CN104560876B

CN104560876B - 一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基

Info

Publication number: CN104560876B
Application number: CN201410857259.8A
Authority: CN
Inventors: 钟慧霖; 赖良学; 邹清雁; 陈文明; 唐时幸
Original assignee: Guangzhou Jidi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Jidi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2018-03-16
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104560876A

Abstract

本发明公开了一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基。本发明所述的培养基包括基础培养基、基础营养添加剂、植物源人血清白蛋白、糖类、脂类、激素、抗氧化剂、促代谢相关物质；基础培养基是由商品化的DMEM/F12与商品化的neurobasal培养基按1:1的比例配制而成；基础营养添加剂包括：胰岛素、含铁转铁蛋白、脱铁转铁蛋白、腐胺、孕酮、亚硒酸钠；激素包括：生物素、皮质酮、硫辛酸、Ve及Ve醋酸酯；抗氧化剂包括：人源过氧化氢酶、人源超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、Vc；促代谢相关物质包括：肉碱、T3、乙醇胺。该培养基能够让细胞扩增速度提高2－3倍、较好维持神经干细胞干性并保持其细胞分化潜能，排除潜在的动物源性内毒素和病毒污染。

Description

一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，涉及一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基以及相应的培养神经干细胞的方法。

背景技术

神经干细胞(NSC)是一类能够自我复制的多潜能干细胞，在一定条件下能够分化成神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。因其具有治疗多种神经系统疾病的潜能，目前在国际临床试验注册网站上注册的神经干细胞治疗项目已达近900项，主要用于脑瘫，脑中风(脑梗死、脑出血)后遗症、脊髓损伤、运动神经元病、小脑萎缩、共济推敲、帕金森病、视神经萎缩、老年痴呆等多种疾病的治疗。伴随着神经干细胞治疗技术的高速发展，开发一种符合临床使用要求且有快速大量扩增神经干细胞的培养基至关重要。

目前市场上人神经干细胞无血清培养基有较多缺陷，较难用于人神经干细胞规模化生产及临床应用。1、商业化培养基仍含有少量动物源性成份，其具有潜在的病毒感染风险；2、商业化培养基批间差异较大，在前期试验中，我们使用不同批次的目前最好的商业化培养基StemPro NSC SFM贴壁培养胎儿源性的神经干细胞，所培养细胞增殖效率及其鉴定结果表达SOX2等神经干细胞表面标志物差异较大，难于保证所培养干细胞质量；3、此类培养基不具有符合要求的质量标准及检测报告，达不到临床使用要求；4、所培养神经干细胞增殖较慢，难于将来源限制较大的人神经干细胞扩增至足够临床使用的数量；5、该类培养基多适用于神经干细胞悬浮培养，贴壁将导致细胞分化，然而悬浮培养中细胞增殖较慢且培养过程中神经球内部细胞难于得到均匀的营养供应而易衰老或分化，而最终导致细胞存活率及细胞纯度均较低；6、价格较高，限制了神经干细胞规模化生产及应用。

本发明针对以上目前商业培养基中存在的缺陷，完全去除培养基中动物源成分，以重组植物源蛋白和植物源因子取代动物源或人源，并摸索了其使用浓度。最终研制出一种可贴壁培养人神经干细胞的培养基并制订了相关质量标准(草案)及检测方法，用本发明所述培养基贴壁培养人胎儿源神经干细胞，与目前同类商业化培养基相比，能够更快速纯化、扩增人神经干细胞并维持其神经干细胞特性，价格较低，适合干细胞规模化制备及临床应用。

发明内容

本发明目的是解决现有无血清神经干细胞培养基所存在的问题，提供一种可用于贴壁培养人神经干细胞的无血清培养基。

本发明所述的用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基包括：基础培养基、基础营养添加剂、植物源人血清白蛋白、糖类、脂类、激素、抗氧化剂、促代谢相关物质；其中，所述基础培养基是由商品化的DMEM/F12与商品化的neurobasal培养基按1:1的比例配制而成；所述基础营养添加剂包括：胰岛素、含铁转铁蛋白、脱铁转铁蛋白、腐胺、孕酮、亚硒酸钠；所述激素包括：生物素、皮质酮、硫辛酸、Ve及Ve醋酸酯；所述抗氧化剂包括：人源过氧化氢酶、人源超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、Vc；所述促代谢相关物质包括：肉碱、T3、乙醇胺。

根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述培养基的成份及其含量如下：植物源人血清白蛋白：100－3000μg/ml；胰岛素：4－30μg/ml；含铁转铁蛋白：5－100μg/ml；脱铁转铁蛋白：1－5μg/ml；腐胺：10－20μg/ml；孕酮：0.005－0.010μg/ml；亚硒酸钠：0.005－0.010μg/ml；D－半乳糖：1－20μg/ml；脂类：1％；生物素：0.1－0.5μg/ml；皮质酮：0.01－0.08μg/ml；硫辛酸：0.01－0.10μg/ml；VE：1－10μg/ml；VE醋酸酯：1－10μg/ml；人源过氧化氢酶：1－10U/ml；人源超氧化物歧化酶：0.1－1U/ml；谷胱甘肽(抑制)1－10μg/ml；Vc：1－10μg/ml；L－肉碱：1－10μg/ml；乙醇胺：1－10μg/ml；三碘甲状腺原氨酸(T3)：0.001－0.010μg/ml；植物源人bFGF 20－50ng/ml；植物源人EGF 20－50ng/ml；谷氨酰胺：1％。

优选地，所述培养基的成份及其含量如下：植物源人血清白蛋白：250μg/ml；胰岛素：25μg/ml；含铁转铁蛋白：100μg/ml；脱铁转铁蛋白：2.3μg/ml；腐胺：16.1μg/ml；孕酮：0.0063μg/ml；亚硒酸钠：0.0052μg/ml；D－半乳糖：15μg/ml；脂类：1％；生物素：0.1μg/ml；皮质酮：0.02μg/ml；硫辛酸：0.047μg/ml；VE：1μg/ml；VE醋酸酯：1μg/ml；人源过氧化氢酶：5U/ml；人源超氧化物歧化酶：0.4U/ml；谷胱甘肽(抑制)1μg/ml；VC：1μg/ml；L－肉碱：2μg/ml；乙醇胺：1μg/ml；三碘甲状腺原氨酸(T3)：0.002μg/ml；植物源人bFGF 25ng/ml；植物源人EGF 25ng/ml；谷氨酰胺：1％。

根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述植物源人血清白蛋白是来源于转基因植物，其浓度为100－3000μg/ml。

优选地，所述植物源人bFGF和植物源人EGF均来源于转基因植物，其浓度均为20－50ng/ml。

根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述含铁转铁蛋白与脱铁转铁蛋白是共同使用的，含铁转铁蛋白的浓度为5－100μg/ml，脱铁转铁蛋白的浓度为1－5μg/ml。

根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述人源过氧化物酶的浓度为1－10U/ml、人源超氧化物歧化酶的浓度为0.1－1U/ml。

本发明还提供了一种培养神经干细胞的方法。

本发明所述的培养神经干细胞的方法，包括以下步骤：提供如本发明所述的用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基；将神经干细胞在所述培养基中进行贴壁培养、悬浮培养或悬浮－贴壁交替进行培养。

根据本发明所述的培养神经干细胞的方法的进一步特征，当进行贴壁培养时，先用促使干细胞贴壁的材料包被培养皿，依次加入所述无血清培养基及干细胞；所述促使干细胞贴壁的材料是选自：Matrigel、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白中的一种或一种以上的组合。

本发明所述的无血清培养基是通过以下方法得到的：

首先，筛选出各文献报导的血清成份及其它可能对神经干细胞生长有良好作用的30多种细胞因子，以N2为基础添加剂，往其中加入高中低浓度的各细胞因子进行细胞培养，以单独N2为对照。细胞培养后分别检测各因子对细胞增殖速度、形态及传代后增殖能力的影响(即培养基对神经干细胞干性维持情况)。结果筛选出对细胞增殖有促进作用且对神经干细胞诱导分化作用不明显的细胞因子十几种。

其次，对各因子根据文献报导浓度设计高低两个浓度，采用Plackett-Burman实验设计，以细胞密度和表型为评价指标，对各种生长因子进行匹配筛选。以此法筛选出几个初步培养基配方，此配方能够快速促进神经干细胞增殖细胞形态在培养前后变化较少。

再次，按以上初筛培养基配方配制培养基，分别培养人神经干细胞从原代到P3代，从促增殖效果好、增殖稳定、表面标志物阳性的神经干细胞比例综合分析，筛选出最佳神经干细胞培养基配方。

最后，从培养基配方中移除一些价格较高及一些性质较不稳定的成分，观察其对细胞的影响，争取降低成本并使培养基更稳定。

经过大量的筛选及分析优化，最终获得了本发明神经干细胞培养基，该培养基完全不含动物来源成份，成本较低且对细胞的促增殖作用及对神经干细胞干性的维持作用均优于目前商业化神经干细胞培养基。

本发明提供了一种可用于贴壁培养人神经干细胞的无血清培养基，该培养基以购自Gibco公司的DMEM/F12及neurobasal培养基按1：1配比为基础培养基，为神经干细胞生长提供基本营养物质，两者混合使用提供了一个更适合于神经干细胞生长的环境，加入其它物质简介如下。人血清白蛋白及转铁蛋白是结合蛋白，可以携带重要的低分子量物质，在细胞代谢中起重要作用，各添加激素如胰岛素、孕酮、生物素、皮质酮、硫辛酸、Ve、Ve醋酸酯等能够促进细胞新陈代谢，维持细胞呼吸，保护细胞膜并且具有抗毒，抗炎作用。抗氧化剂谷胱甘肽、Vc、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等能够与自由基等整合解毒，还原超氧化物，过氧化氢等，清除自由基，保护DNA免受氧化损伤。另外，腐胺是细胞分裂过程中所必须的一类生长因子，T3、乙醇胺、肉碱能够促进细胞代谢，防止脂肪在细胞内积累。亚硒酸钠在维持细胞膜功能、提高抗氧化剂产量、代谢、吸收、酶合成等方面均具有重要作用。

本发明的人神经干细胞无血清培养基，其联合使用转铁蛋白及脱铁转铁蛋白，含铁转铁蛋白中结合有铁、铜、锌、钴等离子，其携带铁能力下降，因此有文献报导使用脱铁转铁蛋白以加强其能力，然而此也减少了铁等元素的含量，且脱铁转铁蛋白价格昂贵，本发明联合使用含铁转铁蛋白及脱铁转铁蛋白，既利用了转铁蛋白中结合的离子，又提高了其携带能力，在细胞培养中取得了较好效果，与单独使用含铁转铁蛋白相比显著增加了细胞增殖速度。

本发明的人神经干细胞无血清培养基，使用谷胱甘肽和Vc联合作抗氧化剂，谷胱甘肽还原过氧化氢后本身变成氧化型，Vc可以使氧化型谷胱甘肽变回还原型，提高了谷胱甘肽的利用率，使培养基拥有更好的抗氧化效果。同时，Vc本身也可以抗氧化，保护细胞。

本发明的人神经干细胞无血清培养基，使用植物源人血清白蛋白及植物源bFGF和EGF，与人源或动物源细胞因子相比，避免了潜在动物源病毒感染。并且较大地降低了培养基成本，植物源因子使用浓度与传统浓度有偏差，本发明通过实验摸索了最佳浓度。

本发明的人神经干细胞无血清培养基，使用人源过氧化物酶及超氧化物歧化酶取代传统的牛源成份，避免了潜在动物内毒素病毒感染，虽然人源成份价格较高，但动物源成份增加临床使用风险，难于进行临床使用。本发明通过降低此两种成份使用浓度，控制成本，取得了一定的效果。

本发明的人神经干细胞无血清培养基，可通过用贴壁材料包被培养皿对人神经干细胞进行贴壁培养，提高了细胞增殖速度并能很好的保持细胞处于未分化神经干细胞状态，减轻了细胞传代损伤。

本发明的人神经干细胞无血清培养基，完全不含血清及其它动物源性成份，所有成份来自人源和植物源，降低了神经干细胞培养成本，排除了潜在动物源性内毒素和病毒，安全性高，稳定性好，所培养细胞形态较好且稳定；与同类商业化培养基相比对细胞有更好的增殖促进效果；所培养细胞具有良好的神经球能力、流式鉴定及免疫荧光光鉴定结果表明所培养细胞绝大多数为SOX2及巢蛋白(Nestin)双阳性的神经干细胞，其中流式鉴定结果中细胞标志物表达率及稳定性优于同类商业化培养基；所培养神经干细胞具有分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。本发明所述无血清培养基中不含动物源血清及其它添加物质，能够培养出符合临床使用要求的干细胞产品，适用于人神经干细胞规模化制备及临床应用。

附图说明

图1是将第3代悬浮培养和贴壁培养神经干细胞冻存三个月后复苏以相同密度接种至培养皿1天后细胞状态。

图2是用含铁转铁蛋白单独使用培养基和含铁、脱铁转铁蛋白联合使用培养基培养相同原代细胞至第3代收获细胞量的比较。

图3是采用本发明所述培养基贴壁培养人神经干细胞原代到第三代细胞形态。

图4是采用本发明所述培养基(图中S8/13/15/16)、商品化人神经干细胞无血清培养基(图中LCM)及N2培养基(S7/9/10/11/14)贴壁培养人神经干细胞从原代到第三代细胞增殖状况曲线图。

图5是本发明所述培养基(图中S13/15/16)贴壁培养的第1、2代神经干细胞神经球形成能力与商品化神经干细胞培养基(图中LCM)的比较。

图6是本发明所述培养基贴壁培养至第三代的人神经干细胞标志物Nestin/Sox2流式细胞术鉴定结果与商品化培养基(图中LCM)的比较。

图7是本发明所述培养基贴壁培养至第三代的人神经干细胞免疫荧光鉴定结果，检测标志物有SOX2、Nestin，同时对细胞核进行染色(DAPI)便于观察判定。

图8是本发明所述培养基贴壁培养至P3的人神经干细胞自发分化20天后细胞向神经元(NSE阳性)、星形胶质细胞(GFAP阳性)、少突胶质细胞(O4阳性，结果未显示)分化鉴定结果，同时对细胞核进行染色(DAPI)便于观察判定。

图9是本发明所述培养基贴壁培养至P3的人神经干细胞向神经元(MAP2阳性)诱导分化20天鉴定结果，同时对细胞核进行染色(DAPI)便于观察判定。

图10是本发明所述培养基贴壁培养至P3的人神经干细胞向星形胶质细胞(GFAP阳性)诱导分化20天后鉴定结果，同时对细胞核进行染色(DAPI)便于观察判定。

图11是本发明所述培养基贴壁培养至P3的人神经干细胞向少突胶质细胞(O4阳性)诱导分化20天后鉴定结果，同时对细胞核进行染色(DAPI)便于观察判定。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器均可通过商业途径获得。

实施例1：神经干细胞贴壁及悬浮培养向临床转化的比较。

神经干细胞临床应用的关键在于干细胞规模化制备及所使用干细胞符合临床使用要求。从目前文献报导表明，贴壁培养神经干细胞细胞增殖较快且贴壁细胞更易于规模化制备。

将贴壁培养细胞(P3)及悬浮培养细胞(P3)用Accutase酶消化后收集细胞用相同冻存液以相同密度于液氮中冻存三个月，复苏细胞进行活细胞计数并以相同密度接种至包被培养板中观察细胞形态。结果悬浮细胞冻存后其存活率仅达60％左右，而贴壁培养细胞存活率达90％以上。细胞复苏贴壁一天后其形态如图1所示，悬浮细胞复苏后有较多死细胞及碎片而贴壁细胞较少。原因可能是处于神经球不同地方的细胞其所接触营养环境不一致导致内部部分细胞营养不良，且在细胞冻存前使神经球分散成单细胞悬液对细胞造成有不小的损伤，因此细胞复苏后存活率较低，即细胞质量较难控制。贴壁培养人神经干细胞存活率更高，在此方面更适合于临床转化。

实施例2：无血清培养基添加剂中各成份的筛选

通过查阅各方面资料，筛选出可能有利于细胞增殖的各种添加成份包括以下几种，腺岛素，转铁蛋白，孕酮，腐胺，亚硒酸钠，脱铁转铁蛋白，HSA，LIF，B-ME，VA，VC，Ve，Ve醋酸酯，雌二醇，甲状腺素，乙醇胺，脂类，TGFβ，氢化可的松，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽，三碘甲状腺原氨酸，L－肉碱，半乳糖等。其中前五种为N2成分，本发明将其按N2中各成分浓度配制成基础添加添，然后再往其中加入适当浓度的其它各种细胞因子及BFGF，EGF，培养NSC从P0至P3，以细胞增殖速度、细胞形态及细胞传代后增殖能力为评价指标，综合评价各因子对细胞增殖及分化的影响。筛选出能提高细胞增殖速度并且所培养细胞形态正常，传代后增殖能力不会明显下降的各生长因子如下：脱铁转铁蛋白，HSA，VC，乙醇胺，脂类，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽，三碘甲状腺原氨酸，L－肉碱，半乳糖，Ve，Ve醋酸酯。添加以上营养物质培养的神经干细胞传代后增殖能力及形态正常，增殖速度优于或不次于单独使用N2的培养基。在实验中我们发现脱铁转铁蛋白的加入显著地提高了细胞增殖速度且对细胞形态无影响，如图2所示。

将以上筛选得到的各种因子设定高低两个浓度，如表1所示；然后使用Plackett-Burman实验设计多因子组合，如表2所示；以细胞增殖密度为评价指标，筛选较优培养基配方。

表1 各培养基添加成分及浓度设定

表2：Plackett-Burman实验设计及响应值(n＝20)

从上述结果中得到促细胞增殖作用明显的几个配方，培养细胞并进行比较，最终筛选出促增殖效果好，稳定且成本低的配方，其组成成份及浓度如表3，将下列各组分按其各自特性溶解，混合后加入到基础培养基中，混匀后过滤除菌，4℃保存。

表3：本发明的人神经干细胞无血清培养基成分及浓度。

成分	来源货号	浓度μg/ml
			DMEM/F12	Gibco 10565
Neurobasal培养基	Gibco 21103
			HSA(人血清白蛋白)	武汉禾元	2500
Catalase(接触酵素；过氧化氢酶)	Sigma C3556(人)5mg	2.5
			Glutathione(reduced)(谷胱甘肽(抑制))	Sigma G6013	1
Insulin(胰岛素)	东宝企业集团	25
			SOD(超氧化物歧化酶)	Sigma S9636(人)1KU	2.5
Holo transferrin(含铁转铁蛋白)	Sigma SLBC6030V	100
			apo transferrin(脱铁转铁蛋白)	Sigma SLBB9087V	2.3
T3(三碘甲状腺原氨酸)	Sigma T6397	0.002
			L-Carnitine(L－肉碱)	Sigma C7518	2

Ethanolamine(乙醇胺)	Sigma MKBJ8093V	10
			D(+)-galactose(D－半乳糖)	Sigma G0625	15
Putrescine(腐胺)	Sigma BCBK1201V	16.1
			Sodium Selenite(亚硒酸钠)	威佳科技10102-18-8	0.0052
Biotin(生物素)	Sigma B4501	0.1
			Corticosterone(皮质酮)	Sigma C2505	0.02
Lipoic acid(硫辛酸)	Sigma T1395	0.047
			Progesterone(孕酮)	MP R27173	0.0063
维生素E(Ve)	Sigma T3251	1
			VE acetate(Ve醋酸酯)	Sigma T3001	1
维生素C(Vc)	Sigma A4544	1
			bFGF(碱性成纤维因子)	武汉禾元	0.025
EGF(表皮生长因子)	武汉禾元	0.025
			Glutamax(谷氨酰胺)	Sigma G7513	1％

实施例3本发明的可用于临床的培养人神经干细胞的无血清干细胞培养，经质量检测，各项指标均达标，见表4：

表4：本发明人神经干细胞无血清培养基检测项目及结果

实施例4：采用本发明的人神经干细胞无血清培养基贴壁培养人神经干细胞并进行鉴定。

取分离自胎儿脑组织原代冻存细胞一支(约2×10⁷个细胞)，用以下三种培养基进行培养。

1、N2培养基；

2、商品化人神经干细胞无血清培养基(StemPro NSC SFM Life A1050901)；

3、本发明的培养基；

以2×10⁵左右细胞/孔接种原代细胞至12孔板各孔(注：原代冻存细胞存活率较低，小于10％，接种细胞记为P0)，细胞长至90％融合后以购自Gibco的Accutase酶消化以1：3或2.5×10⁴细胞/cm²传代。

每代细胞拍照，观察细胞形态，如图3所示，本发明所述培养基培养神经干细胞从原代至P3代细胞形态，每一代细胞均具有典型的神经干细胞特征，并且三代细胞细胞形态未发生明显改变。

将细胞培养至P3，每次传代取样计数，绘制细胞从P0至P3细胞增殖曲线，如图4所示，本发明配制的培养基(图中S8/13/15/16)贴壁培养的神经干细胞，其增殖效果均优于StemPro NSC SFM(图中LCM)，而StemPro NSC SFM优于N2培养基(图中S7/9/10/11/12)。本发明配制的培养基贴壁培养19天左右至P3长满，细胞数从增殖至1.1－2×10⁷，StemProNSC SFM贴壁培养神经干细胞19天至P2长满，细胞数仅达4×10⁶；N2培养基贴壁培养神经干细胞21天至P3长满，细胞数增殖至2.5－5.6×10⁶其促增殖效果较差。

P1、P2代细胞传代时取样悬浮培养以检测其形成神经球能力鉴定，结果如图5所示，本发明配制的培养基贴壁培养的神经干细胞P1代P2代均能形成良好的神经球，而StemPro NSC SFM贴壁培养的神经干细胞形成神经球能力弱，大部分细胞在未加贴壁材料的情况下仍贴壁。

使用流式细胞术鉴定细胞表面标志，取P3细胞长至90％融合时，Accutase酶消化后收集细胞做流术细胞术鉴定，检测标志物包括Nestin、SOX2、CD44、CD90、CD133等，其部分检测结果如图6所示，神经干细胞特异性表达蛋白(SOX2)及神经巢蛋白(Nestin)是神经干细胞特异性表达的标志物，目前通常检测这两种标志物的表达来对神经干细胞进行鉴定，从图6可以看出，本发明配制的培养基贴壁培养的神经干细胞SOX2及Nestin阳性细胞比例高于商品化培养基，StemPro NSC SFM，并且其组内差异较小，较稳定。另外，N2培养基培养细胞Nestin阳性细胞比率较低。

取P3细胞，消化传代至包被玻片上培养1天和3天后进行免疫荧光鉴定细胞表面标志物Nestin和SOX2，其结果如图7所示，本发明所述培养基贴壁培养神经干细胞至P3，其SOX2及Nestin双阳性细胞比例均达90％以上。

采用本发明所述培养基贴壁培养神经干细胞至P4后去除培养基中bFGF及EGF让神经干细胞(NSC)处发分化20天，然后对分化细胞进行免疫荧光鉴定，结果如图8所示，细胞自发分化20天后，形成具有典型表型的NSE(神经元特异性烯醇化酶)阳性且GFAP(主要存在于星形胶质细胞的中间丝蛋白)阴性的神经元，其它细胞大部分分化成星型胶质细胞。

采用本发明所述培养基贴壁培养神经干细胞至P4后用神经元诱导培养基诱导神经干细胞分化20天，然后对分化细胞进行免疫荧光鉴定，结果如图9所示，本发明所述培养基培养的细胞向神经元诱导分化20天后，大部分形成MAP2(神经元树突标志物微管相关蛋白)阳性的神经元。

采用本发明所述培养基贴壁培养神经干细胞至P4后用星型胶质细胞诱导培养基诱导神经干细胞分化20天，然后对分化细胞进行免疫荧光鉴定，结果如图10所示，本发明所述培养基培养的细胞向星型胶质细胞诱导分化20天后，大部分细胞分化形成具有典型形态的GFAP阳性的星型胶质细胞。

采用本发明所述培养基贴壁培养神经干细胞至P4后用少突胶质细胞诱导培养基诱导神经干细胞分化20天，然后对分化细胞进行免疫荧光鉴定，结果如图11所示，本发明所述培养基培养的细胞向少突胶质细胞诱导分化20天后，有少部分细胞分化形成O4(少突胶质细胞标志物)阳性的少突胶质细胞。

Claims

1.一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基、基础营养添加剂、植物源人血清白蛋白、糖类、脂类、激素、抗氧化剂、促代谢相关物质；

其中，所述基础培养基是由商品化的DMEM/F12与商品化的neurobasal培养基按1:1的比例配制而成；

所述培养基的成份及其含量如下：

植物源人血清白蛋白： 250 µg/ml；

胰岛素：25 µg/ml；

含铁转铁蛋白：100 µg/ml；

脱铁转铁蛋白：2.3 µg/ml；

腐胺：16.1 µg/ml；

孕酮：0.0063 µg/ml；

亚硒酸钠：0.0052 µg/ml；

D－半乳糖：15 µg/ml；

脂类： 1%；

生物素：0.1 µg/ml；

皮质酮：0.02 µg/ml；

硫辛酸：0.047 µg/ml；

VE ：1 µg/ml；

VE醋酸酯：1 µg/ml；

人源过氧化氢酶：5 U/ml；

人源超氧化物歧化酶：0.4 U/ml；

谷胱甘肽（抑制）1 µg/ml；

VC ：1 µg/ml；

L－肉碱：2 µg/ml；

乙醇胺：1 µg/ml；

三碘甲状腺原氨酸（T3）：0.002 µg/ml；

植物源人bFGF 25 ng/ml；

植物源人EGF 25 ng/ml；

谷氨酰胺： 1%。

2.一种培养神经干细胞的方法，其特征在于：提供如权利要求1所述的用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基；将神经干细胞在所述培养基中进行贴壁培养或悬浮－贴壁交替进行培养。