CN104593526B - 一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种I型和II型PCV的通用半巢式PCR引物及各型PCV的特异性巢式PCR引物，建立了一种猪圆环病毒的检测方法，经序列测定证实该方法快速、特异和有效。
Description
技术领域
本发明的领域涉及一种猪圆环病毒的检测的方法，尤其涉及一种在轮状病毒疫苗中检测猪圆环病毒的方法。
背景技术
猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14～25nm，平均直径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA。其在组织中的悬浮密度为1.37cm3，沉降系数为52S，是目前发现的最小的动物病毒。PCV对外界的抵抗力较强，该病毒对氯仿不敏感，不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。
根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，PCV被分为PCV—1和PCV—2。PCV—1无致病性，1974年由德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现，1982年证实该病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织。后来证实该病毒只是一种可以感染猪的普通病毒，不会对感染猪造成危害。PCV-2却具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。
2010年3月22日，美国FDA宣布暂停GSK公司生产的轮状病毒疫苗Rotarix的使用，因为在该疫苗存在猪圆环病毒1型(PCV1)DNA的污染。这一结论是在Eric Delwart博士的实验室采用称为深度测序(Deep sequencing)的新技术得到的。但是深度测序在应用上也存在一定缺陷，这主要包括检测方法复杂、费用高昂等。
同时，GSK和FDA随后进行的检测也证实了该疫苗中确实存在这种DNA。2010年5月6日，FDA宣布RotaTeq(由默克公司生产)中查出含有猪圆环病毒I型(PCV1)以及猪圆环病毒II型(PCV2)中的DNA片段。这两种疫苗原本有着极好的安全记录。目前为止，还没有证据表明这2种疫苗中存在的PCV在人体中会引起感染，但是这种动物来源的病原的存在终会是有风险的，这也提示对于疫苗质量的控制很重要。
故如何在轮状病毒疫苗中有效检测猪圆环病毒，从而提高疫苗纯度成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对以上问题分别设计了I型和II型PCV的通用半巢式PCR引物及各型PCV的特异性巢式PCR引物，建立了一种猪圆环病毒的检测方法，经序列测定证实该方法快速、特异和有效。
本发明的一方面在于提供一种猪圆环病毒的检测方法，其中猪圆环病毒包括I型及II型病毒，该方法包括：
对样品提取DNA,并进行第一PCR；以及
就第一PCR所获得的扩增产物进行第二PCR，本申请提供了以下这些引物组，具体为：
第一PCR所使用的引物包括第一引物组，第二引物组及第三引物组，
第二PCR所使用的引物包括第四引物组，第五引物组及第六引物组，
其中，
第一引物组包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下游引物，
第二引物组包括如SEQ NO:3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下游引物，
第三引物组包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下游引物，
第四引物组包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下游引物，
第五引物组包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下游引物，
第六引物组包括如SEQ NO:10所示序列的上游引物，及如SEQ NO:11所示序列的下游引物。
其中，前述检测的样品为轮状病毒口服活疫苗、3价轮状病毒重配疫苗、小牛血清、培养基、细胞消化用胰酶、病毒消化用胰酶、和/或Vero细胞。
其中，前述方法还包括对所述第二PCR扩增之后的产物进行定性分析。定性分析包括用凝胶电泳显示所述第二PCR扩增之后的产物。
本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组为通用引物组，其可以检测包括I型和/或II型病毒在内猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下游引物。
本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组为通用引物组，其可以检测包括I型和/或II型病毒在内猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下游引物。
本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以检测包括I型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下游引物。
本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以检测包括I型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:10所示序列的上游引物，及如SEQ NO:11所示序列的下游引物。
本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以检测包括II型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下游引物。
本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以检测包括II型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下游引物。
本发明有以下特点：
1.本发明所涉及的I型、II型通用引物是根据PCV1和PCV2都保守的区域设计的，用此半巢式PCR引物对合成的PCV1片段以及PCV2细胞培养物均能扩增出260bp的特异性片段。经过序列测定并比对后，其与其他PCV1毒株及PCV-II毒株同源性高(以PCV1为模板扩增的片段与PCV1毒株的同源性在96％以上，以PCV2细胞培养物为模板扩增的片段与II型PCV毒株的同源性高于97％)。
2.另一方面，本发明的申请人设计出了PCV-I型特异性的巢式PCR引物，对合成的PCV-I片段进行扩增，外引物和内引物都能扩增出相应预期大小的目的片段，经测序和序列比对后与其他PCV1毒株的基因同源性高(均在99％以上)。
3.另一方面，本发明的申请人设计出了PCV2特异性的巢式PCR引物，对PCV-II片段进行扩增，获得的500bp的特异性片段经测序后，与其他2型PCV毒株的同源性高(在98％以上)。
4.本发明的另一方面在于提供了一种可在轮状病毒疫苗及其他辅助产品中检测PCV-I及PCV-II的有效方法。
附图说明
本发明将参考附图进行进一步的解释，其中：
图1是以合成的PCV-I片段阳性重组质粒为模板，PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ通用引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片；
图2是以合成的PCV-I片段阳性重组质粒为模板，PCV-Ⅰ特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片；
图3是以PCV-Ⅱ细胞培养物为模板，PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ通用引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片；
图4是以PCV-Ⅱ细胞培养物为模板，PCV-Ⅱ特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片；
图5是以各种轮状病毒疫苗及相关成分为模板，PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ通用引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片；
图6是以各种轮状病毒疫苗及相关成分为模板，PCV-Ⅰ特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片；
图7是以各种轮状病毒疫苗及相关成分为模板，PCV-Ⅱ特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料或生物制剂，如无特殊说明，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
具体实施方式
以下的优先实施例对本发明或者实用新型作补充说明，但不意味着限制本发明的内容。下述引物及基因由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1 检测样本
由于PCV-Ⅰ型病毒的缺乏，设计并和合成了PCV-Ⅰ型病毒的部分基因片段。根据Genebank中登录的序列，设计并和合成的PCV-Ⅰ型病毒的部分基因片段(全长730bp，81bp～810bp)序列如SEQ NO:12所示。II型猪圆环病毒样品为兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室自行培养的猪肾细胞病毒培养物。该病毒和细胞系由兰州兽医研究所提供。轮状病毒口服活疫苗由兰州生物制品研究所有限责任公司疫苗一室提供，3价轮状病毒基因重配疫苗由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室提供。除了新生牛血清浓缩10倍以外，所有检测样品都用浓缩管浓缩到至少100倍。
2 试剂
DNA提取试剂DNA zol购自Invitrogen公司，Ex Taq酶和DNA Marker为Takara公司产品；Agarose Gel DNA回收试剂盒购自QIGEN公司。新生牛血清购自兰州荣晔生物科技有限责任公司，MEM购自GIBCO公司，消化病毒用胰蛋白酶购自Sigma公司，消化细胞用胰酶购自BD公司，Vivaspin15浓缩管购自Sartorius公司。
3 引物及基因片段的设计与合成
根据GeneBank中登录号JN133301.1、GU799575.1、GQ449671.1和EF52452.1的序列，借助Primer 5.0分别设计PCV1和PCV2的通用半巢式PCR引物以及各型的特异性巢式PCR引物，预期扩增片段长度分别为260bp、434bp和500bp，引物序列如下表1：
表1引物序列
4 DNA的提取
采用DNA zol试剂说明方法提取。提取的样品包括，II型猪圆环病毒样品(即为前述猪肾细胞病毒培养物，由第二研究室将PCV-II在PK细胞(兰州兽医研究所提供)中培养后获得)、PCV-Ⅰ型病毒重组质粒(委托上海生物工程有限责任公司)、小牛血清(购自兰州荣晔生物科技有限责任公司)、MEM培养基(购自GBICO公司)、消化细胞用胰蛋白酶(购自BD公司)、消化病毒用胰蛋白酶(购自SIGMA公司)、Vero细胞(购自ATCC)、口服轮状病毒活疫苗(兰州生物制品研究所有限责任公司生产的市售疫苗)、轮状病毒LD株(兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室重配的2型毒株)、轮状病毒LS株(兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室重配的3型毒株)、轮状病毒LH株(兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室重配的4型毒株)、3价轮状病毒基因重配苗(兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室研发的疫苗)。
5 巢式PCR
5.1第一PCR
吸取上步提取的DNA各4μl作模板，分别扩增片段PCS2A3、S2A2和P3P4。分别加入上游正义引物PCS2(10pM)、S2(10pM)和P3(10pM)各1μl，下游反义引物PCA3(10pM)、A2(10pM)和P4(10pM)各1μl、dNTP(各10mM)各1μl，10×Ex taq buffer各5μl，灭菌蒸馏水各37.75μl，Ex taq各0.25μl。将50μl反应体系在PCR扩增仪内进行第一次扩增。其程序如下：94℃变性5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，进行30个循环后72℃延伸5min。
5.2第二PCR
以前述第一PCR产物为模板取2μl，分别扩增片段PCS2A2、S3A3和P5P6。分别加入上游正义引物PCS2(10pM)、S3(10pM)和P5(10pM)，分别加入下游反义引物PCA2(10pM)、A3(10pM)和P6(10pM)各1μl，dNTP(各10mM)各1μl，10×Ex taq buffer各5μl，灭菌蒸馏水各39.75μl，Ex taq各0.25μl。将50μl反应体系在PCR扩增仪内进行第二扩增。其程序如下：94℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环后72℃延伸5min。最后取巢式PCR(第二PCR)产物5μl，于2％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
6 PCR产物序列测定
第二PCR产物经Agarose Gel DNA回收试剂盒(QIAGEN)回收后，取10μl送上海生物技术服务有限公司测序，测序引物分别为PCS2、S3和P5。
7 序列同源性分析
使用DNAstar软件进行。
8 结果
8.1RT-PCR结果
以合成的PCV-I片段(序列如SEQ NO:12所示)阳性重组质粒为模板，两型通用巢式引物经2次PCR扩增后均能分别扩增出537bp和260bp的预期目标片段。结果如图1所示。其中，条带1-1是PCV-I重组质粒第一次扩增后的产物条带，条带1-2是PCV-I重组质粒第二次扩增后的产物条带，条带1-3是100bp ladder。
以合成的PCV-I片段(序列如SEQ NO:12所示)阳性重组质粒为模板，I型特异性巢式引物经2次PCR分别扩增出647bp和434bp的DNA目标片段；结果如图2所示。其中，条带2-1是100bp ladder，条带2-2是PCV-I重组质粒第一次扩增后的产物条带，条带2-3是PCV-I重组质粒第二次扩增后的产物条带。
以PCV-Ⅱ型猪肾细胞培养物的DNA为模板，经巢式PCR扩增后，用两型通用引物和Ⅱ型特异性引物分别扩增出了一条260bp和500bp的特异性条带，与预期目的片段大小相符合。图3所示为以PCV-Ⅱ细胞培养物为模板，PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ通用引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片，其中条带3-1是PCV-Ⅱ细胞培养物第二次扩增条带，条带3-2是100bpladder。图4所示为以PCV-Ⅱ细胞培养物为模板，PCV-Ⅱ特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片，其中条带4-1和4-2是PCV-Ⅱ细胞培养物第二次扩增条带，条带4-3是100bpladder。
在阳性对照成立的条件下，所检测的轮状病毒疫苗及相关成分中均没有扩增出特异性预期条带。结果如图5-7所示。
具体来说，图5是以各种轮状病毒疫苗及相关成分为模板，PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ通用引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片。
其中，条带5-1是阳性对照(PCV-Ⅱ细胞培养物)两次扩增产物条带；条带5-2是小牛血清两次扩增产物条带；条带5-3是MEM培养基两次扩增产物条带；条带5-4是消化细胞用胰蛋白酶两次扩增产物条带；条带5-5是消化病毒用胰蛋白酶两次扩增产物条带；条带5-6是Vero细胞两次扩增产物条带；条带5-7是口服轮状病毒活疫苗两次扩增产物条带；条带5-8是3价轮状病毒基因重配苗两次扩增产物条带；条带5-9是100bp Ladder；条带5-10是轮状病毒LD株两次扩增产物条带；条带5-11是轮状病毒LS株两次扩增产物条带；条带5-12是轮状病毒LH株两次扩增产物条带。
具体来说，图6是以各种轮状病毒疫苗及相关成分为模板，PCV-Ⅰ特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片。
其中，条带6-1是阳性对照(PCV-Ⅰ重组质粒)一次扩增产物条带；条带6-2是阳性对照(PCV-Ⅰ重组质粒)二次扩增产物条带，条带6-3是小牛血清两次扩增产物条带；条带6-4是MEM培养基两次扩增产物条带；条带6-5是消化细胞用胰蛋白酶两次扩增产物条带；条带6-6是消化病毒用胰蛋白酶两次扩增产物条带；条带6-7是Vero细胞两次扩增产物条带；条带6-8是100bp Ladder；条带6-9是口服轮状病毒活疫苗两次扩增产物条带；条带6-10是轮状病毒LD株两次扩增产物条带；条带6-11是轮状病毒LS株两次扩增产物条带；条带6-12是轮状病毒LH株两次扩增产物条带；条带6-13是3价轮状病毒基因重配苗两次扩增产物条带。
具体来说，图7是以各种轮状病毒疫苗及相关成分为模板，PCV-II型特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析照片。
其中，条带7-1是阳性对照(PCV-II细胞培养物)二次扩增产物条带；条带7-2是小牛血清两次扩增产物条带；条带7-3是MEM培养基两次扩增产物条带；条带7-4是消化细胞用胰蛋白酶两次扩增产物条带；条带7-5是消化病毒用胰蛋白酶两次扩增产物条带；条带7-6是Vero细胞两次扩增产物条带；条带7-7是100bp Ladder；条带7-8是口服轮状病毒活疫苗两次扩增产物条带；条带7-9是轮状病毒LD株两次扩增产物条带；条带7-10是轮状病毒LS株两次扩增产物条带；条带7-11是轮状病毒LH株两次扩增产物条带；条带7-12是3价轮状病毒基因重配苗两次扩增产物条带。
从上述电泳结果可知，所检测的轮状病毒疫苗及相关成分中均没有扩增出特异性预期条带。
8.2测序结果与比较
分别将两型通用引物和各型特异性引物2次PCR扩增获得的DNA片段送至上海生工进行了进行序列测定，其中以PCV-2细胞培养物为模板，通用引物和2型特异性引物第2次PCR产物都直接分别用各自的正义引物进行测序；以PCV-1阳性重组质粒为模板，通用引物和1型特异性引物第2次PCR产物构建到T载体后测序。
其中，两型通用引物2次PCR扩增获得的DNA片段序列测序结果如SEQ NO:13(对应PCV-I,260bp)所示，以及如SEQ NO:14(对应PCV-2，240bp)所示，PCV-I型特异性引物2次PCR扩增获得的DNA片段序列测序结果如SEQ NO:15所示(434bp)；PCV-II型特异性引物2次PCR扩增获得的DNA片段序列测序结果如SEQ NO:16所示(479bp)。
将前述所测得的核苷酸序列在NCBI BLAST中进行比对后，结果为：260bp片段(2型通用引物扩增PCV-2型猪肾细胞培养物的产物)的核苷酸序列与PCV-II的序列同源性均为97％，260bp片段(2型通用引物扩增PCV-1型重组质粒)的核苷酸序列与合成的PCV1片段的同源性为100％，与其他PCV1的核苷酸同源性高达96％以上；434bp片段(PCV-I型特异性引物扩增产物)的核苷酸与合成的PCV1片段的同源性为100％，与其他PCV1的核苷酸同源性也高达99％以上；500bp片段(PCV-II型特异性引物扩增产物)的核苷酸序列与PCV2的片段的同源性在98％以上，见下表2-5。
表2是通用引物扩增PCV2细胞培养物得到片段的核苷酸序列比较结果
| 编号 | 说明书 | 同源性 |
| JQ002672.1 | Porcine circovirus 2 strain Bj2010PG,complete genome | 97％ |
| JN388690.1 | Porcine circovirus 2 isolate PCV2-LJR,complete genome | 97％ |
| JF317579.1 | Porcine circovirus 2 isolate A4275,complete genome | 97％ |
| FJ804417.1 | Porcine circovirus 2 isolate PCV2-Ha08,complete genome | 97％ |
| GU325754.1 | Porcine circovirus 2 isolate SY4,complete genome | 97％ |
| GQ227412.1 | Porcine circovirus 2 isolate JSDT0706,complete genome | 97％ |
| FJ905468.1 | Porcine circovirus 2 isolate P710-1,complete genome | 97％ |
| EU257513.1 | Porcine circovirus 2 strain ZJU0601,complete genome | 97％ |
| EF493852.1 | Porcine circovirus 2 strain ZZ rep gene,complete cds | 97％ |
表3是通用引物扩增PCV1重组质粒得到片段的核苷酸序列比较结果
| 编号 | 说明书 | 同源性 |
| GU799575.1 | Porcine circovirus 1 strain NMB,complete genome | 100％ |
| GQ449671.1 | Porcine circovirus 1 strain HRB-09,complete genome | 100％ |
| DQ358813.1 | Porcine circovirus 1 strain SC-1,complete genome | 100％ |
| AY099501.1 | Porcine circovirus 1 isolate CT-PCV-P7,complete genome | 100％ |
| Y09921.1 | Porcine circovirus 1,complete genome | 100％ |
| GU371908.1 | Porcine circovirus 1 isolate Tian Jin,complete genome | 99％ |
| EF533941.1 | Porcine circovirus 1 strain HZ2006,complete genome | 99％ |
| AF071879.1 | Porcine circovirus 1,complete genome | 99％ |
| DQ472013.1 | Porcine circovirus 1 strain sc-3,complete genome | 99％ |
| GQ404925.1 | Porcine circovirus 1 isolate Pork991 | 98％ |
| KC894933.1 | Porcine circovirus 1 strain GY,complete genome | 96％ |
表4是I型特异性引物扩增片段的核苷酸序列比较结果
| 编号 | 说明书 | 同源性 |
| KJ408799.1 | Porcine circovirus 1 isolate PCV1-Hun,complete genome | 100％ |
| JX566507.1 | Porcine circovirus 1 strain NJ03,complete genome | 100％ |
| GU799575.1 | Porcine circovirus 1 strain NMB,complete genome | 100％ |
| EF493843.1 | Porcine circovirus 1 strain SC-11,complete genome | 100％ |
| DQ650650.1 | Porcine circovirus 1 strain PK,complete genome | 100％ |
| U49186.1 | Porcine circovirus 1,complete genome | 100％ |
| KC447455.1 | Porcine circovirus 1 isolate PCV1-XFD-Beijing,complete genome | 99％ |
| DQ648032.1 | Porcine circovirus 1 isolate WB-H-8,complete genome | 99％ |
表5是II型特异性引物扩增片段的核苷酸序列比较结果
应当注意的是，本发明的实施例有较佳的实施性，且并非对本发明作任何形式的限制，任何熟悉该领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容变更或修饰为等同的有效实施例，但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改或等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种非疾病诊断和治疗目的的猪圆环病毒的检测方法，其中所述猪圆环病毒包括I型及II型病毒，所述检测方法包括：
对样品提取DNA,并进行第一PCR；以及
就所述第一PCR所获得的扩增产物进行第二PCR，其特征在于，
所述第一PCR所使用的引物包括第一引物组，第二引物组及第三引物组，
所述第二PCR所使用的引物包括第四引物组，第五引物组及第六引物组，
其中，
所述第一引物组包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下游引物，
所述第二引物组包括如SEQ NO:3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下游引物，
所述第三引物组包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下游引物，
所述第四引物组包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下游引物，
所述第五引物组包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下游引物，
所述第六引物组包括如SEQ NO:10所示序列的上游引物，及如SEQ NO:11所示序列的下游引物。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述样品为轮状病毒口服活疫苗、3价轮状病毒重配疫苗、小牛血清、培养基、细胞消化用胰酶、病毒消化用胰酶、轮状病毒LD株、轮状病毒LS株、轮状病毒LH株和/或Vero细胞。
3.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述方法还包括对所述第二PCR扩增之后的产物进行定性分析。
4.如权利要求3所述的检测方法，其中，所述定性分析包括用凝胶电泳显示所述第二PCR扩增之后的产物或对所述第二PCR扩增之后的产物进行测序。
5.一种用于猪圆环病毒检测的引物组，其中所述猪圆环病毒包括I型和/或II型病毒，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下游引物。
6.一种用于猪圆环病毒检测的引物组，其中所述猪圆环病毒包括I型和/或II型病毒，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下游引物。
7.一种用于猪圆环病毒检测的引物组，其中所述猪圆环病毒包括I型病毒，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下游引物。
8.一种用于猪圆环病毒检测的引物组，其中所述猪圆环病毒包括I型病毒，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:10所示序列的上游引物，及如SEQ NO:11所示序列的下游引物。
9.一种用于猪圆环病毒检测的引物组，其中所述猪圆环病毒包括II型病毒，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下游引物。
10.一种用于猪圆环病毒检测的引物组，其中所述猪圆环病毒包括II型病毒，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下游引物。
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