CN104725520B

CN104725520B - 一种分心木酸性多糖及其制备和应用

Info

Publication number: CN104725520B
Application number: CN201510110116.5A
Authority: CN
Inventors: 贺亮; 李杰君; 李文魁; 李晓君
Original assignee: Fengqing County Yu Zegu Walnut Specialty Co-Operative Organization
Current assignee: Fengqing County Yu Zegu Walnut Specialty Co-Operative Organization
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2035-03-13
Also published as: CN104725520A

Abstract

本发明公开了一种分心木酸性多糖及其制备和应用。所述的分心木酸性多糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖的组成为半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其中，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的物质的量之比为66.30‑72.50:13.50‑18.60:6.20‑11.40:2.80‑4.40。所述的分心木酸性多糖的制备方法，包括：水提醇沉提取分心木粉末粗多糖，经酶‑Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分即为分心木酸性多糖。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及免疫功能研究，发现本发明分心木酸性多糖有较强的抗氧化活性，可以作为抗氧化剂或者用于制备抗氧化剂，可广泛用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。

Description

一种分心木酸性多糖及其制备和应用

技术领域

本发明涉及天然植物多糖领域，具体涉及一种分心木酸性多糖及其制备和应用，属于高分子和分子生物学领域。

背景技术

分心木来源于胡桃科植物胡桃(Juglans regia L.)果核的干燥木质隔膜，又称胡桃衣、胡桃夹、胡桃隔等，味苦、涩，性平，入脾、肾经，固肾涩精，临床主治遗精、淋病、血尿、带下、泻痢等。近年来，人们从分心木中分离得到黄酮类、多糖类、皂苷类、醌类、酚酸类等多种化合物，并对其中的黄酮、鞣质及糖类等成分进行了含量测定。药理活性研究表明分心木除具有抑菌、抗氧化等作用外，对治疗肾虚遗精、滑精遗尿等症具有显著效果。

近年来，有不少报道关于分心木用药的文献。中国发明专利ZL200310119376.6公开了一种补肾生精益元的药物及其制备方法，该药物中含有炒焦分心木的重量比为30份。中国发明专利ZL201210389282.X公开了一种治疗儿童感冒的中药，含有分心木1-3份。中国发明专利ZL201310307132.4公开了一种治疗神经性呕吐的中药，其中分心木的重量份数为3-9份。中国发明专利ZL201210053971.3公开了一种治疗骨肿瘤的中药制剂，分心木的重量份数为7-9份。中国发明专利ZL201310046000.0公开了一种疏导和强化人体气机的保健食品，选用重量比为15-20的分心木，再与桑寄生、乌梅一起炮制，加入普洱茶、茉莉花、浮小麦混合粉碎制成粉剂、片剂或胶囊。王艳等报道了维吾尔药核桃分心木不同提取物对肾阳虚模型小鼠的实验研究，指出分心木水提物对肾阳虚小鼠有不同程度的减轻。多糖作为一种生物免疫应答剂，具有抗肿瘤、降血脂、抗氧化等生物活性(谢明勇，聂少平，天然产物活性多糖结构与功能研究进展，中国食品学报，2010,10(2)：1-11)。然而到目前为止，鲜有深入研究分心木多糖的制备及其应用。高莉等从新疆核桃隔膜中提取分离得到的多糖PDJL-A3具有一定的清除超氧和羟基自由基能力，但活性不明显(高莉，新疆核桃隔膜多糖提取、分离纯化及抗氧化活性的研究，新疆大学硕士学位论文，2010)。

上述报道大多是关于分心木水提物的制备方法及生物活性研究，大多停留在水提物水平重复和小规模试验阶段，创新性技术很少，未能真正使分心木多糖在工业化生产中得以大规模的应用，且未见分心木多糖类产品。更未涉及分心木多糖的高级结构分析，比如对其单糖组成、糖苷键连接方式等未见报道；而且越来越多的研究表明多糖重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象(Conformation)紧密相关，了解该糖分子的构象更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发现新的多糖组分及活性，对研究开发新功能保健品具有非常重要的科学意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种分心木酸性多糖，该多糖具有生物活性，能作为(如针剂等)药用及保健品原料。

本发明的另一目的是提供所述分心木酸性多糖的制备方法，该方法不影响分心木多糖天然结构及分离效果，具有操作简单、易于控制的优点。

本发明还提供了所述分心木酸性多糖的应用，其具有较强的氧自由基清除作用，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种分心木酸性多糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖的组成为半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其中，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的物质的量之比为66.30-72.50:13.50-18.60:6.20-11.40:2.80-4.40。

所述的葡萄糖为β-葡萄糖，优选为β-D-葡萄糖；所述的半乳糖为α-半乳糖，优选为α-D-半乳糖；所述的半乳糖醛酸为α-半乳糖醛酸，优选为α-D-半乳糖醛酸；所述的阿拉伯糖为α-阿拉伯糖，优选为α-L-阿拉伯糖。

所述的分心木酸性多糖是以半乳糖醛酸和葡萄糖为主链，并含有少量分支的多糖。所述的分心木酸性多糖的结构单元中优选主链结构为(1→4)连接的α-D-半乳糖醛酸(α-D-GalpA)残基和(1→2)连接的β-D-葡萄糖(β-D-Glcp)残基，支链为(1→4)连接的α-D-半乳糖(α-D-Galp)残基和端基α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)，支链连接在β-D-葡萄糖残基的O-4位。

所述的分心木酸性多糖的侧链有多种不同的变化组合，如可具有如式Ⅰ所示的结构单元：

式Ⅰ

式Ⅰ中，GalpA为吡喃型聚半乳糖醛酸，Araf为呋喃型聚阿拉伯糖，Galp为吡喃型聚半乳糖，Glcp为吡喃型聚葡萄糖。

所述的分心木酸性多糖的重均分子量为2.5KDa-4.5KDa，进一步优选为2.8KDa-4.2KDa，最优选为3.2KDa-3.6KDa，KDa为千道尔顿。

所述的分心木酸性多糖优选为云南产分心木酸性多糖。

所述的分心木酸性多糖由分心木粉碎、提取分离得到。具体技术方案如下：

一种分心木酸性多糖的制备方法，包括步骤：

(1)水提：将分心木粉碎得到分心木粉末，每克分心木粉末加入20mL-40mL水，90℃-100℃浸提2小时-4小时后离心，取上清液；离心所得沉淀可按所述水提方法重复1-2次，合并上清液得到分心木多糖水提液；

(2)醇沉：向步骤(1)中的分心木多糖水提液中加入乙醇水溶液，搅拌混匀，于2℃-5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次分心木粗多糖；

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次分心木粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；

(4)透析：将步骤(3)所得的提取液用孔径为800Da-1500Da的透析袋在自来水中透析40h-50h，再用去离子水透析40h-50h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次分心木粗多糖；

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次分心木粗多糖用去离子水溶解得到二次分心木粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-52(DEAE纤维素-52)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状分心木酸性多糖，命名为SJP1。

所述的分心木采用市售产品，可选用云南产分心木。

为了达到更好的发明效果，优选：

步骤(1)中，离心的速度选为3000转/分钟-4000转/分钟(rpm)，时间选为15min-30min。

优选每克分心木粉末加入30mL蒸馏水，95℃浸提3小时，离心的速度为3000rpm，离心的时间为15min。

步骤(2)中，向步骤(1)中的分心木多糖水提液中加入占分心木多糖水提液体积4倍-5倍量的乙醇水溶液。优选向步骤(1)中的分心木多糖水提液中加入4倍分心木多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混匀，于4℃沉淀过夜，再于3000rpm-4000rpm离心15min-30min，取离心所得沉淀得到一次分心木粗多糖。

所述的乙醇水溶液的体积百分浓度优选为90％-96％，进一步优选为95％。

步骤(3)中，所述的蛋白酶选用木瓜蛋白酶。所述的蛋白酶的重量为一次分心木粗多糖重量的1％-2％。

所述的用蛋白酶酶解的条件优选为：40℃-55℃水浴2h-2.5h。

本发明灭酶的条件采用本领域的常规条件，例如可在100℃-105℃下灭酶15min-20min。

所述的有机溶剂选用氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。

步骤(5)中，所述的二次分心木粗多糖水溶液的浓度为10mg/mL-30mg/mL，流速为1ml/min。

所述的二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.1mol/L-0.5mol/L的NaCl水溶液，流速0.6ml/min-1.2ml/min。

所述的凝胶过滤层析的条件为：流速0.5ml/min，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1。所述的凝胶选用葡聚糖凝胶，如市售的Sephacryl S-100等。

所述的磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照2005年版《中国药典》。

所述的分心木酸性多糖具有清除氧自由基的能力，其中在ABTS^·+清除率模型当中，SJP1(IC₅₀426.1μg/ml)与对照组Vc(IC₅₀158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，SJP1(IC₅₀34.6μg/ml)也与对照组Vc(IC₅₀14.3μg/ml)非常接近；在OH·自由基清除率模型当中，SJP1(IC₅₀182.1μg/ml)与对照组Vc(IC₅₀280.2μg/ml)比较接近；在ORAC清除率模型中，SJP1的ORAC值为3324.5μmol TE/g；表明本发明分心木酸性多糖具有较强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明分心木酸性多糖(SJP1)，经单糖组成鉴定发现该多糖是由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的物质的量之比为66.30-72.50:13.50-18.60:6.20-11.40:2.80-4.40。FTIR证明SJP1是杂多糖类，含有糖醛酸。核磁共振图谱显示其同时含有α-和β-构型，含有羧基和甲基结构，说明该多糖中含有糖醛酸和甲基糖。激光光散射法证明它是单一组分且分子量为2.5KDa-4.5KDa，核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，主链结构为(1→4)连接的α-D-GalpA残基和(1→2)连接的β-D-Glcp残基，支链为(1→4)连接的α-D-Galp残基和端基α-L-Araf，支链连接在β-D-Glcp残基的O-4位。原子力显微镜观测出该多糖链直径在8nm-15nm。

本发明方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发明制备分心木酸性多糖，不影响其天然结构和活性，该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。

本发明分心木酸性多糖具有较强的氧自由基清除作用，其中在ABTS^·+清除率模型当中，SJP1(IC₅₀426.1μg/ml)与对照组Vc(IC₅₀158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，SJP1(IC₅₀34.6μg/ml)也与对照组Vc(IC₅₀14.3μg/ml)非常接近；在OH·自由基清除率模型当中，SJP1(IC₅₀182.1μg/ml)与对照组Vc(IC₅₀280.2μg/ml)比较接近；在ORAC清除率模型中，SJP1的ORAC值为3324.5μmol TE/g；表明本发明分心木酸性多糖具有较强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。

附图说明

图1A为分心木酸性多糖DEAE纤维素-52离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度曲线；图1B为分心木酸性多糖丙烯酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S-100纯化洗脱液在490nm的吸光度曲线；其中，纵坐标Absorbance at 490nm为在490nm吸光度，横坐标Tubenumber为管数；

图2为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后SJP1溶液的HPLC图谱；A为对照图谱，B为样品图谱；其中，纵坐标mAU为响应值，横坐标Retention time为保留时间，Rham为鼠李糖，GlcUA为葡萄糖醛酸，GalUA为半乳糖醛酸，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖，Xyl为木糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖；

图3为SJP1的红外光谱；其中，纵坐标Transmittance为透光率，横坐标Wavenumbers为波数；

图4为SJP1的SEC-MALLS-RI-VIS激光光散射图；其中，纵坐标relativescale为相对比例，横坐标time为时间；

图5为SJP1的¹H-NMR图谱(A)与¹³C-NMR图谱(B)；

图6为SJP1原子力显微镜测试图；其中，Line Profile:Length为长度线条简介，Line Profile:Heigth为高度线条简介；

图7为SJP1的DPPH清除率曲线；其中，纵坐标DPPH scavenging activity为DPPH自由基清除能力，横坐标Concentration为浓度；

图8为SJP1的ABTS^·+清除率曲线；其中，纵坐标ABTS scavenging activity为ABTS清除能力，横坐标Concentration为浓度；

图9为SJP1的OH·自由基清除率曲线；其中，纵坐标Hydroxyl radicalscavenging activity为羟基自由基的清除能力，横坐标Concentration为浓度；

图10为氧自由基清除能力ORAC值实验中各浓度SJP1溶液的相对荧光强度曲线，其中Blank为不含SJP1的空白液，纵坐标Relative fluorescence intensity为相对荧光强度，横坐标time为时间；

图11为SJP1溶液的相对荧光强度-浓度线性关系图；其中，纵坐标NetAUC为图10中曲线下净面积，横坐标Concentration为浓度；

图12为100μg/ml的SJP1溶液的相对荧光强度曲线，其中Blank为不含SJP1的空白液，纵坐标Relative fluorescence intensity为相对荧光强度，横坐标time为时间。

具体实施方式

云南产分心木原料，购自云南省凤庆县盛玉食品有限公司。

实施例1

(1)水提取：将云南产分心木用自来水清洗干净，于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎得到分心木粉末，加入蒸馏水，每克分心木粉末加入30mL蒸馏水，混合均匀后于95℃恒温水浴锅中水浴浸提3小时，4℃3500rpm离心20min，取上清液；离心所得沉淀按所述水提方法重复2次，合并上清液得到分心木多糖水提液；

(2)醇沉：向步骤(1)中的分心木多糖水提液中加入占分心木多糖水提液体积4倍量的、体积百分浓度为90％的乙醇水溶液，搅拌混匀，置于4℃冰箱中沉淀过夜，再于2℃3500rpm离心20min，取离心所得沉淀得到一次分心木粗多糖；

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次分心木粗多糖溶于水，得到一次分心木粗多糖的水溶液，将木瓜蛋白酶溶液加到一次分心木粗多糖的水溶液中，木瓜蛋白酶的重量为一次分心木粗多糖重量的2％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为800Da-1500Da的透析袋在自来水中透析48h，再用去离子水透析48h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次分心木粗多糖；

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次分心木粗多糖用去离子水溶解得到20mg/mL的二次分心木粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次分心木粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱层析，上样量5ml，二次分心木粗多糖水溶液流速1ml/min，洗脱液为0.1mol/L-0.5mol/L NaCl水溶液，梯度洗脱，洗脱液流速0.8ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖(如图1)，收集第一洗脱峰的洗脱液；将收集的第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为3cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图2)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为800Da-1500Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的分心木酸性多糖，命名为分心木多糖SJP1。

实施例2

(1)水提取：将云南产分心木用自来水清洗干净，于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎得到分心木粉末，加入蒸馏水，每克分心木粉末加入20mL蒸馏水，混合均匀后于90℃恒温水浴锅中水浴浸提2小时，4℃3000rpm离心15min，取上清液；离心所得沉淀按所述水提方法重复2次，合并上清液得到分心木多糖水提液；

(2)醇沉：向步骤(1)中的分心木多糖水提液中加入占分心木多糖水提液体积4倍量的、体积百分浓度为95％的乙醇水溶液，搅拌混匀，置于4℃冰箱中沉淀过夜，再于4℃3000rpm离心15min，取离心所得沉淀得到一次分心木粗多糖；

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次分心木粗多糖溶于水，得到一次分心木粗多糖的水溶液，将木瓜蛋白酶溶液加到一次分心木粗多糖的水溶液中，木瓜蛋白酶的重量为一次分心木粗多糖重量的2％，然后在40℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为800Da-1500Da的透析袋在自来水中透析50h，再用去离子水透析50h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次分心木粗多糖；

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次分心木粗多糖用去离子水溶解得到10mg/mL的二次分心木粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次分心木粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱层析，上样量5ml，二次分心木粗多糖水溶液流速1ml/min，洗脱液为0.1mol/L-0.5mol/L NaCl水溶液，梯度洗脱，洗脱液流速1.2ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖(如图1)，收集第一洗脱峰的洗脱液；将收集的第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为3cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图2)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为800Da-1500Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的分心木酸性多糖，命名为分心木多糖SJP1。

实施例3

(1)水提取：将云南产分心木用自来水清洗干净，于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎得到分心木粉末，加入蒸馏水，每克分心木粉末加入40mL蒸馏水，混合均匀后于100℃恒温水浴锅中水浴浸提4小时，4℃4000rpm离心30min，取上清液；离心所得沉淀按所述水提方法重复2次，合并上清液得到分心木多糖水提液；

(2)醇沉：向步骤(1)中的分心木多糖水提液中加入占分心木多糖水提液体积5倍量的、体积百分浓度为96％的乙醇水溶液，搅拌混匀，置于4℃冰箱中沉淀过夜，再于5℃4000rpm离心30min，取离心所得沉淀得到一次分心木粗多糖；

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次分心木粗多糖溶于水，得到一次分心木粗多糖的水溶液，将木瓜蛋白酶溶液加到一次分心木粗多糖的水溶液中，木瓜蛋白酶的重量为一次分心木粗多糖重量的1％，然后在55℃水浴2.5h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为800Da-1500Da的透析袋在自来水中透析40h，再用去离子水透析40h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次分心木粗多糖；

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次分心木粗多糖用去离子水溶解得到30mg/mL的二次分心木粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次分心木粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱层析，上样量5ml，二次分心木粗多糖水溶液流速1ml/min，洗脱液为0.1mol/L-0.5mol/L NaCl水溶液，梯度洗脱，洗脱液流速0.6ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖(如图1)，收集第一洗脱峰的洗脱液；将收集的第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为3cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图2)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为800Da-1500Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的分心木酸性多糖，命名为分心木多糖SJP1。

下面是对SJP1结构鉴定或性能分析的实施例：

实施例4：理化性质组分及分子量检测

将实施例1制得的分心木酸性多糖即SJP1，用苯酚-硫酸法检测总多糖含量为99.7％。从图4看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品SJP1的保留时间主要分布在14min-18min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SJP1是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。分心木酸性多糖SJP1Mw/Mn的比值为1.031，比较接近1，表明SJP1是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝3.24×10³Da。其Mark-Houwink方程为[η]＝3.80×10^-5M_w ^1.48±0.002，由构象因子1.48可以初步推断该酸性多糖的高级构象为棒状分子。

将实施例2制得的分心木酸性多糖即SJP1，用苯酚-硫酸法检测总多糖含量为99.2％。其激光光散射图与图4相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品SJP1的保留时间主要分布在14min-18min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SJP1是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。分心木酸性多糖SJP1Mw/Mn的比值为1.022，比较接近1，表明SJP1是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝3.15×10³Da。其Mark-Houwink方程为[η]＝3.57×10^-5M_w ^1.64 ^±0.003，由构象因子1.64可以初步推断该酸性多糖的高级构象为棒状分子。

将实施例3制得的分心木酸性多糖即SJP1，用苯酚-硫酸法检测总多糖含量为99.5％。其激光光散射图与图4相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品SJP1的保留时间主要分布在14min-18min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SJP1是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。分心木酸性多糖SJP1Mw/Mn的比值为1.033，比较接近1，表明SJP1是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝3.36×10³Da。其Mark-Houwink方程为[η]＝3.26×10^-5M_w ^1.37 ^±0.005，由构象因子1.37可以初步推断该酸性多糖的高级构象为棒状分子。

实施例5：单糖组成

实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP16mg，分别加入1mL4mol/L TFA溶液，置于具塞试管中、氮气封口，121℃水解6h，冷却至室温，加入200μL甲醇，60℃真空离心浓缩，去除残留的三氟乙酸，反复3次，待衍生化。将各种单糖和糖醛酸标准品溶在0.3M(mol/L)氢氧化钠水溶液中配制每种单糖和糖醛酸浓度为5mmol/L(mM)的单糖和糖醛酸标准品溶液，将多糖SJP1水解样品溶在0.3M氢氧化钠水溶液中配制酸性多糖SJP1水解样品浓度为5mmol/L的SJP1溶液，然后分别取50μl单糖和糖醛酸标准品溶液、取50μlSJP1溶液，各加入50μl 0.5M PMP甲醇液，混匀，70℃水浴100min，冷却至室温，加入50μl、0.3MHCl水溶液中和，10000rpm离心3min，将上清液转移至另一干净离心管，加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层后收集水相，为了除去PMP、过剩反应试剂等杂质，收集的水相，重复“加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层”的步骤三次，过0.22μm膜，分别得到PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液和PMP衍生化后SJP1溶液，待HPLC检测。

HPLC条件:柱子APS-2HYPERSIL(5μm，4.6×250mm)，检测波长245nm，流速1.0ml/min，柱温：室温，注入体积：10μl PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液或10μl PMP衍生化后SJP1溶液，流动相A(乙腈):流动相B(0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8))＝15:85(体积比)。

如图2，对应单糖和糖醛酸标准品，实施例1SJP1多糖部分的单糖组成为由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其物质的量之比为69.5:16.3:8.4:3.7；说明SJP1是以半乳糖醛酸和葡萄糖为主链，并含有少量分支的多糖。

对应单糖和糖醛酸标准品，实施例2SJP1多糖部分的单糖组成为由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其物质的量之比为66.3:18.6:6.2:4.4；说明SJP1是以半乳糖醛酸和葡萄糖为主链，并含有少量分支的多糖。

对应单糖和糖醛酸标准品，实施例3SJP1多糖部分的单糖组成为由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其物质的量之比为72.5:13.5:11.4:2.8；说明SJP1是以半乳糖醛酸和葡萄糖为主链，并含有少量分支的多糖。

实施例6：FTIR

取5mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1，分别用KBr压片，美国Nicolet5700红外光谱仪4000-400cm^-1红外扫描。

如图3，IR谱图在3420cm^-1，出现一强宽吸收峰，为多糖上O-H伸缩振动的强吸收峰，表明多糖的分子内和分子间均存在氢键。2928cm^-1为C-H伸缩振动，1744cm^-1处的吸收峰为糖醛酸的羰基振动峰，进一步说明SJP1含有糖醛酸，1400-1200cm^-1处的吸收峰为C-H的变形振动，表明该组分为多聚糖。1622cm^-1和1416cm^-1为-CH₂的变形振动吸收峰。此外，在920cm^-1和830cm^-1处的吸收峰分别表征该酸性多糖中同时存在β-型糖苷键和α-型糖苷键。

实施例7：甲基化分析

取4mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1样品分别溶于1ml DMSO中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method for permethylation ofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。

SJP1经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表可知：半乳糖醛酸主要以(1→4)键方式连接，葡萄糖以1,2-linked Glcp和1,2,4-linked Glcp两种方式连接，而且SJP1的分支点主要位于葡萄糖上。上述结果表明SJP1由L-Araf-(1→，→4)-D-GalpA-(1→，→2)-D-Glcp-(1→，→2,4)-D-Glcp-(1→，D-Galp-(1→，→4)-D-Galp-(1→组成，摩尔比为0.926:20.327:2.10:1.92:0.978:1.128。

通过比较SJP1的甲基化结果发现，酸性多糖中(1→4)糖苷键连接的半乳糖醛酸含量最高，其次是(1→2)糖苷键连接的葡萄糖，而(1→2,4)糖苷键连接的葡萄糖含量较少，另外还有少量的阿拉伯糖和半乳糖的端基，表明多糖的主链是以(1→4)糖苷键连接的半乳糖醛酸，支链由L-Araf-(1→和→4)-D-Galp-(1→组成。此外，经NMR分析得到证明，→2)-D-Glcp-(1→连接在半乳糖醛酸主链的首端。糖残基的摩尔比与上述单糖组成的摩尔比基本一致。

表1 SJP1甲基化分析

实施例8：核磁共振

取80mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1分别溶于1ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII600M进行600MHz NMR扫描。

根据SJP1的¹H-NMR(见图5A)和¹³C-NMR(见图5B)，检测到8个峰，然而只有6个峰较为显著可用于分析。在¹H-NMR谱中，SJP1的异头质子区(δ4.9-5.15ppm)主要有6个异头氢信号(见图5A)，按低场到高场分别为δ5.15、δ5.09、δ5.08、δ5.05、δ4.95和δ4.90ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E、F，分别与¹³C-NMR谱中异头碳区的碳信号(图5B)，δ110.36、δ104.35、δ103.32、δ103.09、δ102.45和δ101.98ppm逐一对应。其中A归属于Araf糖残基，B归属于1-,4linked GalpA糖残基，C、D归属于Galp糖残基的1-linked Galp与1,4-linked Galp，E、F归属于Glcp糖残基的1,2-linked Glcp与1,2,4-linked Glcp。

从各个糖残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型(δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00ppm为β-型)，除Glc异头氢的化学位移处于相对高场(δ<5.00)，为β-吡喃葡萄糖构型，GalUA、Gal、Ara的异头氢的化学位移均处于相对低场(δ>5.00)，为α-构型。与红外光谱中结果一致。对阿拉伯糖残基而言，化学位移在82-88ppm有振动峰出现，证明为呋喃型连接的端基糖，且化学位移在64.07ppm为C-5；对葡萄糖残基，异头碳C-1(103.09ppm)说明存在β-构型，且存在1→2连接；对半乳糖醛酸残基而言，羧基特征信号碳位于165-180nm，图谱中174.82ppm处有一明显的信号，说明含糖醛酸，与液相色谱中单糖检测含葡萄糖醛酸吻合，与主链以1→4连接；对半乳糖而言，C2-C6的化学位移与标准品对照得知该糖与主链以1→4连接。具体结构单元如结构式Ⅰ所示。

实施例9：原子力显微镜测试

将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1水溶液分别涂抹在云母片上测试，获得该多糖的原子力图，如图6，其中图6A为2维原子力形貌图，图6B为各形貌测量值，图6C为3维立体形貌图，从结果中可以看出样品轮廓长度约为400nm-650nm，高度为8nm-15nm，从而可以判断大多数由多个分子聚集而成的，进一步证实SJP1是具有少量分支的棒状链。

本发明建立了分心木酸性多糖提取纯化的方法，获得均一多糖，并初步研究其一级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要的意义。

综合实施例4-实施例9的分析结果，证实了SJP1由重量百分含量为99％以上的多糖组成；多糖由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其中，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的物质的量之比为66.30-72.50:13.50-18.60:6.20-11.40:2.80-4.40。葡萄糖为β-D-葡萄糖；半乳糖为α-D-半乳糖；半乳糖醛酸为α-D-半乳糖醛酸；阿拉伯糖为α-L-阿拉伯糖。多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接α-D-半乳糖醛酸(α-D-GalpA)残基和(1→2)连接的β-D-葡萄糖(β-D-Glcp)残基，支链为(1→4)连接的α-D-半乳糖(α-D-Galp)残基和端基α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)，支链连接在β-D-葡萄糖残基的O-4位。

实施例10：DPPH自由基清除活性

本发明分别检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1的DPPH自由基清除能力。

参考Cheng等的方法并作适当修改(Cheng,Feng,Jia,Li,Zhou,&Ding,2013)。取0.5mL不同浓度的多糖待测样品(15μg/mL-250μg/mL)于试管中，加入1.5mL去离子水，2.0mL0.1mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均匀，室温避光反应30min，在517nm波长处测吸光度，Vc(ascorbic acid)作为对照。按照下列公式计算待测样品对DPPH自由基的清除率。

清除率(％)＝(1-A₁/A₀)×100％

式中A₀为2mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加2mL蒸馏水的吸光值；A₁为2mL0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加2mL待测样品的吸光值。检测结果见图7。

实施例11：ABTS^·+自由基清除活性

本发明分别检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1的ABTS^·+自由基清除能力。

参考Re等的方法(Re,Pellegrini,Proteggente,Pannala,Yang,&Rice-Evans,1999)。ABTS^·+由7mmol/L ABTS溶液和2.45mmol/L K₂S₂O₈水溶液室温避光反应16h后生成，该溶液提前1天配制，并且必须当天使用。使用前用0.1M PBS(pH7.4)稀释到吸光值在734nm处为0.70±0.02。0.1mL样品(50-500μg/ml)溶液加到3.9mL ABTS^·+溶液中，充分混合，避光反应6min进行吸光值测定，Vc作为对照。按照下列公式计算待测样品对ABTS自由基的清除率:

清除率(％)＝(1-A/A₀)×100％

式中A₀为3.9mL ABTS^·+溶液加0.1mL蒸馏水的吸光值；A为3.9mL ABTS^·+溶液加0.1mL待测样品的吸光值。检测结果见图8。

实施例12：OH·自由基清除率活性

本发明分别检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1的OH·自由基清除能力。

由Fenton反应体系过氧化氢与亚铁离子产生羟自由基，它具有很高的反应活性、存活时间，若加入水杨酸后能有效捕捉·OH，并产生在510nm处有强吸收峰的有色物质。若加入具有清除·OH的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物变浅，吸光值减少。本试验中，在10mL比色管中依次加入7.5mmoL/L硫酸亚铁铵水溶液1mL，7.5mmoL/L水杨酸水溶液1mL，0.1％(质量百分比)H₂O₂水溶液1mL，Tris-HCl缓冲液2mL，最后分别加入一定浓度的SJP1样品1mL，室温静置2h，在510nm处测其吸光值。清除率＝(A₁-A₂)/A₁×100％，式中A₁为不加样品的吸光值，A₂为加入样品后的的吸光值。检测结果见图9。

实施例13：ORAC值检测

本发明分别检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的分心木酸性多糖SJP1的氧自由基清除能力ORAC值。

参考Hua等的方法(Hua Y,Yang B,Tang J,Ma ZH,Gao Q,Zhao MM,Structuralanalysis of water-soluble polysaccharides in the fruiting body of Dictyophoraindusiata and their in vivo antioxidant activities.Carbohyd.Polym.87:343-347(2012))。实验时取出必要量以同样75mmol/L磷酸钾缓冲液稀释至反应体系中的终浓度为63nmol/L。AAPH以75mmol/L磷酸钾缓冲液配制至反应体系终浓度为12.8mmol/L用。标准抗氧化物质Trolox以及待测样品也均用缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为，在96孔板各微孔中分别加入待测样品20μL后添加缓冲溶液20μL及FL 20μL，在37度下预置5min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH 140μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37度下以激发波长485nm，发射波长538nm进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度，测定时间一般设定在荧光衰减呈基线后为止。检测结果见图10、图11和图12。

从以上看出，其中在ABTS^·+清除率模型当中，SJP1(IC₅₀426.1μg/ml)与对照组Vc(IC₅₀158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，SJP1(IC₅₀34.6μg/ml)也与对照组Vc(IC₅₀14.3μg/ml非常接近；在OH·自由基清除率模型当中，SJP1(IC₅₀182.1μg/ml)与对照组Vc(IC₅₀280.2μg/ml)比较接近；在ORAC清除率模型中，SJP1的ORAC值为3324.5μmol TE/g；表明本发明分心木酸性多糖具有较强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。

Claims

1.一种分心木酸性多糖，其特征在于，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖的组成为半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其中，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的物质的量之比为66.30-72.50:13.50-18.60:6.20-11.40:2.80-4.40；

所述的葡萄糖为β-D-葡萄糖；所述的半乳糖为α-D-半乳糖；所述的半乳糖醛酸为α-D-半乳糖醛酸；所述的阿拉伯糖为α-L-阿拉伯糖；

所述的分心木酸性多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接的α-D-半乳糖醛酸残基和(1→2)连接的β-D-葡萄糖残基，支链为(1→4)连接的α-D-半乳糖残基和端基α-L-阿拉伯糖，支链连接在β-D-葡萄糖残基的O-4位；

所述的分心木酸性多糖的重均分子量为2.5KDa-4.5KDa。

2.根据权利要求1所述的分心木酸性多糖，其特征在于，所述的分心木酸性多糖的重均分子量为2.8KDa-4.2KDa。

3.根据权利要求1-2任一项所述的分心木酸性多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)水提：将分心木粉碎得到分心木粉末，每克分心木粉末加入20mL-40mL水，90℃-100℃浸提2小时-4小时后离心，取上清液；离心所得沉淀按所述水提方法重复1-2次，合并上清液得到分心木多糖水提液；

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次分心木粗多糖用去离子水溶解得到二次分心木粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-52离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状分心木酸性多糖。

4.根据权利要求3所述的分心木酸性多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的蛋白酶选用木瓜蛋白酶。

5.根据权利要求3或4所述的分心木酸性多糖的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶的重量为一次分心木粗多糖重量的1％-2％。

6.根据权利要求1-2任一项所述的分心木酸性多糖在作为抗氧化剂中的应用。

7.根据权利要求1-2任一项所述的分心木酸性多糖在用于制备抗氧化剂中的应用。