CN104762233B - 垃圾堆肥中草坪耐旱强化复合微生物菌群的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种垃圾堆肥中草坪耐旱强化复合微生物菌群的制备方法及应用。其中耐旱微生物菌株的获得采用的是PEG6000模拟干旱胁迫来强化堆肥中的微生物。强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪耐旱应用提供技术支撑。

Description

垃圾堆肥中草坪耐旱强化复合微生物菌群的制备方法及应用

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及一种垃圾堆肥中耐旱强化复合微生物菌群的制备方法及应用。

背景技术

微生物菌剂尤其是由多种微生物组成的复合微生物菌剂是近年来发展起来具有广泛应用前景的生物技术。微生物菌剂不仅可以修复石油污染的土壤和降解水体中的有机污染物，还可以防治病虫害，促进作物生产和增产增收，有些微生物菌剂可以提高植物的抗逆性自20世纪70年代以来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品。其中20世纪80年代由日本琉球大学教授研制的EM（有效微生物群）获得了极大的成功，已经广泛应用在90多个国家涉及植业养殖业及环境净化方面，并取得了显著的经济效益和社会效益。基于微生物菌剂在一些发达国家研究和推广得较早，相关技术较为成熟，应用也更普遍。近年来，国外也没有再出现像EM那样可以在全世界都引起很大效应的微生物菌剂。

相对于国外发达国家相关微生物菌剂的研究，我国是从20世纪80年代才开始微生物菌剂的相关研究，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个菌种的复合应用，也相继取得了一些成果。南京农业大学生物防治产品主要有防治黄瓜根结线虫病害的蜡质芽孢杆菌AT31菌剂（使命/线灭，LS20120060）、防治蔬菜土传病害的微生态制剂（蔬得康）、宁盾系列产品，已获生物肥料正式登记。山东生物所木霉菌剂（防治灰霉病）、湖南植保所光合细菌（促进光合作用）、镇江润州短吻杆菌（防治鳞翅目害虫）以及宁夏诺得曼生物技术公司根瘤菌（促进豆科植物生长）等。最近几年，国内有很多关于复合菌剂研制的报道，主要利用微生物净化环境，降解有机污染、提高粮食产量和提高植物抗性等方面。有研究表明利用从水产养殖的优良水质中分离得到的优势菌种研制出水质净化剂，将其用于淡水鱼养殖池中，对降低水体中的COD，NH₃-N，亚硝酸盐等起到了理想的效果。还有研究表明，微生物菌肥均能在适宜的浓度下不同程度的促进生菜的生长，改善生菜品质，降低硝酸盐含量。但这些大都还处于试验研究与初步应用水平，还没有广泛应用于实际。生防菌本身具有固氮、解磷、解钾的作用，刺激植物产生适量生长素；降解大分子有机物，提高有机肥利用率；微生物菌剂就像是植物的开胃剂；保护细胞膜的完整性、维持较高水平的根系活力和叶绿素含量，这方面就不光是一个促生的作用，也有一种抗逆的作用。微生物菌剂诱导植物体内多种抗逆基因的表达，显著提高植物体的抗氧化酶活性。同时微生物菌剂可以防止作物收获后产生病害，诱导抗逆基因表达，诱导SOD等多种相关物质的产生。所以，微生物菌剂对于改善植物在逆境即盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫条件下的建植有积极的影响。

草坪草除了具有美化环境、净化空气、防止水土流失、保持生态平衡、给人们提供休息和运动场所等功能外，尚有调节小气候的作用。然而草坪草同其它植 物一样，常遭受不良环境的影响，如干旱、高温、低温、盐渍等逆境都会抑制草坪草的生长，使草坪质量下降。尤其是盐碱、低温（冷害）和干旱是强烈限制草坪生长的3大非生物因素。

干早胁迫是指植物所消耗的水分高于植物吸收的水分时，造成了植物体内水分亏缺，胁迫时间增加导致水分过度亏缺的现象。干旱胁迫亦是限制草坪植物生长的重要因素。在干旱胁迫条件下，植物体的生理指标变化主要体现在植物的生长受到抑制，包括地上部的生长量、叶面积指数、植物的高度等；植物的光合作用受到影响，即光合速率降低了；植物体内的生长素赤霉素含量降低了，脱落酸含量升高了；植物体内积累了大量的脯氨酸；植物体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性均降低了。植物体内水分分配出现异常，抑制植物生长，更为严重的是引起植株机械性损伤导致植株死亡。有研究表明：干旱胁迫下草坪草叶片相对含水量和叶绿素含量显著下降，丙二醛、可溶性糖和游离的脯氨酸含量显著上升。胁迫到一定程度后，需对其进行浇水养护，防止其萎蔫枯黄。针对干旱问题，目前研究主要集中于选取抗旱性强的草坪植物、节水灌溉方式以及覆盖保水、应用抗旱剂浸种和保水剂拌种等方面，亦有研究者利用氮磷钾肥来提高草坪草抗旱性。随着我国城市绿化面积的增加，绿化灌溉用水与城市供水之间的矛盾日益突出。草坪经常因缺水而出现枯黄，甚至死亡，这已经成为制约城市绿化草坪质量的瓶颈。因此研究如何更好地提高植物的抗旱性是缓解城市用水矛盾、提高城市绿化质量的根本出路。

城市生活垃圾堆肥是自然界中的微生物，比如说是细菌和真菌等，通过它们的生理代谢，可以加快对有机物的分解速度，进而将其变成腐植酸的过程。城市生活垃圾堆肥有氧处理过程中，会产生大量的热量，垃圾中的有机物被分解完成，同时也杀死了垃圾中的病菌等，而产芽孢的杆菌能够大量存在。各种微生物对有机物分解能力和分解速度是不尽相同的，随着温度、季节的变化，堆肥过程中的微生物群落和数量亦不相同；且已有研究表明，堆肥中的微生物群落是相当复杂的。堆肥中微生物数量及种群分布与堆肥有机物质成分和含量、微生物间的相互作用等多种因素密切相关。有人研究接种外源菌剂对堆肥中微生物数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供了依据。猪粪秸秆堆肥复合微生物菌剂能够更有效地促进和优化堆肥过程迅速提高堆体温度提高最高温度延长高温期时间并能更有效地提高堆体养分水平。牛粪堆肥试验表明，添加本源菌剂能快速提高堆肥温度，促进堆体发酵腐熟，缩短堆制时间；从纤维素和半纤维素降解率看，添加菌剂处理后明显比未添加菌剂的对照处理强，由此可见，添加微生物菌剂有利于牛粪堆肥腐熟。而针对从固体废气物基质中提取微生物菌种，并将其用于实验和生产中，还有人分别从鸡粪发酵和牛粪中筛选出高效降解菌并配制成相应的复合微生物菌剂，为复合微生物菌剂的应用奠定了一定的基础，这对前期堆肥微生物菌剂的配置都提供了依据。近期的相关文献及生产表明：微生物菌剂作为成为一种新型的生物技术已经应用到我们的社会生活和生产当中。尤其是微生物菌剂在促进植物生长、提高植物抗性等方面的研究不胜枚举。但是关于微生物菌剂的来源与制备，大多数研究者也仅仅只限于从土壤或污泥中提取和筛选。有关堆肥中微生物菌落结构、堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性。强化制备垃圾堆肥中微生物菌种，将强化堆肥微生物菌种作为接种剂，配制成不同浓度的强化复合微生物菌剂接种应用，将具有重要的意义。

从生活垃圾堆肥（以下简称堆肥）中筛选出有效菌株，再配制成相应微生物菌剂，具有广泛的应用前景。一些研究表明城市生活垃圾堆肥过程中发现，在有机物被分解的过程中，生物群落也发生了重要的变化，主要是致病菌大量减少，而产芽孢的杆菌则数量剧增。生活垃圾在经过高温发酵处理后得到的堆肥酸性变大而且含盐量变高，因此处于高渗体系环境中的微生物具有一定的耐酸、耐盐和耐高温特性。不论是一般的微生物菌剂，还是堆肥微生物菌剂中菌种的选育，都是直接从自然环境（或堆肥）中筛选出有效的菌株，再配制成微生物菌剂应用于相应的领域。而将自然环境（或堆肥）中的微生物经过某些特定方向的强化，进而得到一些高效强化微生物菌剂的研究尚无报道。

发明内容：

耐旱微生物菌株的获得采用的是PEG6000模拟干旱胁迫来强化堆肥中的微生物。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪耐旱应用提供技术支撑。发明内容

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种垃圾堆肥中耐旱强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1；

（2）培养基：

1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg；

（3）菌种的富集：

将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；

（4）耐旱复合微生物菌群的强化：

混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法进行，在强化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以50 g/L的梯度增加，最终目标是250 g/L； PEG6000的浓度分别为（w/w）5%、10%、15%、20%和25%，每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长量稳定后，继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群；

（5） 强化复合微生物的分离及纯化：

1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30µg/ml，混均匀后分别倒平板；

2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成（µg/ml）10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6µg/ml几种浓度的稀释液；

3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；

4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；

（6）平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。其中得到强化复合微生物菌群指的是：蜡状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母。

本发明进一步公开采用此方法制备的强化复合微生物菌群在提高中度和重度干旱胁迫下草坪草抗旱能力方面的应用；特别是在中度和重度干旱胁迫下高羊茅保护酶活性、在降低中度和重度干旱胁迫下高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。

本发明更加详细的制备方法如下：

1研制材料与方法

1.1材料：

生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂。堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12%，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85 g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1。

1.2培养基

富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基（配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml）；

马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基（临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg）。

1.3菌种的富集

将堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为混合微生物菌群。

1.4微生物的强化

混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法。未经过强化的混合菌群一般在无PEG6000的条件下生长较好，在强化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以50 g/L的梯度增加，最终目标是250 g/L；即在本实验中PEG6000的浓度分别为（w/w）5%、10%、15%、20%和25%。每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长量稳定后，才能继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群。

1.5强化微生物的分离及纯化

1.5.1稀释涂布平板法

1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为30µg/ml），混均匀后分别倒平板。

2)制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6几种浓度的稀释液。

3)涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。

4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养。

1.5.2平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化。直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤。

1.6强化微生物的鉴定

按照Ezup柱式试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系：10×Buffer（with MgCl₂）2 µL，dNTP（10mmol/L）0.4µL，341f（10µmol/L）1µL，534r（10µmol/L）1µL，Taq酶（5u/µL）0.4µL，模板DNA 1µL，加超纯水定容至终体积20µL。PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。引物为341f（5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAGCAG-3′）和534r（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）。优势真菌的PCR反应体系：10×Buffer（without MgCl₂）2 µL，MgCl₂（25mmol/L）1.6µL，dNTP（10mmol/L）0.4µL，Geo11（10µmol/L）0.4µL，GeoA2（10µmol/L）0.4µL，Taq酶（5u/µL）0.2µL，模板DNA 1µL，加超纯水定容至终体积20µL。PCR反应条件：94℃4min预变性，94℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸7min。引物为GeoA2 （5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）和Geo11 （5′-ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3′）。将得到的PCR产物送到北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。

2研制结果分析

2.1强化耐旱微生物曲线的测定

对在各PEG6000浓度的培养基中培养的菌群，分别在刚转接时测其OD值，即为菌体的OD初值。以后每隔一定时间（PEG6000浓度在15%以下的菌种间隔8小时，20%和25%PEG6000浓度下的菌种间隔24小时）测一次菌体的OD值，绘制OD—时间曲线图。

（1）直接升高PEG6000浓度下微生物菌群生长曲线

由图1可见，在无PEG6000的浓度下，菌群的适应期很短，很快就达到对数生长期，最大生长值也是最高的。随着PEG6000的浓度升高，菌群的适应期逐渐增加，达到最大生长值所需的时间也相应增长，最大生长值也随之降低。 在高PEG6000浓度下，菌群需要一个相对较长的适应期才能达到对数生长期，达到最大生长值的时间也最长，而且最大生长值也为最低。

结果说明，堆肥中的混合菌群随着PEG6000浓度的升高生长状况逐渐变差（适应期增长），达到最大生长值的时间也相应延长，最大生长值也随之降低。 这是因为初始接种菌群的PEG6000浓度很低，随着PEG6000浓度的升高，菌体要承受PEG6000浓度带来的压力，需要一个适应过程。由于菌体的生长是一个缓慢的过程，而PEG6000浓度的升高是一个剧变的过程，菌群对PEG6000浓度的变化是逐渐适应的。随着PEG6000浓度的升高，大量不能适应的个体会死亡，此时会出现一个适应期，能适应高PEG6000浓度的菌群将会生存下来，并继续大量繁殖，所以在适应期后会出现对数生长期。

（2）逐步提高PEG6000浓度下微生物菌群生长曲线

从图2中可以看出，经过上述低PEG6000浓度下强化的菌群进行转接后，适应期会缩短（与未经过强化的相比），很快就进入到对数生长期，达到最大生长值所需要的时间也缩短了，而且最大生长值也有所提高。

经过逐步提高PEG6000浓度的方法强化的混合菌群，已经适应了前一个相对较高PEG6000浓度的环境。而且由于转接是在菌群的对数生长期进行的，且转接后新培养基的营养丰富，菌群的生长稳定、迅速，与直接升高PEG6000浓度的方法相比，适应期也相应缩短，很快就进入对数生长期，达到最大生长值的时间也大大缩短了。此外，经过逐步强化的混合菌群在高PEG6000浓度下的生长最大值也有所提高。

2.2强化耐旱微生物分离及纯化结果

本次实验对堆肥中的微生物进行耐旱强化，最终经过多次划线纯化得到的3种纯种微生物，为2种细菌和1种真菌，结果如图2所示。

依据培养特征和菌体形态进行初步鉴定，可以将得到的2种细菌，归为芽孢杆菌，而真菌为酵母菌. 详细的微生物菌落形态见表1：

2.3强化耐旱微生物分子鉴定结果

对上述3菌种通过对其菌落形态观察，结合分子鉴定结果（PCR序列相似度）比较，鉴定出2种芽孢杆菌分别为：蜡样芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌，1种酵母菌为粘红酵母：

3 研制结论

本研究最后成功强化、分离、纯化和鉴定得到3种耐旱堆肥微生物，即蜡状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母。由其中1种或几种强化微生物制成相应的强化复合微生物菌剂；而制备成的强化微生物菌剂施加到干旱环境草坪草建植体系当中，可改善草坪植物的生长状况。

附图说明:

图1为不同PEG6000浓度下混合菌群的生长曲线；

图2为强化耐旱优势细菌和真菌。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。需要特别说明是：本发明筛选得到的复合微生物菌群蜡样芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌，粘红酵母市场上均有销售，也可以采用本发明的方法从生活垃圾堆肥中分离得到复合微生物菌群，其得到的菌群的生化特性与市售的相同故未在保藏。

实施例1

垃圾堆肥中耐旱强化复合微生物菌群的制备方法：

（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1；

（2）培养基：

1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg；

（3）菌种的富集：

将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；

（4）耐旱复合微生物菌群的强化：

混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法进行，在强化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以50 g/L的梯度增加，最终目标是250 g/L； PEG6000的浓度分别为（w/w）5%、10%、15%、20%和25%，每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长量稳定后，继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群；

（6） 强化复合微生物的分离及纯化：

1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30µg/ml，混均匀后分别倒平板；

2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6µg/ml几种浓度的稀释液；

3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；

4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；

（6）平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。

实施例2

应用实例

复合微生物菌剂对中度和重度干旱胁迫下高羊茅丙二醛和脯氨酸含量的影响

所述的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。

（1）中度和重度干旱胁迫下复合微生物菌剂处理高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量均显著低于未接种的对照植株（表1）。中度干旱胁迫条件下，施加稀释100倍的复合微生物菌剂的处理组中高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量降低的最明显，分别比对照组降低了38.93%和65.03%。

表1不同浓度的复合微生物菌剂对高羊茅丙二醛和脯氨酸含量的影响

而重度干旱胁迫条件下，在稀释100倍的复合微生物菌剂处理后，高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量的与对照组降低的都很显著，分别降低了47.65%和66.37%。稀释200倍的处理组与对照组相比也存在显著性差异（P<0.05）。

（2）复合微生物菌剂对中度和重度干旱胁迫下高羊茅保护酶活性的影响

接种复合微生物菌剂显著提高了中度和重度干旱胁迫下高羊茅叶片SOD、POD和CAT活性（表2）。中度干旱胁迫下施加在100倍稀释液时，高羊茅叶片SOD、POD和CAT活性达到最高，分别是对照的6.74、1.88和2.41倍。强化耐旱微生物菌剂稀释液倍数为100时，重度干旱胁迫下高羊茅叶片SOD、POD和CAT活性为最高，分别是对照组的2.12、2.17和5.43倍。与对照组相比， 200倍稀释处理组存在显著差异（P<0.05）。

表2不同浓度的复合微生物菌剂对高羊茅保护酶活性的影响

研制结论：

在干旱胁迫下，高羊茅接种了复合微生物菌剂，能明显提高保护酶活性，从而缓解了干旱胁迫对高羊茅带来的伤害，有助于增进草坪草的抗旱能力的提高。从复合强化微生物菌剂的用量刊，100倍稀释液的效果显著优于200倍稀释液。该技术方法可为干旱条件下缓解草坪草的伤害作用具有重要的应用价值。

Claims (3)

1.一种垃圾堆肥中草坪耐旱强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85 g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1；

（2）培养基：

1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg；

（3）菌种的富集：

将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；

（4）耐旱复合微生物菌群的强化：

混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法进行，在强化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以50 g/L的梯度增加，最终目标是250g/L； PEG6000的浓度分别为（w/w）5%、10%、15%、20%和25%，每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长量稳定后，继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群；

（5）强化复合微生物的分离及纯化：

1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55-60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30µg/ml，混均匀后分别倒平板；

2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6µg/ml几种浓度的稀释液；

3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；

4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；

（6）平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群；其中得到强化复合微生物菌群指的是：蜡状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母。

2.采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在提高中度和重度干旱胁迫下草坪草抗旱能力方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。

3.采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在降低中度和重度干旱胁迫下高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。