CN104560844B - 一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌和利用该重组菌制备四氢嘧啶的方法。本发明提供的重组大肠杆菌是将含有延长盐单胞菌Halomonas elongate四氢嘧啶合成基因簇EctABC的重组质粒导入大肠杆菌后得到的。本发明的重组大肠杆菌实现了四氢嘧啶合成的三个关键酶在阿拉伯糖启动子的调控下可溶性表达。诱导表达后的菌体以天冬氨酸钠为前体通过生物转化的方法实现了四氢嘧啶的高效分泌型合成。每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。本发明提供的利用该重组菌制备四氢嘧啶的方法，便于产物的下游纯化分离，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

Description

一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因工程菌及其应用。

背景技术

四氢嘧啶(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid；ectoine)是一种在耐盐及嗜盐微生物中应用最为广泛的渗透压调节物。四氢嘧啶分子具有高度水溶性、不带电荷的特点，在高盐环境下细胞可通过四氢嘧啶的高浓度积累提高胞内渗透压，却不会影响胞内生物大分子正常的生理功能。研究表明在高盐、高温、冷冻和干燥等逆境下四氢嘧啶对核酸、蛋白质、细胞膜及整个细胞可提供保护作用，因此在生物制剂、化妆品生产和制药等领域具有广泛的应用前景。

传统的四氢嘧啶生产工艺是利用嗜盐细菌延长盐单胞菌（Halomonas elongata）可以分泌合成四氢嘧啶的特性，采用“细菌挤奶（Bacterial milking）”的工艺通过高盐诱导合成、低盐释放，渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的高效分泌合成。该方法对反应器材料的稳定性有较高要求，而且这种不连续的生产流程及高浓度的盐增加了下游纯化工艺的难度，另外高浓度的盐易对设备造成腐蚀，同时还会影响菌体的生长，影响四氢嘧啶的产量，导致生产成本的增加，影响了四氢嘧啶的大规模应用。

目前现有的生产菌株及方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此开发一株新型的四氢嘧啶高产菌株从而简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌。

本发明提供的大肠杆菌工程菌具体为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌或重组载体：

1）序列表中SEQ ID№：1所示的核苷酸序列；

2）编码序列表中SEQ ID№：2、SEQ ID№：3和/或SEQ ID№：4所示蛋白质序列的多核苷酸序列；

3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4）与1）或2）或3）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。

所述重组大肠杆菌具体为将所述重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重组菌。

所述重组载体具体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入具有SEQ ID№：1所示核酸序列的DNA片段所得的质粒；所述出发大肠杆菌具体为大肠杆菌；具体的，所述出发大肠杆菌为带有ΔaraBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状的大肠杆菌；再具体的，所述出发大肠杆菌为大肠杆菌BW25113(rrnB3ΔlacZ4787hsdR514Δ(araBAD)567Δ(rhaBAD)568rph-1)。

所述重组载体具体为pBAD-EctABC，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID№.5所示。

所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABCCGMCC NO.8334。

本发明的另一个目的是提供上述任一所述的重组大肠杆菌或重组载体在制备四氢嘧啶中的应用。

本发明的还一个目的是提供一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入上述任一所述的重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了经过诱导表达SEQ ID№：2所示蛋白、SEQ ID№：3所示蛋白和SEQ ID№：4所示蛋白的。

所述诱导包括用L-阿拉伯糖进行诱导。

所述诱导包括用含1g/L的L-阿拉伯糖的发酵液进行诱导；和/或，所述诱导前，菌体溶液的OD600值为0.6-0.8；和/或，所述诱导时，发酵条件为30℃培养6-8小时；优选的，培养6小时。

所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：

溶剂为100mM、pH7.0的PBS缓冲液。

所述100mM、pH7.0的PBS缓冲液是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成的，具体为，每1L所述pH7.0的PBS缓冲液由380ml0.1M磷酸二氢钠水溶液加入620ml0.1M磷酸氢二钠水溶液配制而成。

所述生物转化反应的反应条件为30℃；和/或，在加入权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌后，可调节菌体溶液OD₆₀₀值达到10。

所述生物转化反应后，还需进行胞内和/或胞外四氢嘧啶的抽提；

所述胞内四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集菌体后冻干，将冻干菌体加入体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、水组成的抽提液中震荡1小时，离心取上清，上清液中加入等体积的氯仿与水的混合液，氯仿与水的体积比为1:1，振荡1小时，离心取上层水相，干燥除水后即得；

所述胞外四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集液相，加入等体积氯仿振荡1小时，离心取上清，移除溶剂后即得。

本发明的再一个目的是提供一种利用上述任一所述的重组大肠杆菌制备四氢嘧啶的生物反应液，其组成包括：

溶剂为100mM、pH7.0的PBS缓冲液。

所述100mM、pH7.0的PBS缓冲液是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成的，具体为，每1L所述pH7.0的PBS缓冲液由380ml0.1M磷酸二氢钠水溶液加入620ml0.1M磷酸氢二钠水溶液配制而成。

为了避免传统生产方法的缺陷，本发明将嗜盐菌来源的四氢嘧啶合成基因簇导入非嗜盐微生物大肠杆菌中，重构四氢嘧啶的合成通路。本发明成功构建了延长盐单胞菌Halomonas elongate四氢嘧啶合成基因簇EctABC的大肠杆菌表达载体pBAD-EctABC及K-12系列重组表达菌株BW-pBAD-ectABC。其中四氢嘧啶合成中的三个关键酶:氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶（EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)，在阿拉伯糖启动子的调控下均实现了可溶性表达。诱导表达后的菌体以天冬氨酸钠为前体通过生物转化的方法实现了四氢嘧啶的高效分泌型合成。每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。

本发明首次利用延长盐单胞菌Halomonas elongate四氢嘧啶合成基因簇EctABC实现了四氢嘧啶在大肠杆菌中的高效分泌合成，结合以L-天门冬氨酸钠为催化底物的生物转化方法，单位菌体的四氢嘧啶合成效率显著高于其它现有菌株，合成量达到已报道的最高水平，且绝大部分产物分泌至胞外，便于产物的下游纯化分离。因此本发明对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达情况。

图2为大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

延长盐单胞菌Halomonas elongate CGMCC No.1.6329购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

pBAD/HisA购自invitrogen，产品目录号为V430-01；

实施例1、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的构建

(一)、四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达

1、PCR扩增四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码序列

以延长盐单胞菌H.elongate(CGMCC No.1.6329)的基因组DNA为模板，用引物EctABC-P1、EctABC-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

EctABC-P1：5’-CCTAGCTAGCATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTA-3’

EctABC-P2：5’-CCGCTGCAGTTACAGCGGCTTCTGGTCGTCGGCT-3’

2、酶切、连接

用NheI和PstI双酶切PCR扩增产物，与预先使用NheI和PstI双酶切的pBAD/HisA质粒大片段进行连接，得到重组质粒。

3、转化、筛选以及序列验证

用氯化钙化学转化法将上述制备的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒，进行测序验证。测序结果表明，上述制备的重组质粒中含有具有如序列表中的SEQ ID№.1所示核酸序列（即EctABC编码基因序列）的DNA片段，该序列分别编码具有序列表中SEQ ID№.2-4所示氨基酸序列的3种蛋白（即四氢嘧啶合成中的三个关键酶:氨基丁酸乙酰基转移酶EctA、二氨基丁酸氨基转移酶EctB、四氢嘧啶合成酶EctC），与已报道的序列一致。上述实验过程及结果证明构建的质粒及重组菌正确。将阳性克隆记作DH5α-pBAD-ectABC,阳性质粒记作pBAD-EctABC。质粒pBAD-EctABC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID№.5所示。

4、重组表达菌株的构建

用氯化钙化学转化法将重组质粒pBAD-EctABC转化至大肠杆菌K-12系列表达菌株BW25113(rrnB3ΔlacZ4787hsdR514Δ(araBAD)567Δ(rhaBAD)568rph-1)（购自ThermoCat#OEC5042），用含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，获得EctABC重组表达菌株。检测重组菌株合成四氢嘧啶的能力，将其中合成能力较差的一株重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli）BW-pBAD-ectABC’；将其中合成能力较佳的一株重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli）BW-pBAD-ectABC将该合成能力较佳的大肠杆菌（Escherichia coli）BW-pBAD-ectABC菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.8334，保藏日期为2013年10月15日，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

实施例2、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中EctABC基因的表达

挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入5ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物1ml接种于100ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基，37℃剧烈振荡（200rpm）培养，至发酵液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8左右，向发酵体系中加入L-阿拉伯糖(L-阿拉伯糖终浓度为1g/L），30℃条件下继续培养6小时。设含空载体大肠杆菌BW-pBAD为阴性对照。

发酵完毕后,5000rpm离心15分钟，收集菌体；用pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎后12,000rpm离心15min。收集上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。检测结果见图1。图1中，泳道1表示含空载体大肠杆菌BW-pBAD阴性对照的检测结果；泳道2为四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的检测结果。

实施例3、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的应用

（一）、菌株发酵及生物转化法制备四氢嘧啶过程

1、菌株发酵及EctABC基因的表达

挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入20ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物5ml接种于500ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基，37℃剧烈振荡（200rpm）培养，至发酵液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8左右，再向发酵体系中加入L-阿拉伯糖(L-阿拉伯糖终浓度为1g/L），30℃条件下继续培养6小时5000rpm离心15分钟，收集菌体。

2、生物转化反应

离心后菌体加入转化液，重悬菌体至OD₆₀₀值达到10，取50ml重悬菌液于250ml三角瓶中，30℃振荡（100rpm）反应24小时。

转化液成分：100mM PBS缓冲液（pH7.0）中含有200mM L-天冬氨酸钠、10g/L葡萄糖、10g/L甘油、10g/L KCl。其中，100mM PBS缓冲液（pH7.0）的配制方法为：取380ml0.1M磷酸二氢钠水溶液加入620ml0.1M磷酸氢二钠水溶液配制而成。

（二）、胞内四氢嘧啶的抽提

上述生物转化反应完后，离心（8000rpm,20分钟）收集上述转化后菌体，菌体于-80℃中预冷30分钟后至于冷冻干燥仪中冻干，称重得干菌体160毫克。

称取20mg冻干菌体，加入500ul抽提液（抽提液由体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、水组成），剧烈震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相。上清转移至新离心管中，加入等体积的氯仿与水的混合液（氯仿与水的体积比为1:1），剧烈振荡1小时，再次13000rpm离心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。

按上述方法提取胞内四氢嘧啶，直至将160毫克冻干菌体胞内四氢嘧啶提取完全。

（三）、胞外四氢嘧啶的抽提

离心（8000rpm离心20分钟）收集上清液500ul置于离心管中，加入500ul氯仿剧烈振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。

按上述方法提取胞外四氢嘧啶，直至将50ml反应液中的四氢嘧啶提取完全。

（四）、四氢嘧啶HPLC检测

上述抽提获得的四氢嘧啶干粉溶于500ul浓度为80％(V/V)的乙腈水溶液中，0.22um有机型滤器过滤除去不溶物。过滤后样品用80％（V/V）乙腈水溶液适当稀释后HPLC检测四氢嘧啶浓度。HPLC检测仪为Agilent1260Infinity LC,检测柱为Agilent ZOBAX-NH2氨基柱，紫外检测波长为215nm，流动相80％（V/V）乙腈水溶液,流速为1.0mL/min,进样量为10uL，采用外标法按峰面积定量。Sigma四氢嘧啶标准品作为定性及定量标准。

HPLC检测结果显示，生物转化反应24h后，从160毫克干菌体和50ml反应液中，分别共提取胞内四氢嘧啶15毫克、胞外四氢嘧啶170毫克；换算后，每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。胞外四氢嘧啶浓度为3.4mg/ml。

（五）、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析

按上述（一）-（四）所述方法，分别检测生物转化反应2、4、8、12、16、20、24h后，胞内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，实验结果见图2所示。

图2结果显示，四氢嘧啶的合成量随着生物转化反应时间的增加而增加；生物转化反应4h后，菌株BW-pBAD-ectABC转化的四氢嘧啶开始分泌至胞外，随着反应时间的延长胞外四氢嘧啶的浓度显著增加，而胞内四氢嘧啶的含量保持恒定。转化20小时后四氢嘧啶的分泌速度减缓。生物转化反应24h后，每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。

实施例4、产四氢嘧啶大肠杆菌重组菌BW-pBAD-ectABC’的应用

按照上述实施例3所述的方法（即将实施例3中BW-pBAD-ectABC菌株替换为本对比例中的BW-pBAD-ectABC’菌株，其它均不变），利用大肠杆菌重组菌BW-pBAD-ectABC’制备四氢嘧啶后，检测生物转化反应24h后，胞内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，HPLC检测结果显示，每克菌体可以合成0.75克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。菌株BW-pBAD-ectABC的四氢嘧啶合成效率显著高于BW-pBAD-ectABC’。

此外，目前已报道的合成四氢嘧啶效率最高的是Chromohalobacter salexigens，每克干菌体可以合成0.54克四氢嘧啶。

Claims (6)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌为将重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重组菌；所述出发大肠杆菌为带有ΔaraBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状的大肠杆菌；

所述重组载体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入SEQ ID No.1所示核酸序列的DNA片段所得的质粒；

所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC，其保藏编号为CGMCC NO.8334。

2.权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备四氢嘧啶中的应用。

3.一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入权利要求1所述的重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌经过诱导表达SEQ IDNo.2所示蛋白、SEQ ID No.3所示蛋白和SEQ ID No.4所示蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：

溶剂为100mM、pH 7.0的PBS缓冲液。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的反应条件为30℃；和/或，在加入权利要求1所述的重组大肠杆菌后，调节菌体溶液OD₆₀₀值达到10。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应后，还需进行胞内和/或胞外四氢嘧啶的抽提；

所述胞内四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集菌体后冻干，将冻干菌体加入体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、水组成的抽提液中震荡1小时，离心取上清，上清液中加入等体积的氯仿与水的混合液，氯仿与水的体积比为1:1，振荡1小时，离心取上层水相，干燥除水后即得；

所述胞外四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集液相，加入等体积氯仿振荡1小时，离心取上清，移除溶剂后即得。