CN104726476A - 大豆耐盐基因GmCIPK2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆耐盐基因GmCIPK2及其应用。大豆耐盐基因GmCIPK2的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明首先利用Clontech的酵母双杂交系统，构建了大豆371005的酵母cDNA文库，接着克隆了大豆耐盐基因GmCBL3，构建了诱饵蛋白，通过酵母双杂交的方法获得了GmCBL3蛋白的互作蛋白GmCIPK2；然后利过gateway系统将GmCIPK2基因进行BP反应连接到pDONR221，通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把基因GmCIPK2连接到表达载体pK2GW7上；通过农杆菌介导转入拟南芥中，转基因植株的抗盐性明显提高。

Description

大豆耐盐基因GmCIPK2及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及大豆耐盐相关基因GmCIPK2及其应用。

背景技术

我国是盐渍土分布较为广泛的国家之一，土地的盐渍化已成为限制我国农业发展，特别是大豆产业发展的主要障碍因子之一。目前土壤的改良方法中，化学改良和生物改良是目前研究的重点。对于化学改良来说，虽然见效快，但容易引入新的离子造成二次污染，且资金投入和技术要求都很高，对大面积的土地修复实施起来比较困难。而生物改良能够有效降低成本，是盐渍化土地恢复的最经济有效的措施。

生物改良的最终目标也是实现植被的恢复与重建，然而通过常规育种方法术改良植物的抗旱耐盐性，耗时费力，困难大，已经很难培育出真正的抗性品种。有关植物耐盐碱基因的分离、提取、克隆已有所研究，为实现提高大豆的耐盐性提供了可能。了解掌握大豆的耐盐性并进一步揭示其分子机制，对育成大豆耐盐新品种，扩大大豆的种植范围，减少盐渍土壤等因素对大豆栽培和产量的影响，稳定我国的大豆生产，保证中国粮食安全和社会稳定有着重要意义。同时，也是树立我国自有的大豆品牌，增强我国大豆在国际市场上的竞争力的重要前提和基础。

植物的耐盐性状是一个多基因控制的数量性状，而且很多抗耐盐相关的基因未被发现，这就决定了植物耐盐机制的复杂性。盐胁迫能诱导植物细胞Ca²⁺浓度的变化，而Ca²⁺信号是由受体蛋白接受并传导的，这类蛋白叫钙调磷酸酶B类蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)。CBL为植物抗逆基因调控网络中钙离子通道信号传导的主要调节基因，目前已在拟南芥中克隆到10个CBL基因，在其他物种中，如玉米、马铃薯和水稻中也有类似蛋白发现(GeneBank)。CBL1是CBL蛋白家族中的一员，拟南芥中的CBL1在植物盐胁迫信号传递通路中起着重要作用。CBL1和CBL9共同作用能够激活CIPK23(CBL-interacting protein kinases，CIPK)，后者通过磷酸化K⁺转运蛋白AKT1增加胞内的K⁺浓度，减少Na⁺的摄入，从而提高植物的耐盐性。但大豆中的CBL基因及其对植物耐盐性的研究鲜有报道。

本发明中的大豆基因GmCIPK2属于大豆蛋白激酶，能够通过与大豆耐盐基因GmCBL3(见发明专利申请201510116210.1，发明名称：大豆耐盐基因GmCBL3及其应用，申请人：山东省农作物种质资源中心，申请日：2015.3.17)的蛋白互作来调节大豆GmCBL3的表达，从而影响植物细胞膜内Ca²⁺信号的传导，进而改变植物对盐胁迫的适应性，是植物盐胁迫下钙离子通道信号传导途径中的重要调节基因。它在拟南芥中的过表达能够明显提高植株的耐盐性。本发明所报道的大豆基因GmCIPK2非等同于其亚家族其他成员，具有一定的特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从耐盐、低温敏感型大豆种质371005(山东省沿海地区种质资源收集编号)中分离得到的耐盐基因—GmCIPK2，将该基因转到模式植物拟南芥中，得到耐盐性提高的转基因植株。

本发明所述的大豆耐盐基因GmCIPK2，其特征是，它的基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述的大豆耐盐基因GmCIPK2的植物表达载体pK2GW7-GmCIPK2。

本发明还公开了上述大豆耐盐基因GmCIPK2在提高植物耐盐性方面的用途。

其中：所述植株是拟南芥；进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型。

本发明首先利用Clontech的酵母双杂交系统，构建了大豆371005的酵母cDNA文库；接着在大豆371005植株中克隆到了大豆耐盐基因GmCBL3(如SEQ ID No.2所示)，构建了诱饵蛋白，通过酵母双杂交的方法获得了GmCBL3蛋白的互作蛋白GmCIPK2；然后利过gateway系统将GmCIPK2基因进行BP反应连接到pDONR221，通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmCIPK2连接到表达载体pK2GW7上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中；将转化农杆菌菌株转入拟南芥和大豆中，从而验证表达的GmCIPK2的功能。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了大豆耐盐基因GmCIPK2并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的提高耐盐性的能力。本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐的植物品种。

附图说明

图1为LD-PCR检测扩增产物。1、无模板阴性对照；2、1μg小鼠肝脏阳性对照；3、LD-PCR扩增产物；M、Marker；结果显示本实验得到了和阳性对照相当量的cDNA，LD-PCR扩增成功；

图2为载体pGBKT7示意图；

图3为载体pDONR221示意图；

图4为植物表达载体pK2GW7示意图；

图5为野生型和转GmCIPK2基因的拟南芥转基因阳性植株在NaCl浓度为0.5％的1/2MS培养基上正常培养10天的耐盐性功能验证图。

具体实施方式

实施例1：大豆371005的酵母cDNA文库构建

耐盐大豆种质的采集：本发明的发明人于2009年10月在东营市利津县明集乡齐家村收集并筛选出一种耐盐、低温敏感型的大豆种质(土壤盐浓度(‰)：1.5，纬度/°：37.59，经度/°：118.22，海拔/m：10)。根据山东省编号以37开头，第1005份资源，故命名为371005(山东省沿海地区种质资源收集编号)；其相对盐害指数：18.00。

1.1大豆371005植株总RNA的提取：

(1)大豆371005材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末；

(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1mlTRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀；

(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min；

(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min；

(5)2-8℃12000r/min离心10min，弃上清；

(6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清；

(7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。

1.2利用Clontech酵母双杂交文库试剂盒逆转录合成第一链cDNA

(1)在离心管中混匀以下试剂：

1–2μl RNA样本

1.0μl引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’SEQ IDNo.3)

1–2μl去离子水

4.0μl总体积；

(2)72℃，孵育2min；

(3)冰上冷却2min，然后14000rpm，离心10s；

(4)混合以下试剂，将混合液加入上述步骤(3)得到的样品中，轻拍混匀；

2.0μl 5×First-Strand缓冲液

1.0μl DTT

1.0μl dNTP混合物

1.0μl SMART MMLV反转录酶

9.0μl总体积；

(5)42℃，10min，孵育；

(6)加入1μl SMART III-modified oligo(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’SEQ ID No.4)，混匀，42℃，1hr孵育；

(7)75℃，10min，终止第一链合成反应；

(8)室温冷却，加入1μl RNA酶H；

(9)37℃，20min，孵育；

(10)继续进行LD-PCR扩增。

1.3使用长距离PCR(LD-PCR)扩增ds cDNA

(1)准备：第一链cDNA，预热的PCR仪；

(2)建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组：

2μl第一链cDNA

70μl蒸馏水

10μl 10×2PCR缓冲液

2μl 50×dNTP混合物

2μl 5’PCR引物(5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’SEQID No.5)

2μl 3’PCR引物(5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’SEQ ID No.6)

10μl 10×溶解液(试剂盒自带成分)

2μl 50×Advantage 2聚合酶混合物

100μl总体积；

(3)扩增程序：95℃30sec，36Cycles；95℃10sec；68℃6min^b，68℃5min；扩增程序每过一个循环时延伸时间增加5sec；

(4)琼脂糖电泳分析(如图1)；

(5)柱纯化后，将ds cDNA保存于–20℃待用。

1.4操作纯化ds cDNA

(1)准备：LD-PCR扩增ds cDNA

醋酸钠(3M)

冰乙醇(95–100％)；

(2)每93ul的cDNA样品使用一个CHROMA SPIN TE-400纯化柱

颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀，

移除顶端帽子，

掰断柱底部的break away(分离板)，

将柱放置在2ml的收集管；

(3)700rpm，5min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix(基质)半干；

(4)将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul的样本；

(5)700rpm，5min离心；

(6)将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀ds cDNA：

加入1/10体积的3M醋酸钠；

加入2.5倍体积的冰乙醇(95–100％)；

–20℃，1hr放置沉淀；

14，000rpm，室温离心20min；

弃上清；

14，000rpm瞬时离心，去除残留的上清液；

空气干燥10min；

(7)20μl去离子水重悬ds cDNA。

1.5制备酵母感受态细胞

(1)试剂

1M LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释)50％PEG3350(Sigma P3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装)

2mg/ml salmon sperm DNA/TE(10mM Tris-Cl，pH8.0，1.0mM EDTA)-20℃保存；

(2)感受态毕氏酵母的制备

接种酵母菌种到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约10⁸Cells/ml)；

收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；

重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；

离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；

按50ul/管分装，立即进行转化；

注：不要将感受态酵母菌冰浴。

1.6酵母的转化

(1)煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；

(2)将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

(3)对于每一个转化，按以下顺序加入：

(4)剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min)；

(5)30℃水浴孵育30min；

(6)42℃水浴热休克20～25min；

(7)6000～8000rpm离心收集酵母菌体；

(8)重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；

(9)1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；

1.7建立Mate&Plate文库

(1)制备Y187酵母感受态细胞；

(2)按照转化操作1.6转化酵母细胞

20μl ds cDNA—2–5μg

6μl pGADT7-Rec(0.5μg/μl))

(3)将转化后的酵母细胞重悬于15ml 0.9％(w/v)NaCl中；

(4)将100μl的1/10、1/100稀释液分别铺板于SD/–Leu 100mm固体培养基上，30℃，孵育3d–4d；确定文库的库容，

独立克隆数＝No.of cfu/ml on SD/–Leu x重悬液体积(15ml)

这个值标示转化效率；

(5)将剩下的悬浮液铺板于150mm SD/–Leu选择培养基上

每板150μl悬浮液，约使用100板

30℃孵育3d-4d；

(6)收获转化子：

(7)4℃，3–4hr冷却培养板，加入5ml的冻存液，使用无菌的玻璃珠将板中的菌落分离下来。

(8)将所有的液体收集于无菌的单管中，用血球计数板来计算细胞密度。若细胞密度小于<2x10⁷/ml，离心来减少悬浮液的体积。

1.8酵母cDNA文库进行双杂交

(1)参考Clontch的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybird System的说明，以步骤1.4中的DNA为模板，利用下述引物SEQ ID No.7-8通过高保真DNA聚合酶的PCR反应给GmCBL3加上接头，扩增出带接头的目的基因全长片段；

P1(上游引物)：5'-CATGGAGGCCGAATTCATGGGAACTCAAGGATATGCAGCA-3'(SEQ ID No.7)

P2(下游引物)：5'-GCAGGTCGACGGATCCTTATGGGAATGCAGTAGGAGTATGA-3'(SEQ ID No.8)；

(2)取200μl PCR产物，利用天根公司的凝胶回收试剂盒，回收PCR产物；

(3)将回收的PCR产物和pGBKT7载体，分别用Takara公司的限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切；

(4)将双酶切的PCR产物和pGBKT7载体按照5:1的体积比加入到新的离心管中，然后用Takara公司的DNA连接试剂盒进行连接，构建pGBKT7-GmCBL3诱饵蛋白重组载体；

(5)取(4)中的反应液1μl，进行大肠杆菌转化，并验证阳性；

(6)培养阳性克隆，提取并纯化其质粒；

(7)将(6)中的质粒加入步骤1.5所述的酵母感受态中，通过步骤1.6的方法进行酵母转化，并获得阳性酵母菌株；

(8)将获得阳性酵母菌株与步骤1.7中所获得的酵母文库进行共培养，参考Clontch的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybird System的说明对上述酵母cDNA文库进行双杂交，并获得GmCBL3的互作蛋白阳性单菌落。

1.9DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(氨苄西林，50mg/L)的液体LB培养基摇菌过夜，然后送深圳华大基因有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长627bp。

经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与大豆蛋白激酶Glycine max protein kinase(LOC100305401)的核苷酸同源74.12％。证明实验得到的就是大豆的一个蛋白激酶，命名为大豆GmCIPK2。

实施例2、农杆菌介导的GmCIPK2的拟南芥花转化

2.1过表达载体构建

(1)利用Invitrogen公司的Gateway系统，将GmCIPK2基因进行BP反应连接到pDONR221载体(见图3)，将下述的引物SEQ ID No.9-10通过高保真DNA聚合酶的PCR反应给GmCIPK2加上接头；

P3(上游引物)：5'-AAAAAAGCAGGCTTCATGGAGTACCCATACGACGT-3'(SEQ IDNo.9)

P4(下游引物)：5'-AGAAAGCTGGGTCGGTACGTCGTATGGGTACTCCAT-3'(SEQ IDNo.10)；

(2)取25μl PCR产物，用TE Buffer(10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA)，1/2体积的30％PEG 8000/30mM MgCl₂溶液稀释4倍，终浓度为10％PEG和10mM MgCl₂，涡旋混匀，13，000rpm离心15min；

(3)轻移上清，用TE重悬沉淀，使DNA终浓度为>10ng/μl；

(4)加入以下成分于1.5ml离心管中，并在室温下混合以进行BP反应：

attB-PCR产物(≥10ng/μl，总含量15-150ng)            1-7μl

pDONR221vector(150ng/μl)                           1μl

TE buffer,pH 8.0                                    to 8μl；

(5)取出BP ClonaseⅡ酶，在冰上放置2min后，涡旋振荡2s，重新放置冰上2min；

(6)重复(5)一次，在(4)的体系中加入2μl的BP ClonaseⅡ酶，轻轻混匀，微速离心数秒，使反应液聚集在离心管底，25℃反应1h或过夜，BP ClonaseⅡ酶重新放回-20℃或-80℃冰箱保存；

(7)将1μl蛋白酶K加入到反应体系中，轻轻混匀，37℃孵育10min以终止反应；

(8)取1μl反应液，进行大肠杆菌DH5α转化，并验证阳性；

(9)过夜培养呈阳性的大肠杆菌克隆，并提取其质粒；

(10)经过纯化的阳性克隆质粒(Entry clone)按以下体系加入1.5ml离心管中，并在室温下混合以进行LR反应：

Entry clone(50-150ng)                       1-7μl

Destination vector(150ng/μl，pK2GW7，图4)  1μl

TE buffer,pH 8.0                            to 8μl；

(11)取出LR ClonaseⅡ酶，在冰上放置2min后，涡旋振荡2s，重新放置冰上2min。

(12)重复(11)一次，在(10)的体系中加入2μl的LR ClonaseⅡ酶，轻轻混匀，微速离心数秒，使反应液聚集在离心管底，25℃反应1h或过夜，LR ClonaseⅡ酶重新放回-20℃或-80℃冰箱保存；

(13)在反应体系中加入1μl蛋白酶K终止反应，轻微混匀，37℃孵育10min；

(14)取1μl反应液，进行大肠杆菌转化，并验证阳性；

(15)培养阳性克隆，提取并纯化其质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。2.2拟南芥花转化

(1)正常生长的开花拟南芥植株，长日照条件下在土壤生长。如果拟南芥已经开花，载体还没准备好，可去除顶花，4-6天后得到更多的花进行转化；

(2)将鉴定正确的农杆菌菌种转接到5-10ml含有适当抗生素的LB培养基中，28℃，250rpm，培养2天；

(3)将菌转接到300ml含相应抗生素的LB培养基中，28℃培养到OD600为1.5-2.0；

(4)4000g，15min室温集菌，用0.5％蔗糖溶液(现用现配)将细胞重悬到OD600＝0.6～0.8；

(5)加Sliwet L-77(表面活性剂，Sigma)，浓度0.02～0.05％(vol/vol)，混匀，可尽量将Sliwet L-77降低；

(6)转化时，将混好的细菌液放在适当的器皿中，将花浸入细菌液2-3秒。也可用吸管将细菌液滴到花上；

(7)将转化后的植株用黑色塑料袋避光保湿放置16-24小时；

(8)避光时间结束后，将植株在正常条件下生长，直到种子成熟；

(9)上述转化植株收的F1代种子先干燥1周，然后播在含适当抗生素的平板上；

(10)种子消毒：拟南芥种子在0.5％次氯酸钠溶液中浸泡15min，再用无菌水洗5次；

(11)4℃纯化3天，幼苗在平板上生长10天，挑选叶片和根生长正常的苗子移栽到土中；

(12)将植株在正常条件下生长，直到种子成熟，获得F2代种子，进行功能验证试验。

实施例3、转GmCIPK2基因的拟南芥耐盐性验证

(1)提取植株的DNA样本，并利用下述引物SEQ ID No.11-12通过Taq DNA聚合酶的PCR反应，验证并获得转GmCIPK2基因阳性植株；

P5(上游引物)：5'-ATGGAGTACCCATACGACGTACCAG-3'(SEQ ID No.11)

P6(下游引物)：5'-CTGGTACGTCGTATGGGTACTCCAT-3'(SEQ ID No.12)；

(2)把两种不同类型的拟南芥种子分别进行消毒处理，这两种种子为：拟南芥野生型(阴性对照)和过量表达大豆GmCIPK2基因的拟南芥转基因植株；

(3)在NaCl浓度为0.5％的1/2MS培养基上，培养经过消毒处理的两种拟南芥种子；

(4)正常培养10天后，发现过量表达GmCIPK2基因的拟南芥转基因植株能够较好的正常生长，而拟南芥野生型植株不能正常生长(如图5所示)。

Claims (5)

1.大豆耐盐基因GmCIPK2，其特征是，它的基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述的大豆耐盐基因GmCIPK2的植物表达载体pK2GW7-GmCIPK2。

3.权利要求1所述的大豆耐盐基因GmCIPK2在提高植物耐盐性方面的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征是，所述植物是拟南芥。

5.一种提高植物耐盐性的方法，其特征是，首先利用Clontech的酵母双杂交系统，构建了大豆371005的酵母cDNA文库；接着在大豆371005植株中克隆到了大豆耐盐基因GmCBL3，构建了诱饵蛋白，通过酵母双杂交的方法获得了GmCBL3蛋白的互作蛋白GmCIPK2；然后利过gateway系统将GmCIPK2基因进行BP反应连接到pDONR221，通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把基因GmCIPK2连接到表达载体pK2GW7上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌中；再转入拟南芥或大豆中，得到耐盐性提高的转GmCIPK2基因的植株；所述基因GmCIPK2、基因GmCBL3的基因cDNA的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1-2所示。