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CN104507967B - 抗cxcr3抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗CXCR3抗体,以及使用这些抗体诊断和/或治疗CXCR3相关的疾病,例如I型糖尿病(T1D)、尤其新发生T1D的方法。在某些实施例中,本文公开了CXCR3中和抗体。

Description

抗CXCR3抗体
本申请基于35U.S.C.§119要求于2012年1月20日提交的美国临时申请序列号61/588,936的权益,该申请通过引用全部并入本文。
本发明是关于抗体及使用抗体治疗与CXCR3信号传导相关疾病(例如I型糖尿病(I型糖尿病;T1D))的方法。
糖尿病的特征在于因缺乏胰岛素作用而导致的慢性高血糖症以及伴发的各种特征性的代谢异常。糖尿病从广义上可以分为I型和II型。T1D的特征在于朗格罕氏岛(Langerhans’islets)胰腺β细胞的缺失,而II型糖尿病的特征是胰岛素分泌和胰岛素敏感性二者降低(胰岛素抵抗)。在美国,糖尿病的发病率为人群的约2%至4%,其中I型糖尿病(亦称之为胰岛素依赖性或IDDM)占所有病例的约7%至10%。
I型糖尿病的特点在于无法产生足量的胰岛素以维持葡萄糖稳态。人们认为该病症是由自身免疫介导的对胰腺β细胞破坏而引起的。与I型糖尿病相关的自身免疫性涉及B和T自身反应性淋巴细胞二者的参与。实际上,高达98%的I型糖尿病患者具有抗一种或多种自身β细胞抗原及异原性胰岛细胞胞质抗原(ICAs),其中自身β细胞抗原包括胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素瘤抗原-2以及胰岛素瘤抗原-2b(IA-2及IA-2β)。尽管可能并非总是起决定性作用,但是一种或多种自身抗体的含量通常与β细胞破坏相关。Irvine等人,Diabetes,26:138-47(1997);Riley等人,N.EngL J,Med,323:1 187-72(1990)。因此,自身抗体可以用作自身免疫性糖尿病发展的标志物,也可以与代谢变化一起用于预测T1D患者的亲属中出现糖尿病的风险。
I型糖尿病的发生可以由自身反应性T细胞介导,正如通过借助于T1D诊断时获得的组织活检证实经活化的T细胞浸润胰岛。Bottazzo等人,N,EngL J.Med,,313:353-80(1985);Hanninen等人,J,Clin.Invest,90:1901-10(1992);Itoh等人,J.Clin,invest,92:2313-22(1993);Imagawa等人,Diabetes,50:1289-73(2001)。
趋化因子(C-X-C基序)受体3(CXCR3),亦称之为G蛋白偶联受体9(GPR9)、CD183、IP-10受体和Mig受体,是在自身反应性T细胞上表达的趋化因子受体,其与一系列生理过程和相关疾病(例如T1D)相关。CXCR3几乎不存在于初始T细胞中,但在经抗原活化后上调且因一级配体(CXCL9、CXCL10及CXCL11)将活化细胞募集至组织发炎位点。已显示,在T1D的小鼠模型((Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:8838-6845;orimoto等人,JImmunol 2004;173;7017-7024;Sarkar等人.Diabetes.2012Feb;81(2):436-46)中及在患有胰岛炎的T1D患者的胰岛(Uno等人2010;Roep等人Clinical and ExperimentalImmunology,2003,159:338-343;Sarkar等人.Diabetes.2012Feb;61(2):438-46)中,β细胞主要表达CXCL10,并且CXCL9含量较低。另外,已显示,在T1D小鼠模型中和在I型糖尿病胰腺样本中,已浸润胰腺的T细胞表达CXCR3(Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:8838-6845;Van Haiteren等人,Diabetologia 48:75-82(2005);Uno et al2010;Roep等人,Clinical and Experimental immunology,2003,159:338-343;Sarkar等人,Diabetes.2012Feb;81(2):436-46)。此外,CXCR3缺陷的基因敲除小鼠出现发作显著性延迟及T1D发病率降低(Frigerio等人,Nature Medicine 8:1414-1420(2002)),而CXCL10在转基因小鼠胰岛中过表达促进T细胞浸润并加速T1D发作(Rhode等人,J.Immunol.175(6):3516-24(2005))。通过抗体治疗中和CXCL10是具有保护性(Christen等人,TheJournal of Immunology,2003,171:6838-6845)。
在人类中已鉴定CXCR3有三种亚型,表示为A、B及Alt(Lasagni等人,J.Exp.Med.2003 197:1537;Ehlert et al J.Immunol.2004;173;6234-6240)。CXCR3-A结合至CXC趋化因子CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)及CXCL11(I-TAC);CXCR3-B亦结合至这些靶标,也结合CXCL4;CXCR3-Alt似乎与CXCL11互相作用。尽管选择性剪接产生CXCR3的若干蛋白亚型,但是CXCR3-A是活体内主要形式,这是因为CXCR3-B和CXCR3-Alt在蛋白水平上的表达量远远更低。Lasagni等人,J.Exp.Med.2003197:1537;Ehlert et ai J,Immunol.2004;173;8234-624Q。
尚未证实使用CXCR3小分子抑制剂破坏CXCR3途径的努力是完全有效的。Christen等人,Clin Exp.Immunol.185:318-328(2011)。研究主要集中于在糖尿病发作前破坏CXCL10的抗体和其他方法。Morimoto等人,J.Immun.173:7017-7024(2004);Oikawa etai.,Rev.Diabet Stud.7:209-224(2010)。
鉴于与CXCR3相关的T1D及其他疾病的盛行,因此需要一些靶向性CXCR3信号传导的其他方法,例如,从而治疗或减少诸如T1D等病症或降低其进展。
本发明公开了能够结合至CXCR3的抗体及其使用方法。在一些实施例中,该抗体可通过靶向CXCR3途径来预防、治疗个体的T1D或降低其早期进展。该抗体及方法至少部分依赖于以下令人惊讶的结果:针对CXCR3的中和抗体在疾病发作前给予可预防NOD小鼠的T1D发作,或在NOD小鼠的T1D新发生阶段给予可逆转疾病进行。此外,中和CXCR3活性并不与患者免疫系统的正常运行显著受损相关,因此降低了抗体疗法的不合意副作用。
因此,一方面,本文公开了能够中和CXCR3活性的抗体及抗原结合片段。在某些实施例中,CXCR3中和抗体的特点在于能够结合至选自SEQ ID NO:1的1-58、1-16或1-37位残基的肽。在一些实施例中,抗体包含全部或部分命名为C1 12、C1 135、C1 82、C1 53及/或C14的抗体克隆(C1)。在某些实施例中,提供抗体C1 12、C1 135、C1 82、C1 53及/或C1 4的变体,包括所公开的抗体CDR-移植、人源化、回复突变(back mutated)及完全人类变体。在特定实施例中,抗体包含本文所公开的克隆C1 12、C1 135、C1 82、C1 53和/或C1 4或克隆4、12、53、82和135的任一变体的一个或多个互补决定区(CDR),例如,一个或多个重链CDR1、CDR2及CDR3及/或一个或多个轻链CDR1、CDR2、CDR3。在一些实施例中,源自克隆C1 12、C1135、C1 82、C1 53和/或C1 4或其嵌合和人源化的抗体相对于抗hCXCR3克隆5H7、7H5、V44D7、1C6及49801显示出某些有益的特性。例如,本申请所公开的抗体与抗hCXCR3克隆5H7、7H5、V44D7、1C6及49801相比可表现出增加的结合亲和力。例如,该抗体可相对于抗CXCR抗体(例如1C6)体现出1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更大的亲和力(或其间的任意值),例如,通过表面等离子共振(surface plasmon resonce)测定(例如,使用BIACORETM分析)。在此也预测本申请中所公开的人源化抗体与小鼠抗hCXCR3克隆5H7、V44D7,1C6,及49801相比在免疫原性方面有所降低。另外,本申请所公开的克隆4.7-4.11重链通过去除58位和59位的一个脱酰胺位点而优化(使用IMGT编码),且藉此相对于初始小鼠抗hCXCR3重链可变区(VH)CDR2序列稳定性增强。
另一方面,本申请公开了在T1D发作前,如同治疗新发生T1D或减少其进展中给予个体有效量的CXCR3中和抗体的方法。在特定实施例中,个体是哺乳动物,例如,人类。
在某些实施例中,新发生的T1D个体在临床诊断6个月以内按照本申请所公开的方法进行治疗。在其他实施例中,在临床诊断超过6个月的患者中进行治疗,其中该个体保留至少约0.2nmol/L的残余空腹积分血清C肽浓度(residual fasting integrated serum C-peptide levels)。
在一些实施例中,个体的特点在于在外源性胰岛素不存在时升高的空腹血糖,浓度高于120mg/dL;或在C肽刺激期间异常低的空腹积分血清C肽浓度,为约0.033至1.0nmol/L x min。在特定实施例中,CXCR3中和抗体以约0.03-3.7mg/kg/剂量给予。在一些实施例中,给予个体至少一个剂量的抗体。在某些实施例中,给予个体重复剂量的抗体(例如,至少每年一次,每季度一次,每两月一次,每月一次,每两周一次,每周一次或两天一次)。在其他实施例中,上述方法还进一步包含在给予CXCR3中和抗体的同时或依序(之前或之后)给予免疫抑制剂和/或β细胞刺激剂的步骤。
在多数实施例中,本文中公开的抗CXCR3抗体是用于治疗CXCR3表达异常为特征的状态。在一些实施例中,抗CXCR3抗体可以用于治疗那些受益于CXCR3活性下调或中和的任何情况。在一些实施例中,在本文中公开的抗CXCR3抗体是用于治疗T1D。
本发明的其他实施例及优点将在下文说明书中部分地加以陈述,并且部分是根据本说明书是显而易见的,或者通过对本发明的实施而知晓。通过随附的权利要求中特别指出的要素和组合实现并达成本发明的实施及优点。
需要理解的是,上文的一般性说明以及下文的详细说明书仅具有示例性和解释性,并非限制所主张的发明。
并入说明书中并构成说明书中一部分的附图阐释了本发明的一个(若干个)实施例,且与说明书一起用于解释本发明原理。
附图说明
图1显示了来自6周龄雌性NOD小鼠(第一行)、10周龄雌性NOD小鼠(第二行)、及新发生糖尿病雌性NOD小鼠(第三行)的胰腺切片中胰岛素(左面板)、CXCL10(中面板)、CD3(右面板)的表达。
图2是对来自患有新发生糖尿病的雌性NOD小鼠胰腺中T细胞CXCR3表达的流式细胞仪分析。鉴别CD4+及CD8+T细胞并针对CXCR3表达进行染色,如通过由底部两个图中的实线所显示。同种型对照染色是在相同的两个图中由阴影曲线来显示。
图3显示了在糖尿病发作前,对于从10周龄开始用PBS、抗CXCR3及对照IgG治疗的动物而言,非糖尿病雌性NOD小鼠随时间的百分比。两次独立研究结果显示于图3A和3B中。
图4显示的是对于10周龄开始即用抗CXCR3抗体预防性治疗且针对胰岛素(左面板)或CD3/Foxp3(中面板及右面板)染色的26周非糖尿病雌性NOD小鼠的胰腺切片。右面板是中面板中所示切片放大后的图片。
图5显示的是在诊断为糖尿病后3-4天内开始用PBS、抗CXCR3及对照IgG及鼠类抗胸腺细胞球蛋白(murine thymoglobulin,mATG)抗体治疗的雌性NOD小鼠每天早上的血糖值。各条线代表各只小鼠。箭头指示提供治疗的时间。
图6A是用PBS、抗CXCR3及对照IgG及mATG抗体治疗的雌性NOD小鼠的CD4+(左图)及CD8+(右图)T细胞百分比的条状图。在治疗过程中的第五次注射待测物后从小鼠收集胰腺,同时从年龄匹配的经mATG治疗的小鼠收集胰腺。图6B是用PBS、对照抗体或抗CXCR3治疗小鼠后胰腺的CD4+T细胞的CD44+表达(纵轴)对CD62L表达(横轴)的绘图。G1和G2分别是指门控性高CD44/低CD62L和低CD44/高CD62L T细胞。图6C显示的是与用同种型对照抗体染色且淋巴细胞门控的细胞中CXCR3表达相比较,G1和G2中CD4+T细胞的CXCR3表达。
图7显示的是用对照IgG(左面板)、抗CXCR3抗体(中面板)和mATG(右面板)治疗且针对胰岛素(顶行)或CD3/Foxp3(底行)染色的雌性NOD小鼠的胰岛切片。
图8A-D是年龄匹配的非糖尿病雌性NOD小鼠(图8A)、用PBS治疗的糖尿病NOD小鼠(图8B)、抗CXCR3抗体治疗后疾病缓解的NOD小鼠(图8C)及用对照IgG抗体治疗的糖尿病NOD小鼠(图8D)在进行葡萄糖筛查后血糖含量的曲线图。在初始糖尿病诊断及研究注册后100天对小鼠实施葡萄糖筛查。各条线代表各个独立动物的数据。
图9A-B显示对接受自PBS、抗CXCR3、对照IgG或mATG抗体治疗的雌性NOD小鼠分离采集供体CD4+及CD8+T细胞的NOD.Scid接受者而言,非糖尿病小鼠随时间的百分比。T细胞是在用PBS或对照IgG治疗后约80-90天从糖尿病雌性小鼠中分离,或在用抗CXCR3或mATG抗体治疗后约80-90天从疾病缓解的雌性NOD小鼠中分离。两次独立研究结果见图9A和9B。
图10A展示了如图9中所示的用PBS、抗CXCR3、对照IgG或mATG抗体治疗雌性NOD小鼠中分离的CD4+及CD8+供体T细胞百分比(左板面)。各治疗组中CD4+和CD8+T细胞供体采集物中的效应和中央记忆细胞的百分比见图10A的右面板。图10B显示供体T细胞采集物中通过CD4和CD25的表达或通过CD4、CD25及Foxp3的表达鉴别的调节性T细胞百分比。图10C显示供体T细胞采集物中亦表达CXCR3的CD8+(左面板)及CD4+(右面板)的百分比。
图11A-B显示的是将来自于供体OVA特异性TCR转基因小鼠的T细胞过继性的转移至保持未经治疗或用抗CXCR3抗体或对照IgG治疗的RIP-OVA接受者小鼠中,非糖尿病小鼠随时间的百分比。两次研究结果见图11A和11B中。
图12A显示在过继性转移至RIP-OVA接受者小鼠之前通过流式细胞仪分析供体T细胞CXCR3的表达(实线曲线)。用同种型对照抗体染色见于阴影曲线中。图12B显示在过继性转移后的第2天、第4天、第7天、第9天及第15天用抗CXCR3或对照IgG抗体治疗的接受者小鼠血液、脾及胰腺淋巴结中供体细胞的百分比。图12C显示在过继性转移后用CXCR3或对照IgG抗体治疗的接受者小鼠血液、脾、胰腺淋巴结增殖性供体细胞的百分比。图12D显示在过继性转移后用CXCR3或对照IgG抗体治疗的接受者小鼠血液、脾、胰腺淋巴结中CXCR3+供体细胞的百分比。
图13显示来自保持未经治疗且针对胰岛素(左上)或CD3(右上)染色或用抗CXCR3抗体治疗且针对胰岛素(左下)或CD3(右下)染色的RIP-OVA接受者小鼠的胰腺切片。在过继性转移供体T细胞后60天收集胰腺。
图14A-C显示由克隆Cl 4,12,53,82及135介导的由CXCR3介导的向CXCL11的趋化性的抑制程度。数据显示为在趋化性分析中迁移细胞的平均相对荧光单位(RFU)。图14D显示抗体克隆Cl 4,12,53和135将钙动员抑制50%所需的抗体浓度。
图15A-C显示由由克隆Cl 4,12,53,82及135介导的由CXCR3介导的向CXCL9(图15A)、CXCL10(图15B)及CXCL11(图15C)的趋化性的抑制程度。数据显示为在趋化性分析中迁移细胞的平均相对荧光单位(RFU)。
图16显示抗体与表达各种不同趋化因子的受体细胞结合的直方图。各直方图中结合抗体的浓度沿横轴增加。
图17A显示克隆4.0(标记为“亲本”)与某些人源化变体(标记为VH1-3、7-11及VK1-3)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17A按照比对出现顺序分别公开了如SEQ IDNOS 18,20,22,24,29-33,和659的重链序列,以及如SEQ ID NOS 19,25,21,23和660的轻链序列。图17B显示克隆12.0(标记为“亲本”)与其他人源化变体(标记为VH1-3、和VK1-3)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17B按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS 2,4,6,8和661的重链序列,以及如SEQ ID NOS 3,5,7,9,和662的轻链序列。图17C显示克隆53.0(标记为“亲本”)与某些人源化变体(标记为VH1-6及VK1-9)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17C按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS 38,40,42,44,46-48,和663的重链序列,以及如SEQ ID NOS39,41,43,45,49-54,和664的轻链序列。图17D显示克隆82.0(标记为“亲本”)与其他人源化变体(标记为VH1-3、和VK1-3)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17D按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS 55,57,59,61,和665的重链序列,以及如SEQ ID NOS 56,58,60,62,和666的轻链序列。图17E显示克隆135.0(标记为“亲本”)与其他人源化变体(标记为VH1-3、和VK1-3)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17E按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS 10,12,14,16和667的重链序列,以及如SEQ ID NOS 11,13,15,17,和668的轻链序列。图17F显示克隆4.0(标记为“亲本”)与某些4D人源化变体(标记为VH4-6、和VK4-7)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17F按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS 19,34-37,和669的轻链序列,以及如SEQ ID NOS 18,27,28,和26的重链序列。图17G显示克隆53.0(标记为“亲本”)与某些4D人源化变体(标记为VH7-10、和VK10-13)的重链(VH)和轻链(VK)可变区的比对。图17G按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS38,63-66,和663的重链序列,以及如SEQ ID NOS 39,67-70,和664的轻链序列。图17A-G中各比对的底部序列代表最接近人类种系的序列。黑框指示CDR区,阴影残基序列与对应种系残基(图17A-E)或对应亲本残基(图17F-G)有所不同,使用IMGT编码及CDR划界。图17H显示克隆4.0,12.0,82.0和135以及抗体克隆5H7和7H5的重链(VH)及轻链(VL)可变区比对。图17H按照比对出现顺序分别公开了如SEQ ID NOS 18,2,38,55,10和670-671的重链序列,以及如SEQ ID NOS 19,3,39,56,11,和672-673的轻链序列。黑框指示CDR区,阴影残基序列与比对中的先前序列有所不同,使用IMGT编码。
图18显示抗体克隆4,12,53,82和135的最小表位残基的边界。对于结合活性至关重要的残基表示为X。图18公开了SEQ ID NOS:18。
图19是显示嵌合克隆4,12,53,82和135以及人源化变体Hu1,Hu2,Hu3在人类CXCR3转染300.19细胞中的抗体结合直方图。抗体是以5μg/ml(黑线),0.5μg/ml(深灰线),or 0.1μg/ml(黑虚线)或5μg/ml单独的二级抗体(填满灰色的直方图)给予,并且将数据绘制为细胞数(横轴)对最大荧光百分比的曲线。
图20A-C显示在10g/ml克隆4,12,53,82和135或商业化克隆1C6的嵌合(chim)或人源化(Hu1,Hu2or Hu3)抗体变体存在或不存在的情况下,对人类CXCR3转染细胞向CXCL9(图20A),CXCL10(图20B)和CXCL1 1(图20C)迁移的抑制百分比(纵轴)。
图21是显示克隆4,12,53,82和135以及商业化克隆1C6的嵌合(chim)或人源化(Hu1,Hu2or Hu3)抗体变体抑制人类CXCR3-Gqi4qi4转染CHO细胞中钙动员能力的曲线图。绘制抗体浓度(横轴)对应最大抑制百分比(纵轴)的曲线。
图22A-D显示抗CXCR3抗体治疗对NOD-scid/L2rγnull(NSG)小鼠中CD3+/CD4+Tcells(图22A),CD3+/CD8+T cells(图22B),CXCR3+/CD3+/CD4+T cells(图22C),and CXCR3+/CD3+/CD8+T cells(图22D)的百分比的效应。HulgGI是指人类IgG1(Herceptin),克隆4,12,53,82和135是指嵌合抗体克隆。
图23A显示克隆12.0的重链和轻链的氨基酸序列。图23B显示克隆12.1的重链和轻链氨基酸序列。图23C显示了克隆12.2的重链和轻链的氨基酸序列。图23D显示克隆12.3的重链和轻链的氨基酸序列。
图24A显示克隆135.0的重链和轻链的氨基酸序列。图24B显示克隆135.1的重链和轻链的氨基酸序列。图24C显示了克隆135.2的重链和轻链的氨基酸序列。图24D显示克隆135.3的重链和轻链的氨基酸序列。
图25A显示克隆4.0的重链和轻链的氨基酸序列。图25B显示克隆4.1的重链和轻链的氨基酸序列。图25C显示了克隆4.2的重链和轻链的氨基酸序列。图25D显示克隆4.3的重链和轻链的氨基酸序列。图25E显示克隆4.4的重链氨基酸序列。图25F显示克隆4.5的重链氨基酸序列。图25G显示克隆4.6的重链氨基酸序列。图25H显示克隆4.7的重链氨基酸序列。图25I显示克隆4.8的重链氨基酸序列。图25J显示克隆4.9的重链氨基酸序列。图25K显示克隆4.10的重链氨基酸序列。图25L显示克隆4.11的重链氨基酸序列。图25M显示克隆4.4的轻链氨基酸序列。图25N显示克隆4.5的轻链氨基酸序列。图25O显示克隆4.6的轻链氨基酸序列。图25P显示克隆4.7的轻链氨基酸序列。
图26A显示克隆53.0的重链和轻链的氨基酸序列。图26B显示克隆53.1的重链和轻链的氨基酸序列。图26C显示了克隆53.2的重链和轻链的氨基酸序列。图26D显示克隆53.3的重链和轻链的氨基酸序列。图26E显示克隆53.4的重链氨基酸序列。图26F显示克隆53.5的重链氨基酸序列。图26G显示克隆53.6的重链氨基酸序列。图26H显示克隆53.4的轻链氨基酸序列。图26I显示克隆53.5的轻链氨基酸序列。图26J显示克隆53.6的轻链氨基酸序列。图26K显示克隆53.7的轻链氨基酸序列。图26L显示克隆53.8的轻链氨基酸序列。图26M显示克隆53.9的轻链氨基酸序列。图26N显示克隆53.7的重链氨基酸序列。图26O显示克隆53.8的重链氨基酸序列。图26P显示克隆53.9的重链氨基酸序列。图26Q显示克隆53.10的重链氨基酸序列。图26R显示克隆53.10的轻链氨基酸序列。图26S显示克隆53.11的轻链氨基酸序列。图26T显示克隆53.12的轻链氨基酸序列。图26U显示克隆53.13的轻链氨基酸序列。
图27A显示克隆82.0的重链和轻链的氨基酸序列。图27B显示克隆82.1的重链和轻链的氨基酸序列。图27C显示了克隆82.2的重链和轻链的氨基酸序列。图27D显示克隆82.3的重链和轻链的氨基酸序列。
图28A-P显示克隆12.0-12.3的重链和克隆12.0-12.3的轻链、克隆135.0-135.3的重链和克隆135.0-135.3的轻链、克隆4.0-4.11的重链和克隆4.0-4.11的轻链、克隆53.0-53.6的重链和克隆53.0-53.9的轻链、以及克隆82.0-82.3的重链和克隆82.0-82.3的轻链的核酸序列。
具体实施方式
现在将详细的参考本发明的某些示例性实施例,本发明的某些实施例在附图中予以阐释。
CXCR3
CXCR3(MIM:300574,人类GeneID:2833,趋化因子(C-X-C基序)受体3;亦称之为CD182,CD183,CKR-L2,C KAR3,GPR9,IP10-R,Mig-R,MigR,G蛋白偶联受体9,IP-10受体,SP10受体,Mig受体,趋化因子(C-X-C)受体3,干扰素诱导型蛋白10受体)几乎不存于初始T细胞中,但在经抗原活化后上调且因其一级配体(CXCL9(人类GeneID:4283),CXCL10(人类GeneID;3827),和CXCL11(人类GeneID:6373))将这些细胞募集至组织炎症部位的趋化因子受体。朗格罕氏(Langerhans)岛中的β细胞表达CXCL9和CXCL10(Frigerio等人,NatureMedicine 8:1414-1420(2002))并且那些已经浸润了胰腺的T细胞表达CXCR3(Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:6838-8845;Van Halteren等人,Diabetologia48:75-82(2005);Uno等人2010;Roep等人,Clinical and Experimental Immunology,2003,159:338-343;Tanaka等人,Diabetes 58:2285-2291(2009);Sarkar et aL,Diabetes.2012Feb;61(2):436-46)。
CXCR3在多种有机体中表达,包括例如,人类、小鼠、大鼠、奶牛、黑猩猩、短尾猴、狗、蛙、鸭嘴兽、猪及斑马鱼。表1列出了多种CXCR3在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GeneID及蛋白参考序列。SEQ ID NO:1是人CXCR3的全长序列(剪接变体A)。剪接变体B的肽序列通过参考序列NP_001 136269.1提供。人CXCR3剪接变体A的预测胞外结构域在文献Colvin等人,Mol.Cell.Bio.,26:5838-49(2006)中记载,并且包括SEQ ID NO:1的1-58,1-16,111-126,190-223,278-301位残基,如下文所示:
SEQ ID NO:1NP_001495人类CXCR3,A亚型
1mvlevsdhqvlndaevaall enfsssydyg enesdsccts ppcpqdfslnfdraflpaly
61sllfllgllg ngavaavlls rrtalsstdt fllhlavadt IlvItIplwa vdaavqwvfg
121sglckvagal fninfyagal Ilacisfdry lnivhatqly rrgpparvtl tclavwglcl
181lfalpdfifl sahhderina thcqynfpqv grtalrylql vagfflpIlv maycyahila
241vIlvsrgqrr Iramrlvvvy vvafalcwtp yhlvvivdil mdlgalarnc gresrvdvak
301svtsglgymh cclnpllyaf vgvkfrermw mlllrlgcpn qrglqrqpss srrdsswset
361seasysgl
表1
CXCR3及CXCR10在人类T1D患者中表达。Uno等人,Endocrine J.57:991-996(2010);Roep等人,Clin,and Exp.Immun.159:338-343(2009);Tanaka等人,Diabetes 58:2285-2291(2009)。CXCR10在胰岛的那些剩余能生产胰岛素的β细胞中表达。CXCR3在包围胰岛的入侵性T细胞中表达。已在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠(糖尿病小鼠模型)中再现类似表达模式。orimoto等人,J.immun,173:7017-7024(2004);Li et a!.,World JGastroenterol,11(30):4750-4752(2005);Sarkar等人.Diabetes,2012Feb;61{2):436~46)。
CXCR3也在某些类型的炎症组织的T细胞中表达,而CXCL9、CXCL10及CXCL11经常是由炎性损伤的局部细胞所产生。因此在一些实施例中公开了破坏CXCR3以进行T1D治疗。
抗体
本文中所用的术语“抗体”是指包含抗原结合位点的并且不论来源、物种起源、产生方法和/或特征的任意多肽,并且涵盖了免疫球蛋白或其抗原结合部分或其片段。作为非限制性示例,术语“抗体”包括人类、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、绵羊及鸡抗体。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、完全人类、骆驼化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变、回复突变(back-mutated)及CDR-移植抗体。本发明的目的,除非另有说明,还包括抗体片段,例如Fab,F(ab')2,Fv,scFv,Fd,dAb,VHH(亦称为纳米抗体,nanobodies),和保留抗原结合功能的其他抗体片段,包括双特异性或多特异性抗体。术语“抗体”也指并不基于免疫球蛋白的抗原结合分子。例如,本领域公知的非免疫球蛋白框架包含小的调节免疫药物(例如,参见美国专利申请公开号第20080181892号和20080227958号,分别于2008年7月31日和2008年9月18日公开)、四连接素(tetranectins),纤维连接蛋白域(fibronectin domains)(例如,AdNectins,参见美国专利申请公开号第2007/0082365号,于2007年4月12日公开)蛋白A、脂质转运蛋白(lipocalin)(例如,参见美国专利第7,118,91号),锚蛋白重复序列和硫氧还蛋白(thioredoxin)。
术语“抗原结合域(antigen-binding domain)”是指抗体分子中所包含的与抗原的部分或全部能特异性结合的或互补的那部分区域。当抗原很大,则抗体仅可以结合至抗原的特定部分。在某些实施例中,CXCR3抗体或抗原结合片段包含至少一个抗原结合域。在一些实施例中,抗体或片段具有多特异性且包含两个或更多个(例如,2个,3个,4个,5个或更多个)抗原结合域,以使得抗体或片段能够与相同或不同表位结合两个或更多个CXCR3分子,或能够以高亲和力结合至CXCR3和至少一个其他抗原。抗体的抗原结合部分可以包含抗体的一个或多个保留了特异性结合至抗原能力的片段。这些片段可包含来自亲本抗体或亲本抗体变体的重链及/轻链可变区。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原分子中负责与抗体的抗原结合域特异性相互作用的部分。抗原结合域可由一个或多个抗体可变区提供。一个抗原结合域可包含至少一个抗体轻链可变区(VL)和至少一个抗体重链可变区(VH)。一个抗原结合域也可仅包含VH或VL。例如,来自骆驼及美洲驼(骆驼科(Camelidae,camelids))的抗体仅包含独特类型的抗体,其仅由重链形成而不含有轻链。这类抗体的抗原结合域是单个结构域,称之为VHH,这类抗体被称之为“骆驼化抗体”或“纳米抗体(nanobodies)”。例如,参见美国专利第5,800,988号和第6,005,079号以及国际申请公开号WO 94/04678和WO 94/25591,其以引用方式并入。
本申请中所公开的抗CXCR3抗体可以通过本领域公知的任何适当方法产生。例如,抗体可包含多克隆抗体或单克隆抗体。制备多克隆抗体的方法被本领域技术人员所熟知(Harlow等人,Antibodies;a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.(1988))。可使用包含CXCR3多肽、其片段(例如,一个或多个细胞外结构域、或N-末端58个氨基酸,或N末端37个氨基酸、或N末端20个氨基酸、或N末端16个氨基酸)、融合蛋白或其变体的免疫原来产生抗CXCR3抗体。
免疫原可以由生产或过度生产CXCR3的细胞产生,这类细胞可以为天然细胞、天然突变细胞或遗传改造细胞。取决于天然多肽的性质(例如,疏水百分比、亲水性百分比、稳定性、净电荷、等电点等),免疫原可以经过修饰或偶联而改变其免疫原性。例如,CXCR3或其一部分可以偶联至载体。偶联可以通过活性化学功能基团衍生,或通过融合蛋白的方法,或本领域技术人员知晓的其他方法形成化学偶联。载体和/或其他免疫原性改良蛋白包括,但并不限于KLH、卵清蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂和混合T辅助肽。
各种佐剂可以与CXCR3免疫原共用以增加免疫反应。佐剂的例子包括,但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物油、凝胶、明矾(氢氧化铝)、表面活性物质,例如,溶血卵磷脂、pluronic多元醇(pluronic polyols)、多价阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanins(KLH)),二硝基酚,和人类佐剂,例如BCG(卡介苗(Bacille Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可以用作佐剂的其他例子包括MPL~TDIv1佐剂(单磷酸基脂质A,合成海藻糖dicorynomycolate(trehalosedicorynornycolate))。免疫方法是本领域所公知的,并且可以通过所选宿主动物诱发的免疫反应的任何方法进行实施。因此,不同给予途径可以根据设计选择在不同时间段内使用。
例如,可以将本申请中示例的免疫原给予各种宿主动物,包括但不限于兔、小鼠、骆驼科动物、大鼠等,以诱导产生含有对CXCR3具有特异性的多克隆抗体血清。免疫原的给予可涉及一次或多次注射免疫剂和,任选地,一种佐剂。在一些实施例中,通过多次皮下或腹腔内注射或肌肉或静脉内将免疫原(有或无佐剂)注射给哺乳动物。在一些实施例中,一旦获得了合适的多克隆制剂后,可以通过已知的分离技术,例如亲和力层析、淘选、吸收等来分离特定的抗体,以获得个体化的抗体株。在一些实施例中,个体化的抗体株经过进一步研究,例如测序获得其一个或多个CDRs的氨基酸序列。
在一些实施例中,CXCR3抗体是单克隆抗体。单克隆抗体包括来源于表达该抗体的单个真核、噬菌体或原核克隆的任意抗体。单克隆抗体可以通过,例如,传统的杂交瘤技术(Kohler及Milstein,Nature 256:495-499(1975)和美国专利号No.4,376,1 10,其以引用方式并入本文中)、重组DNA方式(美国专利号No.4,816,567,其以引用方式并入本文中),或噬菌体展示技术使用抗体文库(Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.MoL Biol.222:581-597(1991))制备。关于其他的各种抗体制备技术,参见Antibodies:ALaboratory Manual,eds.Harlow et a/.,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。其他可用于制备单克隆抗体的方法的例子包括,但并不限于人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人,Immunology Today 4:72(1983);Cole等人,Proc Nati Acad Sci USA 80:2028(1983))以及EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp.77-96,Alan R,Liss(1985))。这些抗体可以属于任意免疫球蛋白类型,包括IgG,IgM,IgE,IgA和IgD及其任何亚类或变体。可以在活体外或活体内培育产生本发明mAb的杂交瘤。
在一些实施例中,可以使用包含CXCR3多肽,其片段(例如,一个或多个胞外结构域,或N端58个氨基酸,或N端37个氨基酸,或N端20个氨基酸,或N端16个氨基酸等)、融合蛋白或其变体的免疫原对宿主动物(例如,兔、小鼠、骆驼科动物、大鼠等)进行免疫以产生能生产单克隆抗体的杂交瘤。产生或能够产生特异性结合至CXCR3的抗体的淋巴细胞从免疫宿主中采集并使用合适的融合剂,例如聚乙二醇将其与骨髓瘤细胞融合,以形成杂交瘤细胞(Coding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,pp.59-103(1986))。
可生成产生单克隆抗体的多个杂交瘤,并且可以选择那些具有有益性质或具有治疗潜质的抗体,所述潜质,例如是通过阻止CXCR3配体与其受体结合。所选抗体可经过进一步修饰以获得或增强其有益性质,例如在活体内具有增强的稳定性、例如,在鉴定出能生产具有期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,可以使用稀释程序对该克隆实施亚选择并通过标准培养方法使其生长(Goding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice,Academic Press,pp.59-103(1986))。适合的培养基包括,例如Duibecco'sModified Eagle's培养基(D-MEM)或RP I-1640培养基。另外,可以使杂交瘤细胞在动物体内作为肿瘤生长。可以分析亚克隆的特异性、亲和力和/或活性,并且选择展示最有益特性的亚克隆用于进一步表征。
本领域存在产生单克隆抗体的多种替代方法,可用这些任意方法产生本文中所公开的抗CXCR3抗体。例如,单克隆抗体可以通过重组DNA方法制备,例如美国专利第4,816,567号中所述,其以整体引入方式并入本文。
编码单克隆抗体的DNA可以使用常用的程序分离并测序(例如,通过使用能够结合至编码鼠类抗体重链和轻链或来自人类、人源化或其他抗体链的基因的寡糖探针)(Innis等人.PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic(1990),andSanger等人,Proc Natl Acad Sci USA 74:5463(1977))。杂交瘤细胞可用于此类DNA的来源。分离后,可将DNA置于表达载体中,将该表达载体转染至原本不能产生免疫球蛋白的宿主细胞,例如大肠杆菌细胞、NSO细胞,COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中,以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。也可以通过以下方式修饰DNA,例如,用人类重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号;Morrison等人,Proc Natl Acad Sci USA 81:6851(1984))或将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价结合至免疫球蛋白编码序列。在一些实施例中,非免疫球蛋白多肽可取代抗体的恒定区,或可取代抗体的一个CXCR3组合位点的可变区,以产生嵌合二价抗体。
在一些实施例中,本文所述的抗体可以经过修饰以产生CDR移植和/或以其他方式人源化的抗体。CDR移植是人源化形式之一,但是也可以使用本领域已知的其他人源化技术。CDR移植程序为本领域技术人员所知晓并且可以基于CDR编号命名,包括IMGT(theinternational Im unoGeneTics information Montpellier,France)、Kabat、Chofhia以及经修改Chothia编号方案。例如,参见imgt.org(汇总IMGT连续编号系统的用途,该系统考虑并组合框架区和互补决定区的定义,来自X射线衍射研究的结构数据和超变环的特点,以提供来自全部物种的所有IG和TR V区的独特编号);Abhinandan和Martin,MoiImmunol,,45:3832-9(2008);也参见Abhinandan和Martin,J,MoL Biol.,369(3):852-62(2007)(记载了嵌合抗体人源化的方法);Retter等人,Nucleic Acids Res.33(数据库期号):D671~4(2005)(描述了可变区基因的VBASE2数据库);以及Johnson和Wu,Int.Immunol,10(12):1801-5(1998)(描述了CDRH3s长度的分布)。
例如,使用IMGT编号系统,保守氨基酸总是具有相同的位置。也对框架区保守位置的疏水氨基酸进行编号,以允许比较位于不同序列中的相同位置的框架氨基酸(及密码子)而无需序列比对。在另一实施例中,Kabat编号系统如下,CDR-H1的约第31个氨基酸(即,第一个半胱氨酸残基后约第9个残基)开始,包括约5-7个氨基酸,并且在下一个酪氨酸残基结束。CDR-H2从CDR-H1结束后第15个残基开始,包含约16-19个氨基酸,并且在下一个精氨酸或赖氨酸处结束。CDR-H3在CDR-H2结束后约第33个氨基酸残基开始,包括3-25个氨基酸,并且在序列W-G-X-G处结束,其中的X是任意氨基酸。CDR-L1开始于第24个残基(即,紧随在半胱氨酸氨基后),包括约10-17个残基,且在下一个酪氨酸残基出结束。CDR-L2在CDR-L1结束后的的16个残基开始并且包括约7个残基。CDR-L3在CDR-L2结束后约第33个残基处开始,包括约7-11个残基并且在序列F-G-X-G处结束,其中X是任意氨基酸。包含上述任意之一CDR的抗体将应用于本发明方法中。
CDR移植抗体可以包含来自人源抗体的重链和轻链可变区序列,其中用来自供体抗体(例如,来自下文描述的结合CXCR3的鼠源抗体)的CDR序列替换VH和/或VL中的一个或多个CDR区。来自人源抗体的框架序列可以用作CDR移植模板。然而,在此框架上进行直链CDR替代可能导致对抗原结合亲和力的一定丧失。人源抗体与原始抗体(例如鼠类抗体)的同源性越高,供体CDR和人源框架结合的可能性越低,这种结合将引起CDR畸变从而降低
亲和力。因此,在一些实施例中,本发明的CDR-移植CXCR3抗体包含与供体鼠源CXCR3中和抗体的可变区框架至少具有65%序列同一性的人源可变框架。产生此类抗体的方法为本领域公知((参见EP 239,400;PCT公开号第WO 91/09967号;美国专利第.5,225,539号;第5,530,101号;第5,585,089号),且包括修饰(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan(1991)Mol.Immunol.28(4/5):489-498;Studnicka等人.(1994)Prot.Engineer.7(6):805-814;及Roguska等人(1994)Proc,Acad.Sci.USA 91:969-973),chain shuffling(U.S.Patent No.5,585,352))和抗独特型抗体。
在一些实施例中,本文所述的抗体可以经过人源化。“人源化抗体”是与预期抗原结合的抗体分子,具有一个或多个来自非人源物种的CDR,具有来自人源免疫球蛋白分子的框架区及/或恒定区。已知的人源Ig序列公开于,例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/ query.fcgiwww.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;及Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)中。可以通过引入人源序列降低免疫原性,或降低、增强或修改结合、亲和力、粘合速度、离解速率、亲合力、特异性、半衰期或本领域公知的任意其他适当特征。可以使用本领域已知的多种技术进行抗体人源化,这些技术记载于例如并不限于,Jones等人.(1986)Nature 321:522;Verhoeyen等人.(1988)Science239:1534;Sims等人.(1993)J.Immunol.151:2296;Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901;Carter等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285;Presta等人.(1993)J.Immunol.151:2623;美国专利第5,589,205号;第565,332号;第6,180,370号;第6,632,927号;第7,241,877号;第7,244,615号;第7,244,832号;第7,262,0505号;以及美国专利公开号第2004/0236078号(于2004年4月30日提出申请),这些文献以整体引入方式并入本文中。
在某些实施例中,人源化或CDR-移植抗体中的框架残基可以采用来自CDR供体抗体的对应残基取代,例如用来自抗CXCR3中和抗体的框架残基取代,从而改变,例如提高抗原结合。参见Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-33(1989年12月)。这些框架取代是通过本领域熟知的方法进行鉴定,例如,通过对CDR和框架残基之间的相互作用建模,鉴别对抗原结合重要的框架残基和序列对比从而鉴别特定位置的不寻常框架残基。参见美国专利第5,585,089号;及Riechmann等人.(1988)Nature 332:323。这些文献以整体引用方式并入本文中。三维免疫球蛋白模型是可获得的并且为本领域技术人员所熟知。电脑程序可以用来阐述和展示所选择的候选免疫球蛋白序列序列可能的三维构象结构,检查这些展示内容允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能的作用,例如分析影响候选免疫球蛋白结合抗原能力的残基。通过这种方式,可以通过一致序列及引入序列选择框架残基以获得具有期望特性的抗体,例如对CXCR3的亲和力增加。
抗体可以经过人源化或CDR-移植,可以使用本领域已知的多种技术手段来鉴别来自于CDR-供体可用于改良抗原结合的框架残基,这类技术例如但是并不限制于,记载于以下文献中:Jones等人.(1986)Nature 321:522;Verhoeyen等人.(1988)Science 239:1534;Sims等人.(1993)J.Immunol.151:2298;Chothia和Lesk(1987)J,Mol.Biol.198:901;Carter等人.(1992)Proa Natl.Acad.Sci.USA 89:4285;Presta等人.(1993)J.Immunol.151:2823;及美国专利号第5,565,332号;第5,723,323号;第5,976,862号;第5,824,514号;第5,817,483号;第5,814,476号;第5,763,192号;第5,723,323号;第5,766,886号;第5,714,352号;第6,204,023号;第6,180,370号;第5,693,762号;第5,530,101号;第5,585,089号;第5,225,539号;和第4,816,567号。在一些实施例中,使用4D人源化来制备本发明中的抗体变体(例如,制备克隆4的人源化变体,包含重链4.4-4.6任一者和轻链4.4-4.7任一者)。用于4D人源化的方法,参见WO2009/032661(其以整体引用方式并入本文中),例如第[0037]-[0044]段。简言之,4D人源化可以包含:a)构建将进行人源化的可变区的3D模型;b)使用可变区3D模型的分子动力学模拟鉴别该区中的挠性残基;c)通过比较3D模型的分子动力学轨迹与49个人类种系的分子动力学轨迹来鉴别最接近的人源种系;以及d)将非CDR部分的挠性残基突变为人源种系对应部分(如步骤c中的鉴别)。
在一些实施例中,经CDR-移植和/或以其他方式人源化的抗体可以包含克隆4、12、53,82,和135的CDR移植和/或人源化抗体。例如,可以将来自于克隆4、12、53,82,和135中任一种的对应重链和轻链(例如,克隆4重链和克隆4轻链)结合至人源恒定区以形成嵌合抗体。嵌合抗体可以通过将框架或CDR中一个或多个的氨基酸改变为对应的人类残基来进一步实现人源化。同样,在一些实施例中,可以将来自于克隆4,12,53.82,和135中任一种和克隆4,12,53,82,和135变体中任一种的6个重、轻链CDR区(例如,克隆4重链CDR1、CDR2、CDR3,以及克隆4轻链CDR1、CDR2、CDR3)可以亚克隆至人源框架和/或恒定区中以形成人源化抗体。人源化可包括使用人源可变区,不包括CDR的氨基酸和/或任何游标位(Vernierposition)残基。人源化抗体也可包括进一步的回复突变变化,该变化位点位于CDR的4个氨基酸残基内和/或使用例如基于IMGT的建模鉴别为原始抗体序列与人源序列之间“极为不同”的位置处。可在框架或CDR中引入进一步的突变以增强抗体的稳定性或治疗有效性。例如通过引入突变以去除克隆4VH CDR2的58位和59位(IMGT编号)的脱酰胺位点。
例如,本发明中所公开的抗体、嵌合抗体、人源化抗体可包含来自克隆4,12,53,82,和135中任一个及其嵌合或人源化变体的6个CDR和/或重链和轻链可变区。例如,能结合CXCR3的抗体或片段可包含来自重链4.0-4.11,重链12.0-12.3,重链53.0-53.10,重链82.0-82.3,和重链135.0-135.3中任一者的3个CDR。类似地,抗体或片段可包含来自轻链4.0-4.7,轻链12.0-12.3,轻链53.0-53.13,轻链82.0-82.3,和轻链135.0-135.3中任一者的3个CDR。在一些实施例中,重链和轻链CDR是来自相同克隆,但也可来自该克隆的不同变体(例如,来自重链4.1的三个CDR,其与来自轻链4.2的三个CDR配对)。重链和轻链4.0,12.0,82.0,和135.0是指小鼠抗体克隆和嵌合抗体中的可变区(其中这些抗体包含小鼠可变区和人源框架区)。其余重链和轻链是指表11中所示的人源化链。
在一些实施例中,能够结合CXCR3的抗体或片段可包含重链4.0-4.11,重链12.0-12.3,重链53.0-53.10,重链82.0-82.3,和重链135.0-135.3中的任一种。类似地,抗体或片段可以包含轻链4.0-4.7,轻链12.0-12.3,轻链53,0-53.13,轻链82.0-82.3,和轻链135.0-135.3中的任一种。
在一些实施例中,重链和轻链经过选择以使得来自特定克隆的重链的3个CDR(例如,来自克隆4重链的CDR)与来自该克隆的任一轻链的3个CDR(例如,来自克隆4轻链的CDR)配对。在一些实施例中,重链和轻链经过选择以使得来自特定克隆的重链(例如,克隆4重链)与该克隆的任一轻链(例如,克隆4轻链)配对。
在一些实施例中,来自重链可变区4,0-4.11中任一者的3个CDR与来自轻链可变区4.0-4.7中任一者的3个CDR配对;来自重链可变区12.0-12.3中任一者的3个CDR与来自轻链可变区12.0-12.3中任一者的3个CDR配对;来自重链可变区53.0-53.10中任一者的3个CDR与来自轻链可变区53.0-53,13中任一者的3个CDR配对;来自重链可变区82.0-82.3中任一者的3个CDR与来自轻链可变区82.0-82.3中任一者的3个CDR配对;来自重链可变区135.0-135.3中任一者的3个CDR与来自轻链可变区135.0-135.3中任一者的3个CDR配对。
在一些实施例中,重链可变区4.0-4.11中任一者可与轻链可变区4.0-4.7中任一者配对,重链可变区12.0-12.3中任一者可与轻链可变区12.0-12.3中任一者配对,重链可变区53.0-53,10中任一者可与轻链可变区53.0-53,13中任一者配对,重链可变区82.0-82.3中任一者可与轻链可变区82.0-82.3中任一者配对,或者重链可变区135.0-135.3中任一者可与轻链可变区135.0-135.3中任一者配对。
某些重链和轻链可变区的比对见图17中。在一些实施例中,本发明所公开的抗体可包含如表2中所示的经配对的重链和轻链可变区(Ch=嵌合,Hu=人源化,VH=重链,VK–轻链)。例如,表2中的第一条目表示包含重链4.0和轻链4.0的克隆4变体。第二条目表示包含重链4.1和轻链4.1的克隆4变体。也向包含所示重链和轻链序列的各抗体指配表2第二栏中的抗体标记符。例如,向表中第一条目(包含重链4.0和轻链4.0)指配抗体标记符4Ch,而向表中第二抗体(包含重链4.1和轻链4.1)指配标记符4Hu1。
表2
克隆 抗体 重链 VH SEQ ID NO 轻链 VK SEQ ID NO
克隆4 4Ch VH 18 VK 19
克隆4 4Hu1 VH1 20 VK1 21
克隆4 4Hu2 VH2 22 VK2 23
克隆4 4Hu3 VH3 24 VK3 25
克隆4 4Hu4 VH2 22 VK3 25
克隆4 4Hu5 VH3 24 VK2 23
克隆4 4Hu6 VH4 26 VK4 34
克隆4 4Hu7 VH4 26 VK7 37
克隆4 4Hu8 VH5 27 VK5 35
克隆4 4Hu9 VH5 27 VK6 36
克隆4 4Hu10 VH6 28 VK4 34
克隆4 4Hu11 VH2 22 VK1 21
克隆4 4Hu12 VH1 20 VK2 23
克隆4 4Hu13 VH3 24 VK1 21
克隆4 4Hu14 VH1 20 VK3 25
克隆4 4Hu15 VH7 29 VK2 23
克隆4 4Hu16 VH8 30 VK2 23
克隆4 4Hu17 VH9 31 VK2 23
克隆4 4Hu18 VH10 32 VK2 23
克隆4 4Hu19 VH11 33 VK2 23
克隆12 12Ch VH 2 VK 3
克隆12 12Hu1 VH1 4 VK1 5
克隆12 12Hu2 VH2 6 VK2 7
克隆12 12Hu3 VH3 8 VK3 9
克隆82 82Ch VH 55 VK 56
克隆82 82Hu1 VH1 57 VK1 58
克隆82 82Hu2 VH2 59 VK2 60
克隆82 82Hu3 VH3 61 VK3 62
克隆135 135Ch VH 10 VK 11
克隆135 135Hu1 VH1 12 VK1 13
克隆135 135Hu2 VH2 14 VK2 15
克隆135 135Hu3 VH3 16 VK3 17
克隆53 53Ch VH 38 VK 39
克隆53 53Hu1 VH1 40 VK1 41
克隆53 53Hu2 VH2 42 VK2 43
克隆53 53Hu3 VH3 44 VK3 45
克隆53 53Hu4 VH1 40 VK2 43
克隆53 53Hu5 VH2 42 VK1 41
克隆53 53Hu6 VH2 42 VK4 49
克隆53 53Hu7 VH2 42 VK5 50
克隆53 53Hu8 VH2 42 VK6 51
克隆53 53Hu9 VH2 42 VK7 52
克隆53 53Hu10 VH2 42 VK8 53
克隆53 53Hu11 VH2 42 VK9 54
克隆53 53Hu12 VH4 46 VK2 43
克隆53 53Hu13 VH5 47 VK2 43
克隆53 53Hu14 VH6 48 VK2 43
克隆53 53Hu15 VH1 40 VK4 49
克隆53 53Hu16 VH1 40 VK6 51
克隆53 53Hu17 VH6 48 VK4 49
克隆53 53Hu18 VH6 48 VK6 51
克隆53 53Hu19 VH7 63 VK10 67
克隆53 53Hu20 VH7 63 VK11 68
术语“特异性相互作用”或“特异性结合”或类似的术语,是指两个分子在生理条件下形成相对稳定的复合物。特异性结合的特点在于高亲和力和低至中等容量。非特异性结合通常具有低亲和力与中至高等容量。通常,当亲和力常数Ka高于106M-1或较佳高于108M-1时,认为结合是特异性的。在一些实施例中,抗体、其变体和其片段以至少106,107,108,109M-1或更高的结合常数结合其抗原。在一些实施例中,抗体、其变体或其片段以至少表7A-B、8-10和/或12中的任意一者的所示结合动力学结合CXCR3。若需要,可通过改变结合条件降低非特异性结合而不会从实质上影响特异性结合。这类条件为本领域已知,并且本领域技术人员使用常规技术可以选择合适的条件。通常根据以下方面定义条件:抗体浓度、溶液离子强度、温度、结合允许时间、阻断分子(例如血清白蛋白和乳酪蛋白)的浓度。
在一些实施例中公开了抗CXCR3抗体可以中和CXCR3。“CXCR3中和抗体”与CXCR3结合并阻断受体的活性,例如因CXCR3配体与CXCR3结合所产生的典型生理和遗传反应。中和活性可为完全(100%中和)或部分,例如,约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95(或其间的任意百分数)或更高中和,这取决于本领域技术人员所知晓的各种因素,例如抗体浓度、亲和力和表位,以及用于评估中和活性的特定分析。CXCR3中和抗体的中和活性可以通过分析测量例如配体结合、GTP结合、钙动员、细胞趋化性和/或受体内在化的抑制来表示。诸多用于测定中和抗体尤其是CXCR3中和抗体活性的分析为本领域技术人员所已知并且可以容易地应用从而证实特定抗体具有中和性。
例如,在一些实施例中,用于本发明方法中的抗体的中和活性可以通过趋化性分析评价,实质上如前所述的由克隆49801产生并且由R&D 出售的抗体(目录编号为MAB160)的包装插页中所述。中和剂量-50(ND50)定义为以特定rhl-TAC浓度在反应细胞系中产生细胞表面CXCR3介导rhl-TAC反应的一半最大抑制所需的抗体浓度。为测量抗体阻断rhl-TAC诱导的hCXCR3转染BaF/3细胞的趋化性的能力,将7ng/mL rhl-TAC添加至96孔趋化性室(euroProbe,Cabin John,MD)的下方室中。然后使用无PVP聚碳酸酯过滤器(5μ孔径)组装趋化性室。将抗体连续稀释液(例如,从0.001至10000μg/mL)及0.25x 106个细胞/孔添加到室的顶孔中。在37℃下于5%C02加湿培育器中培育3小时后,拆卸该室,将迁移经过至下室的细胞转移到工作板并使用例如刃刀青荧光进行量化。
Colvin等人,Mol.Cell.Bio.,26:5838-49(2006)文献中记载了可以在某些实施例中用于测定用于本发明的中和CXCR3抗体中和活性的其他分析。简言之,可使用300-19细胞,即功能性表达CXCR4的鼠源性前B细胞白血病细胞系。在转染后,该细胞系可以功能性地表达其它趋化因子受体,例如,人类CXCR3(例如参见美国专利申请公开号第2010/0061983号的第201-209段,其以引用方式并入)。可使表达人源CXCR3的300-19细胞在含有10%胎牛血清(FBS)的完全RPMI培养基上生长。为了评估在候选中和CXCR3抗体存在情况下CXCR3配体与CXCR3的结合,将400,000个CXCR3/300-19细胞于150μl总体积的结合缓冲液(0.5%BSA,5mM gCl2,1mM CaCl2,50mM HEPES,pH 7.4)中置于96孔板组织培养板中。可将总共0.04nM经125I标记的CXCL10(New England Nuclear,Boston,MA)或CXCL11(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)以及5x 106nM-500nM未经标记的CXCL10或CXCL11(Peprotech,Rocky Hill,NJ)添加至细胞中并且在室温下于振荡的同时孵育90min。细胞转移至用0.3%聚乙烯亚胺预浸润的96孔过滤板(Millipore,Billerica,MA)中,用补充有0.5M NaCl的200μΙ结合缓冲液洗涤三次。将板干燥,在添加闪烁流体后在WaNac Microbeta闪烁计数器(Perkin-Elmer Life Sciences,Boston,MA)中测定放射性。可以用于CXCR10和11的类似方法评价与CXCR9的结合。
在某些实施例中,在此公开的抗体能够预防或减少钙流入CXCR3表达细胞中。在一些实施例中,可以在诸如CXCR3/300-19的细胞中检测钙流动。在含有1%BSA的2ml RPMI培养液中悬浮约5x 106个细胞。添加15微克Fura-2(Molecular Probes,Eugene,OR)并且将细胞在37℃培育20min。在PBS中洗涤细胞两次并且再次悬浮于2ml钙流动缓冲液(145mMNaCl,4mM KCl,1mM NaHP04,1.8mM CaCl2,25mM HEPES,0.8mM MgCl2,and 22mM葡萄糖)中。37℃条件下在DeitaRAM荧光计(Photon Technology International,Lawrenceville,NJ)中测量荧光读数。在添加趋化因子(例如,CXCR9、10或11)之前或之后,将胞内钙浓度记录为在340-380nm依次刺激下在510nm发射的刺激荧光强度,表示为340nm的荧光与380nm荧光的相对比。
在某些实施例中,CXCR3中和可以通过测量受体内在化的降低来进行评估。在一些实施例中,受体内在化分析可以通过37℃条件下将约2.5x 105个细胞(例如CXCR3、300-19细胞)在含有1%BSA和不同浓度的CXCR10、CXCR11或CXCR9的RPMI培养基中孵育30min来实施。然后可以采用冰冷荧光活化细胞分选物缓冲液洗涤细胞并且随后使用PE偶联CXCR3抗体分析CXCR3的表面表达。
用于评价中和活性的其他分析公开于,例如美国专利第7,405,275号的实施例2-4中,这些实施例以引用方式并入。
通过上面所述的分析进行评价,在某些实施例中,中和CXCR3抗体的ND50可以为约0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,40,50,or100μg/mL。在特定实施例中,ND50可以为0.5-12μg/mL,在更特定实施例中为1-6μg/mL。
本文中公开的经分离的CXCR3抗体可以包括那些特异性结合CXCR3表位的抗体。例如,用于本发明的抗体可以结合包含选自SEQ ID NO:1的残基1-58、1-16或1-37序列的全部或部分(例如,至少5,6,8,10,12,14,15,16,18,或20个残基的片段)的肽。在一些实施例中,在此所公开的抗体包括那些结合图18中所鉴别的一个或多个表位的抗体。在一些实施例中,抗CXCR3抗体可包含结合至包含SDHQVLNDAE(SEQ ID NO:71)的CXCR3表位的抗体。在一些实施例中,表位包含SDHQVLND(SEQ ID NO:72),DHQVLND(SEQ ID NO:73),和/或VLNDAE(SEQ ID NO:74)。在某些实施例中,表位包含序列VLND(SEQ ID NO:75)。在一些实施例中,表位包含序列XDXXVXNDXX(SEQ ID NO:76),其中X是指任意氨基酸。在一些实施例中,表位包含XDXXVXND(SEQ ID NO:77),DXXVXND(SEQ ID NO:78),和/或VXNDXX(SEQ ID NO:79),其中X是指任意氨基酸。在某些实施例中,表位包含序列VXND(SEQ ID NO:80),其中X是指任意氨基酸。
抗CXCR3抗体可以对来自不同物种的CXCR3序列具有泛特异性(pan-specific)或针对来自特定物种或特定CXCR3同种型的CXCR3序列具有选择性。在特定实施例中,CXCR3抗体对所投与的个体物种具有特异性。因此,在一些实施例中,CXCR3抗体可对人源CXCR3序列具有特异性(例如,能够结合包含与上文所列出的SEQ ID NO:1的任一亚序列同源的序列多肽)。同源序列由本领域技术人员通过诸如蛋白序列比对(例如BLASTp,ClustalW等)手段容易鉴别。在特定实施例中,用于本发明中的抗体结合至包含序列的整个长度或至少10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,或70个残基(或其间任意值)的窗口内与SEQ ID NO:1具有至少90,95.或99%(或其间任意百分比)的类似或一致的肽。在一些实施例中,抗体能够结合与上述一个表位具有至少80,85,90,95,或99%(或其间任意百分比)的类似或一致的表位(亦参见图18)。
在此公开的特定抗体包括,例如抗体克隆(Cl)12,C1 135,Cl 82,Cl 53,和Cl 4,以及其嵌合和人源化变体。
在一些实施例中,在此公开的抗体相对于本领域已知的抗体展示出某些经改良的性质,这些本领域已知的抗体包括抗5H7和7H5(公开于例如美国专利号第7,405,275号;抗体的CDRs公开于表1和2以及参考序列表中,其以引入方式并入);V44D7(记载于国际公开号WO 2008/094942),1C6(记载于美国专利号第7,407,655号;其中表位的定位在实施例8和9中记载,其以引用方式并入),以及49801,由R&D Systems以目录编号MAB160出售。
在一些实施例中,在此公开的抗体克隆(克隆4,12,53,82,和135以及它们的嵌合和人源化对应部分)相对于已知抗体5H7,7H5,V44D7,1C6和49801展示某些令人惊讶的益处。例如,在此所公开的克隆与抗hCXCR3克隆5H7,7H5,V44D7,1C6和49801比较展示出增加的结合亲和力。在此所公开的人源化克隆与小鼠来源的抗-hCXCR3克隆5H7,7H5,V44D7,1C8,和49801比较也具有减少的免疫原性。另外,在此所公开的抗体(例如那些包含克隆4.7-4.11的重链)已通过在58位和59位(使用IMGT编号)去除脱酰胺位点进行修饰以最佳化从而增强稳定性。在一些实施例中,在此所公开的抗体保留CXCR3中和活性。
在某些实施例中,在此所公开的抗体或片段可包含VH和/或VL CDR序列,该序列与抗体C1 12,Cl 135,Cl 82,Cl 53,和Cl 4中任一者或其嵌合或人源化变体的VH和/或VL的CDR序列具有约80-100%(例如,约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%)一致(例如,与Cl 12中的6个CDR或与Cl 12.1中的6个CDR等等具有80-100%一致)。在一些实施例中,抗体或片段可包含VH和/或VL CDR序列,该序列相对于抗体Cl 12,C1 135,Cl82,Cl 53,和Cl 4中任一个的VH和/或VL CDR序列含有1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,或10个氨基酸取代(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)。
在此所用的术语“百分比序列一致性”或“同源性”定义为在对序列进行比对和引入缺口,如果需要,以达成最大百分比序列一致性并且不包括保守核酸取代后,候选序列与参照序列中的氨基酸残基或核苷酸一致的氨基酸残基或核苷酸百分比。用于比较序列的最佳比对可以以手工方式外,还可以通过本领域已知的局部同源性算法或通过使用这些算法的电脑程式(例如,BLAST P)产生。
在一些实施例中,在此所公开的经分离的CXCR3抗体或抗原结合片段包含VH氨基酸序列,该VH氨基酸序列包含与重链4.0-4,11,重链12,0-12.3,重链53.0-53.10,重链82.0-82.3,和重链135.0-135.3中任一种的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%(或其间的任意百分比)一致性。在某些实施例中,抗体或片段包含在重链4.0-4.11,重链12.0-12.3,重链53.0-53.10,重链82.0-82.3,和重链135.0-135.3中的任一序列的氨基酸序列中具有1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,或10个突变(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)的VH氨基酸序列。如本文所用,“保守取代”是指用不实质上改变抗体或片段的化学、物理和/或功能性能(例如,抗体或片段保留相同电荷、结构、极性、疏水性/亲水性和/或保持功能,例如识别、结合、和/或中和CXCR3其活性的能力)的第二氨基酸取代第一氨基酸。
在某些实施例中,在此公开的经分离的CXCR3抗体或抗原结合片段包含VL氨基酸序列,该VL氨基酸序列与轻链4.0-4.7,轻链12.0-12.3,轻链53.0-53.13,轻链82.0-82,3,以及轻链135.0-135.3中任一条的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%(或其间的任意百分比)一致性。在各个实施例中,抗体或片段包含与轻链4.0-4,7,轻链12.0-12.3,轻链53.0-53.13,轻链82.0-82.3,和轻链135.0-135.3中任一条的氨基酸序列具有1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,或10个突变(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)的VL氨基酸序列。
在某些实施例中,在此所公开的经分离的CXCR3抗体或抗原结合片段包含重链可变区,该重链可变区包含与重链4.0-4.11,重链12.0-12.3,重链53.0-53.10,重链82.0-82.3,和重链135.0-135.3中的任一条的氨基酸序列具有至少80%一致性;还包含轻链可变区,其轻链可变区包含与轻链4.0-4.7,轻链12.0-12.3,轻链53.0-53.13,轻链82.0-82.3,和轻链135.0-135.3中的任一条的氨基酸序列具有至少80%一致性。在一些实施例中,重链和轻链经过选择以使得来自特定克隆的重链(例如,克隆4重链)和该克隆的任一轻链(例如,克隆4轻链)配对。在一些实施例中,重链和轻链如表2中所示配对。在其他实施例中,包含所公开的VH和/或VL序列的抗体或片段保留中和CXCR3活性的能力。
在一些实施例中,在此所公开的抗体是Cl 12,135,82,53,和/或4的人源化变体。在其他实施例中,抗体是完全人源的。在某些实施例中,抗体是选自克隆12,135,82,53,和4抗体的人源化或完全人源衍生物。在一些实施例中,抗体的亲和力常数是至少108Μ-1(例如至少108Μ-1,至少109Μ-1,至少1010Μ-1,或至少1011Μ-1或其间的任意值)。在一些实施例,抗体能够与CXCR3全部亚型结合。在某些实施例中,抗体能够与CXCR3的A和B亚型结合。在一些实施例中,抗体不结合CXCR3的B亚型。
在一些实施例中,经分离的CXCR3抗体或抗原结合片段包含VH CDR1,VH CDR2,VHCDR3,VL CDR1,VL CDR2和/或VL CDR3,上述CDR包含与来自克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VH和VL CDR序列约90%-100%(例如,约90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%)一致的氨基酸序列。在一些实施例中,经分离的CXCR3抗体或抗原结合片段包含VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2和/或VL CDR3,上述CDR包含与来自克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VH和VL CDR序列一致或相对于该序列包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基突变(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)的氨基酸序列。
在一些实施例中,抗CXCR3抗体或片段包含具有三个CDR的重链(重链CDR1,CDR2,和CDR3)以及具有三个CDR的轻链(轻链CDR1,CDR2,和CDR3)。在一些实施例中,VH CDR1相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VH CDR1序列具有1个、2个或3个氨基酸突变。在一些实施例中,VH CDR2相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VH CDR2序列具有1个、2个或3个氨基酸突变。VH CDR3相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VH CDR3序列具有1个、2个或3个氨基酸突变。VL CDR1相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VL CDR1序列具有1个、2个或3个氨基酸突变。VL CDR2相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VL CDR2序列具有1个、2个或3个氨基酸突变。VL CDR3相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VL CDR3序列具有1个、2个或3个氨基酸突变。在某些实施例中,重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3是来自克隆12,135,82,53,和4或其嵌合/人源化变体中任一种的CDR,或相对于选自抗体克隆或其嵌合/人源化变体中任一种的CDR包含1-3个氨基酸突变。在一些实施例中,突变是在图17A-H所示的比对中所示突出显示位置处。在一些实施例中,突变是位于克隆4.0-4,11中任一种的VH CDR2的第58和59位点中的一个位点或者多个位点。
在一些实施例中,抗CXCR3抗体或片段包含重链和轻链。在一些实施例中,重链与重链4.0-4.11,重链12,0-12.3,重链53.0-53.10,重链82.0-82,3,和重链135.0-135.3中任一种具有至少约90%一致性(例如,至少约90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99%一致或其间的任何百分比),或相对于上述重链中任一种具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸突变。在一些实施例中,轻链与轻链4.0-4.7,轻链12,0-12.3,轻链53.0-53.13,轻链82.0-82,3,和轻链135,0-135,3中的任一个至少90%一致性(例如,至少约90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99%一致或其间的任何百分比),或相对于上述轻链中的任一个具有1个、2个,3个,4个,5个,6个,7个.8个,9个,或10个氨基酸突变。在一些实施例中,重链与重链4.0-4.11,重链12.0-12.3,重链53,0-53.10,重链82.0-82.3,和重链135.0-135.3中的任一种至少约90%一致(例如,至少约90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99%一致或之间的任何百分比)或相对于上述重链中的任一种具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸突变,和/或轻链与轻链4.0-4,7,轻链12.0-12.3,轻链53,0-53.13,轻链82.0-82.3,轻链135.0-135.3中的任一种至少约90%一致(例如,至少约90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99%一致或之间的任何百分比)或相对于上述轻链中的任一种具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸突变。在一些实施例中,突变是在图17A-H的比对所示位置处。
在某些实施例中,包含上文所公开VH和/或VL CDR序列的经分离CXCR3抗体或抗原结合片段保留CXCR3中和活性。
在各个实施例中,CXCR3抗体或片段的重链和轻链可变区可包含至少一个框架区(例如,FR1,FR2,FR3,和FR4中的至少一个)。将重链的框架区命名为VH FR,而将轻链框架区命名为VL FR。在某些实施例中,框架区可含有取代、插入或其他改变。在某些实施例中,这些改变可使抗体的结合亲和力改良或最佳化。可修饰的框架区残基的非限制性实例包括直接非共价结合CXCR3、与CDR的构象相互作用或影响该构象和/或参与VL-VH界面。
在某些实施例中,CXCR3抗体或片段的重链(VH)可以包含FR1,FR2,FR3和/或FR4,这些FR1,FR2,FR3和/或FR4的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VH框架区约80%-100%一致(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%,或其间的任意百分比)。在某些实施例中,CXCR3抗体或片段可包含至少一个VH FR(FR1,FR2,FR3和/或FR4),这些VH FR的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸突变(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)。
在某些实施例中,CXCR3抗体或片段的轻链(VL)可包含FR1,FR2,FR3和/或FR4,这些FR1,FR2,FR3和/或FR4的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的VL框架区约80%-100%一致(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%,或其间的任意百分比)。在某些实施例中,CXCR3抗体或片段可包含至少一个VL FR(FR1,FR2,FR3和/或FR4),这些VL FR的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸突变(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)。
在某些实施例中,CXCR抗体或片段包含VH FR区(FR1,FR2,FR3和/或FR4),这些VHFR区的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的对应的VHFR区一致或相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的对应的VH FR区含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸突变;并且包含VL FR区(FR1,FR2,FR3和/或FR4),这些VL FR区的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的对应的VL FR区一致或相对于克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的对应的VL FR区含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸突变。在某些实施例中,CXCR3抗体或片段包含氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的对应的VH FR区约80-100%一致的VH FR区(FR1,FR2,FR3和/或FR4),并且包含VL FR区(FR1,FR2,FR3和/或FR4),这些VL FR区的氨基酸序列与克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的对应的VL FR区约80-100%一致的VL FR区(FR1,FR2,FR3和/或FR4)。
本文所公开的CDR和FR区可以通过多种组合方式进行组合,因为对于给定抗体,各个CDR或FR区可以独立的选择并与任一个其他的CDR或FR区组合。在某些实施例中,VH和/或VL CDR和FR序列可以在任一个保留了中和CXCR3活性的抗体或片段的组合中存在。
在此所公开的抗体或片段,包含一个或多个不实质上改变本文所述氨基酸序列的氨基酸。实质上相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代和不损害抗体或片段中和CXCR3活性能力的氨基酸缺失和/或插入的序列。
本文中所公开的抗体和片段可以进一步偶联一个或多个其他分子。例如,偶联可以包含直接或者经过接连体结合到一种或多种治疗剂、增溶剂、稳定剂、免疫抑制剂、受体及其片段、抗原结合肽和/或其他配体靶向基团。在一些实施例中,治疗剂是可以用于治疗T1D和/或与CXCR3相关的其他病症的药剂。在一些实施例中,抗体或片段是偶联到β细胞刺激剂或胰岛素。
核苷酸序列
除了上文所记载的氨基酸序列外,在某些实施例中,本文还公开了对应于这些氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中,核苷酸序列编码能够中和CXCR3活性的抗体或片段。在某些实施例中,核苷酸序列可以用于制备在细胞中表达(例如,在哺乳动物细胞中表达)抗CXCR3抗体的表达载体。
在某些实施例中,在此还公开了实质上与这些在此公开的氨基酸编码序列一致的核苷酸序列。实质上一致的序列可以为多态序列,即群体中的替代序列或等位基因。实质上一致的序列也可以包含诱变序列,包括包含沉默突变的序列。突变可以包含改变一个或多个核苷酸残基变化、缺失一个或多个核苷酸残基或插入一个或多个其他的核苷酸残基。实质上一致的序列也可以是因为核苷酸密码子的简并性而包含本文所公开的氨基酸序列中的任何给定氨基酸位置的相同氨基酸的不同核苷酸序列。实质上一致的序列也包括编码保留中和CXCR3的能力的一条或多条抗体的序列。
在某些实施例中,在此还公开了在高度严格或较低严格性杂交条件下与编码CXCR3中和抗体或片段的多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严格性”是指经实施以评估两个核酸间的同源性程度的杂交试验条件(例如,温度和盐浓度);严格性越高,两个核酸间的同源性百分比越高。本文所用术语“杂交”或其语法变换形式是指第一核酸分子在低、中等或高严格性条件下或在核酸合成条件下与第二核酸分子的结合。杂交可以包括其中第一核酸分子结合到第二核酸分子并且第一核酸分子与第二核酸分子互补的情形。
严格杂交条件包括(但并不限于)在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45摄氏度下与过滤器结合的DNA杂交,随后在0.2X SSC/0.1%SDS中在约50-65摄氏度下洗涤一次或多次。其他严格条件包括在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45摄氏度下与过滤器结合的DNA杂交,随后在0.1X SSC/0.1%SDS中在约65摄氏度下洗涤一次或多次。具有已知严格性的其他杂交条件为本领域技术人员所熟知并且包括在本文中。
在某些实施例中,在此所公开了可以编码能够中和CXCR3活性的抗体或片段中的一条或多条链的氨基酸序列的核苷酸,或者在严格条件下与编码抗体或片段中的一条或多条链的氨基酸序列的核苷酸杂交的核酸。
在某些实施例中,在此公开了包含以下核苷酸序列的多核苷酸序列:编码CXCR3中和抗体或片段的VH域的氨基酸序列,并且与编码克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的重链核苷酸序列至少80%-100%一致(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%,或其间的任意百分比)。在某些实施例中,多核苷酸序列可以包含相对于编码克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的重链核苷酸序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个突变(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)的核苷酸序列。
在某些实施例中,在此公开包含以下核苷酸序列的多核苷酸序列:编码CXCR3中和抗体或片段的VL氨基酸序列,并且与编码克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的轻链核苷酸序列至少80%-100%一致(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%,或其间的任意百分比)。在某些实施例中,多核苷酸序列可以包含相对于编码克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的轻链核苷酸序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个突变(包括添加、缺失和取代,例如保守取代)的核苷酸序列。
在特定实施例中,在此公开了包含以下核苷酸序列的多核苷酸:与VH氨基酸序列至少约80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%一致(或其间的任意百分比)并且与VL氨基酸序列至少约80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%一致(或其间的任意百分比),其中这些核苷酸序列编码来自克隆12,135,82,53,和4以及嵌合和人源化变体中任一种的重链和轻链氨基酸序列。
所公开的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法获得。例如,如果已知抗体的核苷酸序列,可以将化学合成的寡核苷酸组装为编码抗体的多核苷酸。这将涉及到,例如,合成含有编码抗体序列部分的重叠寡核苷酸,使这些寡核苷酸退火并将其连接,以及随后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。公开的多核苷酸也可以通过任何其他的合适核酸来源产生,这些来源是例如,抗体cDNA文库,或表达抗体的任意组织或细胞(例如,经选择以表达抗体杂交瘤细胞)分离的cDNA文库。
在一些实施例中,可以将公开的任一多核苷酸整合入表达载体中。本领域已知在人类和动物细胞中表达的适宜载体。在一些实施例中,提供包含载体的宿主细胞。适宜的宿主细胞包括(例如)CHO、COS、SF9,和/或其他人类或非人类细胞系。在一些实施例中,宿主细胞在培养基中培养时,在载体上瞬时或稳定表达核酸,藉此提供产生本文所公开的抗体或片段的方法。
药物组合物
药物组合物可以包含本文所公开的任一抗体或其片段。本文还公开了包含编码抗体或其片段的核酸的药物组合物,这些核酸是(例如)用于基因疗法和/或用在宿主细胞(例如CHO,COS,SF9,和/或其他人类或非人类细胞系中)瞬时或稳定表达以产生蛋白或其片段。
在此所公开的药物组合物可包含药学上可接受载体和/或至少一种添加剂,例如溶剂、填充剂、膨胀剂、崩解剂、缓冲剂或稳定剂。标准的药学调配技术为本领域技术人员所熟知(例如,参见2005Physicians1Desk Thomson Healthcare:Montvale,J,2004;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Gennado等人,Eds.Lippincoft Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。合适的药物添加剂包括,例如甘露醇、淀粉、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、滑石粉(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、云母(talc)、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。在某些实施例中,药物组合物也可以含有pH缓冲试剂和润湿剂或乳化剂(例如,磷酸盐缓冲盐水、注射用无菌盐水等)。在其他实施例中,组合物可以含有防腐剂或其他稳定剂。
在一些实施例中,包含本文公开的任一抗体或其片段、或编码抗体或片段的核酸的药物组合物可进一步包含以下中的一种或多种:甘露醇、聚山梨醇酯80、七水磷酸氢二钠和一水磷酸二氢钠。在另一个实施例中,药物组合物可含有10mM组氨酸(pH 6.5)和最多2%甘氨酸、最多2%甘露醇和最多0.01%聚山梨醇酯80。
药物组合物的调配可以根据预定的给予途径和其他参数进行变化(例如,参见Rowe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,4th ed.,APhAPublications,2003.)。在一些实施例中,药物组合物可以是冻干饼或粉末。药物组合物可以进行重构以通过静脉内注射给予,例如利用无菌注射水,USP。在其他实施例中,组合物可以是无菌的、非致热溶液。
在此记载的药物组合物可包含所公开的抗体或其片段、或编码抗体或片段的核酸作为唯一活性化合物,或者该药物组合物可以包含与另一化合物、组合物或生物材料的组合。例如,药物组合物也可包含一种或多种可以用于治疗与CXCR3相关的疾病或病症(例如T1D)的小分子或其他药剂。在一些实施例中,药物组合物可包含β细胞刺激剂、胰岛素和/或产生胰岛素的细胞。在一些实施例中,药物组合物也可包含一种或多种免疫抑制剂、mTOR抑制剂或自噬抑制剂。免疫抑制剂的实例包括雷帕霉素和velcade,。雷帕霉素也是mTOR抑制剂。
给予和剂量
在一些实施例中,提供治疗患有与CXCR3相关的疾病或异常的患者的方法,其包括给予患者本文中所公开的一种或多种抗CXCR3抗体和/或其片段。在一些实施例中,抗体或片段是能够中和CXCR3。在一些实施例中,疾病或异常是一种炎性异常。在一些实施例中,异常是T1D。在一些实施例中,给予包含抗体或片段的组合物(例如,药物组合物)预防、治疗与CXCR3相关的疾病或异常、降低其严重程度和/或以其他方式改善其症状。在一些实施例中,抗体或片段是以足以预防、治疗与CXCR3相关的疾病或异常、降低其严重程度和/或以其他方式改善其症状的计量和频率给予。
在某些实施例中,提供了用于生产治疗疾病或异常药剂的方法的组合物,其中所述药剂包含本文所公开的任一种抗体或其片段。例如,抗体或片段可包含来自重链可变区4.0-4.11中任一者的3个CDR,与其配对的是来自轻链可变区4.0-4.7中任一者的3个CDR;来自重链可变区12.0-12.3中任一者的3个CDR,与其配对的是来自轻链可变区12.0-12.3中任一者的3个CDR;来自重链可变区53.0-53.10中任一者的3个CDR,与其配对的是来自轻链可变区53.0-53.13中任一者的3个CDR;来自重链可变区82.0-82.3中任一者的3个CDR,与其配对的是来自轻链可变区82.0-82.3中任一者的3个CDR;来自重链可变区135.0-135.3中任一者的3个CDR,与其配对的是来自轻链可变区135.0-135.3中任一者的3个CDR。
在一些实施例中,药剂中的抗体或片段包含与轻链可变区4.0-4,7中任一者匹配的重链可变区4.0-4,11中的任一者、与轻链可变区12.0-12.3中任一者匹配的重链可变区12.0-12.3中的任一者、与轻链可变区53.0-53.13中任一者匹配的重链可变区53.0-53.10中的任一者、与轻链可变区82.0-82.3中任一者匹配的重链可变区82.0-82.3中的任一者、与轻链可变区135.0-135.3中任一者匹配的重链可变区135.0-135.3中的任一者。
用于本文中所公开方法中的CXCR3抗体的计量将基于本领域技术人员所熟悉的多个参数而变化,这些参数是例如患者生理状态(大小或表面积、体重、年龄和代谢)以及疾病状态,以及药理学参数,例如递送机制、配方和任何同时或依次治疗。“有效量”的CXCR3抗体可以产生期望活体内效应,例如以下中的一种或多种:维持或降低的HA1bc(血红蛋白A1c)浓度(小于约7%,例如,小于7.5,7.4,7,3,7.2,7.1,7.0,6.9,6.8,6.7,6.6,或6.5%,或其间的任意百分比)、增加内源性胰岛素产生和/或循环胰岛素浓度、维持或增加的空腹C肽浓度、改良的葡萄糖耐量、在外源性胰岛素不存在下降低空腹血糖浓度、外源性胰岛素使用的降低、β细胞炎症的降低和/或增加的β细胞群体和/或生长。也可以使用针对CXCR3抑制的直接细胞分析。例如降低血液中CXCR3+细胞(包括但不限于T细胞)、抑制CXCR3配体结合、GTP结合、钙流入和/或动员、细胞趋化性和/或受体内在化。
在某些实施例中,有效量的CXCR3抗体导致上述任一活体内参数相对于对照而言约10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,or 100%(或其间的任意百分数)或1倍,2倍,4倍,5倍,10倍,15倍,20倍,30倍,40倍,50倍,或100倍(或其间的任意倍数)或更高的改善。在某些实施例中,改善的特征是在无外源性胰岛素时空腹血糖浓度降低至低于100,110,120,130,140,150,160,180,200,220,240,250,300,或350mg/dL(或期间的任意值)。在某些实施例中,改良的特征可以是基础血清C肽(basal serum C-peptide levels)浓度增至超过0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8,或1.0nmol/L(或其间的任意值)。在一些实施例中,改良的特征是在C肽筛查(口服葡萄糖后耐量测试)其间空腹积分血清C肽浓度增至大于约0.03,0.033,0.04,0.05,0.08,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.4,0.5,0.6,0.8,或1.0nmol/L x min(或其间的任意值)。在某些实施例中,CXCR3抗体的有效剂量可以进一步通过相对于对照个体而言胰腺中CD4+和/或CD8+细胞浓度减少至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,或90%(或其间的任意百分比)或至少1倍,2倍,3倍,4倍,或5倍(或其间的任意值)来表征。
在各个实施例中,抗体的有效剂量是经选择给予人类个体的安全剂量。在某些实施例中,抗CXCR3抗体的安全剂量可以是以个体中T细胞或T细胞活性(而不是CXCR3活性)(例如,测量个体血液中T细胞浓度或活性)无实质性总消耗来表征。在特定的实施例中,“T细胞或T细胞活性无实质性总消耗”是指相对于用安慰剂治疗和/或相对于治疗前而言,用CXCR3中和抗体治疗的个体中CD4+和/或CD8+细胞的浓度和/或活性(而不是CXCR3活性)降低40%,30%,25%,20%,15%,10%,5%(或其间的任意百分比)或更低。在一些实施例中,安全剂量的特征可以进一步以相对于对照个体而言,一种或多种选自T regs、B细胞、骨髓细胞、树突状细胞和/或粒细胞的细胞类型的浓度40%,30%,25%,20%,15%,10%,5%(或其间任意百分数)或更低来进行表征。
在活体外趋化性分析中ND50为约1-6μg/mL的对于例如人体的个体的非限制性实施例的抗体剂量包括0.03,0.06,0.12,0.24,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,或3.7mg/kg/dose(或其间的任意值)。在某些实施例中,抗体可以以0.03-3.7mg/kg/dose,0.15-0.7mg/kg/dose,or 0.25-0.5mg/kg/dose范围内给予。
抗CXCR3抗体可以单次给予或在不同时间段内重复给予,例如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每季一次或每年一次。因此,在基于上述剂量范围内的非限制性实例中,患者可以在治疗方案进程内接受近0.16-18mg/kg总剂量的CXCR3抗体。
抗CXCR3抗体可以以本领域技术人员所知晓的任何适宜方式给予,包括例如经静脉内、经腹膜内、经鼻、经眼、经口、肠胃外、皮下或经皮。在特定实施例中,可以对个体的胰腺或靠近胰腺或胰腺的特定区(例如胰腺的胰岛细胞)直接给予抗体。
可以利用本领域已知的转化因素将在一种动物中获得的有效剂量转化用于另一动物,包括人类。例如,参见Reagan-Shaw等人,FASEB J.22:859-81(2008);Schein等人,Clin.Pharmacol.Then 1 1:3-40(1970);和Freireich等人,Cancer Chemother.Reports50(4):219-244(1966)。例如,基于动物给药的人类等效给药(HED)(mg/kg)可以表示为以下方程式:HED(mg/kg)=动物剂量(mg/kg)X(Km动物/Km人类),其中Km=体重/体表面积(kg/m2)。
基于上述方程式的示例性转化因素表示于下表中。上文提供用于人类的实例性剂量可以基于这些系数或本领域技术人员已知的其他手段经调节用于其他物种或其他人类患者。
表3
个体
通过本发明所提供的方法进行治疗的个体可以包括人类或动物,例如家畜、驯养动物和野生动物。在一些实施例中,动物是鸟类、牛科动物、犬科动物、鲸类动物、马科动物、猫科动物、羊、鱼类/鱼、猪科动物、灵长类动物、啮齿类动物或有蹄类动物。个体可处于任何发育阶段,包括成人、青年、胎儿或胚胎。在特定实施例中,患者是哺乳动物,并且在更特定实施例中为人类。
在各实施例中,可预防地或在与异常CXCR3活性相关的任何病况或破坏CXCR3信号传导可在治疗上有益的任何病况发作后治疗个体。在一些实施例中,可预防地或在T1D发作后治疗个体。在一些实施例中,可在T1D发作前使用本文所提供方法预防地治疗个体,或可使用本文所提供方法治疗患有新发作T1D的个体。
“患有新发作T1D的个体”是指临床诊断为糖尿病时不考虑个体的年龄,胰腺的β细胞生产胰岛素的能力降低但仍可检测的任何个体(例如,包括成人、青年、胎儿或胚胎个体)。在某些实施例中,新发生T1D的个体将较佳在最早临床诊断为T1D后月六个月内(例如,在约1天、1周、2周、3周、4周、5周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或其间的任何时间内)接受治疗。在其他实施例中,患者在最早临床诊断为T1D后接受超过6个月的治疗,其中个体保留大于或等于约0.2nmol/L(例如,至少约0.2,0,3,0.4,0.5,0.6,0.8,或1.0nmol/L)的最低但可测量的基础血清C肽浓度。在一些实施例中,治疗包含给予一次或多次包含一种或多种本文所公开的抗体剂量。在一些实施例中,抗体是CXCR3中和抗体。
在一些实施例中,患有新发生的T1D个体在C肽刺激期间保留以下空腹积分血清C肽浓度:至少约0.03,0.033,0.04,0,05,0.06,0.07,0.08,0.09,0,1,0.2,0.4,0.5,0.6,0.8,或1.0nmol/L×min,例如约0.03至1.0或0.033至1.0nmol/L x min。在特定实施例中,个体在C肽刺激期间具有0,033至1.0nmol/L x min的空腹积分血清C肽浓度。在某些实施例中,C肽刺激是口服10.0-13.9mmol/L葡萄糖后经60-150分钟测定积分血清C肽浓度。参见Keymeulen et al.,Diabetobgia 53:814-623(2010)。在更特定实施例中,个体口服葡萄糖后耐量测试积分血清C肽浓度增加低于0.8,0.7,0.6,0.54,0.5,0.4,0.3,0.2,or 0.1nmol/L x min。在更为特定实施例中,个体口服葡萄糖后耐量测试积分血清C肽浓度增加低于0.54nmol/L x min或更小。C肽对应于胰岛素前体肽的残基57-87(人类参照序列NP_000198),其中残基90-110和25-54分别对应于胰岛素的A和B链。
在一些实施例中,患有新发生T1D的个体在外源性胰岛素不存在下具有高于以下数值的空腹血糖浓度:大约100,110,120,130,140,150,160,180,200,220,240,250,300,350mg/dl(或其间的任意值)或更高。在某些实施例中,个体可具有如上文所记载的升高的空腹血糖浓度以及如上文所述的降低的空腹积分血清C肽浓度。
在某些实施例中,在诊断为新发生T1D后的很短时间内用本文中所公开的方法对个体进行治疗。在更多特定的实施例中,个体是在临床诊断为新发生T1D的1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10天内,或1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10周内,或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12月内(或其间的任何时间)利用本发明中的方法进行首次治疗。在更具体的实施例中,在临床诊断为新发生T1D的6个月内用本发明的方法对个体进行首次治疗。在其他实施例中,患有T1D的个体在任何时间采用本文中所公开的方法进行治疗,不需要考虑临床诊断时间,其中所述个体保留至少约0.2nmol/L的残余血清C肽浓度。
其他方法
在某些实施例中,本文所提供的方法可包含与抗CXCR3抗体给予同时或依次(之后或之前)进行的其他治疗。例如,在某些实施例中,本文所公开的方法还包括除了给予抗CXCR3抗体外还给予个体免疫抑制剂的其他步骤。免疫抑制剂可包括,但并不限制于以下一种或多种:咪唑硫嘌呤(Imuran),β干扰素1a,β干扰素1b,巴利昔单抗(basiliximab),皮质内固醇,环孢霉素(Sandimmune),环磷酰胺,苯丁酸氮芥(chlorambucil,)达珠单抗(daclizumab),去氧精胍啉(deoxyspergualin),伊那西普(Etanercept),乙酸格拉替雷(glatiramer acetate),英夫利昔单抗(infliximab),来氟米特(leflunomide),硫嘌呤(ercaptopurine(6-MP)),甲氨蝶呤(methotrexate),米托蒽醌(mitoxantrone),莫罗单抗CD-3(muromonab-CD3),微酚酸酯(mycophenoiate(MFM或CellCept)),那他珠单抗(natalizumab),阿那白滞素(anakinra),卡那奴单抗(canakinumab),利妥昔单抗(rituximab),贝利木单抗(belimumab),阿巴他塞(abatacept),阿地介白素(aldesleukin),泼尼松(prednisone),雷帕霉素(rapamycin),西罗莫司(siroiimus),他克莫司(tacrolimus),以及优特克单抗(Ustekinumab)。
在一些实施例中,本文所公开的方法,除了给予抗CXCR3抗体外,可以包括项个体给予β细胞刺激剂的步骤,给予β细胞刺激剂的步骤可以和给予抗CXCR3抗体同时或依次(之前或之后)进行。β细胞刺激剂的实例包括,但并不限于以下的一种或多种:移植的β细胞(自体、同种异体,或异体同质syngenic)、移植的胰岛素生产细胞(同种异体或异体同质)、DDP4(人类蛋白参考序列NP_001926.2)抑制剂、TM4SF20peptide肽(人类蛋白参考序列NP_079071),TMEM27肽(人类蛋白参考序列NP_065716)、毒蜥肽(exendin)1或GLP-1(人类蛋白参考序列NP_002045)类似物,gp130和EGF受体配体,以及在美国专利申请公开号第20100130476号的第8-11段中所公开的内容。本发明方法中β细胞刺激剂可以与免疫抑制剂同时或依次(之前或之后)给予。在某些实施例中,β细胞刺激剂、产生胰岛素的细胞和/或免疫抑制剂可以通过植入一种能将β细胞刺激剂、产生胰岛素的细胞和/或免疫抑制剂递送至靶组织或器官的装置给予。
本文中还公开了检测和/或定量CXCR3和/或表达CXCR3细胞(例如CXCR3+T细胞)的方法。在一些实施例中,这些方法包含使用一种或多种本文中所公开的抗CXCR3抗体来检测和/或定量CXCR3和/或表达CXCR3的细胞。例如,可将一种或多种抗体添加至患者样本(例如血样)并使用可检测标记(例如偶联至可检测信号的二级抗体,例如荧光二级检测抗体)检测。例如,在一级和荧光二级抗体结合后可使用FACS分选来定量样本中CXCR3表达细胞的浓度。
在一些实施例中,可以使用诊断方法来诊断CXCR3异常或与CXCR3相关的异常(例如,糖尿病,T1D)。例如,可以通过检测患者样本中CXCR3的存在或不存在来对异常进行诊断,或者通过比较样本中CXCR3浓度与一个或多个参考标准物种的浓度来进行异常的诊断,其中与标准物浓度的偏差意味着异常的存在。
在各实施例中,还提供了包含至少一种抗CXCR3抗体或片段的试剂盒。该试剂盒对各种研究、诊断和治疗目的是有用的。例如,试剂盒可以通过向个体给予试剂盒内的抗CXCR3抗体或片段来检测CXCR3T细胞,或治疗I型糖尿病。出于分离或纯化的目的,试剂盒可以含有与粒珠(例如,琼脂糖粒珠sepharose beads)偶联的抗体或片段。在某些实施例中,试剂盒也包含关于使用抗CXCR3抗体或片段用于期望研究、诊断和/或治疗目的的说明书。
在本申请中,除非另有明确说明,否则使用单数包括复数。此外,在本申请中,除非另有声明,“或”的使用是指“和/或”。此外,属于“包括including”以及其他形式(例如“includes”和“included”)不具有限制性。本文所述的任何范围应该理解为包括端点和介于端点间的全部值。
本文所用各部分标题仅仅出于组织目的,并不是构成用于限制所述目的物。本申请中所引用的全部文献或文献的部分,包括但并不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文,都是出于任何目的以整体引用方式明确的并入本文中。在以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中的发明相矛盾的程度下,说明书将替代任何矛盾材料。
与本申请中公开的参考基因序列相关的全部信息,例如GenelDs或登录号,包括(例如)基因组基因座、基因组序列、功能注解、等位基因变体和参考mRNA(包括例如外显子边界)和蛋白序列(例如保守区结构),都以整体引用方式并入本文中。
实施例
以下实施例用于阐述本发明,且决不限制本发明。
实施例1:材料和方法
免疫原的产生。用编码人类全长CXCR3的DNA转化CHO细胞并在细胞表面("r-CXCR3-CHO cells")表达CXCR3。获得用于转化细胞的CXCR3序列并将CXCR3开放阅读框置于表达载体pcDNA3.1neo_DEST中,随后转染至300-19细胞(Immunogen)中。通过C端半胱氨酸将CXCR3胞外区(EC区)的N端肽片段(具有氨基酸序列MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSC(SEQ ID NO:81))偶联至KLH,并且用作免疫原。使表达CXCR3的细胞维持于37℃.在5%C02下在补充有10%经透析胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的RPMI(invitrogen,Carlsbad,Calif.)中。通过补充有5mM EDTA的磷酸盐缓冲(Ca/Mg-free)盐水(CMF-PBS)替代上述培养基并且在该缓冲液中收集细胞来制备注射用细胞。以500×g离心约5分钟使所收获的细胞沉淀,将沉淀物再悬浮于CMF-PBS中并且如前所述离心洗涤一次,计数,并通过将细胞沉淀物再悬浮于CMF-PBS中调节至用于注射的适当体积(例如0.2ml中5×106个细胞)。
抗体制备。使用人类CXCR3的N端37个氨基酸来产生抗人类CXCR3的小鼠单克隆杂交瘤,选择五种抗体克隆(4,12,53,82,和135)进行进一步表征。人类CXCR3N端37个氨基酸与小鼠CXCR3中的配对区65%同源并且含有对于CXCL9、CXCL10和CXCL11结合至关重要的残基。用表达CXCR3或CXCR3胞外肽的细胞免疫约6-8周龄的BALB/c小鼠(Charles RiverLaboratories.Wilmington,MA)。在第0天用与佐剂(TiterMax Gold,Sigma Aldrich,#T2685-1ML)以1:1混合的KLH偶联肽的乳液经皮下(SC)对一组小鼠实施初始免疫,以2-3周间隔用肽对佐剂的1:1乳液经SC或用无佐剂的存在于PBS中的细胞经腹膜(i.p.)强化免疫3-5次,并且在处死前连续两天用存在于PBS中的肽和/或细胞(全部不含佐剂)经由i.p.强化免疫。以2-3周间隔经i.p对另一组小鼠实施3-5次初始免疫并且在处死前连续两天用存于PBS中的细胞经由i.p.强化免疫。对于两组小鼠而言,各注射在约100μl体积中含有约2x106个细胞。
在最后一次注射的次日,处死小鼠并取出脾脏将其置于含有10ml无血清DMEM(Gibco)的培养皿中。基于Kohler和Mistein(Nature,258:495-7,(1975))方法使用50%(w/w)PEG将Sp2\0小鼠骨髓细胞(ATCC CRL-1581)与来自免疫小鼠的脾细胞融合。在操作结束时,将细胞再悬浮于50ml ClonaCell-Hy杂交瘤回收培养基(StemCell Technologies)中,转移至T75cm2培养瓶中并在37℃培养16-24小时。在培养后,收集细胞并添加100mlClonaCell-HY甲基纤维素选择培养基(StemCell Technologies)。然后将这些混合物等分到10个100mm2组织培养皿中培养4-10天。将克隆杂交瘤从甲基纤维素转移至液体培养基中并使其在96孔板中生长用于分析,以鉴别对CXCR3具有特异性的单克隆抗体。
除非另有说明,这些实施例中所提及的抗体变体(例如Hu4.1)是指含有相同编号的重链变体和轻链变体的抗体(例如,Hu4.1将含有重链4.1和轻链4.1)。所有涉及的抗体与表2中所示的抗体编号和VH/VL链配对一致。
动物。雌性NOD/LtJ小鼠购自于Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)并且维持在无病原体环境下。在10周龄开始进行每周两次使用微型Plus血糖仪(Roche,Indianapolis,IN)尾静脉穿刺筛选糖尿病小鼠。当连续三天测量血糖高于250mg/dL时,认为小鼠患有糖尿病。在治疗开始后观察小鼠至少100天。全部动物实验都是经过机构内部(in-house)IACUC批准。
抗体注射。对于预防研究而言,10周龄开始每周一次用100μg抗体经腹膜内(i.p.)注射糖尿病前期NOD小鼠,保持6周。对于逆向研究而言,在认为小鼠患有糖尿病后1周内将动物随机登记于治疗组中,每天测量血糖两次,读数间隔至少六小时,并且在研究持续时间内通过腹膜内注射向血糖高于250mg/dL的小鼠给予胰岛素。治疗组中将连续30天不依赖胰岛素的小鼠认为已经逆转。第五次治疗与第六次治疗之间收获五只来自各组小鼠且收集淋巴器官、血液、骨髓和胰腺以供细胞分析。在研究结束时,收集胰腺并且经过处理以供组织学和免疫组织化学分析。抗小鼠CXCR3抗体克隆CXCR3-173(Uppaluri等人,2008)和仓鼠IgG对照抗体是购自于BioLegend(San Diego,CA)。
FACS分析。制备脾、腹股沟淋巴结、胰腺淋巴结和骨髓的单细胞悬浮液。将胰腺剪成小块并在2mg/ml胶原酶D(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN))中在37摄氏度下孵育30min,经过70微米细胞滤器(BD Biosciences,San Jose,CA)过滤,使用密度梯度离心从胰腺组织分离淋巴细胞。用以下物质对细胞染色:APC标记抗小鼠CD25,FITC标记抗小鼠CD4和PE标记抗小鼠Foxp3(eBiosciences,San Diego,CA),其用于调节性T细胞,PerCP标记抗小鼠CD8a,PE标记抗小鼠CD44,APC标记抗小鼠CD62L,和PeCy7标记抗小鼠CXCR3,其用于激活/记忆T细胞,和FITC标记抗小鼠CD94,PerCP标记抗小鼠CD4,APC标记抗小鼠B220,PeCy7标记抗小鼠CD11c,太平洋蓝(Pacific blue)标记抗小鼠CD11b,以及PE标记抗小鼠NKp46,其用于B细胞,骨髓细胞,树突状细胞,NK细胞,和NKT细胞。在冰上用抗小鼠CD16/32封阻20min后在4℃下将细胞孵育30min。对于T reg染色而言,进行表面染色,将细胞洗涤,固定并在Cytofix/Perm缓冲液(eBiosciences)中进行透化处理,然后在冰上用抗小鼠Foxp3抗体染色30min。染色后,将细胞洗涤两次,固定于多聚甲醛中并捕获于LSRII细胞仪上,使用FlowJo软件(Treestar,Ashland.OR)分析数据。除非另有说明,否则全部抗体都购于BDBiosciences。
趋化性分析。在带有5μm膜的transwell可渗透载体的24孔板(Costar)中实施趋化性分析,将CXCR3转染的300.19细胞以1x 106个细胞于2.5%热非活化胎牛血清的RPIM1640中(0.2ml总体积)置于transwell插入物中。单独或补充有重组趋化因子300ng/ml CXCL9(MIG),100ng/ml CXCL10(IP-10)或100ng/ml CXCL11(l-TAC)的培养基置于下区室(0.6ml)中并将含有细胞的transwell插入物加载至下区室中。在5%CO2加湿培养器中在37℃下将板培育4-5小时。在培育后,移出transwell插入物并采集小区室的全部培养基并在1200RPM离心5min使细胞沉淀。抽出培养基,在37℃下用钙黄绿素AM(终浓度为10μg/ml)将细胞染色30分钟。使细胞沉淀并洗涤,添加培养基(0.1ml),将悬浮液转移至96孔黑壁清澈底板中。以1200RPM对板实施脉冲处理以使细胞沉降,于Flexstation上在490/520nm下检测荧光。全部条件都是以一式三份进行检测。所得的数据都表示为漂移细胞的平均相对荧光单位(RFU)。参见图14A-C和图15A-C。
对于利用CXCR3封阻进行的趋化性分析,在用于趋化性分析之前,在37℃条件下用不同量的封阻抗体或对照IgG对CXCR3转染300.19细胞预处理20-30分钟。在分析孵育中抗体不被清洗而是一直存在。
使用FLIP进行钙动员分析。用PBS+2mM EDTA处理融合80%时收集表达hCXCR3的人胚胎肾293(HEK)细胞。将细胞以1x 106个细胞/mL的密度悬浮于无血清HEK-SFM培养基中。将15μl(15,000个细胞)悬浮液分配至384孔板的各孔中,在室温下添加15μl经重构FLIPR钙4染料对细胞进行30分钟染料加载。将抗人类CXCR抗体克隆和同种型对照在HBSS+20mMHEPES+1%BSA中连续稀释(3倍)以产生10种测试浓度/克隆。在相同板上以一式两份(n=2)测试各测试浓度。将15μl测试浓度添加至各孔的细胞中并且在室温下孵育1小时。将代表诱发胞内钙动员的EC80的固定浓度的CXCL11(R&D Systems)于FLIPR上添加至各孔中并随时间监测荧光变化。将各孔的最大反应正规化为基线并且在平均后使用GraphPad Prism将数据整合至四参数方程并测定各克隆的IC50。参见图14D和图21。
Biacore亲和力分析。Biacore表面准备。使用Biacore T100动力学/亲和力分析计算小鼠a~人类CXCR3杂交瘤抗体克隆4,12,53,82和135与人类CXCR3肽的结合亲和力。用兔抗小鼠-Fc(RAM-Fc)捕获抗体(GE编号GE#BR-1006-68)使用标准胺耦合程序固定BiacoreCM5系列S感测器晶片(GE编号GE#BR-1006-68)。使用0.1M N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)和0.4MN-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的1:1混合物活化晶片的羟甲基葡聚糖表面,以使表面结合捕获抗体上的反应性胺基。在抗体固定后,使用1M乙醇胺盐酸盐/NaOH(pH 8.5)淬灭反应性感测器晶体表面。固定在一个流动小室上产生8,000RU RAM-Fc捕获抗体。在数据分析其间使用另一空白流动小室作为参照扣减表面。
Biacore分析条件。将Biacore T100仪器试样室温度和分析温度分别设定为4℃和25℃。在HBS-EP+运行缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05%P20表面活性剂,3mM EDTA,pH 7.4)中将小鼠抗hCXCR3抗体稀释至500nM,并使用三十秒注射以10μl/min加以捕获。该等条件可稳定捕获约1200RU所测试各小鼠抗Hcxcr3克隆。在HBS-EP+中将hCXCR3肽稀释至200,100,50,25,12.5和OnM。对于各分析循环而言,以50μl/min流速经五分钟注射肽以测量缔合,随后在HBS-EP+中以50μl/min流速洗涤十分钟以测量解离。以50μl/min经三分钟使用10nM甘氨酸-HCl pH1.7在分析循环之间按捕获表面(RAM-Fc)再生。在Biacore T100动力学评估软件v2.0(GE Healthcare)中进行分析。利用参照流动小室和0nM浓度扣减(双参照扣减)将感测(Sensorgrams)吻合至1:1结合模型。
Biacore全受体分析。利用棒状病毒载体在昆虫sf9细胞中表达具有C端6×His及HPC4标签的全长人类CXCR3受体蛋白(SEQ ID NOS:82)。然后经由Ni-NTA和HPC4亲和力纯化来纯化受体蛋白。将最终产物缓冲液交换至10nM HEPES,300mM NaCl,0,5%正十二烷基β-D-吡喃麦芽糖苷和5%甘油中。经由Ni-螯合在NTA晶片上捕获受体蛋白并且通过由胺耦合使用0.1M N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)和0.4M N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的1:1混合物的1:10稀释混合物使其进一步稳定。通过注射20nM hCXCL10和hCXCL11配体测试经稳定受体表面的配体结合活性。对于动力学分析而言,在HBS-EP+中将人类CXCR3配体(hCXCL9,hCXCL10和hCXCL11)稀释至20,10,5,2.5,1.25,0,6125,0.3125和OnM。在HBS-EP+中将抗CXCR3抗体稀释至20,10,5,2.5,1.25,0,6125,0.3125和OnM。以50μl/min流速经5分钟注射分析物以测量缔合,然后在HBS-EP+中以50μl/min流速洗涤十分钟后测量解离。以50μl/min经1分钟使用10nM甘氨酸-HCl pH1.7在分析循环之间使受体表面再生。在BiacoreT 100动力学评估软件v2.0(GE Healthcare)中进行分析。利用参照流动小室和0nM浓度扣减(双参照扣减)将感测(Sensorgrams)吻合至1:1结合模型。
葡萄糖耐量测试。在葡萄糖筛查前晚上,检测非空腹血糖并且停止糖尿病动物的胰岛素治疗。将小鼠禁食12小时,随后以2mg/g体重经腹膜内注射D-葡萄糖(20%;Sigma)。在注射前和注射后15分钟、30分钟、60分钟和120分钟检测血糖。
实施例2:NOD小鼠的表征
对包埋于石蜡中的来自8-10周龄糖尿病前期雌性NOD小鼠和新发生糖尿病雌性NOD小鼠的代表性胰腺切片进行胰岛素、CXCL10和T细胞标记物CD3染色。图1.检测NOD小鼠的胰腺中由浸润细胞包围的胰岛内的CXCL10的表达(图1中间栏的箭头)。年龄较大糖尿病前期和新发生糖尿病小鼠胰岛中T细胞浸润显著性增加(图1,右栏),胰岛内胰岛素生产降低(图1,左栏)。
为了进一步评估NOD小鼠的胰腺中是否存在CXCR3+T细胞,对新发生糖尿病的雌性NOD小鼠收获胰腺组织并进行流式细胞术分析。图2.在CD4+/TCR+和CD8+/TCR+T细胞上评估CXCR3表达。用同种型对照抗体染色表示为阴影曲线。对从几个小鼠收集的胰腺组织的单细胞悬液进行流式细胞术。数据显示,在NOD小鼠的胰腺中存在CXCR3+细胞毒性和辅助T细胞。
实施例3:用抗CXCR3抗体预防性治疗NOD小鼠
糖尿病前期雌性NOD小鼠在10周龄进行每周一次,持续6周的100μg仓鼠抗小鼠CXCR抗体(克隆CXCR3-173,购自BioLegend,San Diego,CA)治疗,或用对照的仓鼠抗小鼠IgG或PBS治疗。每周检测两次血糖并且在连续三次血糖读数高于250mg/dL后,认为动物患有糖尿病并将其无痛处死。图3显示了各治疗组随时间发展为糖尿病的小鼠的百分比。各条线代表的是每组十只小鼠综合结果。两次独立性研究的结果见图3A和3B。曲线表明用抗CXCR3抗体进行预防性治疗防止糖尿病前期雌性NOD小鼠的糖尿病进展。
为进一步评估给予预防性抗CXCR3抗体后的效应,对用抗CXCR3抗体治疗的雌性NOD小鼠的代表性胰腺切片进行胰岛素(图4,左面板)、CD3和Foxp3(图4,中面板和右面板)染色。图4中的右侧面板是中面板中所示切片的放大率增加的影像。研究期结束时从小鼠收集胰腺组织。图4证实了用抗CXCR3抗体治疗的NOD小鼠出现胰岛素阳性胰岛,然而大多数T细胞包围胰岛并且尚未侵袭胰腺。
实施例4:NOD小鼠的新发生糖尿病的逆转
连续三次血糖读数高于250mg/dL的雌性小鼠被认为患有糖尿病并将其随机募集于治疗组中。在募集后的一周内开始治疗。对小鼠用PBS、抗CXCR3抗体(100μg经腹膜内注射,克隆CXCR3-173)或者利用对照IgG(100μg经腹膜内注射i.p)进行一周一次、持续6周的治疗,或者利用小鼠抗胸腺细胞球蛋白(mATG;500μg经腹膜内注射i.p)在第0天和第4天对小鼠进行治疗。一旦募集,在早上和下午(两者间隔至少6小时)测量血糖,并且通过腹膜内注射将胰岛素仅给予血糖浓度高于250mg/dL的这些小鼠。个体小鼠每日早上的血糖值见图5。从8-10只小鼠/组/研究进行四次独立逆转研究收集数据。数据显示,利用抗CXCR3抗体治疗后逆转NOD小鼠的新发生的糖尿病。
为了评估利用抗CXCR3抗体治疗后小鼠胰腺T细胞亚群的变化,从每个治疗组(PBS,抗小鼠CXCR3,对照IgG或mATG治疗的小鼠)收集胰腺单个细胞悬液,针对T细胞染色并且通过流式细胞仪进行分析。在PBS、抗小鼠CXCR3或对照IgG的第五次治疗计量后数天并且自年龄匹配mATG治疗小鼠收集胰腺组织。悬浮液中CD4+和CD8+T细胞的百分比示于图6A中。图6B显示用PBS(左),对照IgG(中),和抗CXCR3抗体(右)治疗的小鼠胰腺中CD4+T细胞上CD44和CD62L的表达。门1(gate 1)显示每个处理组的细胞百分比(PBS 67.3%,对照IgG67.1%,抗CXCR3处理组为30.4%)。图6C是与用同种型对照抗体染色并且针对淋巴细胞门控的细胞比较,CD4+T细胞在如图6B中所定义的门1(G1)或门2(G2)中的CXCR3表达的曲线图。
为了评估用抗CXCR3抗体治疗的NOD小鼠逆转中是否存在胰岛素阳性胰岛,制备用对照IgG(左面板)、抗小鼠CXCR3抗体(中面板)或鼠类ATG(右面板)治疗的雌性NOD小鼠的石蜡包埋胰腺切面,并且针对胰岛素(顶行)或针对CD3和Foxp3共染色(底行)。参见图7。在研究结束时(约募集后的100天)从小鼠收集胰腺组织。经染色切片显示,在用抗CXCR3治疗逆转的NOD小鼠中存在胰岛素阳性胰岛,并且T细胞包围胰岛,很是很少侵袭胰岛。
为了评估葡萄糖筛查的反应,进行葡萄糖耐量测试。图8,使年龄匹配雌性无糖尿病NOD小鼠(图8A)、已用PBS治疗的糖尿病NOD小鼠(图8B)、用抗小鼠CXCR3治疗逆转的糖尿病NOD小鼠(图8C)和已用IgG治疗的糖尿病NOD小鼠(图8D)禁食过夜并且通过腹膜内注射葡萄糖进行筛查。在筛查前(时间0)和在所示时间筛查后测量血糖。显示了4-5只小鼠/治疗组的代表性数据。数据表明,抗CXCR3抗体治疗改善了募集后100天的空腹葡萄糖耐量。
实施例5:T细胞过继性转移(Adoptive Transfer)
为评估来自用抗CXCR3抗体(克隆CXCR3-173)治疗并且出现疾病缓解的NOD小鼠的T细胞在接受者动物中诱导糖尿病的能力,通过静脉内注射将所分离的CD4+和CD8+T细胞过继性转移至接受者非肥胖型糖尿病-重症联合免疫缺陷(NOD.scid)小鼠中。图9展示在过继性转移所分离的CD4+和CD8+T细胞后无糖尿病小鼠随时间的百分比,这些T细胞是来自用PBS或对照IgG治疗的糖尿病小鼠或在用鼠类ATG或抗小鼠CXCR3抗体治疗后疾病缓解的小鼠。自募集后80-100天不同治疗组的雌性NOD小鼠收集脾、胰腺淋巴结和腹股沟淋巴结分离CD4+和CD8+T细胞。收集CD4+和CD8+T细胞并将总共8百万个细胞过继性转移至NOD.scid受体中,并通过每两周测量一次血糖来监测糖尿病的发展。图9中各线代表五只小鼠/组的组合数据。图9A和9B显示两次代表性研究。来自抗CXCR3抗体治疗小鼠的分离T细胞显示疾病转移延迟。
进一步表征分离的供体T细胞。图10A展示了如前一段所记载用PBS、抗小鼠CXCR3抗体、对照IgG或鼠类ATG治疗的小鼠分离供体T细胞中总CD4+和CD8+T细胞的百分比(左面板)。图10A右面板展示各供体细胞悬浮液中T细胞亚群中为CD4+(上面板)和CD8+(下面板)的效应和中央记忆T细胞的百分比,例如通过由CD44和CD62L的表达进行定义。将所分离收集CD4+和CD8+T细胞在转移前针对CD44和CD62L表达进行染色,捕获于流式细胞仪上并分析。也对分离供体T细胞采集物中的调节性T细胞的百分比进行评估。图10B显示各治疗组的调节性T细胞百分比,例如通过由CD4和CD25表达或通过CD4、CD25和胞内Foxp3表达所定义。图10C显示供体细胞中也表达CXCR3的CD8+(左面板)和CD4+(右面板)T细胞的百分比。数据显示,来自用抗CXCR3抗体治疗逆转的小鼠供体细胞中CXCR3+T细胞的百分比有所降低。
使用I型糖尿病的RIP-OVA模型来评估在过继性转移OT-1CD8+供体T细胞后CXCR3治疗的有效性。RIP-OVA小鼠是转基因小鼠,其中已将由大鼠胰岛素启动子(RIP)驱动的编码卵清白蛋白(OVA)的转基因引入小鼠基因组中并且使胰岛β细胞中膜形式的卵清白蛋白表达。小鼠的背景品系是C57BL/8并且RIP-OVA小鼠不会自发的发生糖尿病。RIP-OVA小鼠也称为C57BL/6-Tg(Ins2-TFRC/OVA)296Wehi/WehiJ,是购自于Jackson Laboratory。这些小鼠在过继性转移购自Jackson Laboratory的OT-1TCR(T细胞受体)转基因小鼠(Kurts etal.J Exp Med 184:923-930)的卵清白蛋白特异性CD8+T细胞后产生糖尿病。OT-1小鼠含有小鼠TCRa-V2和TCRb-V5基因的转基因插入(Hogquist et al.Cell76:17-27)。在MHCI H2Kb蛋白背景下,转基因TCR识别卵清白蛋白残基。OT-1小鼠中大于95%的CD8+T细胞表达转基因TCR并且识别卵清白蛋白肽并由其活化。
图11显示在将OT-1CD8+T细胞过继性转移至RIP-OVA接受者小鼠后,无糖尿病小鼠随时间的百分比,这些小鼠在转移OT-1CD8+T细胞后保持未治疗,用抗小鼠CXCR3抗体治疗,或用对照IgG治疗。在过继性转移后1天(研究1或研究2)或7天(研究2)开始治疗(100μg经腹膜内)并且每周给予两次,持续3周。各线代表5只小鼠/组的组合数据。两次研究结果显示于图11A和图11B中。数据显示,抗CXCR3抗体治疗保护RIP-OVA模型中小鼠免于出现糖尿病。
图12中提供了在将OT-1T细胞过继性转移至RIP-OVA接受者小鼠后不同治疗的有效性的其他数据。图12A显示在过继性转移至RIP-OVA接受者之前通过流式细胞术所分析供体T细胞的CXCR3表达。用同种型对照抗体染色是由阴影曲线表述。图12B显示在将OT-1T细胞过继性转移至用抗小鼠CXCR3抗体或对照IgG治疗的RIP-OVA接受者小鼠中后在所示时间下血液、脾和胰腺淋巴结(pLN)中供体细胞的百分比。在T细胞转移后一天开始抗体治疗(100μg经腹膜内),并且每周给予两次,持续两周。各点代表每只小鼠的数据。图12C表明在过继性转移后的所示时间下用抗小鼠CXCR3抗体或对照IgG治疗的RIP-OVA接受者小鼠中血液、脾和胰腺淋巴结(pLN)中因自体抗原(OVA)刺激而增殖的供体细胞数。在OT-1T细胞转移后一天开始抗体治疗(100μg经腹膜内),并且每周给予两次,持续两周。各点代表每只小鼠的数据。图12D显示将OT-1T细胞过继性转移到用抗小鼠CXCR3抗体或对照IgG治疗的RIP-OVA接受者小鼠后在所示时间下血液、脾和胰腺淋巴结(pLN)中CXCR3表达供体细胞的百分比。在OT-1T细胞转移后一天开始抗体治疗(100μg经腹膜内),每周给予两次,持续两周。各点代表每只小鼠的数据。用抗CXCR3抗体治疗使RIP-OVA小鼠中CXCR3+T细胞的百分比降低。
图13显示保持未经治疗且针对胰岛素(图13A)或CD3(图13B)染色或用抗小鼠CXCR3抗体治疗或用抗小鼠CXCR3抗体治疗且针对胰岛素(图13C)或CD3(图13D)染色的RIP-OVA接受者小鼠的代表性石蜡包埋胰腺切片。在OT-1T细胞转移后一天开始抗CXCR3治疗(100μg经腹膜内),每周给予两次,持续三周。在研究结束(T细胞转以后约60天)时收集胰腺组织。切片显示用抗CXCR3抗体治疗的RIP-OVA小鼠中缺乏T细胞浸润。
实施例6:抗人类CXCR3抗体克隆的评估
使用上文材料和方法部分(实施例1)中所述方法评估抗人类CXCR3抗体克隆Cl4,12,53,82,和135对CXCR3趋化性和钙动员的效应。对于趋化性分析而言,在添加至趋化性分析之前,在单独或具有如图14A-C所示不同浓度的抗体培养基中预培育人类CXCR3转染300.19细胞。图14A-C显示,克隆Cl 4,12,53,82,和135抑制CXCR3介导的向CXCL11的趋化性。图14中的克隆2与克隆4一致。
对于钙流动分析而言,在添加至FLIPR前根据上文材料和方法部分(实施例1)中所述方法在不同浓度的抗体中预培育人类CXCR3转染HEK细胞。各抗体将钙动员抑制50%时所需的抗体浓度示于图14D中。图14D显示,克隆Cl 4,12,53,和135抑制CXCR3介导的向CXCL11的钙动员。
为了进一步评价克隆Cl 4,12,53,和135对趋化性的效应,在添加至趋化性分析之前在单独或具有50μg/ml抗体的培养基中预培育hCXCR3转染300.19细胞,并且评价向CXCL9(图15A)、CXCL10(图15B)和CXCL11(图15C)的迁移。数据显示,克隆4,12,53,82,和135抑制向CXCL10和CXCL11的迁移并且部分的抑制向CXCL9的迁移。
为评估克隆4,12,53,82,和135的特异性,分析抗体与其他趋化因子受体的结合。用人类CXCR1,CXCR5,CXCR2,CXCR4或CCR5转染300.19细胞并且通过与抗人类CXCR3抗体克隆一起培育,之后进行二级抗体染色和流式细胞术来分析抗体结合。单独给予二级抗体作为阴性对照。用人类CXCR3转染的300.19细胞作为克隆染色的阳性对照。图16显示抗体与表达不同趋化因子受体的细胞进行结合的直方图,显示克隆4,12,53,82,和135不与其他趋化因子受体结合并且对CXCR3具有特异性。
在趋化因子受体结合分析中采用标准流式细胞术程序。简言之,通过维尔烯(Versene)处理收集细胞系并且将各细胞系分成7个试样。于冰上与一种一级抗体(5μg/ml)一起培育各试样,之后用FITC偶联二级抗体染色以检测结合的一级抗体。作为阴性对照,单独用二级抗体将细胞染色(无一级抗体孵育)。一级抗体是抗人类CXCR3抗体克隆或抗人类CXCR3对照抗体克隆1C6。在染色后,将细胞捕获于流式细胞仪上并使用FlowJo染色分析数据。图16中的各线代表用一种一级抗体和二级抗体或单独用二级抗体染色的细胞的每个试样。
使用Biacore分析根据上述方法(实施例1)分析克隆4,12,53,82,和135的亲和力(Ka)和解离速度(Kd),结果汇总于表4中。
表4
克隆编号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
4 108539.245 0.000348 3.2076E-09
53 79557.574 0.000581 7.3085E-09
12 183854.704 0.001473 8.01056E-09
82 195114.396 0.001828 9.36793E-09
135 88939.340 0.001214 1.36548E-08
实施例7:表位定位
使用来自CXCR3N端胞外区的截短生物素人类CXCR3肽(16个氨基酸N段片段)测定克隆4,12,53,82,和135的表位。产生一系列丙氨酸取代片段(参见下表5,丙氨酸取代,粗体)并将其生物素化。通过(ForteBio,Menlo Park,CA)和BiacoreTM(GEHealthcare)分析评估表位定位。
对于Octet分析而言,将肽再悬浮于80%DMSO中并且在PBS中稀释至10μg/ml。在PBS中将抗体克隆4,12,53,82,135和商业克隆1C6(BD Biosciences)稀释至120nM。在OctetQK system(ForteBio)上以96孔板模式(300μl/孔)进行动力学分析。各分析板包括N端生物素化全长WT hCXCR3ECD肽(Abgent)作为阳性对照,以及PBS缓冲液空白用于参照扣减。Octet Streptavidin biosensors(ForteBio)预浸渍于PBS中至少5分钟,随后进行分析。对于基线而言,首先将生物感测器浸入PBS中不振荡保护5分钟。对于所有其余步骤而言,震荡速度是1000rpm。将生物感测器浸于肽溶液中保持5分钟以加载肽。进行在PBS中保持5分钟的另一基线步骤。然后将生物感测器浸于抗体溶液中保持10分钟以测量结合。最后,将生物感测器转移到PBS中保持15分钟以达成解离。使用Octet DataAnalysis v7.0分析感测图。将结合活性表示为各抗体与wt全长hCXCR3肽相比的最大反应量百分比。
在表位热图中记录相对反应量。对野生型hCXCR3ECD肽的最大感测图反应在4-8nm范围内。各克隆筛选具有独特表位。所测试突变体都未完全消除克隆1C6的结合。第10位缬氨酸残基和第13位天冬氨酸在所有筛选抗体的结合中起作用。抗体12和1C6具有最多的N端表位,其中第5位缬氨酸突变影响二者的活性。抗体82具有最多的C端表位,并且结合活性在第9位谷氨酸盐开始降低,基于这些数据,各抗体的CXCR3序列上氨基酸表位边界如下:Cl4:第7-13位氨基酸;Cl 12:第5-13位氨基酸;Cl 53:第7-13位氨基酸;Cl 82:第9-15位氨基酸;Cl 135:第7-13位氨基酸;和克隆1C8:第5-13位氨基酸。
对于Biacore分析而言,在HBS-EP+运行缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mMEDTA,0.005%Polysorbate 20)中将肽稀释至10ng/ml。使用Biacore T100TM,以5μl/min的速度将肽注射到CM5-SA(GE编号BR-1005-31)晶片上直至每流动小室获得20反应单位(RU)稳定捕获为止。各晶片上的流动小室1保持空白用于参照扣减。在各晶片之一个流动小室上包括野生型37个AA的hCXCR3肽作为阳性对照。用HBS-EP+将小鼠抗hCXCR3抗体4,12,53,82,和135稀释至50,25,12.5,6.25,和3.125nM。对于各循环而言,以50μl/min的流速将抗体注射3分钟以测量结合,之后以5μl/min将缓冲液注射3分钟以测量解离。在循环之间使用10nM甘氨酸-HCl pH2.0以50μl/min保持60秒使肽表面再生。将感测图拟合至1:1结合模型并且在BiaEvaluation v2.0.1中使用双参照扣减进行分析并将其捕获于抗生蛋白链菌素生物感测器上,典型反应量在0-500RU范围内,且测定“强”、“中度”、“弱”结合反应的截止值。记录相对反应量以产生表位图。将离解速率分级,并且记录产生快Kd(大于0.001s-1)的肽。
表5
所有抗体均与野生型hCXCR3结合并且在hCXCR3序列的前16个AA内。克隆4,12,53,82,和135的结合数据示于表6中,并且显示各抗体克隆结合活性所需的最小表位边界的对应图示于图18中,其中重要残基以X标记。所有抗体表位都定位于人类CXCR3序列残基6-15内,参与CXCL10和CXCL11结合的区域。通过在CXCR3肽片段中给定位处进行丙氨酸取代后检测反应降低来测定表位内的氨基酸。克隆53和135具有最类似表位。克隆4和12具有最多N端表位(结合强度影响开始于第5位缬氨酸)。克隆82具有最多C端表位,其中结合活性从第9位谷氨酰胺开始降低。除82外的每一个克隆需要CXCR3中的第7位天冬氨酸。CXCR3中的第10位缬氨酸和第13位天冬氨酸两者在所有克隆的结合中都起作用。五种克隆小鼠、嵌合和人源化形式的表位没有差异。
表6(根据比对出现顺序分别为SEQ ID NOS 99-114)
Key
+++强结合反应(>300RU)
++中等结合反应(150-300RU)
+弱结合反应(10-150RU)
-无结合(<10RU)
*快离解速率(Kd>0,001)但较强结合反应(>10RU)
实施例8:抗人类CXCR3克隆的人源化
产生五种抗CXCR3克隆(克隆4,12,53,82,和135)中每一种的四种变体(嵌合,人源化1(Hu1)、Hu2和Hu3)。20个所有嵌合变体都是由“池表达”产生用于活体内动物模型研究。用含有嵌合CXCR3抗体克隆4,12,53,82和135的重链和轻链表达载体将适应于悬浮培养的CHO-DXB11细胞(Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,77:4216-20,(1980))进行电穿孔。这些表达载体也含有用于选择稳定CHO转染的二氢叶酸还原酶。在经过100nM甲氨蝶呤选择后,使用经稳定转染CHO池在具有OptiCHO培养基的振荡晒瓶中完成生物产生运行。使用标准蛋白A层析自条件化培养基中纯化重组嵌合抗体。将Hu1克隆CDR移植到人类框架区上并且进行完全人源化,不包括小鼠CDR的氨基酸和任何游标位残基。Hu2克隆是“经扩增CDR”克隆,具有在位于小鼠CDR的四个氨基酸内的残基处具有自Hu1序列的回复突变变化。Hu3克隆在位于使用基于IMGT建模鉴别为在小鼠与人类之间“极不类似”的位置处包括自Hu2序列的其他回复突变。在CHO-NRC细胞中瞬时表达所有20个变体并且经纯化用于活体外分析。
针对克隆4和53进行其他人源化。重链4.7-4.11包括除了CDR以外的其他人源化回复突变,以及修饰去除VH CDR2中的58位和59位(IMGT编号)的脱酰胺位点,以尝试改良克隆稳定性。尤其是,用诸多替代残基替代VH 4.2中的脱酰胺位点。克隆VH 53,4-53.6和VL53.4-53.9包括除了CDR之外的其他人源化回复突变,尤其是以试图使链更类似于VH 4.1和VL 4.1。
实施例9全受体结合动力学
使用 and BiacoreTM利用完整CXCR3肽评估20种抗CXCR3变体的结合动力学。如前文所述进行Octet分析。对于Biacore分析而言,将三种经管柱步骤纯化的人类野生型CXCR3肽经C端His和HPC4标记并且经过镍螯合和胺耦合捕获在NTA晶片上。使用中等RU(约1200RU)晶片用于较佳数据品质并且使二价结合效应最小化。将0-80nM抗体试样注射于受体上,使用感测图利用较佳曲线拟合的局部Rmax拟合BiacoreTM评估分析。评估四种变体(嵌合(Ch)和人源化(Hu)1-3)和5种克隆(4,12,53,82,和135)的结合曲线。出于比较的目的,也评估人源CXCR3配体CXCL9、CXCL10和CXCL11以及小鼠CXCL11(mCXCL11)的结合动力学。结果示于下表7A(通过KD分级)和7B(通过Kd分级)中。通过KD和Kd确定的最高四种变体突出显示于表中。当通过理解速度(Kd)将人源化抗hCXCR3mAb变体分级时,多数变体显示离解速率比最有效人源CXCR3配体hCXCL11慢至少1个位数。
表7A
表7B
如表7A所示,通过KD所确定的最高四种变体是嵌合克隆4(快结合速率、低离解速率)、Hu3克隆4(快结合速率、低离解速率)、Hu3克隆82(快结合速率、平均离解速率)和嵌合克隆53(平均结合速率、低离解速率)。
在CXCR3表达细胞中进一步评估抗体结合。使人类CXCR3转染300.19细胞与经纯化人源化抗hCXCR3抗体变体Hu1、Hu2、Hu3和嵌合抗体接触。如图19中所示,对于各克隆4,12,53,82,和135而言,使用5μg/ml(黑线),0.5μg/ml(深灰线),或0.1μg/ml(黑虚线)或5μg/ml单独的二级抗体(填满灰色的直方图)。在冰上用未经标记的抗体克隆对细胞染色30min,之后用PBS-1%FBS洗涤两次并且使用FITC偶联人源IgG1特异性二级抗体于冰上在于黑暗中孵育30min来检测结合抗体。将试样洗涤两次,固定于2%多聚甲醛PBS溶液中,存储于黑暗中4℃下且捕获于流式细胞仪上。针对活细胞门控的CXCR3阳性直方图示于图19中。
实施例10:与抗体1C6比较
使用Biacore全受体分析方法比较抗hCXCR3mAb克隆1C6(Becton,Dickinson目录编号为557183,相同克隆报导于U.S专利号第6,184,358号中)和小鼠抗hCXCR3mAb克隆4及其人源化变体Hu2和Hu3。克隆4表现出约为2倍的亲和力(KD)。人源化变体表选出进一步改良的亲和力(Hu2和Hu3变体二者具有约为4倍的亲和力)。表8列出克隆1C6和克隆4以及人源化变体Hu2和Hu3的结合动力学以及亲和力。
表8
实施例11:功能分析
评估20种变体抗体的功能效应。评估抗体对CXCL9、CXCL10和CXCL11的细胞趋化性效应并且通过钙分析评估其对钙动员的抑制效应。
在10μg/ml克隆4,12,53,82,和135的人源化抗人类CXCR3抗体变体存在或不存在下评估人源CXCR3-转染300.19细胞向CXCR3配体CXCL9,CXCL10,和CXCL11的趋化性。在37℃下用10μg/ml人源化抗人源CXCR3抗体变体或商业抗体1C6预处理经转染细胞20min。将具有抗体的细胞转移到5微米transwell中并且将插入物分别置于含有100ng/ml或300ng/ml重组小鼠CXCL10和CXCL11或CXCL9的接收孔中。在37℃,5%C02下将趋化性板孵育4小时。移出transwell插入物将迁移至接收孔的细胞转移到U底的96孔板中,使其沉淀并再悬浮于钙黄绿素AM燃料中。在37℃,5%C02下将细胞孵育30min,洗涤一次,转移到黑色/清澈板中并且立即在FlexStation上于490/520nm下读数。数据表示为趋化性抑制%。图20提供展示了5种克隆中每一种不同变体抑制向CXCL9,CXCL10,和CXCL1的趋化性能力的代表性数据。
为评估对胞内钙动员的抑制,在不同浓度的抗CXCR3抗体变体或阳性对照抗体1C6存在或不存在下测量应答于CXCL10的转染人类CXCR3-Gqi4qi4的CHO细胞中的钙流动。将细胞接种(12,000个/孔)于384-黑板中并且使其粘附过夜。第二天,用钙敏感性染料Fluo-4NW将细胞加载40min,之后添加抗体并在37℃下培育。添加抗体将其孵育30min,之后以CXCL10的预定EC80浓度添加CXCR3配体重组人源CXCL10。使用电子多通道吸管手工进行染料添加,但抗体和激动剂添加是在FLIPR 上自动进行并且在添加CXCL10后立即在470-495nm上读取板。一式两份运行试样并且将各抗体浓度下的平均抑制%(±标准偏差)制成图表。克隆4Hu1不抑制钙动员并且在这些实验中用作阴性对照。图21显示5种克隆中的每一种不同变体抑制钙动员的能力并且与商业克隆1C6进行比较。在钙动员分析中抗体抗CXCL10的代表性IC50值(M)示于下表9中。
表9
表9中的(*)表示,1C6抗体不是嵌合抗体,而是抗人源CXCR3的完全小鼠IgG1抗体。
如表10中所示,结合动力学数据(参见实施例9)和功能分析结果充分相关。基于结合动力学数据和功能分析结果,选择克隆4和53用于进一步评估和4D人源化。
表10
实施例12:4D人源化
抗hCXCR3抗体克隆的4D人源化是如WO 2009/032661(例如[0037]-[0044]段)中所述进行。简言之,4D人源化包含:a)构建需要人源化的可变区3D模型;b)使用该可变区的3D模型的分子动力学模拟鉴别该区的挠性残基;c)通过比较3D模型的分子动力学轨迹和49个人类种系的分子动力学轨迹(从而比较抗体序列,如在传统人源化中进行)来鉴别最接近的人源种系;d)使并非CDR的一部分的挠性残基突变为人源种系对应部分(在步骤c中鉴别)。使用该方法设计重链4.4-4.6和轻链4.4-4.7。尤其是,设计初始4D人源化构建体(VH4.4和VL4.4)并且随后设计对重链和轻链的其他修饰(VH4.5-4.6和VL4.5-4.7)以引入稳定并且抗聚集的突变并消除其他不期望的基序。并且使用类似方法来设计4D人源化构建体VH53.7-53.10和VL53.10-53.13.
表11表明用于制备克隆4,12,53,82,和135的重链和轻链变体(包括人源化和4D人源化链(VH=重链;VK=轻链))的人源化策略(及其他修饰,若适用)。
通过Biacore全受体分析评估克隆4(4Hu6,4Hu7,4Hu8,4Hu9,4Hu10)的若干4D变体以评估结合动力学和CXCR3亲和力,并与克隆4嵌合抗体比较。如表2中所示,克隆4Hu6含有重链4.4和轻链4.4。克隆4Hu7含有重链4.4和轻链4.7。克隆4Hu8含有重链4.5和轻链4.5。克隆4Hu9含有重链4.5和轻链4.6。克隆4Hu10含有重链4.6和轻链4.4。
如表12中所示,当比较克隆4的4D建模变体和嵌合变体(4Ch)时,4/5的变体显示经改良的亲和力(KD)。然而,4D变体4Hu10显示降解接近1个数量级的亲和力。
表11
表12
曲线 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
4Ch 1.71E+05 8.57E-05 5.09E-10
4Hu6 4.76E+05 1.55E-04 3.27E-10
4Hu7 4.12E+05 1.33E-04 3.26E-10
4Hu8 3.27E+05 1.13E-04 3.49E-10
4Hu9 3.48E+05 1.34E-04 3.87E-10
4Hu10 3.55E+05 1.05E-03 2.96E-09
实施例13:NSG-PBL小鼠模型
在第0天用2E7新鲜一级人源聚蔗糖分离的外周血单核细胞(PBMC)注射NOD-scidIL2rγ无效(NSG)小鼠。在整个研究中在细胞转移后第3天开始每周用5mg/kg抗人源CXCR3嵌合抗体或对照人源IgG1(Herceptin)治疗动物(n=8只/组)两次。对起始后第14天获取的血液进行处理用流式细胞仪并且使用标准程序针对人源CD45(hCD45),人源CDS(hCD3),人源CD4(hCD4),人源CDS(hCD8)s的人源CXCR3抗体染色。针对hCD45+细胞对淋巴细胞门控中的细胞设门,之后针对hCD3+细胞设门。评估hCD45+hCD3+T细胞的hCD4和hCD8表达并测定人源CD4+CD5+CD3+T细胞和人源CD8+CD45+CD3+T细胞的百分比。测定表达CXCR3的人源CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比。图22中的各点代表单个小鼠,其中代表性数据是来自三次实验显示。数据显示,在异种GvHD(移植物抗宿主病)的NSG-PBL小鼠模型中进行抗CXCR3抗体治疗可以调节CXCR3表达T细胞。并且公开5种克隆间的功能差异。
表12显示患有异种GvHD的NSG-PBL小鼠在使用嵌合抗人源CXCR3候选抗体治疗后的中值存活。
表13
治疗 中值存活(天)
PBS 31
hulgG1 33.5
克隆4 43**
克嵌合隆体12 41
克嵌合隆体53 44*
克嵌合隆体82 36.5
克嵌合隆体135 45***
*,p=0.043;**p=0.016;***p=0.010抗CXCR3抗体治疗对应hulgGI治疗,使用对数秩测试。
上述实施例是用于阐述但并不限制本发明。结合本说明书和实践本文所公开的装置和方法,对于本领域技术人员而言使用所公开的装置和方法的其他实施例是显而易见的。

Claims (28)

1.一种能够结合C-X-C基序趋化因子受体3(CXCR3)的抗体或抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段包含如下6个互补决定区(CDRs):重链可变区(VH)CDR1、VH CDR2、VH CDR3,轻链可变区(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中:
VH CDR1的氨基酸序列为GFTFTSYA(SEQ ID NO:368);
VH CDR2的氨基酸序列为ISHGGTYT(SEQ ID NO:370);
VH CDR3的氨基酸序列为ARHPIYSGNYQGYFDY(SEQ ID NO:372);
VL CDR1的氨基酸序列为SGVNY(SEQ ID NO:375);
VL CDR2的氨基酸序列为FTS(SEQ ID NO:377);且
VL CDR3的氨基酸序列为QQFTSSPYT(SEQ ID NO:379)。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体或抗原结合片段是重组的抗体或抗原结合片段。
3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体或抗原结合片段是嵌合的抗体或抗原结合片段。
4.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体或抗原结合片段是经CDR移植的抗体或抗原结合片段.
5.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或抗原结合片段。
6.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体或抗原结合片段是突变去除一个或多个脱酰胺位点的抗体或抗原结合片段。
7.如权利要求5所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体或抗原结合片段是在CDR之外的区域进行了回复突变的抗体或抗原结合片段。
8.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中该抗体或抗原结合片段能够结合包含选自下组的肽的多肽:
a)包含SEQ ID NO:1的残基1-58的肽;
b)包含SEQ ID NO:1的残基1-16的肽;和
c)包含SEQ ID NO:1的残基1-37的肽。
9.如权利要求1的抗体或抗原结合片段,其中该抗体或抗原结合片段能够结合包含选自以下组的肽的多肽:
a)包含氨基酸序列SDHQVLNDAE的肽(SEQ ID NO:71);
b)包含氨基酸序列SDHQVLND的肽(SEQ ID NO:72);
c)包含氨基酸序列DHQVLND的肽(SEQ ID NO:73);
d)包含氨基酸序列VLNDAE的肽(SEQ ID NO:74);
e)包含氨基酸序列VLND的肽(SEQ ID NO:75);
f)包含氨基酸序列XDXXVXNDXX的肽(SEQ ID NO:76);
g)包含氨基酸序列XDXXVXND的肽(SEQ ID NO:77);
h)包含氨基酸序列DXXVXND的肽(SEQ ID NO:78);
i)包含氨基酸序列VXNDXX的肽(SEQ ID NO:79);
和j)包含氨基酸序列VXND的肽(SEQ ID NO:80),
其中X独立代表任意氨基酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段,该抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:
重链可变区包含与选自SED ID NO:38、40、42、44、46-48和63-66的序列至少95%一致的序列;轻链可变区包含与选自SED ID NO:39、41、43、45、49-54和67-70的序列至少95%一致的序列;并且
VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3与权利要求1中的100%相同。
11.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中:
重链可变区包含选自下组的氨基酸序列:SED ID NO:38、40、42、44、46-48和63-66;以及轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列:SED ID NO:39、41、43、45、49-54和67-70。
12.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段,其包含重链可变区,其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:48至少95%一致的氨基酸序列;并且
VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3与权利要求1中的100%相同。
13.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段,其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
14.如权利要求10所述的抗体或抗原结合片段,其中所述重链可变区包含与SEQ IDNO:48至少95%一致的氨基酸序列;并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:41至少95%一致的氨基酸序列。
15.如权利要求10所述的抗体或抗原结合片段,其中所述重链可变区包含与SEQ IDNO:48至少98%一致的氨基酸序列;并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:41至少98%一致的氨基酸序列。
16.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中该抗体或抗原结合片段包含选自下组的重链和轻链可变区的组合:
SEQ ID NOs:38和39;SEQ ID NOs:40和41;SEQ ID NOs:42和43SEQ ID NOs:44和45;SEQ ID NOs:40和43;SEQ ID NOs:42和41;SEQ ID NOs:42和49;SEQ ID NOs:42和50;SEQID NOs:42和51;SEQ ID NOs:42和52;SEQ ID NOs:42和53;SEQ ID NOs:42和54;SEQ IDNOs:46和43;SEQ ID NOs:47和43;SEQ ID NOs:48和43;SEQ ID NOs:40和49;SEQ ID NOs:40和51;SEQ ID NOs:48和49;SEQ ID NOs:48和51;SEQ ID NOs:63和67;以及SEQ ID NOs:63和68。
17.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其中该抗体或抗原结合片段能够以1x108M-1至1x1011Μ-1的亲和力常数优先结合至CXCR3。
18.一种分离的核酸,其编码如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列。
19.一种载体,其包含如权利要求18所述的分离的核酸。
20.一种宿主细胞,其包含如权利要求19所述的载体。
21.一种产生如权利要求1中所述的抗体或抗原结合片段的方法,其包含在适于产生抗体或抗原结合片段的条件下在培养基中培养权利要求20中所述的宿主细胞。
22.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段在制备药物中的用途,所述药物用于在受试者中预防、治疗新发生的I型糖尿病(T1D)或减少其进展。
23.如权利要求22所述的用途,其中所述药物经配制从而以0.03-3.7mg/kg/剂的剂量递送所述抗体或抗原结合片段。
24.如权利要求22或23所述的用途,其中所述药物经配制从而在全部施用中以0.16-18mg/kg的总剂量递送所述抗体或抗原结合片段。
25.一种偶联物,其包含权利要求1所述的抗体或抗原结合片段以及至少一种其他试剂,其中所述的其他试剂是治疗剂、增溶剂、稳定剂、免疫抑制剂、受体或抗原结合肽。
26.一种药物组合物,其包含如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段或权利要求18中所述的分离的核酸以及药学上可接受的载体。
27.如权利要求26所述的药物组合物,其中该组合物进一步包含至少一种其他治疗剂,所述治疗剂选自由β-细胞刺激剂、胰岛素和胰岛素产生细胞组成的组。
28.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段在制造用于体外检测测试试样中CXCR3存在或浓度的产品中的用途,其中使该测试试样与所述抗体或抗原结合片段以及可检测标记接触,并且CXCR3的存在或浓度与该可检测标记产生的信号直接或间接相关。
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