CN104592346A - 一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学领域，具体涉及木本植物银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法。该方法是采用银杏叶片，先制得叶绿体粗颗粒，再通过Percoll细胞分离液进行梯度离心，用特定的离心力，获得完整叶绿体。然后采用蛋白质提取缓冲液溶解蛋白质，再加入等体积的Tris-平衡酚抽提后乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质。本发明可以有效的增加叶绿体蛋白质提取的效率和纯度。采用本方法获得的银杏叶绿体蛋白质可用于银杏叶片及其他富含干扰物质的木本植物材料的蛋白质组学分析时使用，提高了蛋白质的溶解性及纯度，2-DE图谱背景清晰，可分辨的蛋白质点数多。

Description

一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及木本植物银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科银杏属落叶乔木，素有植物界的“活化石”之称，是现有种子植物中最古老的裸子植物。中国是银杏的故乡，现有的银杏资源约占世界银杏资源的70％以上。银杏是一种集食用、药用、保健、化妆、用材于一体的优良经济树种^[1]，近年来，银杏作为全国各地的重要绿化树种也得到了广泛的运用。由于银杏是珍贵孑遗植物，因此具有许多原始特性，是科学家们重点研究的植物品种之一，受到不同科研工作者的重视和研究。

在过去几年里，亚细胞蛋白质组学从一定程度上为蛋白质的定位和功能研究提供了新的见解，叶绿体作为绿色植物中重要的细胞器之一具有复杂的结构，是植物通过光合作用还原和同化二氧化碳、形成碳水化合物的场所，同时也是植物次生物质代谢的场所，研究表明树木光合作用的下降与其叶绿体蛋白结构组分的变化有关^[2]，因此叶绿体蛋白质组的研究受到越来越多人的关注。

双向电泳(tow-dimensional electrophoresis,2-DE)技术是将蛋白质等电点和分子质量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术,具有较高的分辨率和灵敏度。2-DE技术是研究蛋白质组的核心方法之一,已经成为复杂体系中检测和分析蛋白质的一种强有力的生化手段。近年来,2-DE技术在植物研究中的应用越来越多,而样品制备是进行2-DE的先决条件。在样品制备中,增加处理步骤能改善电泳分析结果,但同时也能导致一些蛋白质的丢失。目前，针对植物组织蛋白质的提取方法较多，但由于不同植物组织和器官所含有的组成成分不同，从而导致提取方法有所不同，而且由于实验目的的不同，提取方法也会有所不同。因此,针对不同样品不同组织或器官建立一套可靠而有效的蛋白质提取方法是2-DE分析成功的关键。

由于银杏叶片中蛋白质的含量较低,且富含多酚、色素、多糖及碳水化合物等干扰物质会影响蛋白质的提取的质量^[3]。多酚类化合物通过氢键可与蛋白质结合,导致电荷的异质性和蛋白质点的拖尾；色素也能造成蛋白质点拖尾和电荷的异质性；碳水化合物则阻塞凝胶孔使部分蛋白质沉淀,不仅延长等电聚焦时间,而且使可溶性蛋白质的数量减少,凝胶图谱上出现横纵条纹^[4]。由此可见,银杏叶片叶绿体蛋白质样品的制备更加困难。TCA-丙酮沉淀法作为目前蛋白质提取最通用的方法,虽然操作步骤较为简单,蛋白粗提物的产量较高^[5],但是在银杏叶绿体蛋白质提取时采用此法所得蛋白粉末的再溶解性较差，样品中杂质残留较多，2-DE图谱背景模糊并会有明显的条纹^[6]。而当前对植物叶绿体蛋白质提取方法的研究主要集中在水稻、拟南芥等草本植物^[7],而银杏作为珍贵孑遗木本植物，其叶绿体蛋白质提取的效率和质量还不足以满足其蛋白质组学的研究需要。

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发明内容

本发明的目的是提供一种银杏叶绿体蛋白质提取方法，该方法是采用银杏叶片，先制得叶绿体粗颗粒，再通过Percoll细胞分离液进行梯度离心，用特定的离心力，获得完整叶绿体。然后采用蛋白质提取缓冲液溶解蛋白质，再加入等体积的Tris-平衡酚抽提后乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质。本发明可以有效的增加叶绿体蛋白质提取的效率和纯度。采用本方法获得的银杏叶绿体蛋白质可用于银杏叶片及其他富含干扰物质的木本植物材料的蛋白质组学分析时使用，提高了蛋白质的溶解性及纯度，2-DE图谱背景清晰，可分辨的蛋白质点数多。

与已公开发表的银杏叶绿体提取方法相比，本方法所需的实验条件更易满足，不需要使用超高速冷冻离心机提前混合Percoll且只需两个Percoll梯度即能完成完整叶绿体的提取。与传统TCA-丙酮沉淀法提取叶绿体蛋白质相比，本方法通过对离心时间、离心速度、沉淀时间等操作步骤改进和蛋白提取缓冲液中增加适量去污剂TritonX-100等的方式使提取的叶绿体蛋白质所含干扰物质明显减少，纯度更高，双向电泳效果更好，2-DE图谱背景清晰,条纹影响较小,得到了更多数量的蛋白质点，且蛋白点外观圆滑清晰,聚焦情况良好。

本发明所述银杏叶片叶绿体蛋白质提取方法，包括以下主要步骤：

(1)采用经24小时以上暗处理后耗尽淀粉粒的银杏叶片10g；

(2)将叶片冰浴下用研钵碾碎，加入一定量的提取缓冲液研磨成浆后4层纱布过滤，取滤液，所述提取缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl₂，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA，0.04％巯基乙醇，0.1％PVP；

(3)滤液于4℃，1500g离心10min进行沉积得叶绿体沉淀颗粒，并用用6ml分离缓冲液悬浮，所述分离缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl₂，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA；

(4)Percoll密度梯度液制备：用分离缓冲液分别配制40％和80％Percoll，由上至下分别加入5ml的40％Percol和2.5ml的80％Percoll，形成Percoll密度梯度液；

(5)将悬浮的叶绿体颗粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的顶端，经4℃，6000g离心30min后。在80％和40％Percoll细胞分离液之间的分界面上收集完整叶绿体，并用分离缓冲液清洗两次，分离得到完整的叶绿体颗粒；

(6)将1.5ml蛋白质提取缓冲液加入到由10g银杏叶片所提取的叶绿体颗粒中,室温下漩涡混匀5min，加入等体积的Tris-平衡酚(pH 8.0)，超声波混匀10min。所述蛋白质提取缓冲液成分为：100mM Tris,100mM EDTA,50mM硼砂,50mM维生素C，1％Triton X-100,2％巯基乙醇，30％蔗糖；

(7)混合液经4℃，15000g离心15min后，将上层的酚相转移到新离心管中；

(8)酚相中加入5倍体积的0.1M醋酸銨(用80％甲醇配)溶液，放入-20℃条件下6小时以上以沉淀蛋白，后经4℃，15000g离心15min得蛋白质颗粒；

(9)蛋白质颗粒重新悬浮，用冰冻的甲醇和丙酮各清洗两次，每次清洗均经4℃，15000g离心5min，仔细倒出上清液留沉淀即为高纯度的叶绿体蛋白质。清洗好的蛋白质颗粒空气中干燥待用。

以上步骤(1)-(5)的所有操作需在0-4℃下进行。

本研究以富含次生代谢物的药用木本植物银杏叶片为材料，首先采用Percoll梯度离心的方式使银杏叶片细胞中大量的次生代谢物与叶绿体分离开来以获得完整叶绿体。在提取过程中通过改变提取液成分和离心条件，从而大大提高了其分离纯度和完整度。然后采用蛋白质提取缓冲液溶解叶绿体蛋白质，再加入等体积的Tris-平衡酚抽提后乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质，使提取的蛋白质效率更高，纯度更好。通过SDS-PAGE及2-DE电泳分离，考马斯亮蓝R-250染色，凝胶图像分析后显示，我们的银杏叶绿体蛋白质整个提取过程最大限度地避免了各类干扰物质的影响，更适合木本植物银杏叶绿体蛋白质的提取。

附图说明

图1透射电镜下所提取的银杏叶绿体形态；A纯度和完整度较好的叶绿体，B完整的叶绿体，C破裂的叶绿体。

图2两种方法提取银杏叶绿体蛋白质的单向凝胶图谱。

图3Tris-平衡酚抽提法提取的蛋白质双向电泳图。

图4TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白质双向电泳图。

具体实施方式

1.材料与方法

1.1材料

银杏叶片，采自江苏省南京市南京林业大学校园内

1.2提取溶液和介质

(1)叶绿体提取缓冲液：0.3M山梨醇，1mM MgCl2，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA，0.04％巯基乙醇，0.1％PVP。

(2)叶绿体分离缓冲液：0.3M山梨醇，1mM MgCl2，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA。

(3)Percoll密度梯度液：用叶绿体分离缓冲液分别配制80％和40％的Percoll，在15ml的离心内从上到下依次加入2.5ml80％和5ml40％的Percoll,形成二级密度梯度分离液。

(4)蛋白质提取缓冲液：100mM Tris,100mM EDTA,50mM硼砂,50mM维生素C，1％TritonX-100,2％巯基乙醇，30％蔗糖。

(5)样品处理液Ⅰ(10ml):2g TCA(三氯乙酸)，0.02g DTT，用acetone(丙酮)溶解并定容至10ml。

(6)样品处理液Ⅱ(10ml)：0.02g DTT，用acetone(丙酮)溶解并定容至10ml。

1.3提取方法

1.3.1银杏叶片完整叶绿体的提取

(1)称取12份10g组织叶片，分别加入一定量的提取缓冲液，冰浴下用研钵研磨均匀成浆，匀浆用4层纱布过滤，过滤两次，取滤液，滤液定容至50ml；

(2)含有叶绿体的滤液于4℃，1500g离心10min进行沉积，沉积后的叶绿体沉淀颗粒(粗提取物)用6ml分离缓冲液重新悬浮；

(3)将重新悬浮的叶绿体颗粒每1ml加入到预先制好的两级Percoll密度梯度的顶端，4℃，6000g离心20min。在80％和40％Percoll之间的分界面上收集完整叶绿体，用分离缓冲液清洗两次，然后提取的12份银杏叶绿体颗粒可以直接用于蛋白提取或是保存在-80℃下；

1.3.2银杏叶绿体蛋白质的提取

1.3.3.1 Tris-平衡酚抽提法

(1)取其中的6份叶绿体蛋白质颗粒，将1.5ml蛋白质提取缓冲液直接加入到由10g银杏叶片所提取的叶绿体颗粒中,室温下漩涡混匀5min，加入等体积的Tris-平衡酚(pH 8.0)，进一步漩涡混匀10min；

(2)混合液经4℃，15000g离心15min后，将上层的酚相转移到新离心管中；

(3)酚相中加入5倍体积的0.1M醋酸銨(用80％甲醇配)，放入-20℃条件下沉淀蛋白，至少6h后经4℃，15000g离心15min。蛋白质颗粒重新悬浮，冰冻的甲醇清洗一次，冰冻的丙酮清洗三次。每次清洗后，蛋白质颗粒重新经4℃，15000g离心5min，仔细倒出上清液留沉淀即为高纯度的叶绿体蛋白质。清洗好的6份蛋白质颗粒空气中干燥待用，标记为Tris-平衡酚1、Tris-平衡酚2、Tris-平衡酚3、Tris-平衡酚4、Tris-平衡酚5、Tris-平衡酚6。

1.3.3.2 TCA-丙酮沉降法

取另外6份由10g银杏叶片提取的叶绿体颗粒，加入3ml冷冻的样品处理液Ⅰ，于-20℃下沉降12h。沉降过后，4℃下16000g离心30min，弃上清，加入3ml冷冻的样品处理液Ⅱ，漩涡混匀后放入-20℃下沉降2h。沉降后，4℃下16000g离心10min，取沉淀，再次加入3ml冷冻的样品处理液Ⅱ，再次于4℃下16000g离心10min，沉淀经冰冻的甲醇清洗一次，冰冻的丙酮清洗三次后，在室温空气中晾干得6份蛋白颗粒待用，标记为TCA-丙酮1、TCA-丙酮2、TCA-丙酮3、TCA-丙酮4、TCA-丙酮5、TCA-丙酮6。

2透射电镜检测银杏叶绿体完整率

将提取的叶绿体颗粒用4％戊二醛溶液4℃下固定2h以上后用磷酸缓冲液清洗3次，每次20min。然后用1％溶化的琼脂预包埋材料后脱水、包埋、聚合、切片、染色后进行透射电镜观察。透射电镜下提取的银杏叶绿体形态如图1所示。

在透射电镜观察过程中随机选取5个视野，并统计视野中完整和破损的叶绿体数量，并计算叶绿体完整率的平均值，结果如表1所示。

表1透射电镜下叶绿体的完整率

3 SDS-PAGE法检测银杏叶绿体蛋白质提取质量

3.1溶液的配制

(3)Acr(acrylamide)/Bis(N'N'-bis-methylene-acrylamide)储备液：29.2g acrylamide,0.8g N'N'-bis-methylene-acrylamide,加蒸馏水至100ml后过滤，4℃下暗存。

(4)10％(w/v)SDS：0.1g SDS，加蒸馏水至1ml,4℃下保存。

(5)分离胶缓冲液：18.15g Tris base，蒸馏水溶解后，用HCl调pH 8.8，定容至100ml，4℃下保存。

(4)浓缩胶缓冲液：6g Tris base，用蒸馏水溶解，用HCl调pH 6.8，定容至100ml，4℃下保存。

(6)10％APS(现配现用)：0.1g过硫酸铵，用蒸馏水定容至1ml。

(6)1x电极缓冲液，pH 8.3(500ml):1.515g Tris base，7.2g甘氨酸，0.5g SDS，用蒸馏水溶解并定容至500ml，现配现用。

(7)样品缓冲液：25ml甘油，2g SDS，0.01g溴酚兰，用配好的Tris-HCl(pH 6.8)溶解，并定容至100ml，室温下可保存一年。在样品处理前，取950μl样品缓冲液加入50μlβ-巯基乙醇，混匀得样品处理的上样缓冲液。

(8)凝胶染色液(500ml)：200ml甲醇，50ml乙酸，0.5g考马斯亮蓝R-250，充分溶解后蒸馏水定容至500ml。

(9)脱色液(500ml)：200ml甲醇，50ml乙酸，用蒸馏水定容至500ml。

3.2凝胶的配制

根据以下表2、表3格，依次加入各种溶液，混匀后用枪加入到制胶架中，先制备分离胶，待分离胶凝固后再灌制浓缩胶，并在灌入浓缩胶后插入样品梳。

表2分离胶的制备(10ml，12％)

表3浓缩胶的制备(5ml，5％)

3.3样品的处理与蛋白的定量

在Tris-平衡酚1、Tris-平衡酚2、Tris-平衡酚3和TCA-丙酮1、TCA-丙酮2、TCA-丙酮3中加入等体积的上样缓冲液，混匀，置于沸水浴中加热5min，冷却后经10000rpm离心15min，取上清。所得上清液按照Bradford(1976)的方法测定蛋白质含量进行定量，保证6个样品以等蛋白上样。

3.4电泳

SDS-PAGE在Mini-PROTEAN 3Cell(Bio-Rad)上进行，每个样品取10ul上样，蛋白浓度为1.5ug/ul,电泳仪采用POWERPAC 300(Bio-Rad)，浓缩胶恒压75V，分离胶恒压120V，电泳时间约90min。

3.5染色和脱色

将电泳结束后的胶剥离至培养皿中，用蒸馏水反复冲洗3遍后，倒入配制好的染色液过夜。染色结束后，用蒸馏水冲洗掉多余的染色液后倒入脱色液，并置于摇床上脱色，需换脱色液2-3次直至背景色脱掉。3.6图像扫描和分析：图像通过ImageScanner Ⅲ(GE Healthcare)对凝胶扫描获得，扫描结果如图2所示。

从图2方框内所标区域可以看出，两种方法提取的叶绿体蛋白质样品在低分子量蛋白区域内有明显的区别，Tris-平衡酚抽提法提取的蛋白质样品跑出的条带更多更清晰，这表明了TCA-丙酮沉淀法在提取木本植物银杏叶绿体低分子量蛋白质上的不足。虽然仅通过一向电泳不足以证明两种方法的优劣，还需进一步进行双向电泳的验证，但是也能在一定程度上反映我们的方法提取蛋白质的有效性。

4 2-DE法检测银杏叶绿体蛋白质提取质量

4.1溶液的配制

(1)水化上样缓冲液(10ml)：4.2g尿素，1.52g硫脲,0.4gCHAPS，0.077gDTT，100ul0.2％Carrier Ampholytes，20ul 1％溴酚蓝，加蒸馏水至10ml

(2)胶条平衡缓冲液母液(100ml)：36g尿素,25ml Tris-Hcl pH8.8,20ml 20％甘油，2g SDS,加蒸馏水100ml

胶条平衡缓冲液Ⅰ:0.2gDTT加胶条平衡缓冲液母液至10ml。

胶条平衡缓冲液Ⅱ:0.25g碘乙酰胺加胶条平衡缓冲液母液至10ml。

(3)10x电极缓冲液:60.57g Tris base，288.27g甘氨酸，20g SDS，用蒸馏水溶解并定容至2L，临用时用9倍体积的蒸馏水稀释为1x电极缓冲液。

(4)5％低熔点琼脂糖封顶液(100ml)：0.5g低熔点琼脂糖(FW 228.20)，100ml 1x电极缓冲液,60ul 1％溴酚蓝，加蒸馏水定容至100ml。

(5)Acr/Bis储备液、10％SDS、分离胶缓冲液、10％APS、凝胶染色液、脱色液的配制同SDS-PAGE。

4.2第一向等电聚焦(IEF)

(1)样品处理：Tris-平衡酚4、Tris-平衡酚5、Tris-平衡酚6和TCA-丙酮4、TCA-丙酮5、TCA-丙酮6中分别加入适当体积的水化上样液，充分振荡后，放置于30℃水浴中1h，经15000g离心15分钟后取上清即为双向电泳上样液。

(2)蛋白定量：采用Bradford(1976)的方法测定蛋白质含量进行定量，保证450ul样品水化上样液内均含1mg蛋白。

(3)胶条槽水化上样：将6块24cm ReadyStrip IPG Strip(Bio-Rad)胶条提前30min从冰箱取出备用。将6份蛋白定量后的450ul样品水化上样液用枪沿着聚焦盘中槽至左而右线性加入样品。用镊子去除胶条上的保护层后，胶面朝下置于样品水化液上，胶条的正极对应聚焦盘的正极并与电极紧密接触，并避免产生气泡。在每根胶条上覆盖3ml的矿物油以防止样品水化液蒸发，盖上胶条槽盖子。水化时间为12-16小时。

(4)聚焦：将盛有水化好胶条的聚焦盘水平放入IPGphor 3等电聚焦电泳仪，设置等电聚焦程序如下：

选择所放置的胶条数(6条)。

设置每根胶条的极限电流。(50μA/根)

设置等电聚焦时的温度。(20℃)

4.3胶条平衡

(1)将聚焦后的胶条从IPGphor 3中取出，在滤纸上滴尽矿物油后放入含8ml平衡缓冲液Ⅰ的平衡管后置于水平摇床上平衡15min。

(2)取出胶条，在滤纸上滴干平衡缓冲液Ⅰ后放入含8ml平衡缓冲液Ⅱ的平衡管，置于水平摇床上平衡15min后待用。

4.4第二向SDS-PAGE电泳

(1)凝胶的配制：按照表4的配方依次加入各种溶液，充分摇匀后灌至胶架中，并用正丁醇封顶，灌至好的6块胶条在室温下需放置5h以上用于电泳。

表4第二向SDS-PAGE凝胶的制备

(2)胶条的转移和电泳

安装好电泳设备后，用滤纸吸去凝胶上方的正丁醇并用凝胶储备液冲洗干净，将平衡好的胶条转移到胶架上，用镊子轻轻将胶条向下推动至与胶面完全接触，避免气泡，然后在胶条上注入加热后的低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移到DALT SIX电泳槽上电泳，电泳条件为：恒压600v，400mA,功率2w,时间40min；然后恒压600v，400mA,功率26w,时间7h。

(3)染色和脱色

电泳完成后，用蒸馏水反复清洗胶条后放入染色液中过夜。染色结束后，将胶用蒸馏水冲洗2遍置于脱色液中脱色，中间需换脱色液3-4遍直至背景色完全脱掉。

4.5凝胶扫描与分析

将脱色后的凝胶通过ImageScanner Ⅲ进行扫描获得Tris-平衡酚抽提法提取的蛋白质双向电泳图如图3所示和TCA-丙酮沉淀法获得的蛋白质双向电泳图如图4所示，从图中可以看出，两种提取方法以等量蛋白上样进行的双向电泳，虽然两种银杏叶绿体蛋白质提取方法得到的2-DE图谱背景均比较清晰，且没有明显的条纹影响，但Tris-平衡酚抽提法得到的2-DE图谱蛋白质点数明显多于TCA-丙酮沉淀法，蛋白点质量也更好。

采用ImageMaster 7.0分析软件自动统计两种叶绿体蛋白质提取方法所得2-DE图谱上的蛋白质斑点数量。蛋白质斑点选定标准是:斑点个体独立,形态明显,3个样品重复出现。结果显示:Tris-平衡酚抽提法提取的蛋白质双向电泳图上蛋白点平均有967±11个,TCA-丙酮沉淀法获得的蛋白质双向电泳图上蛋白点平均为853±13个。另外通过Bradford(1976)的方法测定了两种提取方法的平均蛋白质含量(表5)。以上结果说明Tris-平衡酚抽提法提取的蛋白质不仅数量更多，而且质量更好。

表5两种方法叶绿体蛋白质产量和双向电泳蛋白质点数量

5结论

蛋白质组学的关键之一是蛋白质样品的制备，样品制备的质量直接影响双向电泳的效果，采用本方法所用的percoll密度梯度液提取银杏叶绿体，实验条件更容易满足，且通过透射电镜观察，提取的叶绿体平均完整率在85％左右，高质量叶绿体的分离和纯化，降低了样品的复杂性，提高了蛋白质的富集，然后采用本方法所示Tris-平衡酚抽提法与传统的TCA-丙酮沉淀法提取银杏叶绿体蛋白质相比，提高了提取效率，蛋白质质量更好，用于双向电泳实验所得到的图谱清晰，所分离的蛋白点更多,形态更好,条纹影响相对较小,图谱分辨率更高，而且提取过程比普通酚抽法更为简单、方便,有利于减少蛋白降解，从而为银杏叶绿体蛋白质组学研究奠定基础，同时其它富含杂质的木本植物叶片的叶绿体蛋白质组学研究也可借鉴。

Claims (2)

1.一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)银杏叶片经24小时以上暗处理，耗尽淀粉粒；

(2)将叶片冰浴下用研钵碾碎，加入提取缓冲液研磨成浆后4层纱布过滤，取滤液，所述提取缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl₂，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA，0.04％巯基乙醇，0.1％PVP；

(3)滤液于4℃，1500g离心10min进行沉积得叶绿体沉淀颗粒，并用分离缓冲液悬浮，所述分离缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl₂，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA；

(4)Percoll密度梯度液制备：用分离缓冲液分别配制40％和80％Percoll，由上至下分别加入5ml的40％Percol和2.5ml的80％Percoll，形成Percoll密度梯度液；

(5)将悬浮的叶绿体颗粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的顶端，经4℃，6000g离心30min后，在80％和40％Percoll细胞分离液之间的分界面上收集完整叶绿体，并用分离缓冲液清洗两次，分离得到完整的叶绿体颗粒；

(6)将蛋白质提取缓冲液加入到所提取的叶绿体颗粒中,室温下漩涡混匀5min，加入等体积的Tris-平衡酚(pH 8.0)，超声波混匀10min；所述蛋白质提取缓冲液成分为：100mMTris,100mM EDTA,50mM硼砂,50mM维生素C，1％Triton X-100,2％巯基乙醇，30％蔗糖；

(7)混合液经4℃，15000g离心15min后，将上层的酚相转移到新离心管中；

(8)酚相中加入5倍体积的0.1M醋酸銨溶液，放入-20℃条件下6小时以上以沉淀蛋白，后经4℃，15000g离心15min得蛋白质颗粒；

(9)蛋白质颗粒重新悬浮，用冰冻的甲醇和丙酮各清洗两次，每次清洗均经4℃，15000g离心5min，仔细倒出上清液留沉淀即为高纯度的叶绿体蛋白质；清洗好的蛋白质颗粒空气中干燥待用。

2.根据权利要求1所述的银杏叶片叶绿体蛋白质提取方法，其特征在于步骤(1)-(5)的所有操作需在0-4℃下进行。