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CN104694541A - 禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用 - Google Patents

禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用 Download PDF

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CN104694541A
CN104694541A CN201310664639.5A CN201310664639A CN104694541A CN 104694541 A CN104694541 A CN 104694541A CN 201310664639 A CN201310664639 A CN 201310664639A CN 104694541 A CN104694541 A CN 104694541A
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avian influenza
cell
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张辰宇
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王进
李西汉
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Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明涉及禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用。具体地，本发明通过检测禽流感动物的样本的microRNA表达谱水平，首次从中筛选出特异性的microRNA：miR-HA-3p。试验证明，该miR-HA-3p作为microRNA标志物可非常有效地检测禽流感病毒和禽流感。此外，通过抑制miR-HA-3p的功能，可以很有效地缓解禽流感症状和治疗禽流感。基于本发明首次揭示的microRNA，可以开发成检测试剂和治疗试剂以及相应的试剂盒，从而用于禽流感(如H5N1)的检测和治疗。

Description

禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用
技术领域
本发明涉及生物和医学领域，更具体地，涉及禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用。
背景技术
流感病毒颗粒由两型表面糖蛋白覆盖，一型为植物血凝素(即H)，一型为神经氨酸酶(即N)，H又分15个亚型，N分9个亚型。
所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性，H5N1是禽流感病毒的一种亚型。H5N1为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，又称人感染高致病性禽流感。禽类流感根据其致病性可分为高致病性和低致病性。H5N1为高致病性禽流感病毒。
1997年，H5N1病毒首次从中国香港一3岁儿童的流感死亡病例标本中分离鉴定出。至2012年，绝大多数的人类感染病例都直接来自鸟，只有个别的病例被认为是来自被感染的人，不过一般认为H5N1病毒尚未能在人与人之间建立持续的传播链。禽流感重症患者一般均为H5N1亚型病毒感染。患者呈急性起病，早期表现类似普通型流感。主要为发热，体温大多持续在39℃以上，热程1-7天，一般为3-4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、肌肉酸痛和全身不适。部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克等多种并发症。白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低。
H5N1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行。
当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前比较有效的预防措施和关键环节。因此研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为当前禽流感防制工作的热点之一,针对疫苗的研制已经取得了大量的研究成果。但是，由于病毒变异速度快，变种种类多，现有疫苗研发速度并不能保证有效的抵抗病毒变种，所以，对H5N1侵染过程的深入研究及新治疗方法的开发更加迫在眉睫。
微小核糖核酸，英文名为microRNA，简写作miRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于生物细胞中。微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制靶mRNA的翻译。其序列、结构、丰度和表达方式的多样性使微小核糖核酸成为信使RNA强有力的调节因子并在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用。
微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，涉及生物个体发育；组织分化；细胞调亡以及能量代谢等生命活动的方方面面。同时，微小核糖核酸也与许多疾病的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某种疾病时总有一些微小核糖核酸表达量是上调的，一些是下调的。
已有相关研究表明，病毒或微生物在感染宿主细胞后，会编码特异性的miRNA，特异性miRNA作用于宿主免疫相关mRNA，调节宿主的细胞因子系统，进而影响宿主的免疫调节。
综上所述，为了更有效地预防和治疗禽流感，本领域迫切需要开发可用于检测和治疗禽流感的相关试剂和方法。
发明内容
本发明的目的就是提供可有效用于检测和治疗禽流感的相关试剂和方法。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：
(i)序列如SEQ ID NO:1、2或3所示的miRNA，或
(ii)长度为20-26nt，且具有SEQ ID NO.:4所示核心序列的miRNA；或
(iii)与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的miRNA。
在另一优选例中，所述的互补包括基本上互补(不互补的碱基≤3个，较佳地≤3个，更佳地≤1个)和完全互补。
在另一优选例中，所述的miRNA来自禽流感病毒。
在另一优选例中，所述的miRNA来自禽流感病毒H5N1。
在另一优选例中，所述的miRNA分离自人或非人哺乳动物的血液、体液、或组织样品。
在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。
在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在动物细胞内剪切并表达成如本发明第一方面所述的miRNA。
在另一优选例中，所述的动物细胞包括人细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如本发明第一方面所述的miRNA。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
式I中，
Seq正向为能在动物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的miRNA，或第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述miRNA的用途，它被用于(a)制备检测禽流感的试剂、检测芯片或试剂盒；(b)制备调控PCBP2表达或活性的调节剂；(c)制备调控细胞因子表达的试剂。
在另一优选例中，所述的调控PCBP2表达或活性的调节剂是下调PCBP2表达或活性的抑制剂。
在另一优选例中，所述细胞因子包括：TNFα、IFN-β、IL-6、IL-1β、或其组合。
在本发明的第六方面，提供了一种核酸芯片(如miRNA芯片)，所述芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获本发明第一方面所述的miRNA。
在本发明的第七方面，提供了本发明第六方面所述核酸芯片的用途，它被用于制备检测禽流感的试剂盒。
在本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有第七方面所述的核酸芯片或本发明第一方面所述的miRNA。
在本发明的第九方面，提供了一种特异性抑制或阻断本发明第一方面所述的miRNA的抑制剂。
在另一优选例中，所述的抑制剂是miRNA海绵(sponge)、与miRNA序列互补的反义核酸、小分子化合物。
在另一优选例中，所述的抑制剂是与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的核酸(如RNA、DNA或类似物)。
在本发明的第十方面，提供了本发明第九方面所述的miRNA的抑制剂的用途，它被用于制备(a)治疗禽流感的药物，(b)缓解禽流感症状的药物，(c)减少宿主动物中禽流感病毒数量的药物，(d)降低禽流感死亡率的药物，(e)降低过度免疫的药物。
在本发明第十一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和特异性抑制或阻断本发明第一方面所述的miRNA的抑制剂
在另一优选例中，所述的miRNA的抑制剂包括miRNA海绵(sponge)、与miRNA序列互补的反义核酸。
在本发明的第十二方面，提供了一种筛选用于治疗禽流感的候选药物的方法，包括步骤：
(a)提供一测试组和一对照组，其中在所述测试组中将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miR-HA-3p的表达水平，而所述的对照组采用与测试组相同的条件，但不将候选物质施用于对照组的细胞或动物；
(b)将测试组的miR-HA-3p与对照组的miR-HA-3p的表达水平进行比较；
其中，当测试组的miR-HA-3p的表达水平显著低于对照组的miR-HA-3p的表达水平时，则表明该候选物质是用于治疗禽流感的候选药物。
在另一优选例中，所述的miR-HA-3p的序列如SEQ ID NO.:1-3中所述。
在另一优选例中，所述的动物包括小鼠，所述的细胞包括体外培养的细胞。
在本发明的第十三方面，提供了一种miR-HA-3p的用途，它用于制备的下调PCBP2表达或活性的调节剂或药物组合物。
在另一优选例中，所述的miR-HA-3p的序列如SEQ ID NO.:1-3中所述。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在禽流感H5N1在感染宿主细胞后，会释放特殊的小分子miR-HA-3p。
图2显示了miR-HA-3p对靶基因PCBP2的抑制作用。
图3显示了在H5N1野生型和突变株感染的巨噬细胞中，miR-HA-3p对细胞因子分泌的影响。
图4显示了用miR-HA-3p抑制剂进行处理后，PCBP2的表达情况。
图5显示的是感染了H5N1或H5N1突变株的巨噬细胞在不同处理条件下TNF-α,IFN-β,IL-1β或IL-6mRNA的表达水平。
图6显示了在小鼠模型中，miR-HA-3p与H5N1感染程度呈正相关。
图7显示了不同处理条件下四天后小鼠肺部PCBP2蛋白水平。
图8显示了组织病理学方法针对多组实验小鼠的肺部组织研究结果。
各附图中，“Mut”表示突变，“control”表示对照，“Marker”表示分子量标准，“Mock”表示空白对照。
具体实施方式
本发明人经过长期而广泛的研究，首次意外地发现，体内病原体(包括感染微生物、寄生微生物、共生微生物等)会释放非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，包括miRNA，这些特定的ncRNA可作为体内病原体的生物标志物，可有效地用于体内病原体的检测和治疗，从而显著改善微生物感染性疾病的诊断和治疗。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人通过检测禽流感动物的样本的microRNA表达谱水平，首次从中筛选出一种特异性的microRNA：miR-HA-3p。经检验证明，miR-HA-3p作为microRNA标志物可非常有效地检测禽流感病毒和禽流感。此外，通过抑制miR-HA-3p的功能，可以很有效地缓解禽流感症状和治疗禽流感。基于本发明首次揭示的microRNA，可以开发成检测试剂和治疗试剂以及相应的试剂盒，从而用于禽流感(如H5N1)的检测和治疗。
实验证实，H5N1在感染宿主细胞后，会释放特殊的小分子物质miR-HA-3p进入宿主体内循环，并且miR-HA-3p的表达量与病毒的感染程度是成正相关的。本发明进一步发现miR-HA-3p的靶基因为PCBP2,miR-HA-3p通过作用于PCBP2mRNA下调PCBP2蛋白表达，导致MAV介导的抗病毒过程的增强，从而在H5N1侵染过程中引起过渡的免疫应答或者细胞因子风暴。本发明通过构建人类巨噬细胞模型及小鼠模型，证实了阻断miR-HA-3p后，可以缓解宿主的炎症反应，提高小鼠的存活率。
本发明通过构建miR-HA-3p特异性的刺激剂和抑制剂，达到了调节miR-HA-3p表达水平的目的，由此可以缓解和治疗H5N1病毒引起的多种免疫反应及组织学病变。这种疗法特异性强、高效、副作用小、成本低，并且这种方法给人类抗H5N1病毒及其变种提供了一种新思路。
术语
如本文所用，术语“本发明miRNA”、“禽流感H5N1特异性miRNA”可互换使用，指miR-HA-3p，包括miR-HA-3p-1、miR-HA-3p-2、miR-HA-3p-3以及具有其核心序列(SEQ ID NO.:4)的类似miRNA。
如本文所用，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”可互换使用，含义相同。
如本文所用，术语“miR-HA-3p阻断剂”、“本发明阻断剂”、“本发明抑制剂”指能够抑制或阻断miR-HA-3p功能的物质，如反义序列或核酸sponge等。这些抑制剂可抑制miR-HA-3p与PCBP2的mRNA的结合，以及抑制miR-HA-3p对靶基因PCBP2表达的下调。
如本文所用，术语“Agomir”指miRNA刺激剂。Agomir可根据microRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的双链小RNA分子,是用于模拟内源性成熟体miRNA序列。通常，agomir包括一条与目标miRNA成熟体序列一致的序列，以及一条与miRNA成熟体序列互补的序列。特异的microRNA agomir能够被导入到表达对应microRNA的细胞内，模拟microRNA的作用，或者与构建有miRNA结合位点的双荧光素酶报告系统结合，验证miRNA与靶基因之间的调控关系。
如本文所用，术语“Antagomir”指miRNA阻断剂。Antagomir可根据microRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA,是专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。
Agomir和antagomir可根据所提供的短RNA的序列，用常规方法进行设计和合成。
如本文所用，术语“Ago2”指argonaute RISC catalytic component2。它是构成RISCs复合物的主要成分，参与干涉性短RNA-介导的基因沉默(short-interfering-RNA-mediated gene silencing)。
miRNA及其前体
本发明提供了一类新的、来自于禽流感病毒的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:1-3所示的序列或具有SEQ IDNO.:4所述的核心序列。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。
反义寡核苷酸
根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了其反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到动物(如禽流感患者)体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：
式I中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
所述的表达载体可优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
检测试剂、检测芯片和检测试剂盒
本发明还提供了一种用于检测禽流感病毒或禽流感的试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的检测试剂、或检测芯片。所述的试剂盒可用于检测本发明的禽流感特异性miRNA的表达谱；或用于检测禽流感病毒或禽流感，优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
芯片
microRNA表达谱芯片通常含有多上百、上千或更多个探针，涵盖多种microRNA，利用双链同源互补的原理检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中的microRNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。
在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于检测禽流感病毒或禽流感。
本发明的所述的miRNA芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括针对SEQ ID NO:1-4所示的序列的核酸序列。
具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。
本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的本发明miRNA(即miR-HA-3p)的抑制剂、阻断剂或拮抗剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物(如哺乳动物和禽类)而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备治疗禽流感、缓解禽流感症状、减少宿主动物中禽流感病毒数量、降低禽流感死亡率的药物、降低过度免疫等。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明提供了一类禽流感H5N1病毒的特异性microRNA，即miR-HA-3p。
(b)本发明miRNA可作为检测禽流感病毒或禽流感的标志物，非常有效地检测禽流感病毒或禽流感。
(c)本发明miRNA还可作为治疗禽流感的靶标，通过使用针对本发明miRNA的抑制剂(或阻断剂)，可以靶向性治疗H5N1病毒引起疾病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.H5N1编码miRNAs的筛选及检测
首先利用计算机建模，筛选H5N1编码的miR。利用实时定量PCR检测筛选得到的miRs在H5N1感染的多种细胞中的表达水平；利用RNA印迹法加以验证miR-HA-3p的表达水平。
1.1实验方法：
1).利用计算机建模软件，根据结构与相似度，用未知miRNAs前体与已知miRNAs前体进行比对的方法，针对H5N1流感病毒四种亚型(H1N1,H3N2,H5N1和H9N2)进行上述比对，获得了十八个候选的由H5N1编码的特殊的miRNAs前体并预测出相应的miRNAs。针对18个候选miRNAs进行了实时定量PCR以检测在H5N1感染细胞中是否含有预测的miRNAs，所用RNA样品提取自H5N1感染的HEK293A,HEK293T,A549和MDCK细胞。miRNA表达量检测以U6为内参基因。
2).针对筛选出的表达量有显著性变化的miRNA——miR-HA-3p，利用实时定量PCR法分别测定其处于H5N1重感染期及恢复期的患者血清中表达水平。
3).利用RNA印迹法再次检测目标miRNAs在H5N1感染细胞中的表达量。
4).利用RNA印迹法证实miR-HA-3p不只存在于特定的H5N1流感病毒中，本发明人提取了H5N1感染的A549细胞的小RNA片段(＜200nt)，用这些片段与miR-HA-3p相应探针进行杂交。
1.2实验结果：
具体结果见图1
1).图1A显示预测的H5N1miRNA前体茎环结构次级结构。预测通过Mfold进行，预测出的成熟miRNA的5'端和3'端分别用红蓝色标注。图1A结果表明，三个预测出的前体中，一条由HA片段编码，其他两条由PA片段编码。每个候选的miRNA都可以折叠成特异稳定的发夹结构。
图1B显示的是18种候选miRNA在H5N1病毒侵染四种细胞后的表达水平，由图1B可以看出miR-HA-3p和miR-PA1-3p两种miRNA可以在感染24小时后的细胞中稳定检测到，其他16种miRNA表达量较低。
其中，miR-HA-3p有以下三种具体序列：
miR-HA-3p-1：AGGACUAUUUGGAGCUAUAGCA(SEQ ID NO.:1)
miR-HA-3p-2：GGACUAUUUGGAGCUAUAGCAG(SEQ ID NO.:2)
miR-HA-3p-3：GAGGACUAUUUGGAGCUAUAGC(SEQ ID NO.:3)
上述3种miRNA的核心序列是GGACUAUUUGGAGCUAUAGC(SEQ ID NO.:4)。
图1C显示的是病毒感染后不同时间点miR-HA-3p和miR-PA1-3p的表达水平测定结果，图1C表明miR-HA-3p和miR-PA1-3p两种miRNA在H5N1感染的A549细胞中不同时间点的表达量在感染过程中逐渐增高，并且miR-HA-3p的表达量在感染后每个时间点都高于miR-PA1-3p的表达量。
2).图1D显示的是恢复期患者血清中miR-HA-3p的绝对值，图1D表明处于重感染期(acute)的患者血清中的miR-HA-3p表达量很高，但是在病毒感染减退之后，miR-HA-3p几乎检测不到。
3).图1E显示的是RNA印迹法分析复合感染A549细胞24小时后miR-HA-3p和miR-PA1-3p的表达水平，最左边为marker。图1E表明～80-nt miR-HA-3p前体miRNA和22-nt成熟miR-HA-3p可以从H5N1感染的A549细胞中快速检测到。～100-nt前体miR-PA1-3p RNA也可以检测到，但是成熟的miR-PA1-3p不能检测到。RNA印迹法结果与实时定量PCR结果是一致的。
4).图1F显示的是RNA印迹法分别测定两种菌株感染A549细胞后miR-HA-3p的表达水平。图1F结果显示两种H5N1IAV分离株感染宿主后都可产生miR-HA-3p。
上述多组实验结果证明，H5N1在感染宿主细胞后，会释放特殊的小分子miR-HA-3p进入宿主体内循环，并且miR-HA-3p的表达量与病毒的感染程度是成正相关的。
实施例2.miR-HA-3p靶位点的预测及验证
在本实施例中，对miR-HA-3p的靶位点进行预测和验证。构建了小鼠和人类的PCBP2突变株，通过检测荧光素酶活性检测PCBP2与miR-HA-3p量的关系；通过Wertern blotting检测靶基因相应蛋白的表达量与miR-HA-3p量的关系。
2.1实验方法：
1).计算机建模方法预测miR-HA-3p靶位点。
2).为检测miR-HA-3p是否调节PCBP2的表达，分别构建了小鼠和人类的PCBP2突变株，之后用agomir-HA-3p(miR-HA-3p刺激剂)和agomir-HA-3p(M)(突变的miR-HA-3p刺激剂)分别处理PCBP2野生型和突变株。通过检测荧光素酶活性检测PCBP2与miR-HA-3p量的关系。通过Werternblotting检测靶基因相应蛋白的表达量与miR-HA-3p量的关系。
3).为了确定PCBP2蛋白表达量的下调是由miR-HA-3p引起的，通过Wertern blotting检测了含有miR-HA-3p的A549细胞中PCBP2蛋白的含量。作为对照，构建了可以沉默PCBP2基因的RNAi系统。
4).为了获得miR-HA-3p以PCBP2为靶位点的直接证据，本发明人还做了RNA结合蛋白的免疫沉淀实验用来检测PCBP2mRNA和Ago2的复合物，该复合物是一种RNA诱导的沉默复合体，用miR-16作为对照。
2.2实验结果：
具体结果见图2
1).图2A显示的是miR-HA-3p与人类和小鼠PCBP2 mRNA 3'端结合位点，图2A表明经过预测后发现PCBP2 mRNA是miR-HA-3p的一个潜在靶位点。
2).图2B显示的是人类PCBP2基因野生型和变异型转染的HEK293T细胞分别经agomir, agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理后的荧光素酶活性。图2B表明人类模型中agomir-HA-3p可以显著下调野生型PCBP2的表达量。但是agomir-HA-3p(M)没有上述作用。
图2C显示的是小鼠PCBP2基因野生型和变异型感染的HEK293T细胞分别经agomir, agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理后的荧光素酶活性。图2C表明小鼠模型中agomir-HA-3p可以显著下调野生型PCBP2的表达量，但是agomir-HA-3p(M)没有上述作用。
3).图2D显示的是agomir, agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理的A549细胞PCBP2蛋白水平的Wertern blotting分析结果。图2D 结果说明A549细胞转染了agomir-HA-3p后，PCBP2的表达明显被抑制，但是转染了agomir-HA-3p(M)的细胞PCBP2表达无明显变化。
图2E显示的是agomir, agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理A549细胞后PCBP2 mRNA表达水平。
4).图2F显示的是agomir, agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理A549细胞后经免疫沉淀反应获得的PCBP2 mRNA的实时定量PCR测定结果；对照结果为agomir 处理A549细胞后通过IgG进行免疫沉淀获得的结果。图2F结果表明，转染了agomir-HA-3p的A549细胞，当miR-HA-3p过量表达时，PCBP2 mRNA和Ago2复合物有近20倍的富集，说明miR-HA-3p和PCBP2 mRNA在RNA诱导的沉默复合体中发生了反应，并调节了PCBP2蛋白的转录后水平。与预期相符的是，去掉agomir-HA-3p的实验组没有出现PCBP2 mRNA和Ago2复合物的富集。
以上结果表明，miR-HA-3p可以直接作用于PCBP2 mRNA的3'端，说明miR-HA-3p在抑制翻译方面起到了作用。PCBP2属于核蛋白E族，与MAV介导的抗病毒作用相关。H5N1可以通过沉默PCBP2来增强MAV介导的抗病毒过程，从而在H5N1侵染过程中引起过度的免疫应答或者细胞素风暴。
实施例3. 利用巨噬细胞模型证实miR-HA-3p在H5N1感染过程中调节细胞因子的分泌
为了验证miR-HA-3p对细胞因子的影响，在本实施例中，用人类巨噬细胞作为体外模型进行如下实验。
3.1实验方法：
1).用agomir, agomir-HA-3p和agomir-HA-3p(M)分别处理已分化的巨噬细胞，检测转染24小时后通过实时定量PCR法检测胞内miR-HA-3p水平。
2).为了检测病毒感染过程中miR-HA-3p对目标蛋白表达量的影响，本发明人利用反向基因学构建了一种H5N1病毒突变株。为了检测突变株在体外的复制效果，本发明人用野生型和突变株两种病毒对巨噬细胞进行了复合感染。48小时后进行了病毒滴定实验检测病毒值(效价)。
3).检测野生型H5N1和突变株H5N1感染巨噬细胞后胞内miR-HA-3p的表达水平。
4).在病毒感染前，本发明人分别用antagomir-HA-3p(mir-HA-3p阻断剂)和antagomir(mir阻断剂)处理巨噬细胞。之后检测病毒感染后24、48小时后几个处理组的PCBP2表达水平。
5). 取感染后几个特定时间点检测各个处理组中TNF-α、IL-6及其他细胞因子例如IFN-β、IL-1β的转录水平。
6). 取感染后几个特定时间点检测各个处理组巨噬细胞培养物上清液中的TNF-α, IFN-β和IL-6的含量。
3.2实验结果：
具体结果见图3，图4，图5。
1). 图4A显示的是agomir-HA-3p突变序列和H5N1突变株突变点的原理示意图。
图4B显示的是电穿孔24小时后agomir, agomir-HA-3p或agomir-HA-3p(M)处理组巨噬细胞中miR-HA-3p的表达水平。图4B结果表明转染24小时后agomir-HA-3p 处理组的miR-HA-3p含量显著提升，agomir或agomir-HA-3p(M)处理组的胞内miR-HA-3p水平保持平稳，
图4C显示的是电穿孔48小时后agomir, agomir-HA-3p或agomir-HA-3p(M)处理组巨噬细胞的PCBP2蛋白水平。由图4C可以看出，PCBP2蛋白的表达量，agomir-HA-3p处理组显著低于agomir或agomir-HA-3p(M)处理组。
图4D显示的是电穿孔48小时后agomir, agomir-HA-3p或agomir-HA-3p(M)处理组巨噬细胞的PCBP2 mRNA表达水平。图4D结果表明三个处理组的PCBP2mRNA水平均无显著变化。
2).图4E显示的是感染H5N1(野生型)或H5N1突变株的巨噬细胞在感染48小时后的效价。结果表明，野生型H5N1跟突变株H5N1的效价无较大差异。
3).图3A显示的是H5N1和突变株感染的巨噬细胞在感染后不同时间点miR-HA-3p的表达水平。图3A结果表明，野生型H5N1病毒感染的巨噬细胞24小时后miR-HA-3p表达水平相对较高，突变株感染的巨噬细胞中的miR-HA-3p基本保持不变。
4).图3B显示的是先通过antagomir或antagomir-HA-3p处理，后经H5N1感染的巨噬细胞在感染后不同时间点的PCBP2蛋白水平分析结果。图3B可以看出病毒感染后24小时和48小时后，antagomir-HA-3p处理组的PCBP2蛋白水平显著高于antagomir处理组。
图3C显示的是TCID50 法测定感染了H5N1的细胞在感染后不同时间点的病毒值。
5). 图3D-F 显示的是不同处理组分别处理H5N1或H5N1突变株后，细胞上清液中TNF-α, IFN-β和IL 6的水平。图3D-F可以看出antagomir-HA-3p处理组细胞因子浓度低于antagomir处理组。实际上antagomir-HA-3p处理组巨噬细胞培养物上清液中的TNF-α, IFN-β和IL-6的含量与变异株感染巨噬细胞组相应细胞因子含量相当。
6).图5显示的是感染了H5N1或H5N1突变株的巨噬细胞在不同处理条件下TNF-α, IFN-β, IL-1β或IL-6 mRNA的表达水平。图5结果表明antagomir-HA-3p处理组TNF-α的转录水平有下调，antagomir-HA-3p处理组在感染24小时后，IL-6mRNA在巨噬细胞中的含量是antagomir处理组的60%左右。在其他细胞因子例如IFN-β、IL-1β，也检测到了类似现象。
以上实验结果表明，跟普通流感患者相比，感染了H5N1病毒的患者血清中的细胞活素及炎症趋化因子的水平明显较高。本实验证实了H5N1病毒产生的miR-HA-3p在感染过程中对RIG-I信号系统有调节作用，会促进细胞因子的产生。因为PCBP2在RIG-I信号系统中起着重要调节作用，所以miR-HA-3p通过作用PCBP2来行使功能。
实施例4.利用小鼠模型证实miR-HA-3p与H5N1感染程度呈正相关
在本实施例中，应用已经建立好的小鼠模型来检测miR-HA-3p在体内H5N1感染引起的细胞因子调节异常中的作用。主要应用了实时定量PCR法，组织学检测法，ELISA及病毒值滴定法，方法如下。
4.1实验方法：
1).给雌性BALB/c小鼠分别鼻内接种致死剂量的H5N1(野生型)和H5N1突变株，之后检测其体重、致死率、病毒复制情况和细胞因子聚合物。在病毒侵染8小时后，接种H5N1和H5N1突变株的两组小鼠每组分为两小组连续五天分别注射miR-HA-3p阻断剂和miR阻断剂。
2).进一步测定了各个处理组小鼠肺匀浆的病毒值。实验组共7组，6个处理组为H5N1，H5N1(MUT),H5N1+control antagomir,H5N1(MUT)+control antagomir,H5N1+antagomir-HA-3p,H5N1(MUT)+antagomir-HA-3p，对照组为PBS处理组。
3).对7个实验组小鼠进行了组织学检查。
4).为了确定病毒感染过程中产生的细胞因子是否与miR-HA-3p相关，在感染后多个时间点针对7个实验组测定了TNF-α,IFN-β,IL-1β和IL-6四种细胞因子的浓度。
4.2实验结果：
针对实验方法1中具体结果见图6：
图6(A,B)显示的是接种H5N1或者突变株的小鼠在不同处理条件的死亡率。图6(C,D)显示的是接种H5N1或者突变株的小鼠在不同处理条件的体重流失程度。
图6(E-H)显示的是ELISA测定的接种了H5N1或者突变株的小鼠在不同处理条件下肺部四种细胞因子(TNF-α(E),IFN-β(F),IL-1β(G)and IL-6(H))的水平。
具体结果分析如下：
1).图6A显示，接种7天后，H5N1处理组的小鼠死亡率100%，图6C显示H5N1处理组小鼠有20%以上的体重流失。(H5N1+control antagomir)处理组小鼠死亡率和体重流失与H5N1处理组相当，然而(H5N1+antagomir-HA-3p)处理组小鼠7天后虽然有一定的体重流失但是死亡率仅在10%左右。图6A和图6C显示H5N1(MUT)处理组小鼠和H5N1处理组小鼠相比存活时间较长，体重减少速度慢。图6B显示，H5N1(MUT)处理组小鼠在继续注射mir-HA-3p刺激剂后，存活率明显下降，图6D显示H5N1(MUT)处理组小鼠在继续注射mir-HA-3p刺激剂后体重下降速度加快，跟预期相同的是，图6B显示H5N1(MUT)处理组小鼠继续注射miR刺激剂后存活率和体重均无显著变化。
2).图6E-H表明H5N1处理组四种细胞因子的浓度均高于突变株处理组及(mir-HA-3p阻断剂+H5N1)处理组。这与之前巨噬细胞模型中细胞因子检测结果一致。
3).图7显示的不同处理条件下四天后小鼠肺部PCBP2蛋白水平。图7结果表明4天后，H5N1处理组小鼠肺部的PCBP2蛋白含量明显低于(H5N1+miR-HA-3p阻断剂)处理组和H5N1(MUT)处理组。
4).图8显示的是组织病理学方法针对多组实验小鼠的肺部组织研究结果。图8检测结果显示，阻断miR-HA-3p可以缓解小鼠肺部炎症损伤。H5N1处理组小鼠有严重的支气管上皮细胞坏死并伴随有炎症反应。相反，(mir-HA-3p阻断剂+H5N1)处理组和H5N1(MUT)处理组小鼠在感染四天后炎症反应适中。
以上实验结果表明，应用mir-HA-3p阻断剂阻断miR-HA-3p与目标mRNA结合，可以降低H5N1感染小鼠的死亡率，并且可以减缓感染小鼠体重下降速度。这一结论在H5N1(MUT)处理组中也得到了证实。
讨论：
本发明的实验结果证实了H5N1在感染宿主细胞后，会释放特殊的小分子物质miR-HA-3p进入宿主体内循环，并且miR-HA-3p的表达量与病毒的感染程度是成正相关的。
此外，miR-HA-3p的靶基因为PCBP2,miR-HA-3p通过作用于PCBP2mRNA下调PCBP2蛋白表达，导致MAV介导的抗病毒过程的增强，从而在H5N1侵染过程中引起过渡的免疫应答或者细胞因子风暴。
阻断miR-HA-3p可以达到调节miR-HA-3p表达水平的目的，由此可以缓解和治疗H5N1病毒引起的多种免疫反应及组织学病变，在目前的H5N1研究基础上完成了新的科学和技术突破，将H5N1的理论研究提升到了新的高度。
本发明中，创造性地将microRNA疗法引入H5N1的治疗中，通过采用一系列原创性试验方法如microRNA预测及鉴定，巨噬细胞试验，小鼠模型试验等证实了H5N1特异性miRNA的存在，这种疗法特异性强、高效、副作用小、成本低，方法上的创新使本发明在应用前景上十分广阔。
在上述基础上，本发明还证实了这种特异性miRNA前体存在于多株H5N1病毒分离株中，这表明H5N1病毒变种中也可能稳定存在有此种miRNA，现有疫苗只能达到预防H5N1的目的，而H5N1病毒变异快，疫苗研发速度无法匹配。在本发明中，利用miR-HA-3p阻断剂靶向性治疗H5N1病毒引起疾病的方法，是一种创新方法，为人类抵抗H5N1病毒及其变异株提供了新思路、新方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自：
(i)序列如SEQ ID NO:1、2或3所示的miRNA，或
(ii)长度为20-26nt，且具有SEQ ID NO.:4所示核心序列的miRNA；或
(iii)与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的miRNA。
2.如权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述的miRNA来自禽流感病毒，较佳地来自禽流感病毒H5N1。
3.一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在动物细胞内剪切并表达成如权利要求1所述的miRNA。
4.一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如权利要求1所述的miRNA。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
式I中，
Seq正向为能在动物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的miRNA，或权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.权利要求1所述miRNA的用途，其特征在于，用于(a)制备检测禽流感的试剂、检测芯片或试剂盒；(b)制备调控PCBP2表达或活性的调节剂；(c)制备调控细胞因子表达的试剂。
8.一种核酸芯片，其特征在于，所述的核酸芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获权利要求1所述的miRNA。
9.一种试剂盒，所述的试剂盒中含有权利要求8所述的miRNA芯片或权利要求1所述的miRNA。
10.一种特异性抑制或阻断权利要求1所述的miRNA的抑制剂；以及所述的miRNA的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备(a)治疗禽流感的药物，(b)缓解禽流感症状的药物，(c)减少宿主动物中禽流感病毒数量的药物，(d)降低禽流感死亡率的药物，(e)降低过度免疫的药物。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和特异性抑制或阻断权利要求1所述的miRNA的抑制剂。
12.一种筛选用于治疗禽流感的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一测试组和一对照组，其中在所述测试组中将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miR-HA-3p的表达水平，而所述的对照组采用与测试组相同的条件，但不将候选物质施用于对照组的细胞或动物；
(b)将测试组的miR-HA-3p与对照组的miR-HA-3p的表达水平进行比较；
其中，当测试组的miR-HA-3p的表达水平显著低于对照组的miR-HA-3p的表达水平时，则表明该候选物质是用于治疗禽流感的候选药物。
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