当大小的片段。将PCR产物进行TOPO克隆并验证了序列。DNA序列显示甘露糖苷酶表达载体已在此插入末端成功地整合至GS115基因组中。
设计了侧翼PCR引物来扩增图1中显示的来自M5-Blast基因组DNA的同源区。这些PCR引物的比对显示于图2中。Phusion聚合酶的使用导致从M5-Blast基因组DNA的成功PCR反应。
将下列引物对组合的PCR产物进行凝胶分离并用作用于添加lox71和lox66重组位点的模板：
80765855-80765856 (642bp,图2A)
80765857-80765858 (658bp,图2A)
80765852-80765854 (910bp,图2B)
80765853-80765854 (956bp,图2B)
设计了错配PCR引物来在两个同源臂的适当末端上添加lox位点。这些错配引物图示于图3中。利用Phusion聚合酶的PCR反应成功地从3个反应的每一个产生正确大小的DNA产物：
80765855-80984794 (670bp,图3A)
80765857-80984794 (681bp,图3A)
80984795-80765854 (850bp,图3B)
除了将lox位点添加至所述臂以外，还设计了PCR引物来将适当的M5-Blast毕赤酵母基因组DNA延伸物添加在现有的lox71-MazF-NatR-lox66盒上。同样地，将Phusion聚合酶用于产生正确的PCR产物，如图4中所显示的。所使用的引物对：
80984793-80984796 (2941bp,图4)
将选择/反选择盒的PCR产物进行凝胶纯化并进行三片段重叠PCR来将同源臂连接至所述盒。简而言之，将所述三片段在不存在引物的情况下循环20×以退火并在片段的末端延伸重叠序列。随后将经循环的混合物稀释并在图5中图示的引物存在的情况下循环35×。
利用Phusion聚合酶使用3分钟的延伸时间来进行PCR反应。引物详述如下：
80765855-80765854 (4311bp,图5)
将该PCR产物进行凝胶分离和TOPO克隆。TOPO克隆的选择在LB-Nat板上进行以确保选择盒的包含。对多个分离物进行DNA测序以测定同源臂序列。最终的分离物包含功能性NatR表达盒、lox71和lox66重组位点以及正确的同源臂。
将图5中详述的克隆片段内部的PCR引物用来产生用于巴斯德毕赤酵母转化的线性DNA。设计了两组独立的引物：
81364233-81364234 (4063bp,图6)
81364235-81364236 (4060bp,图6)
使用Phusion聚合酶利用100秒的延伸时间来进行PCR反应。
将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来纯化并用水从结合基质洗脱。使用标准DTT/山梨醇处理来使M5-Blast巴斯德毕赤酵母菌株感受态化以用于电穿孔。使用包含20μl感受态细胞和1-2μl纯化的线性DNA的1mm比色皿来进行电穿孔。将转化混合物平板接种于YPD-Nat琼脂上。
在电穿孔后，使细胞在30℃生长3天。将个体转化子补缀(patch)至YPD-Nat用于储存和分析。图7显示OCH1基因座在PCR产物至M5-Blast基因组中的适当双交叉互换整合后的理论排列。设计了PCR引物对来核查诺尔丝菌素抗性分离物是同源重组的结果，而不是PCR产物至基因组中的随机整合的结果。这些PCR引物对图示于图7中。
81487116-81487117 (895bp,图7)
81487118-81487119 (937bp,图7)
81487120-81487121 (656bp,图7)
81487122-81487123 (756bp,图7)
通过PCR筛选了总共24个独立的分离物并将2个看起来正确的分离物通过PCR产物的DNA测序来进行进一步的表征。将该两个分离物在YPD培养基上冲击成单菌落并在YPD-Nat上进行再测试。使用苯酚/氯仿玻璃珠裂解来制备小规模基因组DNA制剂。基于对这些基因组提取物的81487116-81487117、81487118-81487119、81487120-81487121和81487122-81487123引物对的测序结果，所述两个分离物均在M5-Blast基因组中的适当位置上包含lox71-lox66选择/反选择盒。用来产生转化片段的起始PCR反应没有引入突变，两个末端上的重组接合点与M5-Blast“野生型”DNA序列是相同的，并且lox71和lox66位点都是完整的。OCH1基因座在双交叉互换重组后的DNA序列示于SEQID NO:59中。
将所述两个分离物(A1-2和A4-3)用组成性表达cre重组酶的质粒进行转化。简而言之，使用DTT/山梨醇程序将两种菌株制成电-感受态，用环状质粒进行电穿孔并在YPD-G418上进行平板接种。在30℃生长转化子数天并挑选菌落。将菌落直接转移至甲醇板以诱导MazF反选择或补缀至YPD以允许cre-ARS质粒在MazF诱导前的丢失。甲醇诱导在BMMY(1％甲醇)和CSM(完全的合成培养基，0.5％甲醇)上进行。通过将100μl甲醇添加至倒置的平板盖来给平板每天补充甲醇。培养在30℃下进行。在所有测试的条件下均有显著的菌落形成；在甲醇上的生长似乎是不依赖于转化子是直接来自于YPD-G418还是经历了在无G418的YPD上的中间补缀的。
Cre重组应当去除lox71和lox66位点之间的DNA序列，从而仅在基因组中留下缺陷lox位点裂痕。该重组事件的理论结果显示于图8中。设计了PCR引物来扩增包含缺陷lox裂痕的区域。通过PCR筛选了在甲醇上生长的20个菌落以测定选择/反选择盒的丢失。所使用的PCR引物是：
80670916-80670917 (680bp,图8)
80670918-80670919 (782bp,图8)
20个分离物中的17个使用第一引物对产生了适当的PCR产物。所述17个中的大多数但非全部还显示了使用第二引物对的适当的产物。将所述17个分离物的每一个补缀至YPD、YPD-Blast、YPD-Nat和YPD-G418以测试药物选择标记的存在或不存在。如果cre质粒已恰当地去除了选择/反选择盒并随后被丢失，那么所得的菌株应当是杀稻瘟菌素抗性的并且对G418和诺尔丝菌素敏感。所有的分离物都是杀稻瘟菌素抗性和诺尔丝菌素敏感性的。一些保留了G418抗性(仍然包含cre质粒，可能被整合了)并将其丢弃。在剩余部分中，挑选出4个用于LEU5-甘露糖苷酶HDEL基因间区域的DNA测序。
将现有的PCR引物用于扩增跨越LEU5和甘露糖苷酶HDEL ORF的基因组区域。
81487118-80765854 (1602bp,图9)
使用Phusion聚合酶对已通过苯酚/氯仿玻璃珠提取进行制备的基因组DNA进行PCR扩增。将多种内部测序引物用于验证1602bp PCR产物的整个序列。所有4个经测序的PCR产物都是正确的，并且在LEU5基因和甘露糖苷酶HDEL ORF之间的适当位置上包含缺陷lox位点。驱使甘露糖苷酶HDEL表达的LEU5启动子和GAP启动子都是完整的并且与存在于起始M5-Blast菌株中的启动子相同。OCH1基因组在双交叉互换重组和cre重组之后的DNA序列示于SEQ ID NO:1中。
制备了所述4个分离物的每一个(和cre重组之前的2个亲代菌株)的甘油储备物。
将每个甘油储备物进行划线并针对适当的标记进行再测试：
所有甘油储备物均如所期望的测试。
产生所有6个分离物的YPD针刺培养物并使其经历糖分析。甘油储备物bG酵母-100017被用于产生大量基因组DNA制剂以用于基因组测序。此外，从野生型GS115和M5-Blast菌株制备了样品。简而言之，将来自100ml酵母培养物(YPD，30℃生长)的细胞沉淀重悬于1M山梨醇/100mM柠檬酸盐(pH6.0)中并用包含RNA酶的Zymolyase(ZymoResearch)在37℃处理2小时。添加SDS至0.5％以裂解原生质球。随后添加蛋白水解酶K并将混合物在50℃温育过夜。添加等体积的苯酚/氯仿并轻柔地摇动混合物30分钟。离心后，去除上面的水层并用异丙醇沉淀DNA。将丝状DNA从溶液中缠绕取出并重悬于TE中。用乙醇重新沉淀DNA并用70％乙醇洗涤，风干并最后一次重悬于TE中。
将DNA分配在多个管中：
为了测试基因组DNA分离物并验证在产生bG酵母-100017菌株的过程中进行的操作未改变OCH1ORF的突变形式，通过PCR从bGDNA-100221(新的菌株)和bG DNA-100223(M5-Blas t菌株)分离OCH1ORF的N-末端区并进行再测序。该两个DNA制剂在OCH1 ORF基因座上是相同的，并且包含如上所述的10bp删除。
本实施例中使用的引物列于下文中：
SEQ ID
实施例2—储存和处理
将SuperM5在-80℃、-4℃、20℃和室温下储存于不同的条件中。将菌株储存为冷冻甘油储备物和穿刺培养物。将不同的培养物储存和解冻用于不同的实验和用于运送至合作者以用于测试。在所有的实例中，菌株的恢复、平板接种和培养均相似于亲代巴斯德毕赤酵母GS115菌株并生长于与亲代菌株相似的复杂和确定培养基中。与亲代菌株相似地转化SuperM5菌株并且以甘露糖-5糖基化作为主要糖形或唯一糖形地表达蛋白。菌株已被重复地储存和再生长以建立SuperM5菌株的健全性。
实施例3-巴斯德毕赤酵母菌株中测试蛋白的分析
使用标准转化方法将南极念珠菌(Candida antartica)脂肪酶A和B、人转铁蛋白和来自IgG的人CH2结构域的基因整合至SuperM5基因组中。在所有的实例中均产生了显著量的蛋白并被分泌至培养基中。使用先前公开的方法测试转化的菌株和含有培养基的蛋白用于聚糖分析。在所有的实例中，测试蛋白和菌株糖蛋白的聚糖分布显示出甘露糖-5聚糖结构并且所使用的方法没有检测到其它更高级的甘露糖结构。
实施例4-巴斯德毕赤酵母菌株中细胞壁甘露糖蛋白的分析
在含2ml YPD的24孔板中开始培养12个巴斯德毕赤酵母菌株和Man5-Blast菌株，在28℃振荡(250rpm)生长过夜。在生长后，通过离心(室温3000g 5分钟)收获细胞并按照Jacobs等人的方案提取细胞壁甘露糖蛋白(参见Jacobs等人,2009,Nature Protocols4(1):58-70)。用RCM缓冲液(8M尿素,3.2mM EDTA,360mM Tris-HCL,PH 8.6)将提取的甘露糖蛋白(100μl ddH20中)稀释至300μl。按照如Laroy等人公开的96孔膜上去糖基化程序从这些样品制备N-聚糖(Laroy等人,2006,Nature Protocols,1:397-405)。
在用8-氨基芘-1,3,6-三硫磺酸2标记干燥的N-聚糖后，使用尺寸排阻色谱法(葡聚糖凝胶G-10树脂2)除去过量的标记物。将样品最终重建于10μl超纯水中并在将其注射(1.2kV 80")至ABI 3130DNA测序仪的毛细管(e.l.36cm；i.d.50μm)中之前稀释10x。应用如下设置：烘箱温度：60℃；运行电压：15kV；预运行电压：180"；运行时间：1000"；预运行时间：15kV。使用Genemapper v3.7来分析所获得的数据并将结构指定至峰(参见图10)。
实施例5-材料和方法
下文描述用于本发明的材料和方法的非限制性实施例。
质粒和菌株：巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA购自InvitrogenCorporation；pUC19/GM-CSF质粒(包含GM-CSF基因序列)由ShanghaiQing-Lan Biotech Co.,Ltd.合成；酿酒酵母表达载体pYES2、巴斯德毕赤酵母X-33(野生型)、大肠杆菌(E.coli)JM109来自本发明人的实验室。
试剂和仪器：Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶、5-荧光乳清酸(5-FOA)购自Shanghai BiologicalEngineering Technology Services Co.,Ltd.；Zymolyase购自Sigmag公司(USA)；N-糖苷酶F(PNGase F)购自New England Biolabs,Inc.(USA)；蛋白胨、酵母提取物、无氨基酸的酵母氮源(YNB)购自BIOBASIC INC(Canada)。PCR仪(PTC100)来自MJ Research,Inc.(USA)；电泳系统、凝胶成像系统来自Bio-Rad(USA)；AKTA纯化系统购自GE(USA)。
引物：基于已报道的毕赤酵母URA3(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)基因序列(GenBank:AF321098)，设计了两对基于同源片段的延伸扩增引物：URA5F、URA5R和URA3F、URA3R；基于酿酒酵母表达载体pYES2序列，设计了引物pYES2F和pYES2R；基于GenBank(E12456)报道的毕赤酵母OCH1基因序列，设计了两对基于同源序列的扩增引物：OCH5F、OCH5R和OCH3F、OCH3R。内部鉴定引物(in)5F、(in)3R也基于相同的序列；通用引物5'AOX1、3'AOX1序列基于参照。引物由Shanghai Biological Engineering Technology Services Co.,Ltd.合成。
酵母细胞培养、基因组提取和PCR条件均基于已知的方案来进行。
URA3同源替换DNA序列的构建：通过使用X-33菌株基因组作为模板和使用引物对URA5F、URA5R和URA3F、URA3R，PCR扩增URA3基因两侧的同源片段URA5'和URA3'(分别为700bp和600bp)。随后使用URA5'和URA3'作为模板和使用URA5F和URA3R作为引物对，PCR扩增URA3基因的靶同源替换DNA片段URA5-3，其大小为约1300bp。
pYXZ质粒的构建：通过使用质粒pYES2作为模板和使用引物对pYES2F和pYES2R，PCR扩增包含URA3基因的序列。纯化PCR产物并用Sal I进行消化，随后进行连接反应。将自连接的质粒pYXZ转化至大肠杆菌JM109中，并平板接种于包含氨苄青霉素的LB平板上以选择阳性克隆。
OCH1同源臂的克隆：通过使用X-33菌株基因组作为模板和使用引物对OCH5F、OCH5R和OCH3F、OCH3R，PCR扩增OCH1基因同源臂的5'和3'末端OCH5'和OCH3'及其融合片段OCH3-5。所使用的方法与上文描述的相似。片段大小分别为1000bp、700bp和1700bp。
敲除质粒pYXZ-OCH1的构建：本发明人用Nhe I和Sal I消化OCH1基因5'和3'同源融合片段OCH3-5并将片段克隆至用Sal I和Nhe I消化的pYXZ质粒中以制备敲除质粒pYXZ-OCH1。
敲除巴斯德毕赤酵母X-33的URA3基因以构建营养缺陷选择标记：使用具有针对URA3基因的两个末端的同源序列的融合片段URA5-3臂来电激转化X-33感受态细胞；将转化的细胞散布在含有5-FOA和尿嘧啶的MD培养基(YNB 1.34％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，尿嘧啶100μg/mL，5-FOA 1mg/mL)上，并在30摄氏度温育3-5天。选择培养基上生长的单菌落并用牙签分别接种至MD培养基(YNB 1.34％，葡萄糖2％，琼脂1.5％)和MDU培养基(YNB 1.34％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，尿嘧啶100μg/mL)，在30摄氏度温育3-5天。随后，选择在MDU培养基上良好生长但不能在MD培养基上生长的菌株。将选择过程重复3轮以得到稳定性状并通过PCR反应使用URA5F、URA3R作为引物和基因组DNA作为模板来确认最后的菌株。
巴斯德毕赤酵母X-33的OCH1基因敲除：将敲除质粒pYXZ-OCH1在位于两个同源臂之间的Mlu I位点上线性化并电激转化至X-33(ura3-)感受态细胞中，散布于MD培养基上，并在25摄氏度温育约1周。用牙签挑选单菌落并接种至两个具有YPD培养基(蛋白胨2％、酵母提取物1％、葡萄糖2％、琼脂1.5％)的平板上的相同坐标处，分别在25摄氏度和37摄氏度温育数天。提取在25摄氏度良好生长但不能在37摄氏度生长的菌落以获得基因组DNA。将OCH1基因外部引物OCH5F、OCH3R和内部引物(in)5F、(in)3R用于PCR鉴定。
表达载体的构建：用EcoRI和Not I双重消化来自本发明人自己的实验室的质粒pUC19/GM-CSF。提取GM-CSF基因片段(引入了6xHis标签序列)，并克隆至用相同的限制性内切酶消化的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中以制备表达载体pPICZαA/GM-CSF。利用限制性内切酶消化和测序来选择和确认阳性克隆。
GM-CSF在巴斯德毕赤酵母X-33和X-33(och1-)中的表达和分析：用Sal I线性化表达载体pPICZαA/GM-CSF并将质粒电激转化至X-33和X-33(och1-)感受态细胞中。将电激混合物散布至用YPDZ培养基(各自包含100μg/mL、300μg/mL或500μg/mL Zeocin)涂覆的培养布，在30摄氏度生长X-33转化子3-5天，并在25摄氏度培养X-33(och1-)转化子约一周。挑选良好生长的单菌落以提取基因组DNA并使用引物5'AOX、3'AOX1利用PCR反应来鉴定以选择阳性转化子。将阳性X-33/PICZαA/GM-CSF细胞接种至2mL YPD培养基(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)中，在30摄氏度温育24小时。将培养物用于接种(5％接种比率)至10mL的BMGY培养基(2％蛋白胨、酵母提取物1％、YNB 1.34％、甘油2％、100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH 6.0)中。在30摄氏度温育36小时后，将培养物离心以去除上清液并将沉淀物重悬于3mL BMMY培养基(酵母提取物1％、YNB 1.34％、蛋白胨2％、100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH 6.0)中，添加2％甲醇以诱导表达：将X-33(och1-)/pPICZαA/GM-CSF阳性细胞在YPD培养基中于25摄氏度培养48小时，BMGY中于25摄氏度培养48小时，并于25摄氏度诱导表达。表达诱导条件与X-33细胞中使用的条件相同，每24小时添加甲醇，诱导进行72小时。完成后，将细胞培养物离心并收集上清液用于蛋白分析。
实施例6-M5-BLAST和SUPERM5菌株的转录组分析
用于RNA分离的菌株生长。在YPD琼脂平板上维持BG10、GS115、M5Blast和SuperM5(描述于实施例1中)菌株为斑块(patch)。对于转录组分析，从斑块接种每种菌株的50ml培养物并在BMGY中于30℃、200rpm生长约16小时。将静止培养物稀释100倍至新鲜的BMGY培养基中并于30℃、200rpm生长6小时。该时间点是所认为的指数生长，其中甘油为碳源。在15ml管中将等分部分旋转下来，丢弃上清液并将细胞沉淀物快速冷冻在液氮中。将细胞沉淀物储存在-80℃用于后续的总RNA分离。
总RNA分离。将FastRNA SPIN试剂盒(MP Bio)用于分离总RNA。使用BioSpec Mini-Beadbeater 96进行细胞裂解。将总RNA从旋转柱上洗脱至15μl不含RNA酶/DNA酶的水中、冷冻于液氮中并储存于-80℃。将RNA样品在干冰上运送用于在Illumina HiSeq仪上进行RNA-Seq分析。使用Agilent BioAnalyzer分析RNA样品，所有样品均显示完整的酵母核糖体RNA峰。
RNA文库产生和测序。使用Illumina试剂制备mRNA文库。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒来从polyA RNA选择性产生条码cDNA。在条形编码和扩增后，集合总共12个样品(4个样品用于此研究)用于分析。进行50碱基、单末端读数。将数据以标准FASTQ形式提供至BioGrammatics。基于不明确的碱基和质量得分来平衡读数并随后进行滤过以排除所有长度小于40碱基的平衡读数。从每个数据组去除了约0.3％的读数。
将CLC Genomics Workbench的RNA-Seq算法用于将每个数据组的读数针对BG10野生型注释序列进行作图。注意BG10基因组不包含存在于Man5和SuperM5菌株中的甘露糖苷酶和杀稻瘟菌素抗性基因的表达盒。
基因表达分布。将来自4个菌株的每一个的表达分布进行作图和分组。评价散点图(具有R-值)以用于菌株间总体表达分布的比较。BG10和GS115菌株显示最紧密的相关性(R-值＝0.98)，随后是Man5和SuperM5菌株)(R-值＝0.95)。在OCH1突变菌株相对GS115(对于Man5和SuperM5的R-值分别为0.92和0.84)中观察到微小的总体上调。总体上，当在甘油上生长时基因表达模式在3个菌株(GS115、M5和SuperM5)之间是相似的。
从针对BG10菌株进行作图的每个RNA-Seq数据组，提取OCH1作图。在BG10和GS115菌株中，覆盖规模为0至约75。OCH1的表达水平是大致相等的。测序读数在开放阅读框间大致相等地分布。这两种菌株中OCH1的表达水平大致为最高表达基因的水平的0.2％。
对于SuperM5菌株，覆盖规模为0-47。表达水平下降至BG10和GS115菌株的水平的大致一半。同样的，没有开放阅读框的N-末端的覆盖。该覆盖的缺乏是这些DNA序列从SuperM5菌株的完全删除的结果。
对于Man5菌株，覆盖规模为0-502。开放阅读框的N-末端部分的覆盖显著高于C-末端部分。此不连续的覆盖是Man5菌株中开放阅读框的大多数N-末端部分的复制的结果。ORF的N-末端部分从甘露糖苷酶ORF上游的DNA表达并且该ORF的C-末端部分的突变形式表达在甘露糖苷酶和杀稻瘟菌素抗性ORF的下游。基于读数覆盖，Man5中ORF的C-末端部分的丰度似乎比SuperM5中要略微更少。
Man5和SuperM5数据针对OCH1 ORF的突变形式的作图显示两种菌株中突变OCH1 ORF的完全覆盖，从而指示基因表达。出于上文对于野生型OCH1 ORF作图所描述的相同原因，Man5菌株在ORF的N-末端部分中显示额外的覆盖。
Man5和SuperM5数据针对甘露糖苷酶ORF的作图显示两种菌株中相似的表达水平。
结论。已对GS115、Man5和SuperM5菌株进行了转录组分析。所述菌株显示相似的总体基因表达模式。在Man和SuperM5菌株中，表达了OCH1 ORF的突变形式(存在多腺苷酸化的mRNA)。甘露糖苷酶HDEL ORF在两种菌株中以大致相同的水平表达。
实施例7-M5-Blast相似的和SuperM5菌株中的曲妥珠单抗表达
在研究1中，用编码曲妥珠单抗的表达载体通过电穿孔转化实施例1中描述的SuperM5菌株。使用AOX1引物和赫赛汀特异性引物通过基因组PCR筛选Zeocin抗性菌落。培养基因组PCR的阳性克隆并通过SDS-PAGE评价培养上清液的Man5-型曲妥珠单抗表达。
在研究2中，筛选用编码曲妥珠单抗的表达载体转化的毕赤酵母菌株以选择表达高水平曲妥珠单抗的菌株。用质粒(pGlycoSwitch-M5/2(GAP,BSD),由Gent University提供)通过电穿孔转化所选择的菌株。通过用于检测OCH1基因座中的pGlycoSwitch-M5插入和MDS1基因存在的基因组PCR筛选杀稻瘟菌素S-抗性菌落。培养基因组PCR的阳性克隆并通过SDS-PAGE评价培养上清液的Man5-型曲妥珠单抗表达。
在研究3中，在1L带挡板的烧瓶中培养研究1(克隆46)和研究2(克隆11)中获得的阳性克隆。通过用含甲醇的培养基进行替换来诱导曲妥珠单抗表达。甲醇诱导后72小时，使用蛋白A-亲和树脂从培养上清液纯化曲妥珠单抗。来自克隆46和克隆11的曲妥珠单抗的生产率分别为3mg/L和1.3mg/L培养物。
在研究4中，分析了克隆46(研究1)和克隆11(研究2)中产生的曲妥珠单抗的N-聚糖结构。在第一分析中评估N-聚糖结构的均质性，在第二分析中根据搜索N-聚糖数据库和与标准样品一起的HPLC注射来鉴定N-聚糖结构。根据这些分析，从克隆46(研究1)获得的曲妥珠单抗的N-聚糖是实质上均质的并且从MALDI-TOF质量分析评估主要的(或基本上唯一的)N-聚糖为Man5GlcNac2(图11)。从克隆11(研究2)获得的曲妥珠单抗的N-聚糖结构被发现为Man5GlcNAc2至Man8GlcNAc2的混合物。
表7.从研究2获得的曲妥珠单抗的N-聚糖分析
通过ELISA和BIAcore测定与商购赫赛汀平行地分析从克隆46获得的Man5-型曲妥珠单抗的Her2结合亲和力，发现具有与商购赫赛汀相似的HER2结合活性。参见图12和表8。
表8.在BIAcore上分析的曲妥珠单抗的动力学参数
实施例8-M5-Blast和SuperM5中表达的另外的糖基化蛋白的分析
将由AOX1启动子驱动的针对南极念珠菌脂肪酶A和B(CalA，2N-糖基化基序和CalB,1N-糖基化基序)以及针对人血清转铁蛋白(2N-糖基化基序)的基因通过同源重组在AOX1基因座上整合至M5-Blast菌株以及SuperM5菌株(均描述于实施例1中)的基因组中(通过Zeocin选择)。将具有紧靠于由AOX1启动子驱动的编码天然毕赤酵母PDI的合成基因的用于组氨酸营养缺陷型的互补盒的质粒进行共转化。用Zeocin在固体最小培养基上进行选择。
培养上述每个组合的47个转化子并就分泌的蛋白在microCE(毛细管电泳,GXII,CaliperLS)上的迁移行为中的明显变化来针对蛋白丰度和质量进行筛选。将模拟菌株上清液(GS115)用作阴性对照。
从SuperM5菌株分泌的所有3种蛋白均显示出相较于M5-Blast菌株可比较的表达水平。此外，来自microCE上的SuperM5上清液的靶蛋白信号显示出比来自M5-Blast上清液的靶蛋白信号减少的迁移时间，从而迁移至较低的表观分子量。据信来自SuperM5的分泌蛋白的改变的N-糖基化在微小规模上导致较低的分子质量。
对来自微量培养物的上清液和来自生物反应器中的培养物的上清液的样品分析了其N-聚糖组成。从获自微量培养物的样品，用两倍体积的RCM缓冲液(8M尿素,3.2mM EDTA,360mM Tris-HCL,PH 8.6)稀释0.5ml的培养基。从生物反应器样品，使用0.2ml培养基。按照如Laroy等人(同上)公开的96孔膜上去糖基化程序从这些样品制备N-聚糖。在用8-氨基芘-1,3,6-三硫磺酸标记干燥的N-聚糖后，使用尺寸排阻色谱法(葡聚糖凝胶G-10树脂)除去过量的标记物。将样品最终重建于10μl超纯水中并在将其注射(在1.2kV进行80")至ABI 3730 DNA测序仪的毛细管(e.l.36cm；i.d.50μm)中之前稀释10x。应用如下设置：
烘箱温度：60℃ 运行电压：15kV
预运行电压：180" 运行时间：1000"
预运行时间：15kV
使用Genemapper v3.7来分析所获得的数据并将结构指定至峰。
如图13-15中所显示的，从SuperM5菌株产生的蛋白的N-聚糖是基本上均质的，其中Man5GlcNAc2是主要的N-聚糖。相反，从M5-Blast(尤其是从生物反应器中的培养物)产生的蛋白的N-聚糖是相当异质性的。
实施例9
在本实施例中，通过使实施例1中描述的SuperM5菌株与具有不同遗传背景的野生型巴斯德毕赤酵母菌株进行交配来产生双倍体菌株。两种遗传背景的组合允许确定是否OCH1破坏表型的第二位点抑制子或增强子存在于任一菌株中。所述双倍体通过使用每种单倍体菌株中的相同基因组位置中的两个显性可选标记来“保持在一起”。在双倍体OCH1基因座上，此菌株转录两种不同的mRNA；一种编码野生型Och1p(来自野生型单倍体基因组拷贝)而另一种编码突变Och1p(来自SuperMan5单倍体基因组拷贝)。
构建了包含潮霉素B选择标记的双交叉互换载体，其用V5附加表位替换Och1p的高度保守区。该载体被设计来使得至双倍体基因组中的整合将(以大致50/50的分布)替换Och1p的野生型或突变形式中的高度保守结构域，从而在相同的起始遗传背景中产生两种表位插入。在其中载体整合至OCH1的SuperM5基因组拷贝的情形中，载体上的药物选择标记将紧密连接至现有的相邻于OCH1的杀稻瘟菌素标记。基因组PCR和DNA测序可用于验证两种二倍体菌株的构建，一种具有野生型而一种具有已附加表位的Och1p的突变形式。
使双倍体生成孢子并生长和分析任意孢子。在非选择性培养基上生长后，将所得的单倍体菌落针对潮霉素B抗性进行评分。潮霉素B抗性单倍体的分布和生长特征可确定通过表位插入的Och1p失活的致死性或生长缺陷性。
方法-将在prb1Δ基因座上具有Zeocin抗性标记的现有SuperMan5菌株与在prb1Δ基因座上具有诺尔丝菌素抗性标记的BG10单倍体菌株进行交配以产生起始的双倍体菌株。BG10菌株从prb1Δ敲除DNA构建体产生。
构建了潮霉素B载体以用14个氨基酸的V5表位(GKPIPNPLLGLDST,SEQ ID NO:93)替换Och1p中的14个氨基酸(LFARGGLYADMDTML,SEQID NO:92)。这在整合入基因组中时保留了Och1p的野生型和突变形式的全长编码区。
潮霉素B载体通过同源重组整合至双倍体基因组中。基因组DNA的PCR筛选可用于验证在其上发生同源重组的染色体(SuperMan5或BG10)和位置。对来自阳性菌株的PCR产物进行测序以验证V5标签对Och1p的14个氨基酸结构域的替换，从而确保各自的ORF长度保留在两个拷贝的每一个中。
将上述两种菌株生长和产生孢子，通过针对prb1Δ基因座上的一种或另一种药物标记的敏感性来验证所得的单倍体。可视觉上筛选单倍体在平板水平上的生长表型，并且如果观察到显著的生长分布，则针对在SuperMan5或BG10 och1基因座的任一或两个上的V5标记的构建体的存在进行评分。如果所有的单倍体同等地良好生长，则可针对潮霉素B标记的存在对其进行评分。在孢子形成和随后的萌发上潮霉素B标记的丢失将表示V5表位至Och1p蛋白中的插入在野生型和突变情形中都是致死的。
通过Western印迹检测双倍体菌株和(若存活)所得的单倍体的上清液和提取物中的V5标记蛋白。作为另外的实验，可通过双倍体细胞上的免疫荧光来进行Och1p的野生型和突变V5标记形式的亚细胞定位。
如本文中所用，术语“约”是指所引数字的±10％。
本发明的多种变化，除本文中描述的那些以外，将根据前文描述而对本领域技术人员是明显地。这样的变化还意欲落入所附权利要求的范围之内。本申请中引用的每个参考资料均通过引用以其整体并入本文。
虽然已显示和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将显而易见的是可对其进行修饰而不超出所附权利要求的范围。因此，本发明的范围仅受到所附权利要求的限制。
所附权利要求中记载的参考数字仅用于方便本专利申请的检查，并且是示例性的，并且不意欲以任何方式将权利要求的范围限制至具有附图中的相应参考数字的特定特征。
表1.SEQ ID NO:1。
表2.SEQ ID NO.2
表3.
表3.接上页
表3.接上页
表3.接上页
表4.SEQ ID NO:53
表5.SEQ ID NO：54(上方)和SEQ ID NO：55(下方)
氨基酸序列
MAKADGSLLY YNPHNPPRRY YFYMAIFAVS VICVLYGPSQ QLSSPKIDYD
PLTLRSLDLK TLEAPSQLSP GTVEDNLRRQ LEFHFPYRSY EPFPQHIWQT
WKVSPSDSSF PKNFKDLGES WLQRSPNYDH FVIPDDAAWE LIHHEYERVP
EVLEALDAHR NAVKVRMEKL GLI
DNA序列
ATGGCGAAGG CAGATGGCAG TTTGCTCTAC TATAATCCTC ACAATCCACC
CAGAAGGTAT TACTTCTACA TGGCTATATT CGCCGTTTCT GTCATTTGCG
TTTTGTACGG ACCCTCACAA CAATTATCAT CTCCAAAAAT AGACTATGAT
CCATTGACGC TCCGATCACT TGATTTGAAG ACTTTGGAAG CTCCTTCACA
GTTGAGTCCA GGCACCGTAG AAGATAATCT TCGAAGACAA
TTGGAGTTTC ATTTTCCTTA CCGCAGTTAC GAACCTTTTC CCCAACATAT
TTGGCAAACG TGGAAAGTTT CTCCCTCTGA TAGTTCCTTT CCGAAAAACT
TCAAAGACTT AGGTGAAAGT TGGCTGCAAA GGTCCCCAAA TTATGATCAT
TTTGTGATAC CCGATGATGC AGCATGGGAA CTTATTCACC ATGAATACGA
ACGTGTACCA GAAGTCTTGG AAGCTCTAGA TGCTCACCGC
AATGCTGTTA AGGTTCGTAT GGAGAAACTG GGACTTATTT AA
表6.SEQ ID NO：56(上方)和SEQ ID NO：57(下方)
氨基酸序列
MRSDLTSIIV FAVSVICVLY GPSQQLSSPK IDYDPLTLRS LDLKTLEAPS
QLSPGTVEDN LRRQLEFHFP YRSYEPFPQH IWQTWKVSPS DSSFPKNFKD
LGESWLQRSP NYDHFVIPDD AAWELIHHEY ERVPEVLEAF HLLPEPILKA
DFFRYLILFA RGGLYADMDT MLLKPIESWL TFNETIGGVK NNAGLVIGIE
ADPDRPDWHD WYARRIQFCQ WAIQSKRGHP ALRELIVRVV
STTLRKEKSG YLNMVEGKDR GSDVMDWTGP GIFTDTLFDY
MTNVNTTGHS GQGIGAGSAY YNALSLEERD ALSARPNGEM LKEKVPGKYA
QQVVLWEQFT NLRSPKLIDD ILILPITSFS PGIGHSGAGD LNHHLAYIRH
TFEGSWKD
DNA序列

Claims (16)

1.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的经工程化的稳定菌株，其包含：
被转录为编码突变型OCH1蛋白的mRNA的突变OCH1等位基因，所述突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域和相较于野生型OCH1蛋白改变突变型OCH1蛋白的高尔基体定位的N-末端序列，其中所述菌株产生基本上均质的N-聚糖。
2.权利要求1的菌株，其中包含催化结构域的所述突变型OCH1蛋白的C-末端片段与SEQ ID NO:2的氨基酸45-404具有至少95％的同一性。
3.权利要求1的菌株，其中所述突变型OCH1蛋白缺乏用于将所述突变型OCH1蛋白靶向至高尔基体的N-末端序列。
4.权利要求3的菌株，其中所述突变型OCH1蛋白在N-末端区上缺乏膜锚定结构域。
5.权利要求1的菌株，其中所述突变型OCH1蛋白中膜锚定结构域的缺乏是OCH1野生型蛋白的N-末端部分的删除的结果，其中被删除的部分包含野生型OCH1蛋白的膜锚定结构域的一个或多个氨基酸。
6.权利要求5的菌株，其中所述删除部分还包含野生型OCH1蛋白的胞质尾区的一个或多个氨基酸。
7.权利要求1的菌株，其中所述突变型OCH1蛋白包含如SEQ IDNO:3所示的序列。
8.权利要求1的菌株，其中所述突变OCH1等位基因存在于染色体上。
9.权利要求8的菌株，其中所述突变OCH1等位基因取代OCH1基因座上的野生型OCH1等位基因。
10.权利要求1的菌株，其中所述突变OCH1等位基因被维持在质粒上，并且其中染色体上的野生型OCH1等位基因已被破坏。
11.权利要求1的菌株，其中所述菌株产生基本上均质的以Man8GlcNAc2为主要的N-聚糖形式的N-聚糖。
12.权利要求1的菌株，其中所述菌株还包含编码和表达α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸。
13.权利要求12的菌株，其中所述编码和表达所述α-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸被整合在所述菌株的OCH1基因座上。
14.权利要求13的菌株，其中所述OCH1基因座包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
15.权利要求12的菌株，其中所述菌株产生基本上均质的以Man5GlcNAc2为主要的N-聚糖形式的N-聚糖。
16.权利要求1或权利要求12的菌株，其还包含编码和表达异源蛋白的核酸。
CN201380055395.9A 2012-10-23 2013-10-23 产生显著均质的聚糖结构的巴斯德毕赤酵母菌株 Pending CN104797703A (zh)

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