CN104498382A - 一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂及其制备方法，从采自福建省厦门市海沧、同安等港口的淤泥样品中筛选分离得到降解亚硝酸盐效果最佳的一菌株，并从福建省宁德市滩涂淤泥样中筛选得到降解亚硝酸盐效果最佳的另一菌株；两菌株分别为沼泽红假单胞菌菌株PSB20（ Rhodopseudomonas palustris ）、枯草芽孢杆菌菌株ND04（ Bacillus subtilis ）；利用两菌株制备所得的微生物制剂，能够降解水产养殖水环境中的氨氮、亚硝酸，且对饵料残留有机质也具有较好的分解效果，同时还能一定程度上对养殖水体中治病弧菌起到抑制生长的效果，即具有较好的生产应用前景；此外，该生物制剂还具备制备方法简单的特点。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖水质改良技术领域，尤其涉及一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂及其制备方法。
背景技术
随着水产养殖业的发展，池塘逐年老化，养殖水质、底质受到严重污染，导致养殖病害频繁发生，水质改良成为健康养殖的主要措施之一。
近年来，水质改良剂的研究也在不断的发展中。传统的水质改良剂利用物理和化学的原理，通过吸附或增加水体溶氧来改善水质，效率较低，无法解决目前高密度养殖模式下的水质净化的要求，因此目前在养殖水质改良方面使用较多的是生物水质改良剂，主要成分为: 光合细菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、硝化细菌、反硝化细菌、酵母菌、假单胞菌、双歧杆菌等，其中光合细菌、芽孢杆菌、硝化细菌、反硝化细菌为常见的微生态水产养殖水质改良剂制剂；如专利号为CN200910044291.3、名称为“一种水质改良剂或饲料、肥料增效剂及其生产方法”的中国发明专利中就揭露了以芽孢杆菌、光合细菌、硝化细菌、乳酸菌、放射菌和酵母菌组成的微生物制剂，该微生物制剂中生物生长促进剂的含量为50-100亿个/克，功效是：1、可促进浮游动植物的生长繁殖速度，提高浮游植物对水体中的氮、磷、钾等物质的转化吸收能力，从而提高肥料效果，提高渔业效益。2、可提高氮、磷、钾等物质向浮游植物的转化效率，促进浮游植物生长，预防藻类水华的发生。
目前世界上普遍认为生物防治可能是解决水产养殖病害较为行之有效的途径之一，但国内外还暂未发现专门防水产养殖中各种病害的生物杀菌药剂，所以，研发出一种能够有效防治水产养殖病害的微生物菌剂是本领域技术人员所迫切希望地。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂，并同时揭露了该微生物制剂的制备方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂，其由以下质量百分数的组分组成：
经培养、浓缩及固化后的菌株PSB20 5-25%；
经扩培、固化后的菌株ND04 10-25%；
余量为载体；
其中：
所述载体为硅藻土或沸石粉，且硅藻土、沸石粉的粉碎细度均为120-250目；
所述菌株PSB20为沼泽红假单胞菌菌株PSB20（Rhodopseudomonas palustris），于2014年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No: 9632；
所述菌株ND04为枯草芽孢杆菌菌株ND04（Bacillus subtilis），于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No: 9545。
同时揭露了上述应用于水产养殖环境改良的微生物制剂的制备方法，该制备方法的具体步骤为：
（1）沼泽红假单胞菌菌株PSB20的培养：取所述的沼泽红假单胞菌菌株PSB20并将其接种至培养基Ⅰ中，且于25-35℃、2500-3500lx下光照培养72-144h，当培养液的OD660达1.5-2.2时即制得种子液；接着按5-20%接种量将种子液接种至透明塑料农膜，于30~35℃、并利用太阳光光照进行塑料薄膜培养，培养时间3~5天，且阴天、及夜晚时采用60W/25L白炽灯照射，当菌液呈现深红则培养完成；
（2）沼泽红假单胞菌菌株PSB20的浓缩及固化：往步骤（1）培养好获得的菌液中添加絮凝剂，静置过夜絮凝，去上清；接着依次添加保护剂、权利要求1所述的载体，然后于30-40℃下风干，得固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20，备用；
其中，絮凝剂的添加量为步骤（1）培养好获得的菌液体积的5-15%；保护剂的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加保护剂0.1-0.5g；载体的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加载体50-2000g；且载体为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉；
（3）枯草芽孢杆菌菌株ND04的扩培及固化：取所述的枯草芽孢杆菌菌株ND04并将其接种至培养基Ⅱ中，且于30-40℃、150-200rpm下培养24-48h，制得种子液；接着将所得种子液按5-10%接种量接种至发酵培养基，于30-40℃、pH6.5-8、50-200 rpm条件下发酵培养24-48h；发酵结束后的发酵液于50-70℃下烘干，得固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04，备用；
（4）复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25% 步骤（2）所得的固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20、10-25% 步骤（3）所得的固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04、余量为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的微生物制剂。
进一步地，所述絮凝剂为浓度为0.5-1.0g/L的硫酸铝钾溶液，保护剂为固体海藻糖。
进一步地，所述培养基Ⅰ的组分为：醋酸钠3.3g、磷酸二氢钾0.6g、氯化铵1.0g、硫酸镁0.3g、氯化钙0.05g、氯化钠1.0g、酵母膏1.0g、硫酸锰0.023g、硫酸亚铁0.005g、水1000mL，pH7.5~8.5；所述塑料薄膜培养所用的培养基为PSB培养基，其组分为：氯化铵1.0g、醋酸钠3.5g、氯化镁 2.0g、氯化钙 0.1g、磷酸二氢钾 0.6g、磷酸氢二钾 0.4g、酵母膏0.1g、水1000mL、pH 7.2；所述培养基Ⅱ为牛肉膏蛋白胨培养基，其组分为：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、氯化钠 5.0g、水 1000mL、 pH7.2-7.4；所述发酵培养基的组分为：糖蜜1-3%、大豆粕0.1-0.3%、玉米粉0.1-0.3%、硫酸镁0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.03-0.06%、碳酸钙0.05-0.15%；且培养基中的百分比均为质量百分比。
本发明的有益效果在于：
通过利用沼泽红假单胞菌菌株PSB20、枯草芽孢杆菌菌株ND04（Bacillus subtilis）制备所得的微生物制剂，能够降解水产养殖水环境中的氨氮、亚硝酸，且对饵料残留有机质也具有较好的分解效果，同时还能一定程度上对养殖水体中治病弧菌起到抑制生长的效果，即具有较好的生产应用前景；此外，该生物制剂还具备制备方法简单的特点。
具体实施方式
本发明中涉及两菌株即沼泽红假单胞菌菌株PSB20、及枯草芽胞杆菌菌株DN04；其中，沼泽红假单胞菌菌株PSB20是从采自福建省厦门市海沧、同安等港口的淤泥样品中筛选分离得到的对改良水体环境有促进作用的功能菌株，枯草芽胞杆菌菌株DN04是从福建省宁德市滩涂淤泥样中筛选得到的对改良水体环境有促进作用的功能菌株；并分别采用16s rDNA法对这两菌株进行测序分析，最终鉴定它们分别为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）的一个菌株、及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个菌株。
1、第一个菌株的分离：
（1） 初筛：称取10g滩涂淤泥样品，并加至100mL 0.85%NaCl中，搅拌后取上层浊液置于富集培养基，且于34℃、3000lx光照富集培养至菌液变红；取红色菌液进行梯度稀释后在分离培养基上用双层平板法进行分离操作，挑取分离培养基上长起的红色菌落，保存备用。
（2）复筛：取初筛得到的不同红色菌落并置于富集培养基中，34℃、3000lx光照培养至菌液变红、且OD660为1.5，接着按10%接种量接种至含有初始浓度为500mg/L亚硝酸钠的富集培养基中，34℃、3000lx光照培养5天，使用N-(1-萘基)-胺光法测量其亚硝酸盐含量，比较其降解效果进而筛选出降解亚硝酸盐效果最佳的菌株，将该菌株标记为菌株PSB20。
2、第一个菌株的鉴定：
将筛选所得菌株PSB20接种至分离培养基，于34℃、3000lx光照培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：红色菌落，表面光滑，边缘整齐，不透明，无芽孢，革兰氏阴性。同时对该菌株进行16S rDNA测定，得其16s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
需要说明的是，上述富集培养基的组分均为：氯化铵0.1g，碳酸氢钠0.1g，磷酸氢二钾 0.02g，醋酸钠0.3g，硫酸镁0.02g，氯化钠0.2g，生长因子 1mL，微量元素溶液1mL，蒸馏水97mL，pH7.0；分离培养基的组分均为：氯化铵 1.0g，醋酸钠3.5g，硫酸镁0.1g，氯化钙0.1g，磷酸二氢钾 0.6g，磷酸氢二钾 0.4g，酵母膏0.1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）；则结合生理生化测定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株PSB20为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）的一个菌株。
3、第二个菌株的分离：
（1）初筛：称取10g滩涂淤泥样品，并加至100mL 0.85%NaCl中，搅拌后取上层浊液置于LB培养基，且于37℃、180rpm下富集培养，富集培养30h后，将菌液置于75℃水浴20min，水浴后的菌液进行梯度稀释及平板涂布法进行分离操作，之后挑取LB平板上长起的不同菌落形态的芽孢杆菌，保存备用。
（2）复筛：挑取初筛得到的不同菌落形态的芽孢杆菌并置于LB培养基中，于37℃、180rpm条件下进行活化，活化6h后，按5%接种量接入含有初始浓度为0.5g/L亚硝酸钠的无机盐培养基中，并于37℃、180rpm下摇床震荡培养30h，使用N-(1-萘基)-胺光法测量其亚硝酸盐含量，比较其降解效果进而筛选出降解亚硝酸盐效果最佳的菌株，将该菌株标记为菌株ND04。
其中，无机盐培养基的组分为：磷酸二氢钾 0.5g，磷酸氢二钾 0.5g，硫酸镁 0.2g，氯化钙 0.1g，氯化钠0.2g，硫酸锰0.005g，亚硝酸钠0.5g，水1000mL，pH7.0。
4、第二个菌株的鉴定
将筛选所得的菌株ND04接种至LB固体培养基，37℃培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：菌落白色微黄，表面粗糙，不透明，革兰氏阳性，产芽孢，葡萄糖发酵阳性，水解淀粉阳性。同时对该菌株进行16S rDNA测定，得其16s rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。
将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；则结合生理生化测定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株ND04为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个菌株。
5．一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂，其由以下质量百分数的组分组成：
经培养、浓缩及固化后的菌株PSB20 5-25%；
经扩培、固化后的菌株ND04 10-25%；
余量为载体；
所述载体为硅藻土或沸石粉，且硅藻土、沸石粉的粉碎细度均为120-250目。
且该微生物制剂制备方法的具体操作步骤如下：
（1）沼泽红假单胞菌菌株PSB20的培养：取沼泽红假单胞菌菌株PSB20并将其接种至培养基Ⅰ中，且于25-35℃、2500-3500lx下光照培养72-144h，当培养液的OD660达1.5-2.2时即制得种子液；接着按5-20%接种量将种子液接种至透明塑料农膜，于30~35℃、并利用太阳光光照培养3~5天，且阴天、及夜晚时采用60W/25L白炽灯照射，当菌液呈现深红则培养完成；
（2）沼泽红假单胞菌菌株PSB20的浓缩及固化：往步骤（1）培养好获得的菌液中添加絮凝剂，静置过夜絮凝，去上清；接着依次添加保护剂、权利要求1所述的载体，然后于30-40℃下风干，得固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20，备用；
其中，絮凝剂的添加量为步骤（1）培养好获得的菌液体积的5-15%；保护剂的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加保护剂0.1-0.5g；载体的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加载体50-2000g；且载体为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉；
（3）枯草芽孢杆菌菌株ND04的扩培及固化：取所述的枯草芽孢杆菌菌株ND04并将其接种至培养基Ⅱ中，且于30-40℃、150-200rpm下培养24-48h，制得种子液；接着将所得种子液按5-10%接种量接种至发酵培养基，于30-40℃、pH6.5-8、50-200 rpm条件下发酵培养24-48h；发酵结束后的发酵液于50-70℃下烘干，得固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04，备用；
（4）复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25% 步骤（2）所得的固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20、10-25% 步骤（3）所得的固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04、余量为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的微生物制剂。
其中，所述培养基Ⅰ的组分为：醋酸钠3.3g、磷酸二氢钾0.6g、氯化铵1.0g、硫酸镁0.3g、氯化钙0.05g、氯化钠1.0g、酵母膏1.0g、硫酸锰0.023g、硫酸亚铁0.005g、水1000mL，pH7.5~8.5；所述塑料薄膜培养所用的培养基为PSB培养基，其组分为：氯化铵1.0g、醋酸钠3.5g、氯化镁 2.0g、氯化钙 0.1g、磷酸二氢钾 0.6g、磷酸氢二钾 0.4g、酵母膏0.1g、水1000mL、pH 7.2；所述培养基Ⅱ为牛肉膏蛋白胨培养基，其组分为：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、氯化钠 5.0g、水 1000mL、 pH7.2-7.4；所述发酵培养基的组分为：糖蜜1-3%、大豆粕0.1-0.3%、玉米粉0.1-0.3%、硫酸镁0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.03-0.06%、碳酸钙0.05-0.15%；且培养基中的百分比均为质量百分比。
需要说明的是，本发明中所涉及到的：LB培养基的组分均为：蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，H20 1000 mL；固体LB培养基、SLB培养基的组分均为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，H20 1000 mL。絮凝剂还可以选择壳聚糖或甲壳素；保护剂还可选明胶或甘油。
为了更好的对本发明中微生物制剂进行进一步阐述说明，申请人例举了如下实施例。
实施例一
菌株PSB20的培养：取菌株PSB20并将其接种至培养基Ⅰ中，且于27℃、2500lx下光照培养72h，当培养液的OD660达1.5时即制得种子液；接着按10%接种量将种子液接种至透明塑料农膜，于30~35℃（当当天温度过高时则采用喷水进行降温）、并利用太阳光光照培养3天，且阴天、及夜晚时采用60W/25L白炽灯照射，当菌液呈现深红则培养完成。
菌株PSB20的浓缩及固化：往菌株PSB20培养好获得的菌液中添加浓度为 0.5g/L的硫酸铝钾溶液，静置过夜絮凝，去上清；接着依次添加固体海藻糖、硅藻土（粉碎细度120目），然后于30℃下风干，得固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20，备用；
其中，硫酸铝钾溶液的添加量为菌株PSB20培养好获得的菌液体积的5%；固体海藻糖的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加固体海藻糖0.1g；硅藻土的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加硅藻土1000g。
菌株ND04的扩培及固化：取菌株ND04并将其接种至培养基Ⅱ中，且于30℃、150rpm下培养24h，制得种子液；接着将所得种子液按5%接种量接种至发酵培养基，于30℃、pH6.5、100 rpm条件下发酵培养24h；发酵结束后的发酵液于50℃下烘干，得固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04，备用。
复配：先按照下列质量百分数称取组分：10%所得的固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20、15%所得的固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04、75%粉碎细度120目的硅藻土；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，即得所述的微生物制剂。
实施例二
菌株PSB20的培养：取菌株PSB20并将其接种至培养基Ⅰ中，且于30℃、3000lx下光照培养96h，当培养液的OD660达1.7时即制得种子液；接着按5%接种量将种子液接种至透明塑料农膜，于30~35℃（当当天温度过高时则采用喷水进行降温）、并利用太阳光光照培养5天，且阴天、及夜晚时采用60W/25L白炽灯照射，当菌液呈现深红则培养完成。
菌株PSB20的浓缩及固化：往菌株PSB20培养好获得的菌液中添加浓度为 0.7g/L的硫酸铝钾溶液，静置过夜絮凝，去上清；接着依次添加固体海藻糖、沸石粉（粉碎细度250目），然后于40℃下风干，得固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20，备用；
其中，硫酸铝钾溶液的添加量为菌株PSB20培养好获得的菌液体积的10%；固体海藻糖的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加固体海藻糖0.3g；沸石粉的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加沸石粉1000g。
菌株ND04的扩培及固化：取菌株ND04并将其接种至培养基Ⅱ中，且于35℃、170rpm下培养30h，制得种子液；接着将所得种子液按7%接种量接种至发酵培养基，于35℃、pH6.5、130 rpm条件下发酵培养36h；发酵结束后的发酵液于60℃下烘干，得固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04，备用。
复配：先按照下列质量百分数称取组分：15%所得的固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20、20%所得的固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04、65%粉碎细度250目的沸石粉；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，即得所述的微生物制剂。
实施例三
菌株PSB20的培养：取菌株PSB20并将其接种至培养基Ⅰ中，且于34℃、3500lx下光照培养120h，当培养液的OD660达1.9时即制得种子液；接着按15%接种量将种子液接种至透明塑料农膜，于30~35℃（当当天温度过高时则采用喷水进行降温）、并利用太阳光光照培养4天，且阴天、及夜晚时采用60W/25L白炽灯照射，当菌液呈现深红则培养完成；
菌株PSB20的浓缩及固化：往菌株PSB20培养好获得的菌液中添加浓度为 1.0g/L的硫酸铝钾溶液，静置过夜絮凝，去上清；接着依次添加固体海藻糖、硅藻土（粉碎细度1800目），然后于35℃下风干，得固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20，备用；
其中，硫酸铝钾溶液的添加量为菌株PSB20培养好获得的菌液体积的15%；固体海藻糖的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加固体海藻糖0.5g；沸石粉的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加沸石粉1500g。
菌株ND04的扩培及固化：取菌株ND04并将其接种至培养基Ⅱ中，且于37℃、170rpm下培养48h，制得种子液；接着将所得种子液按5%接种量接种至发酵培养基，于35℃、pH7.0、150 rpm条件下发酵培养48h；发酵结束后的发酵液于70℃下烘干，得固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04，备用；
复配：先按照下列质量百分数称取组分：20%所得的固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20、25%所得的固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04、55%粉碎细度180目的硅藻土；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，即得所述的微生物制剂。
6．对水产养殖环境的改良试验
试验一：实施例一制备所得微生物制剂对水产养殖环境的改良试验
（1）试验方法：取实施例一制备所得微生物制剂在养殖南美白对虾虾塘使用：设计一组对照组，一组实验组；实验组中每立方米水体每次使用2g实施例一制备所得微生物制剂，使用时兑水稀释10倍后进行全池泼洒，且每周使用一次；对照组为空白对照，即不使用实施例一制备所得微生物制剂；一个月后取虾塘水样检测其氨氮、亚硝酸、弧菌总数及有机质含量。
（2）试验结果：没有使用实施例一制备所得微生物制剂的对照组氨氮测量值为0.6mg/L、亚硝酸测量值为0.1mg/L、弧菌总数为850个/ml、有机质含量为1.3%；而实验组的氨氮测量值为0.2mg/L、亚硝酸测量值为0.01mg/L、弧菌总数为570个/ml、有机质含量为0.79%；即试验组虾塘的水质明显得以提高。
试验二：实施例二制备所得微生物制剂对水产养殖环境的改良试验
（1）试验方法：取实施例二制备所得微生物制剂在养殖南美白对虾虾塘使用：设计一组对照组，一组实验组；实验组中每立方米水体每次使用2g实施例二制备所得微生物制剂，使用时兑水稀释10倍后进行全池泼洒，且每周使用一次；对照组为空白对照，即不使用实施例三制备所得微生物制剂；一个月后取虾塘水样检测其氨氮、亚硝酸、弧菌总数及有机质含量。
（2）试验结果：没有使用实施例二制备所得微生物制剂的对照组氨氮测量值为0.6mg/L、亚硝酸测量值为0.1mg/L、弧菌总数为850个/ml、有机质含量为1.3%；而实验组的氨氮测量值＜0.2mg/L、亚硝酸测量值为0.01mg/L、弧菌总数为480个/ml、有机质含量为0.73%；即试验组虾塘的水质明显得以提高。
试验三：实施例三制备所得微生物制剂对水产养殖环境的改良试验
（1）试验方法：取实施例三制备所得微生物制剂在养殖南美白对虾虾塘使用：设计一组对照组，一组实验组；实验组中每立方米水体每次使用5g实施例二制备所得微生物制剂，使用时兑水稀释10倍后进行全池泼洒，且每周使用一次；对照组为空白对照，即不使用实施例三制备所得微生物制剂；一个月后取虾塘水样检测其氨氮、亚硝酸、弧菌总数及有机质含量。
（2）试验结果：没有使用实施例三制备所得微生物制剂的氨氮测量值为0.6mg/L、亚硝酸测量值为0.1mg/L、弧菌总数为850个/ml、有机质含量为1.3%；而实验组的氨氮测量值为＜0.2mg/L、亚硝酸测量值为0.05mg/L、弧菌总数为440个/ml、有机质含量为0.67%；即试验组虾塘的水质明显得以提高。
综上可知，本发明利用沼泽红假单胞菌菌株PSB20、枯草芽孢杆菌菌株ND04（Bacillus subtilis）制备所得的微生物制剂，能够降解水产养殖水环境中的氨氮、亚硝酸，且对饵料残留有机质也具有较好的分解效果，同时还能一定程度上对养殖水体中治病弧菌起到抑制生长的效果，即具有较好的生产应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家海洋局第三海洋研究所
<120> 一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂及其制备方法
<130> 10000
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）
<400> 1
ggacgggcgg cagcttacac atgcaagtcg aacgggcgta gcaatacgtc agtggcagac 60
gggtgagtaa cgcgtgggaa cgtacctttt ggttcggaac aacacaggga aacttgtgct 120
aataccggat aagcccttac ggggaaagat ttatcgccga aagatcggcc cgcgtctgat 180
tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc agtagctggt ctgagaggat 240
gatcagccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa 300
tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg 360
gttgtaaagc tcttttgtgc gggaagataa tgacggtacc gcaagaataa gccccggcta 420
acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgctcgga atcactgggc 480
gtaaagggtg cgtaggcggg tttctaagtc agaggtgaaa gcctggagct caactccaga 540
actgcctttg atactggaag tcttgagtat ggcagaggtg agtggaactg cgagtgtaga 600
ggtgaaattc gtagatattc gcaagaacac cagtggcgaa ggcggctcac tgggccatta 660
ctgacgctga ggcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 720
ccgtaaacga tgaatgccag ccgttagtgg gtttactcac tagtggcgca gctaacgctt 780
taagcattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 840
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgacgcaac gcgcagaacc ttaccagccc 900
ttgacatgtc caggaccggt cgcagagacg tgaccttctc ttcggagcct ggagcacagg 960
tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1020
caacccccgt ccttagttgc taccatttag ttgagcactc taaggagact gccggtgata 1080
agccgcgagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgggc tgggctacac 1140
acgtgctaca atggcggtga caatgggaag ctaaggggtg acccttcgca aatctcaaaa 1200
agccgtctca gttcggattg ggctctgcaa ctcgagccca tgaagttgga atcgctagta 1260
atcgtggatc agcatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag ttggctttac ctgaagacgg tgcgctaacc cgcaaggggg gcagccggcc 1380
acggtagggt cagcgactgg gggaagtcga acaagtgcat gccc 1424
<210> 2
<211> 1475
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 2
aacctggcct cggactaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg 180
gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg 420
aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540
ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600
ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720
taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac 1260
aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg agccagccgc 1440
cgaaggtggg acagatgatg ggggaagtcg atcaa 1475
Claims (4)
1.一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂，其特征在于：由以下质量百分数的组分组成：
经培养、浓缩及固化后的菌株PSB20 5-25%；
经扩培、固化后的菌株ND04 10-25%；
余量为载体；
其中：
所述载体为硅藻土或沸石粉，且硅藻土、沸石粉的粉碎细度均为120-250目；
所述菌株PSB20为沼泽红假单胞菌菌株PSB20（Rhodopseudomonas palustris），于2014年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No: 9632；
所述菌株ND04为枯草芽孢杆菌菌株ND04（Bacillus subtilis），于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No: 9545。
2.一种权利要求1所述应用于水产养殖环境改良的微生物制剂的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）沼泽红假单胞菌菌株PSB20的培养：取权利要求1中所述的沼泽红假单胞菌菌株PSB20并将其接种至培养基Ⅰ中，且于25-35℃、2500-3500lx下光照培养72-144h，当培养液的OD660达1.5-2.2时即制得种子液；接着按5-20%接种量将种子液接种至透明塑料农膜，于30~35℃、并利用太阳光光照进行塑料薄膜培养，培养时间3~5天，且阴天、及夜晚时采用60W/25L白炽灯照射，当菌液呈现深红则培养完成；
（2）沼泽红假单胞菌菌株PSB20的浓缩及固化：往步骤（1）培养好获得的菌液中添加絮凝剂，静置过夜絮凝，去上清；接着依次添加保护剂、权利要求1所述的载体，然后于30-40℃下风干，得固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20，备用；
其中，絮凝剂的添加量为步骤（1）培养好获得的菌液体积的5-15%；保护剂的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加保护剂0.1-0.5g；载体的添加量为：每1L经絮凝后得到的浓稠菌液中添加载体50-2000g；且载体为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉；
（3）枯草芽孢杆菌菌株ND04的扩培及固化：取权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌菌株ND04并将其接种至培养基Ⅱ中，且于30-40℃、150-200rpm下培养24-48h，制得种子液；接着将所得种子液按5-10%接种量接种至发酵培养基，于30-40℃、pH6.5-8、50-200 rpm条件下发酵培养24-48h；发酵结束后的发酵液于50-70℃下烘干，得固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04，备用；
（4）复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25% 步骤（2）所得的固化后的沼泽红假单胞菌菌株PSB20、10-25% 步骤（3）所得的固化后的枯草芽孢杆菌菌株ND04、余量为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的微生物制剂。
3.根据权利要求2所述一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述絮凝剂为浓度为0.5-1.0g/L的硫酸铝钾溶液，保护剂为固体海藻糖。
4.根据权利要求2所述一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述培养基Ⅰ的组分为：醋酸钠3.3g、磷酸二氢钾0.6g、氯化铵1.0g、硫酸镁0.3g、氯化钙0.05g、氯化钠1.0g、酵母膏1.0g、硫酸锰0.023g、硫酸亚铁0.005g、水1000mL，pH7.5~8.5；所述塑料薄膜培养所用的培养基为PSB培养基，其组分为：氯化铵1.0g、醋酸钠3.5g、氯化镁 2.0g、氯化钙 0.1g、磷酸二氢钾 0.6g、磷酸氢二钾 0.4g、酵母膏0.1g、水1000mL、pH 7.2；所述培养基Ⅱ为牛肉膏蛋白胨培养基，其组分为：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、氯化钠 5.0g、水 1000mL、 pH7.2-7.4；所述发酵培养基的组分为：糖蜜1-3%、大豆粕0.1-0.3%、玉米粉0.1-0.3%、硫酸镁0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.03-0.06%、碳酸钙0.05-0.15%；且培养基中的百分比均为质量百分比。
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