CN104726355B - 酿酒酵母孢子表达的(s)‑羰基还原酶ii不对称转化制备(s)‑苯乙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
酿酒酵母孢子表达的(S)‑羰基还原酶II不对称转化制备(S)‑苯乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一株重组酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）AN120/pRS424‑TEFpr‑scrII，保藏编号CCTCC NO：M2015100；及其不对称转化制备(S)‑苯乙二醇的方法。本发明将(S)‑羰基还原酶II表达于酿酒酵母AN120中，利用限制培养条件使重组酿酒酵母产生具有活性的孢子，以2‑羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应，通过优化生物转化反应条件，产物(S)‑苯乙二醇光学纯度达到99.3%，产率为99.0%。本发明利用酵母孢子表达技术解决了羰基还原酶对环境耐受性和重复使用性差的问题，为高效生物合成(S)‑苯乙二醇的工业应用奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
利用酿酒酵母孢子中表达的(S)-羰基还原酶II不对称转化制备(S)-苯乙二醇的方法，本发明涉及基因工程技术使酶在酿酒酵母中表达，通过限制培养条件诱导其产生孢子将(S)-羰基还原酶II进行包埋，形成活性孢子。利用酵母孢子天然的抗逆性有效提升(S)-羰基还原酶II的耐逆性，高效制备(S)-苯乙二醇，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
手性化合物在医药、农药、激素、食品添加剂等精细化工行业中应用广泛，如光学纯(S)-苯乙二醇不仅是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，也是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂。
氧化还原酶能用于不对称催化转化手性化合物的制备，但其催化活性受环境影响较大，仅在特定温度和pH条件下进行稳定的生物转化，无法适应工业生产中多变的反应环境；同时，现阶段研究多采用大肠杆菌作为表达系统，该系统存在一些致命弱点，如菌种安全性和蛋白翻译后无法修饰等，限制了其工业应用的潜力。
与大肠杆菌相比，酿酒酵母是一种安全的、具有完整蛋白后修饰功能的基因表达宿主。更加特别的是，酿酒酵母细胞在营养匮乏时产生网状膜结构的子囊孢子，可以拦截酶等外源大分子，而且能抵御外界不良环境，能为孢子内的重组酶提供一个优良的催化内环境，是一种极具潜力的酶表达宿主。
本实验室已经利用(S)-羰基还原酶II的重组大肠杆菌不对称转化制备(S)-苯乙二醇，在此基础上，将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) CCTCC NO：M203011的(S)-羰基还原酶II基因克隆至酿酒酵母AN120中，实现酶的异源表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质诱导培养重组酵母，产生含有(S)-羰基还原酶II的重组活性孢子。以重组孢子为生物催化剂，2-羟基苯乙酮为底物进行生物转化，重组孢子对不良环境具有很好的耐受性，连续使用20次后仍能保持85%以上的转化效率，实现了重组孢子在多变环境下高效制备(S)-苯乙二醇。
发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种基因工程技术实现酶在酿酒酵母中的异源表达，利用重组菌株(菌种保藏号：CCTCC NO：M2015100)不对称转化制备(S)-苯乙二醇的方法。本发明目的在于将来源于近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)中的(S)-羰基还原酶II基因克隆至酿酒酵母AN120中表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质培养菌体，诱导其产生孢子将(S)-羰基还原酶II进行包埋，形成活性孢子。该活性孢子不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学活性(S)-苯乙二醇，连续使用20批次后，产物光学纯度高达99％，转化率高于85%。解决了(S)-羰基还原酶II对环境耐受性差的问题，显著提升了酶的催化稳定性和使用批次性，为工业上高效、低成本制备光学纯(S)-苯乙二醇奠定了坚实的基础。
（2）技术方案：一株产生用于不对称转化制备(S)-苯乙二醇的重组活性孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母（S. cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015100。
利用所述的重组酿酒酵母所产的重组活性孢子不对称转化制备(S)-苯乙二醇的方法，将(S)-羰基还原酶通过构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII转入酿酒酵母AN120中，得到重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII，利用培养得到含有目标酶的重组活性孢子，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL 0.1 mol/L pH5.0~5.5醋酸缓冲液，或1 mL 0.1 mol/L pH 6.0~7.5磷酸缓冲液，或1 mL 0.1 mol/L pH 8.0~9.0 Tris-HCl缓冲液中，重组活性孢子浓度为0.1 g/mL，2-羟基苯乙酮底物浓度为6 g/L，与2-羟基苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度40℃，反应时间4 h。
重组活性孢子的获得：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；
YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制；
产孢培养基以g/L计：KAc 20，，以去离子水配制；
培养条件：挑取重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/ pRS424-TEFpr-scrII的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h；取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，并转入1L产孢培养基中继续培养2 - 3 d，用显微镜镜检产孢效率，产孢完成后，6000 rpm、10 min离心收集菌体并以少量pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理1 h，工作强度50%、工作时间1 s、工作间隙3 s，离心收集重组活性孢子待用。
重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/ pRS424-TEFpr-scrII的构建：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；
SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；
培养条件：挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL 组成为1MDTT 10 μL、50% PEG 80 μL、2M LiAc 10 μL 的Buffer重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养。
重组质粒pRS424-TEFpr-scrII的构建：
利用限制性内切酶Pst I 和Xho I，目的基因scrII与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRS424-TEFpr-scrII。
scrII基因的获得
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Pst Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的引物SCR_F，SCR_R：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’，
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’；
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNApolymerase 0.5 μL；
PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min、60 ℃ 30 s、72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。
用于获得scrII基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO：M203011。
一、基因组的获得
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011的培养基组成为：葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
将近平滑假丝酵母接种于培养基装液量为20% 的250 mL摇瓶中于30℃、200 rpm振荡培养16 h。培养结束后，将菌体于6,000 rpm、20min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。
二、scrII基因的获得
合成两端引物（下划线为酶切位点）：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’(Pst I)，
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’(Xho I)；
具体方法如下：
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5μL，引物SCR_F和SCR_R (50 pmol/μL) 各1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase (5U/μL) 0.5 μL。
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，以引物SCR_F和SCR_R进行PCR反应，获得scrII全长片段。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化DNA片断。
三、含scrII基因的重组质粒pRS424-TEFpr-scrII的构建
基因scrII及质粒pRS424-TEFpr的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pRS424-TEFpr。
按照水、缓冲液、基因或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
反应体系组成：10×Buffer H 4 μL，DNA 10 μL，Pst I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。
基因scrII与质粒pRS424-TEFpr的连接
反应体系组成如下：质粒pRS424-TEFpr 0.8 μL，基因scrII4.2 μL，LigationSolution 5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
重组质粒转化大肠杆菌E. coli JM109
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育复苏1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pRS424-TEFpr-scrII。
四、重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII的获得
YPD培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，固体培养基添加20琼脂粉。
挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL Buffer重悬菌体（1MDTT 10 μL，50% PEG 80 μL，2M LiAc 10 μL），加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养。挑取单菌落至SD-Trp液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养可生长即为阳性克隆。
五、重组酵母孢子的培育
YPD培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。YPACE培养基以g/L计：KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。产孢培养基以g/L计： KAc 20。
挑取重组酿酒酵母单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24h。将菌液于6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，将菌体转移到1 L的产孢培养基中继续培养2 – 3 d，期间用显微镜镜检产孢效果。6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS缓冲液（pH 6.0）重悬菌体，经超声波细胞破碎仪处理1 h（工作强度50%，工作时间1 s，工作间隙3 s），镜检破碎率约为90%即可。6000 rpm、10 min离心收集孢子。
六、重组孢子催化不对称转化制备(S)-苯乙二醇
利用重组孢子催化不对称还原反应。
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；
YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，以去离子水配制；
产孢培养基以g/L计：KAc 20，以去离子水配制。
挑取重组酵母单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h。将菌液于6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，将菌体转移到1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，期间用显微镜镜检产孢效果。6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS缓冲液（pH6.0）重悬菌体，经超声波细胞破碎仪处理1 h（工作强度50%，工作时间1 s，工作间隙3 s）镜检破碎率约为90%即可。
破碎后的孢子在6000 rpm、10 min下离心收集。在以下体系中进行检测：1 mL 0.1mol/L醋酸缓冲液（pH5.0~5.5），或1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0~7.5）或1 mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0~9.0）中，加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，与2-羟基苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，0.1 g/L湿孢子，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4 h。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100) 进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流动相为正己烷/异丙醇（v/v，9/1），流速0.4 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(S)-苯乙二醇对映过量值的计算：
对映过量值( e.e.%)=[(C S-C R)/(C S+C R)]*100%，
产物(S)-苯乙二醇产率的计算：产率（%）= C S/C 0*100%，
式中C R为反应后(R)-对映体的浓度，C S为反应后(S)-对映体的浓度，C 0为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。
以微胶囊酶为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(S)-苯乙二醇。
（3）有益效果
成功从近平滑假丝酵母中获得了（S）-羰基还原酶II，成功构建了目的基因的重组菌株S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII及其重组活性孢子。
重组酵母孢子S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII催化转化底物2-羟基苯乙酮，获得高光学纯度和高产率的产物(S)-苯乙二醇。通过优化反应条件，在pH 6.0的磷酸缓冲液中，利用0.1 g/mL重组孢子对6 g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化4 h，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为99.3%e.e.，产率为99.0%。同时与大肠杆菌体系相比，反应时间由48 h缩短为4 h；在极端温度和pH条件下，微胶囊酶都表现出了优良的耐受性；连续使用20次后，其催化产物的光学纯度几乎不变，得率仍维持在85%以上。这些工作很好地克服了羰基还原酶对环境耐受性较差的限制，首次实现了氧化还原酶在酵母孢子内的异源表达，为手性化合物的高效制备奠定了坚实的研究基础。
生物材料样品保藏：酿酒酵母Saccharomyces.cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2015100。保藏日期2015年3月11日。
具体实施方式
实施例1
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011的菌体培养，其培养基组成为：葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
将酵母接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、200 rpm振荡培养16h。
实施例2
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO：M203011基因组的提取：将实施例1培养的菌体于6,000 rpm、20min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。
实施例3
scrII基因获得：引物：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’(Pst I)；
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’(Xho I)。
采用PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L)0.5 μL，引物(50 pmol/μL)各 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5μL。
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，以引物SCR_F和SCR_R进行PCR反应，获得scrII基因片段。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化DNA片断。
实施例4
pRS424-TEFpr-scrII重组质粒的获得：基因scrII及质粒pRS424-TEFpr的酶切反应体系：10×Buffer H 4 μL，DNA 10 μL，Pst I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。37℃水浴3 h，在管中加入1/10（v/v）的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收并浓缩。采用以下连接反应体系：质粒pRS424-TEFpr 0.8 μL，基因scrII4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
在每管100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，质粒DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pRS424-TEFpr-scrII。
实施例5
重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII的获得：YPD培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，需用固体培养基可加入20琼脂粉。挑取酿酒酵母AN120接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL Buffer（1M DTT 10 μL，50% PEG 80 μL，2M LiAc 10 μL）重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，于30℃恒温培养箱中倒置培养2–3 d获得重组菌单菌落。
实施例6
重组酵母孢子的培育：YPD培养基组分同实施例5，YPACE培养基以g/L计：KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。产孢培养基以g/L计：KAc 20。
挑取重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h。6000 rpm、10min无菌离心收集菌体，用产孢培养基重悬菌体，转移到1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，期间取样并用显微镜镜检产孢率。待产孢完全后，6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS（pH 6.0）重悬，经过超声破碎处理即可将孢子从酵母细胞中释放出来待用。
实施例7
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为90.2% e.e.，产率为69.7%。
实施例8
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为99.3% e.e.，产率为99.0%。
实施例9
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为97.1% e.e.，产率为92.8%。
实施例10
在1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为91.3%e .e.，产率为78.1%。
实施例11
在1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为90.2% e.e.，产率为71.3%。
实施例12
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在20℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为97.4% e.e.，产率为60.7%。
实施例13
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为97.3% e.e.，产率为94.1%。
实施例14
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在50℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为96.6% e.e.，产率为85.0%。
实施例15
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在60℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为92.7% e.e.，产率为49.9%。
实施例16
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，加入0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在50℃水浴锅中保温1 h。取出后加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为99.1% e.e.，产率为60.2%。
实施例17
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，加入0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在4℃冰箱中存放24 h。取出后12000 rpm离心菌体，弃去上清，加入1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0），以及6 g/L底物2-羟基苯乙酮和等摩尔量辅酶NADPH，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度为99.3% e.e.，产率为85.2%。
实施例18
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应4 h。反应结束后同实施例7处理样品，并将离心所得菌体重复实施例15的步骤，反复20次。当重组孢子反复使用20次后，产物(S)-苯乙二醇的光学纯度仍可达99.1% e.e.，产率为85.1%。
Claims (7)
1.一株产生用于不对称转化制备(S)-苯乙二醇的重组活性孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母（S. cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015100。
2.利用权利要求1所述的重组酿酒酵母所产的重组活性孢子不对称转化制备(S)-苯乙二醇的方法，其特征是将(S)-羰基还原酶通过构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII转入酿酒酵母AN120中，得到重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII，利用培养得到含有目标酶的重组活性孢子，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL 0.1 mol/L pH5.0~5.5醋酸缓冲液，或1 mL 0.1 mol/L pH 6.0~7.5磷酸缓冲液，或1 mL 0.1 mol/L pH 8.0~9.0 Tris-HCl缓冲液中，重组活性孢子浓度为0.1 g/mL，2-羟基苯乙酮底物浓度为6 g/L，与2-羟基苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度40℃，反应时间4 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于重组活性孢子的获得：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；
YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制；
产孢培养基以g/L计：KAc 20，以去离子水配制；
培养条件：挑取重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/ pRS424-TEFpr-scrII的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h；取10 mL培养液转接于1L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，并转入1L产孢培养基中继续培养2 - 3 d，用显微镜镜检产孢效率，产孢完成后，6000rpm、10 min离心收集菌体并以少量pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理1h，工作强度50%、工作时间1 s、工作间隙3 s，离心收集重组活性孢子待用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII的构建：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；
SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；
培养条件：挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL 组成为1M DTT 10μL、50% PEG 80 μL、2M LiAc 10 μL 的Buffer重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是重组质粒pRS424-TEFpr-scrII的构建：
利用限制性内切酶Pst I 和Xho I，目的基因scrII与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRS424-TEFpr-scrII。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是scrII基因的获得
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Pst Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的引物SCR_F，SCR_R：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’，
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’；
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L dNTP 0.5 μL，50pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；
PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min、60 ℃ 30 s、72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是用于获得scrII基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO：M203011。
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