CN104535770A

CN104535770A - 一种复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒

Info

Publication number: CN104535770A
Application number: CN201410782871.3A
Authority: CN
Inventors: 董同义; 李玲; 董海江; 张文静
Original assignee: JIANGSU HAOSHEN MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU HAOSHEN MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明提供一种复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。所述试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液；所述试剂R2为结合有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒的缓冲液。试剂R2的特征是通过将直径为50~300nm的聚苯乙烯纳米胶乳微粒与肌红蛋白单克隆抗体或多克隆抗体偶联，得到不同粒径和不同抗体的偶联物。将不同粒径和不同抗体的偶联物按不同比例混合制成试剂R2，用于检测人血清中的肌红蛋白，可以提高本发明试剂盒的检测灵敏度和线性范围。本发明试剂盒的检测灵敏度为0.2μg/L，线性范围为0~1200μg/L。

Description

一种复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及一种纳米胶乳微粒型的肌红蛋白测定试剂盒。

背景技术

肌红蛋白（Mbglobin，Mb）是一个具有153个氨基酸的多肽链和一个含铁血红素辅基组成的亚铁血红素蛋白，相对分子质量17500，主要分布于横纹肌（心肌和骨骼肌）细胞中。由于分子量小，当心肌细胞损伤时，Mb是进入血液的最佳早期标志物。Mb通过肾小球滤过，从尿液中排出，因此测定血清和尿液中Mb的浓度可用于某些肌病和心脏病的诊断。如急性心肌梗死、急慢性肾衰竭、严重的充血性心力衰竭、长时间休克，神经肌肉病及各种原因引起的肌病。

急性心肌梗死（AMI）是临床常见的一种高病死率的急性心肌损伤性疾病，在发病初期，Mb最先被释放入血液中，在症状出现约1~3小时后，血中Mb可超出正常上限，9~12小时达到峰值，24~36小时后恢复正常，测定血清Mb可作为AMI诊断的早期最灵敏的指标。由于Mb半衰期短（15min），在胸痛发作后6～12小时不升高，则可排除AMI的诊断；Mb在AMI后很快从肾脏清除，发病18～30小时内可完全恢复到正常水平，故Mb的测定有助于在AMI病程中观察有无再梗死或者梗死再扩展，如果Mb频繁出现增高，提示原有心肌梗死仍在延续。

有关检测血清肌红蛋白的方法主要采用免疫学方法，以酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫测定法（radioimmunoassay，RIA）、化学发光法（Chemiluminescence，CL）和颗粒增强透射免疫比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）这几种方法为主。ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。RIA灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。CL价格昂贵，需要专门的仪器和专业人员操作，不利于基层医院普及。PETIA是近年来出现的一种较为稳定、快速、准确测定肌红蛋白血清浓度的检测方法。PETIA的基本原理是在高分子胶乳微粒的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微粒与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的透光性能。而且，反应液透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，即胶乳颗粒凝集越多，越会阻碍光线的透光性，反应液的吸光度就越大，在一定范围内与被测抗原的浓度成正比。PETIA检测方法反应时间短，精密度好，检测范围宽，黄疸、溶血和脂血标本均不受影响，易于自动化，是目前使用非常广泛的一种检测方法，但该方法的检测灵敏度和线性范围还有待进一步提高。

目前，PETIA检测试剂所采用的胶乳颗粒多为惰性微粒、羧基化微粒及氨基化微粒。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结合，在微粒与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。国内外已有多家公司提供纳米级表面修饰的微粒粒子原料，并广泛应用于PETIA。这些厂家提供的粒子直径在20nm~4μm，可以作为多克隆抗体和单克隆抗体的载体。纳米级粒子的推出解决了对单克隆抗体结合的能力不强，临床检测的线性范围窄，灵敏度低，干扰因素多，实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是进一步提高检测血清中肌红蛋白含量的分析灵敏度和检测范围；提供一种特异性好，灵敏度高，精密度好，准确度高的纳米胶乳微粒型肌红蛋白测定试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1和试剂R2的体积比为3︰1。所述试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液，组分包括：10~30mmol/L的缓冲液、0.01%~4%（w/v）的增乳剂、0.05%~2%（w/v）的稳定剂、0.1%（w/v）的防腐剂；所述试剂R2为结合有抗人肌红蛋白抗体纳米胶乳微粒的缓冲液，组分包括：0.1%~0.5%（w/v）标记有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒、0.02%~2%（w/v）的稳定剂、10~30mmol/L的缓冲液、0.1%（w/v）的防腐剂。

所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、2-吗啉乙横酸（NES）缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液和三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6~9。所述缓冲液可以为其他具有相似特征的缓冲液。

所述增乳剂为聚乙二醇 2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基醚、NaCl、吐温20或吐温80。增乳剂主要作用是可以增加抗体抗原的反应速率。本发明所述的增乳剂优选品种为聚乙二醇 6000。

所述防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种。本发明优选品种为叠氮化钠。

所述稳定剂为牛血清白蛋白、聚乙二醇 6000、乙二胺四乙酸钠中的一种或多种。

所述抗人肌红蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体或单克隆抗体与多克隆抗体的混合物。

所述标记有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒的制备方法为：选择不同粒径的羧基化聚苯乙烯纳米胶乳微粒，通过活化剂1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐（EDAC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）活化微粒表面的羧基，生成活性酯，再与肌红蛋白单克隆抗体或多克隆抗体上的伯氨基反应，形成共价键，完成偶联，制成不同粒径的肌红蛋白单克隆抗体或多克隆抗体纳米胶乳微粒偶联物。所述不同粒径的羧基化聚苯乙烯纳米胶乳微粒的直径在50~300nm（为市售产品）。其中，小粒径纳米胶乳粒偶联单克隆抗体，可提高检测的线性范围；大粒径纳米胶乳微粒偶联多克隆抗体，可提高检测灵敏度。

本发明的原理：本发明利用交联了抗体的纳米胶乳微粒偶联物，与相应标本中的抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成时所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。进一步的，所述本发明中，血清中的肌红蛋白与交联在纳米胶乳微粒上的抗人肌红蛋白抗体结合，产生抗体抗原反应，使纳米胶乳微粒形成聚集，在500nm波长处测定反应物吸光度，通过对照标准曲线可计算出标本中肌红蛋白的含量。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1. 本发明试剂盒的检测灵敏度可以达到0.2μg/L，线性范围为10~1000μg/L，二者均高于同类产品的分析灵敏度和线性范围。是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、精密度好、线性范围宽的纳米胶乳微粒型的肌红蛋白测定试剂盒。

2. 本发明所涉及的纳米胶乳微粒的粒径在50~300nm；将不同粒径的微粒分别与肌红蛋白单克隆抗体或肌红蛋白多克隆抗体交联，可以形成多种粒径的偶联物；将不同粒径、不同抗体的偶联物按不同比例混合，可以拓宽肌红蛋白测定试剂盒的线性范围，提高检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明中6种不同浓度的标准血清样本线性分析图；

图2为本发明肌红蛋白测定试剂盒的相关性分析图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

肌红蛋白测定试剂盒的制备

1. 试剂R1的制备

在20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4）中分别加入终浓度为0.5%聚乙二醇6000、0.1%吐温20、0.1%牛血清白蛋白、和0.1%叠氮化钠，充分混匀，用0.22μm滤膜过滤，制成试剂R1。

2. 试剂R2的制备

鼠抗人肌红蛋白单克隆抗体和兔抗人肌红蛋白多克隆抗体均委托专业公司按照常规方法制得，该抗体仅与人肌红蛋白反应，与其他抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试验需要。

在20mmol（pH6.1）NES缓冲溶液中加入EDAC︰Sulfo-NHS︰纳米胶乳微粒（250nm或60nm），其质量比为1︰0.6︰1，混匀后室温旋转摇床活化1小时，17000rpm离心30min，用20mmol（pH6.1）的NES缓冲液洗涤3次，然后将微球悬于20mmol（pH6.1）的NES缓冲液中，制成微粒悬液。

在250nm微粒悬液中加入质量为纳米胶乳微粒1/4重的肌红蛋白多克隆抗体，在60nm微粒悬液中加入质量为纳米胶乳微粒1/4重的肌红蛋白单克隆抗体，立即混匀，室温旋转摇床孵育2小时。然后分别加入1mol Tris-HCl缓冲液（pH7.4），使Tris-HCl缓冲液终浓度为0.1 mol，室温旋转摇床孵育1小时。再分别加入终浓度为20mmol的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）、0.1%牛血清白蛋白、0.1%叠氮化钠和0.03%聚乙二醇辛基苯基醚的封闭液，室温旋转摇床孵育20 min。在2~10℃条件下17000rpm离心30 min，弃上清液，沉淀物分别用含终浓度为30mmol的磷酸盐缓冲液（pH7.4）、0.1%叠氮化钠、0.03%聚乙二醇辛基苯基醚的洗涤液重悬，再离心，如此洗涤3次，制成250nm微粒交联肌红蛋白多克隆抗体偶联物和60nm微粒交联肌红蛋白单克隆抗体偶联物。用含0.1%牛血清白蛋白、0.1%叠氮化钠和30mmol的磷酸盐缓冲液（pH7.4）缓冲液分别重悬偶联物，使其终浓度为0.25%（W/V），再以1︰3体积比混合，制成试剂R2。

实施例2

肌红蛋白测定试剂盒的性能试验

试验分析方法：两点终点法。取试剂R1 150ul，加入样本25ul，于37℃ 5min后加入试剂R2 50 ul，开始读点，反应5min，再次读点，得到吸光度差值（△A）。

检测仪器：日立7180型自动分析仪。

检测波长：500nm。

1. 灵敏度试验

检测20次水，记录吸光度差值（△A_水），计算平均值（X_水）和标准偏差（SD_水）；检测浓度为100μg/L的样本20次，记录吸光度差值（△A_样），计算平均值（X_样）和标准偏差（SD_样），试验结果如表1所示。用如下公式计算灵敏度。

灵敏度 = 100 ×（X_水＋3×SD_水）/ X_样

表1

本发明试剂的灵敏度 = 100 ×（0.691＋3×0.0419）/ 398 = 0.2μg/L

结果显示，本发明的肌红蛋白测定试剂盒的灵敏度为0.2μg/L，优于专利（CN 102628865 B）的灵敏度3μg/L、专利（CN 102565419 B）的灵敏度1.59 μg/L。本发明的研究结果达到了提高肌红蛋白测定试剂盒分析灵敏度的目的。

2. 标准血清样本线性试验

用重组人肌红蛋白蛋白溶于类似人血清基质的溶液（0.9%NaCl、0.1%牛血清白蛋白、0.1%叠氮化钠、30mmol的磷酸盐缓冲液pH7.4），制成浓度为0.0μg/L、100.0μg/L、300.0μg/L、600.0μg/L、900.0μg/L、1200.0μg/L的6个标准血清样本。每个不同浓度的样本用本发明的肌红蛋白测定试剂盒检测3次，取其平均值。对测定值进行相关性分析，如图1所示，图中X轴表示理论值（μg/L），Y轴表示实测值（μg/L），r = 0.9998，Y = 0.970X﹣4.121。说明本发明试剂盒在浓度为0~1200μg/L范围内线性关系良好，优于专利（CN 102565419 B）的线性范围20~700μg/L、专利（CN 102628865 B）的线性范围10~1000μg/L。本发明的研究结果达到了增加视黄醇结合蛋白测定试剂盒线性范围的目的。

3. 精密度试验

用本发明的试剂盒检测高、中、低3个浓度的肌红蛋白人血清样本各20次，计算批内精密度；用3个批号的试剂盒检测同一浓度的肌红蛋白人血清样本各20次，计算批间精密度。试验结果如表2所示，本发明试剂盒的批内精密度（CV%）分别为2.89、0.82和0.71；批间精密度（CV%）为2.81。说明本发明试剂盒具有良好的精密度。

表2

4. 干扰试验

取体检正常的健康人血液标本（无明显溶血、黄疸、乳糜），制成混合血清。精密称取抗坏血酸、胆红素、血红蛋白和甘油三酯，制成4组高浓度干扰物溶液。分别精密量取高浓度干扰物溶液与混合血清，制成不同干扰物浓度的混合血清样本（如表3所示），将配制好的血清样本用本发明试剂盒分别进行测定，每个样本重复测定3次，取其平均值，以未加干扰物的样本测定均值为100%，计算干扰度。

干扰度 = 加干扰物样本均值 / 未加干扰物样本均值 × 100%

干扰度在90%~110%之间的示为可以接受的结果。

表3

结果显示：当抗坏血酸浓度小于300mg/L、胆红素浓度小于400mg/L、血红蛋白浓度小于5g/L、甘油三酯浓度小于10g/L时，各干扰物对本发明试剂盒的测定结果无明显影响。

5. 相关性试验

分别使用本发明试剂盒和对照试剂盒（市售某知名公司同类型产品）对50份正常人血清和50份异常人血清进行相关性试验和相关性分析。试验结果如图2所示，图中X轴为对照试剂盒测定值（μg/L），Y轴为本发明试剂盒测定值（μg/L），两试剂盒的相关系数r = 0.996。结果表明：本发明试剂盒与对照试剂盒的检测数据图呈直线关系，两试剂盒具有显著的相关性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制。但凡利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例，均未脱离本发明技术方案内容。依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

专利引用

授权国家及专利号	公布或公告日期	专利名称
			CN 102565419 B	2014.05.14	肌红蛋白检测试剂盒
CN 102628865 B	2014.07.16	检测肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒

非专利引用

1. 邹思湘. 动物生物化学（第四版）中国农业出版社，2005。

2. 肖玉艳，邢燕芳，绳建敏. 肌红蛋白测定在急性心肌梗塞诊断中的临床意义. 标记免疫分析与临床，2000，7(2)︰61~64。

3. 吴明. 胶乳增强免疫比浊法测定肌红蛋白. 医学影像与检验，2011，24(5)︰274~275。

4. 康凯，阚成友，等. 生物医用高分子微球研究进展. 化学研究与应用，2004，16(2)︰137~142。

5. 李青，李富荣，吴雄文. 纳米技术在检验医学中的应用与研究进展，2006，29(5)︰472~474。

Claims

1.一种复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液，组分包括：10~30mmol/L的缓冲液、0.01%~4%（w/v）的增乳剂、0.05%~2%（w/v）的稳定剂、0.1%（w/v）的防腐剂；所述试剂R2为结合有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒的缓冲液，组分包括：0.1%~0.5%（w/v）标记有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒、0.02%~2%（w/v）的稳定剂、10~30mmol/L的缓冲液、0.1%（w/v）的防腐剂。

2.根据权利要求1所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、2-吗啉乙横酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6~9，所述缓冲液可以为其他具有相似特征的缓冲液。

3.根据权利要求1所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述增乳剂为聚乙二醇 2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基醚、NaCl、吐温20或吐温80。

4.根据权利要求1所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为牛血清白蛋白、聚乙二醇 6000、乙二胺四乙酸钠中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的复合抗体的型肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述抗人肌红蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体或单克隆抗体与多克隆抗体的混合物。

7.根据权利要求1所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述的纳米胶乳微粒为被化学基团修饰的聚苯乙烯胶乳微粒，所述的化学基团优选羧基。

8.根据权利要求1或6~7所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述标记有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒的制备方法为：选择不同粒径的聚苯乙烯纳米胶乳微粒，在活化剂的作用下，聚苯乙烯微粒上的羧基与抗体上的氨基缩合形成偶联物，所述不同粒径的聚苯乙烯纳米胶乳微粒的直径在50~300nm。

9.根据权利要求1或8所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述试剂R2为0.1%~0.5%（w/v）多克隆抗体偶联物和单克隆抗体偶联物的混合缓冲液，所述单克隆抗体偶联物和多克隆抗体偶联物的质量比是1:1~5:1。

10.根据权利要求1~9任一项所述的复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于：用于测定人血清中肌红蛋白的含量。