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CN104459135B - 检测样本阴阳性的设备、方法及判断标准的确定方法 - Google Patents

检测样本阴阳性的设备、方法及判断标准的确定方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于判断未知样本阴阳性的判断标准的确定方法、提高细胞表面抗原表达检测准确性的方法以及检测样本阴阳性的设备，将被测体液样本与荧光检测试剂混合处理，得到染色后的被测样本液，采用流式细胞仪检测被测样本液，得到被测样本液的荧光强度，计算被测样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值，将所述差值与预设的荧光临界值进行比较，根据比较结果判断细胞表面抗原的表达。本申请确定了一个适合的值作为荧光临界值，减少了非特异性结合对检测结果的干扰，提高了对HLA‑B27抗原表达检测结果的准确性。

Description

检测样本阴阳性的设备、方法及判断标准的确定方法
技术领域
本申请涉及未知样本抗原表达阴阳性检测，尤其涉及一种用于判断未知样本中抗原表达阴阳性的判断标准的确定方法、提高细胞表面抗原表达检测准确性的方法以及检测样本阴阳性的设备。
背景技术
人类白细胞表面抗原（Human Leukocyte Antigen，HLA）是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。根据HLA结构、功能和组织分布的不同可分为三类：Ⅰ类分子为HLA-A、HLA-B及HLA-C系列抗原，其广泛分布于各组织有核细胞表面；Ⅱ类分子为HLA-DR、HLA-DP及HLA-DQ系列抗原，其主要在B淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达；Ⅲ类分子为补体成分。
HLA-B27抗原属于I型MHC，基本上表达在机体所有有核细胞上，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，在临床研究上需要测量白细胞表面HLA-B27抗原的表达。HLA-B27抗原属于B7交叉反应族（Cross-reaction Group HLA-B7，CREG HLA-B7）成员，B7交叉反应族成员包括HLA-B27、HLA-B7、HLA-B42、HLA-B22、HLA-B40以及HLA-B13等一系列抗原。HLA-B27抗原对应的HLA-B27单克隆抗体均可与B7交叉反应族成员有不同程度的交叉反应。
目前，HLA-B27抗原表达水平检测的方法主要有：补体依赖的细胞毒试验（Complement dependent cytotoxicity，CDC）、酶联免疫测定试验（Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）、聚合酶链式反应检测法（Polymerase Chain Reaction，PCR）以及流式细胞法（Flow Cytometry，FCM）。FCM因其无需分离淋巴细胞，操作简单且具有很高的灵敏度和特异性，因此被广泛使用。
FCM主要是利用荧光标记的HLA-B27抗原对应的单克隆抗体，与淋巴细胞表面的HLA-B27抗原结合，使淋巴细胞发出一定的荧光，这种荧光的荧光强度值可被流式细胞仪测定，通过所测定的荧光强度值的高低判断淋巴细胞表面是否存在HLA-B27抗原，从而判断样本的阴阳性。现有的一种采用FCM检测HLA-B27抗原表达的方案是：采用FITC-HLA-B27/PE-CD3双色试剂和样本反应，通过流式细胞仪分析CD3阳性细胞FITC通道荧光值的强弱，将荧光值的中位值和试剂瓶上预设的临界值比较来判定样本的阴阳性，该方法操作较简单，但结果有时不够准确。
发明内容
本申请提供一种用于判断未知样本阴阳性的判断标准的确定方法、提高细胞表面抗原表达检测准确性的方法以及检测样本阴阳性的设备，提高细胞表面抗原表达检测结果的准确性。
根据本申请的第一方面，本申请提供一种用于判断未知样本阴阳性的判断标准的确定方法,包括：
将多个试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，得到各自的试验样本液，该多个试验样本针对于感兴趣抗原已知被确定为阴性或阳性，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
采用流式细胞仪检测各试验样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
根据该试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值，计算该试验样本液的荧光强度；
计算试验样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的差值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的荧光临界值。
在另一具体实施例中，荧光检测试剂中还包括采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质的发光波长与第一荧光物质的发光波长不同，所述方法还包括：
在采用流式细胞仪检测各试验样本液的过程中，还检测试验样本液中各细胞发出的第二荧光物质的荧光信号，获得第二荧光强度值；
在由同型对照样本液的感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的同型对照散点图中，设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；
在由试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的试验样本散点图中，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占试验样本散点图中全部细胞数的比值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的比值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的比值临界值。
根据本申请的第二方面，本申请提供一种提高细胞表面抗原表达检测准确性的方法，包括：
将被测样本与荧光检测试剂混合处理，得到染色后的被测样本液，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
采用流式细胞仪检测被测样本液，检测被测样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值计算被测样本液的荧光强度；
计算被测样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值，所述差值用于与预设的荧光临界值进行比较。
在另一实施例中，所述荧光检测试剂中还包括采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质的发光波长与第一荧光物质的发光波长不同，所述方法还包括：
在采用流式细胞仪检测被测样本液的过程中，还检测被测样本液中各细胞发出的第二荧光强度值；
在由同型对照样本液的感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的同型对照散点图中，设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；
在由被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的被测样本散点图中，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占被测样本散点图中全部细胞数的比值；所述比值用于与预设的比值临界值进行比较。
根据本申请的第三方面，本申请还提供一种用于检测细胞表面抗原表达的设备，包括：
样本液制备系统，用于将被测体液样本与荧光检测试剂混合处理，得到染色后的被测样本液，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
流式细胞仪，用于检测被测样本液，所述流式细胞仪检测被测样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
数据处理系统，用于接收流式细胞仪输出的数据，根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值计算被测样本液的荧光强度，计算被测样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值，所述差值用于与预设的荧光临界值进行比较。
在另一实施例中，所述荧光检测试剂中还包括采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质发光波长与第一荧光物质的发光波长不同，所述流式细胞仪在检测被测样本液的过程中，还检测被测样本液中各细胞发出的第二荧光物质的荧光信号，获得第二荧光强度值；所述数据处理系统根据同型对照样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成二维的同型对照散点图，在同型对照散点图中设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成被测样本散点图，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占被测样本散点图中全部细胞数的比值；所述比值用于与预设的比值临界值进行比较。
本申请可确定一个适合的值作为荧光临界值，减少了非特异性结合对检测结果的干扰，提高了对HLA-B27抗原表达检测结果的准确性。
附图说明
图1为本申请一种实施例中检测细胞表面抗原表达设备的结构示意图；
图2为本申请一种实施例中确定判断标准的流程图；
图3为本申请另一种实施例中检测细胞表面抗原表达的流程图；
图4为被测样本1的散射光的散点图；
图5为被测样本1的同型对照散点图；
图6为被测样本1的被测样本散点图；
图7为被测样本2的散射光的散点图；
图8为被测样本2的同型对照散点图；
图9为被测样本2的被测样本散点图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
细胞表面抗原通常分布于各组织中的有核细胞表面，通过分析发现，荧光标记的单克隆抗体与淋巴细胞表面HLA-B27抗原存在非特异性结合，而这种非特异性结合对HLA-B27抗原的阳性或阴性的判断会造成干扰，例如，某些淋巴细胞表面HLA-B27抗原真实呈阴性，而由于上述非特异性结合，使得这些淋巴7细胞表面HLA-B27抗原检测为阳性，从而降低了白细胞表面抗原检测的准确度。本申请实施例中，采用流式细胞法判断细胞表面抗原的表达。在一种具体实施例中，这种采用流式细胞法来检测细胞表面抗原表达的设备的结构示意图如图1所示，可包括样本液制备系统101、流式细胞仪和数据处理系统104，样本液制备系统101用于将被测体液样本与荧光检测试剂混合处理，得到染色后的被测样本液。流式细胞仪用于检测被测样本液，流式细胞仪通常包括光检测单元102和流动室103，被测样本液在鞘液的裹挟下以单细胞方式通过流动室103的检测区域，光检测单元102用于收集各细胞粒子发出的光。光检测单元102包括至少一个检测通道，其中包括荧光检测通道，荧光检测通道用于检测因细胞被荧光物质标记后发出的荧光。为了将不同荧光物质发出的荧光区别开来，荧光检测通道可以包括多个荧光检测通道，例如第一和第二通道，每个通道的滤光波段与其检测的荧光物质的发光波段相同。样本液制备系统101制得的样本液可通过输送系统105输送到流式细胞仪的流动室103。数据处理系统104用于接收流式细胞仪输出的数据，对数据进行处理。被测体液样本可以是血液，也可以是尿液等其它体液。在检测时通常以某一抗原为感兴趣抗原，判断被测样本针对于该感兴趣抗原的阴阳性。
下面以HLA-B27抗原为感兴趣抗原、以血液样本为例进行说明。
实施例一：
本实施例提供一种用于判断未知样本阴阳性的判断标准的确定方法，判断标准包括荧光临界值和比值临界值，在一种具体实施例中，确定判断标准的流程图请参考图2，包括以下步骤：
步骤10，选择多个试验样本，该多个试验样本针对于HLA-B27抗原已知其阴阳性。将每个试验样本按照步骤11-13进行处理。为方便描述，在步骤11-13中只针对一个试验样本进行描述。
步骤11，采用样本液制备系统将试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，制成需要的试验样本液。荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的HLA-B27抗原的抗体（以下简称HLA-B27抗体）和采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体（以下简称干扰抗体）。HLA-B27抗体例如可以是单克隆抗体，第二荧光物质与第一荧光物质为不同发光波长的荧光素或荧光蛋白等荧光物质，例如，第一荧光物质为FITC，第二荧光物质为PE，或者第一荧光物质为PE，第二荧光物质为FITC。对于HLA-B27抗原来说，干扰抗原是与它同族的其它抗原，主要是HLA-B7。当将荧光检测试剂和试验样本混合后，被荧光标记的HLA-B27抗体和HLA-B27抗原结合，被荧光标记的干扰抗体和干扰抗原（例如HLA-B7抗原）结合，因此携带有HLA-B27抗原和干扰抗原的白细胞被荧光物质染色，同时被荧光标记的HLA-B27抗体也与干扰抗原（例如HLA-B7抗原）发生交叉反应。通过清洗分离，将未与白细胞结合的标记物清除，得到染色后的试验样本液。
步骤12，采用流式细胞仪检测试验样本液。当试验样本液通过流式细胞仪的流动室时，通过特定的荧光检测通道检测细胞因被荧光物质标记而发出的荧光。流式细胞仪的光检测单元根据后端光收集的需要可以包括多个光检测通道，多个光检测通道的光检测器可以是各自独立，也可以是合一的，其中第一通道用于检测第一荧光物质发出的荧光，该通道的光检测器可检测的波长包括第一荧光物质的发光波长，以使被第一荧光物质标记的细胞发出的荧光可被第一通道收集，获得第一荧光强度值。第二通道用于检测第二荧光物质发出的荧光，该通道的光检测器可检测的波长包括第二荧光物质的发光波长，以使被第二荧光物质标记的细胞发出的荧光可被第二通道收集，获得第二荧光强度值。每个被荧光物质标记的细胞对应一个第一荧光强度值和一个第二荧光强度值。在本步骤中，除了检测细胞因被荧光物质标记而发出的荧光外，为了减少后续的数据处理量，还可以在本步骤中检测细胞因被光束照射而发出的散射光，因此，检测通道还包括散射光检测通道。在一种具体实例中，检测的散射光包括反映细胞体积大小的前向散射光和反映细胞内部复杂度的侧向散射光。流式细胞仪将检测的各种光信号转换为电信号传输给数据处理系统。
步骤13，数据处理系统对流式细胞仪检测的各种数据进行处理，计算各样本液的差值和比值，所述比值为落入对照区域的细胞数与全部细胞数的比值，比值例如可以是一个百分比，或与百分比相等的小数。
差值的计算步骤包括：
步骤131，根据第一荧光强度值计算该试验样本液的荧光强度。在计算样本液的荧光强度时，可根据该试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值来计算，感兴趣细胞可以是全部白细胞，也可以仅是淋巴细胞。因HLA-B27抗原尤其在淋巴细胞表面含量丰富，因此在一种较佳的实施例中，可只根据淋巴细胞的第一荧光强度值计算该试验样本液的荧光强度，具体步骤包括：利用步骤12收集的散射光，对白细胞进行分类统计，识别出淋巴细胞，获取淋巴细胞的第一荧光强度值，根据这些淋巴细胞的第一荧光强度值计算该试验样本液的荧光强度。荧光强度可以是这些第一荧光强度值的平均值，也可以是这些第一荧光强度值的中位值。
步骤132，计算试验样本液的差值。获取试验样本液的荧光强度与同型对照数据，同型对照数据中包括同型对照的荧光强度，同型对照的荧光强度可以是设备中预存的值，也可以是同型对照样本液的荧光强度。例如，将试验样本分成两份，一份用于制备试验样本液，另一份用于制备同型对照样本液，即将荧光检测试剂的同型对照试剂和另一份试验样本混合处理后得到该试验样本液的同型对照样本液，采用流式细胞仪检测同型对照样本液得到同型对照样本液的各细胞的第一荧光强度值，根据同型对照样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值，计算同型对照的荧光强度。计算试验样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值作为该试验样本液的差值。
比值的计算步骤包括：
步骤133，生成同型对照散点图。获取同型对照数据，同型对照数据中包括同型对照样本液中感兴趣细胞第一荧光强度值和第二荧光强度值，根据同型对照样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成二维的同型对照散点图。该散点图为多个由第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的二维数组的数据集合，或根据第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的一个二维图，例如以第一荧光强度值为横坐标，第二荧光强度值为纵坐标，反之亦可，图中的每个点代表一个细胞。
步骤134，在同型对照散点图中设门。设门是指设定一些条件，将符合某种条件的细胞归为一类，从而将细胞分类。本步骤中，通过比较第一荧光强度值的大小和第二荧光强度值的大小，使得预定比例的细胞分布在门限的指定区域。例如设定一个第一阈值和一个第二阈值，指定区域为第一荧光强度值小于第一阈值和第二荧光强度值小于第二阈值的区域，则第一阈值和一个第二阈值构成门限，该门限使落入该指定区域的细胞占散点图中全部细胞数的比例应满足预定比例，即该门限使落入该指定区域的细胞占散点图中全部细胞数的比例应是一个预定比例，或在该预定比例可接受的误差范围内，预定比例可以是一个根据实际要求预设的一个值，例如使落入该指定区域的细胞占散点图中全部细胞数的比例为95%或98%或98%±0.5%等。
步骤135，生成试验样本散点图。获取试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值，根据试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成试验样本散点图。
步骤137，在试验样本散点图中采用同样门限划分细胞群体，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占试验样本散点图中全部细胞数的比值。对照区域为在沿第一荧光强度值正向上不同于指定区域的区域，例如指定区域为第一荧光强度值小于第一阈值和第二荧光强度值小于第二阈值的区域，则对照区域为第一荧光强度值大于第一阈值和第二荧光强度值小于第二阈值的区域。当设定门限为十字门时，指定区域为十字门的左下象限，对照区域为十字门的右下象限。
步骤14，将所有的试验样本的阴阳性以及各样本的差值和比值进行统计，根据试验样本的已知的阴阳性以及可接受的灵敏度和特异性标准，从多个试验样本中确定出一个样本的差值和比值作为判断未知样本阴阳性的荧光临界值和比值临界值。其中，可接受的灵敏度和特异性标准根据用户的要求和具体设备而确定。
在优选的具体实例中，在采用流式细胞仪检测试验样本液之前，先对流式细胞仪进行荧光值校准，调节流式细胞仪荧光检测通道的电压,将校准荧光微球在荧光检测通道显示的荧光值调整到校准值。
下面以一个实例进一步说明如何确定未知样本的HLA-B27阴阳性判断标准。
1、收集血液样本348例，其中阳性样本182例，阴性样本166例，检测数据如表1所示。将HLA-B27检测试剂（即用于检测HLA-B27抗原的荧光检测试剂）和血液样本混合，在室温下反应一段时间，对样本进行染色。
2、将染色后样本通过流式细胞仪检测。在检测样本之前对流式细胞仪进行校准，调节流式细胞仪第一通道FL1和第二通道FL2的通道电压，根据采用的第一荧光物质FITC和第二荧光物质PE的参数，将校准荧光微球在FITC/PE通道显示的荧光值调整到校准值。通过流式细胞仪检测样本时，通过前向散射光信号和侧向散射光信号，可以识别出样本中的淋巴细胞，收集该淋巴细胞FL1及FL2通道的荧光值信号。
3、根据各淋巴细胞FL1通道的荧光值信号，计算其中位值或平均值，得到该样本FL1通道的荧光强度。
4、计算各样本的差值MFI(差值)，计算公式为：
MFI(差值)=MFI(FITC-HLA-B27)-MFI(FITC-IgG2a)
其中，MFI(FITC-HLA-B27)为各样本液FL1通道的荧光强度，MFI(FITC-IgG2a)为同型对照样本液的FL1通道的荧光强度。
5、通过同型对照设门，得到FITC-HLA-B27/PE-HLA-B7散点图十字门右下象限细胞占淋巴细胞的百分比Q4。
6、统计以上结果，请参考表1，表中，MFI_IgG2为同型对照的荧光强度，MFI_B27为样本的荧光强度，MFI(差值)为MFI_B27与MFI_IgG2的差值，Q4为FITC-HLA-B27/PE-HLA-B7散点图十字门右下象限细胞占淋巴细胞的百分比。经过分析得知，当MFI(差值)≥540且Q4≥80%时，检测结果的假阳性和假阴性样本总数最低，检测结果如表2所示，敏感性=180/182=98.9%，特异性=166/166=100%，得到的MFI(差值)和Q4值即为阴阳性判定的荧光临界值和比值临界值。
表1
MFI_IgG MFI_B27 Q4% MFI(差值) 样本的阴阳性
17 2486 92.9 2469 阳性
19 2230 90 2211 阳性
19 1549 93.9 1530 阳性
17 1374 94.8 1357 阳性
19 1375 97 1356 阳性
17 1320 89.9 1303 阳性
15 1315 89.4 1300 阳性
18 1302 91.8 1284 阳性
19 1274 93.2 1255 阳性
14 1269 15.1 1255 阳性
17 1267 90.6 1250 阳性
17 1267 92.2 1250 阳性
17 1254 90.6 1237 阳性
17 1241 96.3 1224 阳性
18 1231 92.8 1213 阳性
16 1227 92 1211 阳性
17 1226 95.3 1209 阳性
19 1223 97.4 1204 阳性
17 1211 91.6 1194 阳性
17 1200 91.9 1183 阳性
19 1201 95.6 1182 阳性
16 1191 17.4 1175 阳性
19 1192 90.2 1173 阳性
17 1182 93.3 1165 阳性
19 1182 93.5 1163 阳性
18 1164 95.6 1146 阳性
16 1148 97 1132 阳性
19 1137 90.8 1118 阳性
16 1131 91.7 1115 阳性
19 1126 93.6 1107 阳性
19 1124 95.8 1105 阳性
20 1119 96 1099 阳性
17 1113 93.3 1096 阳性
21 1112 94.2 1091 阳性
15 1105 98.3 1090 阳性
15 1105 88.6 1090 阳性
19 1102 96.3 1083 阳性
17 1097 93.7 1080 阳性
15 1090 92.1 1075 阳性
16 1091 90.7 1075 阳性
14 1086 90.3 1072 阳性
19 1070 98.2 1051 阳性
17 1064 92.7 1047 阳性
17 1057 91.6 1040 阳性
17 1053 93.7 1036 阳性
18 1051 96.7 1033 阳性
18 1048 91.9 1030 阳性
16 1045 94 1029 阳性
17 1043 95 1026 阳性
18 1041 95.1 1023 阳性
17 1039 92 1022 阳性
17 1038 95.9 1021 阳性
18 1036 91 1018 阳性
16 1029 91.6 1013 阳性
14 1026 94.1 1012 阳性
16 1026 94.5 1010 阳性
16 1022 94 1006 阳性
15 1019 90.7 1004 阳性
16 1020 90.8 1004 阳性
15 1016 98.3 1001 阳性
18 1019 80 1001 阳性
16 1016 89.5 1000 阳性
16 1014 90.7 998 阳性
20 1016 94.9 996 阳性
18 1013 93.2 995 阳性
18 1007 97 989 阳性
15 1004 92.4 989 阳性
17 1005 97.9 988 阳性
21 1007 96 986 阳性
16 999 90.7 983 阳性
16 988 96.3 972 阳性
17 980 95 963 阳性
15 978 94.2 963 阳性
16 978 93.8 962 阳性
16 978 95.8 962 阳性
17 978 87.3 961 阳性
16 973 95.6 957 阳性
16 970 98.4 954 阳性
16 969 95.1 953 阳性
17 967 93.7 950 阳性
17 958 92.9 941 阳性
17 948 93.4 931 阳性
17 945 96.2 928 阳性
17 941 92.1 924 阳性
16 940 96 924 阳性
18 942 94.5 924 阳性
19 943 92.3 924 阳性
16 938 98.3 922 阳性
16 938 93.5 922 阳性
16 934 92.2 918 阳性
20 936 96 916 阳性
17 932 94.7 915 阳性
19 931 93.6 912 阳性
20 931 97.3 911 阳性
17 926 92.5 909 阳性
15 917 91.1 902 阳性
15 916 95.1 901 阳性
16 914 96.8 898 阳性
19 916 96.7 897 阳性
14 909 94.8 895 阳性
20 913 93.9 893 阳性
17 909 94.7 892 阳性
15 906 90.5 891 阳性
18 908 96.8 890 阳性
15 905 95.5 890 阳性
16 903 95 887 阳性
18 903 90.9 885 阳性
21 901 98.7 880 阳性
19 893 96.9 874 阳性
16 888 91.1 872 阳性
16 888 96.7 872 阳性
19 886 96.5 867 阳性
15 881 93.4 866 阳性
14 879 93 865 阳性
17 877 95.6 860 阳性
15 865 0.6 850 阴性
19 868 91.3 849 阳性
17 862 95.8 845 阳性
14 859 92.7 845 阳性
18 861 95.8 843 阳性
16 857 90 841 阳性
14 853 93.6 839 阳性
33 870 97.7 837 阳性
19 853 95 834 阳性
17 844 90.1 827 阳性
17 843 95.8 826 阳性
14 832 92.2 818 阳性
19 837 89.7 818 阳性
18 836 90 818 阳性
17 834 94.5 817 阳性
17 833 98.3 816 阳性
17 832 91.5 815 阳性
36 850 98.6 814 阳性
14 825 89.7 811 阳性
17 827 93.5 810 阳性
14 820 92.6 806 阳性
16 821 95.7 805 阳性
17 814 90.7 797 阳性
16 809 96.3 793 阳性
19 812 96 793 阳性
14 806 88.6 792 阳性
20 810 96.7 790 阳性
15 805 97.1 790 阳性
15 803 98.1 788 阳性
17 804 96.5 787 阳性
14 801 91 787 阳性
16 802 92.8 786 阳性
18 803 97.1 785 阳性
15 797 94.8 782 阳性
16 795 95.1 779 阳性
15 786 94.3 771 阳性
14 779 93.6 765 阳性
19 780 96.3 761 阳性
19 777 93.6 758 阳性
17 772 95.1 755 阳性
22 769 98.2 747 阳性
19 759 96.1 740 阳性
15 747 92.9 732 阳性
16 745 96.1 729 阳性
18 744 92.1 726 阳性
17 741 89.8 724 阳性
18 741 90.9 723 阳性
15 733 94.1 718 阳性
17 734 91.8 717 阳性
18 734 97.3 716 阳性
17 730 94 713 阳性
14 727 90.6 713 阳性
15 723 93.5 708 阳性
43 748 99.1 705 阳性
15 714 95.7 699 阳性
17 712 97.3 695 阳性
14 708 95.3 694 阳性
21 705 98.1 684 阳性
16 689 92.5 673 阳性
15 680 89.1 665 阳性
17 680 96.5 663 阳性
15 678 90.3 663 阳性
17 645 95.6 628 阳性
16 627 95 611 阳性
14 622 92.7 608 阳性
18 620 97.8 602 阳性
18 617 0.3 599 阴性
17 597 93.4 580 阳性
20 560 95 540 阳性
20 549 90.6 529 阴性
23 509 0.2 486 阴性
20 475 87.7 455 阴性
17 448 89.7 431 阴性
18 418 92.1 400 阴性
21 405 3.1 384 阴性
17 367 1.8 350 阴性
16 364 0.7 348 阴性
19 355 0.2 336 阴性
18 348 4.8 330 阴性
17 342 74.9 325 阴性
16 314 2 298 阴性
18 307 88.9 289 阴性
18 307 75.7 289 阴性
17 278 0.6 261 阴性
16 264 0 248 阴性
20 264 3.4 244 阴性
17 252 0.8 235 阴性
16 248 79.7 232 阴性
21 240 78.7 219 阴性
18 234 12.6 216 阴性
17 232 5.5 215 阴性
15 226 0.8 211 阴性
16 218 3 202 阴性
25 227 77.5 202 阴性
20 216 76.9 196 阴性
19 212 3.3 193 阴性
18 211 0.4 193 阴性
19 207 77.9 188 阴性
17 202 78.4 185 阴性
16 199 5.9 183 阴性
19 199 0.1 180 阴性
15 190 4 175 阴性
20 187 4.3 167 阴性
17 170 15.2 153 阴性
19 172 73.1 153 阴性
16 150 0.1 134 阴性
17 143 68.6 126 阴性
20 122 67.4 102 阴性
19 115 3.1 96 阴性
17 111 53.9 94 阴性
18 96 38 78 阴性
19 96 38.5 77 阴性
18 93 40.5 75 阴性
15 81 34.4 66 阴性
18 83 35.6 65 阴性
17 82 38.9 65 阴性
21 83 34.3 62 阴性
18 80 34.6 62 阴性
18 79 30.5 61 阴性
18 77 34.3 59 阴性
20 75 32.2 55 阴性
20 74 33.7 54 阴性
18 71 27.5 53 阴性
18 70 22.5 52 阴性
17 66 24.1 49 阴性
18 67 22.7 49 阴性
20 68 19.4 48 阴性
20 67 22.6 47 阴性
18 64 25 46 阴性
17 61 18.9 44 阴性
17 60 13.7 43 阴性
15 56 14.1 41 阴性
19 60 15.2 41 阴性
17 58 73.3 41 阴性
20 58 11.2 38 阴性
19 56 24.7 37 阴性
18 55 13.6 37 阴性
15 52 15.8 37 阴性
22 59 12 37 阴性
18 53 23.3 35 阴性
19 52 6.8 33 阴性
18 51 11.3 33 阴性
17 49 13.4 32 阴性
18 50 10 32 阴性
17 46 9.6 29 阴性
19 47 9.5 28 阴性
19 47 15.7 28 阴性
21 49 6.6 28 阴性
16 43 9.1 27 阴性
18 45 8.5 27 阴性
16 43 12 27 阴性
19 45 11.1 26 阴性
18 44 8 26 阴性
16 42 6.2 26 阴性
16 42 9 26 阴性
17 42 6 25 阴性
17 42 6.9 25 阴性
21 46 5.5 25 阴性
17 42 8 25 阴性
20 44 6.1 24 阴性
17 41 6 24 阴性
16 39 11.3 23 阴性
21 44 9.3 23 阴性
15 38 7.4 23 阴性
17 40 5.5 23 阴性
21 44 5.2 23 阴性
17 40 7.1 23 阴性
20 42 5 22 阴性
17 39 4.3 22 阴性
17 39 4.4 22 阴性
16 38 5.2 22 阴性
18 40 4.7 22 阴性
21 43 4.6 22 阴性
22 44 4.1 22 阴性
16 37 8.4 21 阴性
17 38 10 21 阴性
16 36 4.1 20 阴性
19 39 2.9 20 阴性
20 39 6.1 19 阴性
17 36 5.5 19 阴性
17 35 3.1 18 阴性
16 34 4.8 18 阴性
21 39 5.2 18 阴性
19 36 4.8 17 阴性
17 34 4.2 17 阴性
17 34 1.7 17 阴性
20 37 3.9 17 阴性
16 33 2.7 17 阴性
16 32 3 16 阴性
19 35 3.5 16 阴性
18 34 2.7 16 阴性
15 31 2.5 16 阴性
17 33 1.5 16 阴性
19 34 5.5 15 阴性
18 32 2.3 14 阴性
20 34 3.6 14 阴性
15 28 2.7 13 阴性
18 31 4 13 阴性
19 30 2.7 11 阴性
17 28 1.4 11 阴性
19 30 3.4 11 阴性
19 29 2.2 10 阴性
15 25 2 10 阴性
17 26 1.9 9 阴性
16 25 1.6 9 阴性
14 23 0.6 9 阴性
20 29 0.8 9 阴性
17 26 0.7 9 阴性
18 27 1 9 阴性
20 29 1.9 9 阴性
19 27 2.2 8 阴性
18 25 1.5 7 阴性
17 24 0.7 7 阴性
20 26 2.1 6 阴性
14 20 1.4 6 阴性
21 27 1.2 6 阴性
19 24 0.9 5 阴性
21 26 1 5 阴性
18 23 2 5 阴性
17 22 1.6 5 阴性
18 23 1.4 5 阴性
19 24 0.9 5 阴性
17 22 1 5 阴性
19 24 0.6 5 阴性
17 21 0.3 4 阴性
20 23 0.9 3 阴性
20 23 0.9 3 阴性
18 20 1.7 2 阴性
35 37 0.9 2 阴性
17 19 0.3 2 阴性
20 22 0.5 2 阴性
21 22 0.7 1 阴性
14 15 0.5 1 阴性
表2
实施例二：
当采用上述实施例确定的荧光临界值和比值临界值标准判断未知样本的阴阳性时，其判断流程如图3所示，包括以下步骤：
步骤21，采用样本液制备系统将被测血液样本和荧光检测试剂混合处理，制成需要的被测样本液。荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的HLA-B27抗体和采用第二荧光物质标记的干扰抗体。HLA-B27抗体例如可以是单克隆抗体，第二荧光物质与第一荧光物质为不同发光波长的荧光物质。当将荧光检测试剂和被测样本混合后，被荧光标记的HLA-B27抗体和HLA-B27抗原结合，被荧光标记的干扰抗体和干扰抗原（例如HLA-B7抗原）结合，因此携带有HLA-B27抗原和干扰抗原的白细胞被荧光物质染色，同时被荧光标记的HLA-B27抗体也与干扰抗原（例如HLA-B7抗原）发生交叉反应。通过清洗分离，将未与白细胞结合的标记物清除，得到染色后的被测样本液。
步骤22，采用流式细胞仪检测被测样本液。具体检测步骤可与实施例一中的检测步骤相同。经过检测得到被测样本液中被标记细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值，根据需要还可检测得到细胞因被光束照射而发出的散射光。流式细胞仪将检测的各种光信号转换为电信号传输给数据处理系统。
步骤23，数据处理系统对流式细胞仪检测的各种数据进行处理，计算被测样本液的差值和比值。
差值的计算步骤包括：
步骤231，根据第一荧光强度值计算该被测样本液的荧光强度。在计算样本液的荧光强度时，可根据该被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值来计算。感兴趣细胞可以是全部白细胞，也可以仅是淋巴细胞。淋巴细胞的识别步骤包括：利用步骤22收集的散射光，对白细胞进行分类统计，识别出淋巴细胞，获取淋巴细胞的第一荧光强度值，根据这些淋巴细胞的第一荧光强度值计算该被测样本液的荧光强度。在优选的实施例中，本步骤中的感兴趣细胞应与判断标准确定过程中采用的感兴趣细胞群体一致。荧光强度可以是这些第一荧光强度值的平均值，也可以是这些第一荧光强度值的中位值。在优选的实施例中，本步骤中的荧光强度也应与判断标准确定过程中荧光强度的算法一致。
步骤232，计算被测样本液的差值。获取被测样本液的荧光强度与同型对照数据，同型对照数据中包括同型对照的荧光强度，同型对照的荧光强度可以是设备中预存的值，也可以是同型对照样本液的荧光强度。例如，将被测样本分成两份，一份用于制备被测样本液，另一份用于制备同型对照样本液，即将荧光检测试剂的同型对照试剂和另一份被测样本混合处理后得到该被测样本液的同型对照样本液，采用与被测样本液同样的方法用流式细胞仪对同型对照样本液进行检测，得到同型对照样本液的荧光强度。将被测样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值作为该被测样本液的差值。
比值的计算步骤包括：
步骤233，生成同型对照散点图。获取被测样本的同型对照数据，同型对照数据中包括同型对照样本液中感兴趣细胞第一荧光强度值和第二荧光强度值，根据同型对照样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成二维的同型对照散点图。
步骤234，在同型对照散点图中设定门限，该门限使落入指定区域的细胞占散点图中全部细胞数的比例应满足预定比例，即该门限使落入该指定区域的细胞占散点图中全部细胞数的比例应是一个预定比例，或在该预定比例可接受的误差范围内，预定比例可以是一个根据实际要求预设的一个值，例如使落入该指定区域的细胞占散点图中全部细胞数的比例等于95%、98%或其附近的一个值。判断时采用的预定比例值应与判定标准确定时采用的预定比例一致。
步骤235，生成被测样本散点图。获取被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值，根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成被测样本散点图。
步骤237，在被测样本散点图中采用同样门限划分细胞群体，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占被测样本散点图中全部细胞数的比值。当设定门限为十字门时，指定区域为十字门的左下象限，对照区域为十字门的右下象限。
步骤24，将差值和比值分别和荧光临界值和比值临界值比较，根据比较结果判断被测样本针对于HLA-B27抗原的阴阳性。该判断可以是操作者根据数据处理系统输出的差值和比值自行与荧光临界值和比值临界值比较，也可以是将荧光临界值和比值临界值预先输入数据处理系统中，由数据处理系统在计算得到被测样本的差值和比值后自动将差值和比值分别和荧光临界值和比值临界值比较。判断规则例如可以是：当被测样本的差值大于或等于荧光临界值，且该被测样本的比值大于或等于比值临界值时，被测样本液为阳性，否则为阴性。当然，本领域技术人员应该理解，判断规则中的任一个“大于或等于”也可以改为“大于”。
根据上述实施例的判断标准的建立方法和未知样本阴阳性的判断方法，一方面由于采用同型对照的荧光强度作为底数，减少了非特异性结合的影响，确定了合理的荧光临界值，所以减少了非特异性结合对检测结果的干扰，提高了对HLA-B27抗原表达检测结果的准确性。另一方面，根据设定的比值临界值，B27的荧光强度大于该临界值，而B7的荧光强度小于该临界值，荧光强度大于该临界值的应该是真实表达B27抗原的细胞。因此根据被测未知样本的Q4的结果，可准确的判断出HLA-B27抗原的表达，从而排除了HLA-B7抗原对检测结果的影响，显著的减低了检测结果的假阳性。
上述实施例中，通过对流式细胞仪进行荧光校准，可以很好的实现不同机器以及不同流式机型之间的相互移植，检测结果在不同的实验室之间具有很好的可比性。
下面以两个实例进一步说明利用上述实施例确定的荧光临界值和比值临界值标准判断样本针对于HLA-B27抗原的阴阳性。
被测样本1：
将已知的HLA-B27阴性的新鲜抗凝血作为被测样本1和HLA-B27检测双色试剂反应，制备好的样本通过流式细胞法检测，通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)选定淋巴细胞，如图4所示，在前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)形成的散点图中，左下角P1区域中为淋巴细胞。根据同型对照（检测中使用的一种对照试剂，具体为FITC-IgG2a/PE-IgG1双色同型对照）的第一FL1和第二FL2的荧光强度值，设置FL1/FL2散点图十字门，如图5所示，假设十字门左下象限为指定区域，要求有98%的细胞落入左下象限。当使99%的细胞的第一荧光强度值分布在第一阈值分界线左边，且99%的细胞的第二荧光强度值分布在第二阈值分界线下边，第一阈值分界线和第二阈值分界线形成一十字门，该十字门左下象限中分布的细胞数占散点图中全部细胞数的98%。如图6所示为被测样本1的第一FL1和第二通道FL2的荧光强度值形成的散点图，在被测样本1的散点图中，采用与同型对照散点图中相同的十字门，计算被测样本1的MFI(差值)值及Q4值，Q4值为落入十字门第四象限的细胞数占散点图中全部细胞数的百分比，第四象限为第三象限的对照象限。检测结果MFI(差值)值＜540且Q4＜80%，检测结果为阴性。
被测样本2：
将已知的HLA-B27阳性的新鲜抗凝血作为被测样本2和HLA-B27检测双色试剂反应，通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)选定淋巴细胞，如图7所示，在前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)形成的散点图中，左下角P1区域中为淋巴细胞。根据同型对照（检测中使用的一种对照试剂，具体为FITC-IgG2a/PE-IgG1双色同型对照）的第一通道FL1和第二通道FL2的荧光强度值，设置FL1/FL2散点图十字门，如图8所示，假设十字门左下象限为指定区域，同样要求有98%的细胞落入左下象限。则分布在第一阈值分界线左边的细胞数和分布在第二阈值分界线下边的细胞数仍然都为99%，第一阈值分界线和第二阈值分界线形成一十字门，该十字门左下象限中分布的细胞数占散点图中全部细胞数的98%。如图9所示为被测样本2的第一FL1和第二FL2的荧光强度值形成的散点图，在被测样本2的散点图中，采用与同型对照散点图中相同的十字门，计算被测样本2的MFI(差值)值及Q4值，检测结果为MFI(差值)值＞540且Q4＞80%，检测结果为阳性。
实施例一中，判断标准包括荧光临界值和比值临界值，在其它的实施例中，判断标准也可以只包括荧光临界值和比值临界值中的任一个，相应的，在对未知样本进行HLA-B27抗原表达的检测中，也只须与一个判断标准比较。
上述实施例中，感兴趣抗原为HLA-B27抗原，干扰抗原为HLA-B7抗原。在其他的实施例中，感兴趣抗原也可以为其它细胞表面抗原，相应的干扰抗原为该细胞表面抗原有交叉反应的抗原。上述实施例中，使用的抗体为单克隆抗体，在其他实施例中，也可以使用多克隆抗体。
本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分步骤可以通过程序来指令相关硬件完成，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (20)

1.一种用于判断未知样本阴阳性的判断标准的确定方法,其特征在于包括：
将多个试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，得到各自的试验样本液，该多个试验样本针对于感兴趣抗原已知被确定为阴性或阳性，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
采用流式细胞仪检测各试验样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
根据该试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值，计算该试验样本液的荧光强度；
计算试验样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的差值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的荧光临界值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光检测试剂中还包括采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质的发光波长与第一荧光物质的发光波长不同，所述方法还包括：
在采用流式细胞仪检测各试验样本液的过程中，还检测试验样本液中各细胞发出的第二荧光物质的荧光信号，获得第二荧光强度值；
在由同型对照样本液的感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的同型对照散点图中，设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；
在由试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的试验样本散点图中，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占试验样本散点图中全部细胞数的比值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的比值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的比值临界值。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同型对照为荧光检测试剂的同型对照试剂与试验样本混合处理后所得的样本液，所述同型对照样本液和试验样本液采用同一试验样本制得，采用流式细胞仪检测同型对照样本液得到同型对照样本液的各细胞的第一荧光强度值，根据同型对照样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值，计算同型对照的荧光强度。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述同型对照为荧光检测试剂的同型对照试剂与试验样本混合处理后所得的样本液，所述同型对照样本液和试验样本液采用同一试验样本制得，采用流式细胞仪检测同型对照样本液得到同型对照样本液的各细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值。
5.一种提高细胞表面抗原表达检测准确性的方法，其特征在于包括：
将被测样本与荧光检测试剂混合处理，得到染色后的被测样本液，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
采用流式细胞仪检测被测样本液，检测被测样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值计算被测样本液的荧光强度；
计算被测样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值，所述差值用于与预设的荧光临界值进行比较；所述预设的荧光临界值通过以下步骤获得：
将多个试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，得到各自的试验样本液，该多个试验样本针对于感兴趣抗原已知被确定为阴性或阳性，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
采用流式细胞仪检测各试验样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
根据该试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值，计算该试验样本液的荧光强度；
计算试验样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的差值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的荧光临界值。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于还包括：
将所述差值与荧光临界值进行比较，根据比较结果输出被测样本液阴阳性的判断结果；当所述差值大于或等于荧光临界值，被测样本液为阳性，否则为阴性。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述荧光检测试剂中还包括采用第二荧光物质标记的抗体，所述抗体为与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质的发光波长与第一荧光物质的发光波长不同，所述方法还包括：
在采用流式细胞仪检测被测样本液的过程中，还检测被测样本液中各细胞发出的第二荧光强度值；
在由同型对照样本液的感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的同型对照散点图中，设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；
在由被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的被测样本散点图中，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占被测样本散点图中全部细胞数的比值；所述比值用于与预设的比值临界值进行比较,所述预设的比值临界值通过以下步骤获得：
将多个试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，得到各自的试验样本液，该多个试验样本针对于感兴趣抗原已知被确定为阴性或阳性，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体和采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质的发光波长与第一荧光物质的发光波长不同；
采用流式细胞仪检测各试验样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号和第二荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值和第二荧光强度值；
在由同型对照样本液的感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的同型对照散点图中，设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；
在由试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的试验样本散点图中，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占试验样本散点图中全部细胞数的比值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的比值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的比值临界值。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于还包括：
将所述差值与荧光临界值进行比较，将所述比值与比值临界值进行比较；
根据比较结果输出被测样本液阴阳性的判断结果；当所述差值大于或等于荧光临界值，且所述比值大于或等于比值临界值时，被测样本液为阳性，否则为阴性。
9.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，在采用流式细胞仪检测各试验样本液之前对流式细胞仪进行荧光值校准。
10.如权利要求2或7所述的方法，其特征在于，所述感兴趣抗原为HLA-B27。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，第一荧光物质标记的抗体为HLA-B27单克隆抗体，和/或干扰抗原为HLA-B7，和/或第二荧光物质标记的抗体为HLA-B7单克隆抗体。
12.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，在采用流式细胞仪检测各样本液的过程中，还检测样本液中细胞被光束照射后发出的散射光，根据散射光统计样本液中的淋巴细胞，在计算样本液的荧光强度时将淋巴细胞作为感兴趣细胞，根据统计出的样本液中淋巴细胞的第一荧光强度值计算荧光强度。
13.如权利要求2或7所述的方法，其特征在于，所述门限为十字门，所述指定区域为十字门的左下象限，对照区域为十字门的右下象限。
14.一种用于检测细胞表面抗原表达的设备，其特征在于包括：
样本液制备系统，用于将被测体液样本与荧光检测试剂混合处理，得到染色后的被测样本液，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
流式细胞仪，用于检测被测样本液，所述流式细胞仪检测被测样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
数据处理系统，用于接收流式细胞仪输出的数据，根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值计算被测样本液的荧光强度，计算被测样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值，所述差值用于与预设的荧光临界值进行比较；所述预设的荧光临界值通过以下方式获得：
将多个试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，得到各自的试验样本液，该多个试验样本针对于感兴趣抗原已知被确定为阴性或阳性，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体；
采用流式细胞仪检测各试验样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值；
根据该试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值，计算该试验样本液的荧光强度；
计算试验样本液的荧光强度与同型对照的荧光强度的差值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的差值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的荧光临界值。
15.如权利要求14所述的设备，其特征在于，所述流式细胞仪在采用流式细胞仪检测各被测样本液的过程中，还检测样本液中细胞被光束照射后发出的散射光，数据处理系统根据流式细胞仪检测的散射光统计样本液中的淋巴细胞，计算被测样本液的荧光强度时将淋巴细胞作为感兴趣细胞，根据统计出的样本液中淋巴细胞的第一荧光强度值计算荧光强度。
16.如权利要求14或15所述的设备，其特征在于，所述荧光检测试剂中还包括采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质发光波长与第一荧光物质的发光波长不同，所述流式细胞仪在检测被测样本液的过程中，还检测被测样本液中各细胞发出的第二荧光物质的荧光信号，获得第二荧光强度值；所述数据处理系统根据同型对照样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成二维的同型对照散点图，在同型对照散点图中设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；根据被测样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成被测样本散点图，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占被测样本散点图中全部细胞数的比值；所述比值用于与预设的比值临界值进行比较；所述预设的比值临界值通过以下方式获得：
将多个试验样本分别和荧光检测试剂混合处理，得到各自的试验样本液，该多个试验样本针对于感兴趣抗原已知被确定为阴性或阳性，荧光检测试剂中包括采用第一荧光物质标记的与感兴趣抗原对应的抗体和采用第二荧光物质标记的与感兴趣抗原的干扰抗原对应的抗体，第二荧光物质的发光波长与第一荧光物质的发光波长不同；
采用流式细胞仪检测各试验样本液中各细胞发出的第一荧光物质的荧光信号和第二荧光物质的荧光信号，获得第一荧光强度值和第二荧光强度值；
在由同型对照样本液的感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的同型对照散点图中，设定门限，使预定比例的细胞分布在门限的指定区域；
在由试验样本液中感兴趣细胞的第一荧光强度值和第二荧光强度值形成的试验样本散点图中，计算落入指定区域的对照区域的细胞数占试验样本散点图中全部细胞数的比值；
根据试验样本的已知的阴阳性，从多个试验样本的比值中确定出一个最合适值作为判断未知样本阴阳性的比值临界值。
17.如权利要求16所述的设备，其特征在于，所述门限为十字门，所述指定区域为十字门的左下象限，对照区域为十字门的右下象限。
18.如权利要求16所述的设备，其特征在于，
数据处理系统将所述差值与荧光临界值进行比较，将所述比值与比值临界值进行比较，并根据比较结果输出被测样本液阴阳性的判断结果。
19.如权利要求18所述的设备，其特征在于，当所述差值大于或等于荧光临界值，且所述比值大于或等于比值临界值时，被测样本液为阳性，否则为阴性。
20.如权利要求14所述的设备，其特征在于，所述感兴趣抗原为HLA-B27。
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