CN104367549A

CN104367549A - 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN104367549A
Application number: CN201410421132.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡天革; 蔡宇; 唐凤德
Original assignee: Liaoning University
Current assignee: Liaoning University
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2034-08-22
Also published as: CN104367549B

Abstract

本发明涉及包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂及其制备方法。采用的技术方案是：包括以下原料按重量份配比制成：补骨脂素1–5份、阿霉素1–5份、固体脂质40–120份、液体脂质10–30份、脂溶性乳化剂35–350份、水溶性乳化剂25–250份、表面活性剂100–600份。本发明将两个药物制备成复合纳米结构脂质载体，对其处方工艺及理化性质进行优化和考察，制备出较优的纳米结构载体，为进一步研究逆转白血病细胞的多药耐药作用提供基础。

Description

包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于中药制剂学领域，具体涉及一种包载补骨脂素和阿霉素的复合纳米结构脂质载体及其制备方法。

背景技术

肿瘤是当今危害人类健康的主要疾患之一。肿瘤侵袭和转移是恶性肿瘤最普遍的一种生物学行为和最本质的特征，也是影响肿瘤患者生存和愈后的关键因素。因此抗肿瘤药物也是本领域的技术人员不断研发的课题。

补骨脂素(PSO)为从豆科植物中提取的有效成分，脂溶性作用较强，是一种钙离子通道阻滞剂，同时可以抑制P-gp蛋白的泵出，协助化疗药物逆转肿瘤细胞多药耐药作用。阿霉素(DOX)是蒽环类抗肿瘤药物，其盐酸盐具有水溶性，主要用于治疗白血病、淋巴癌及乳腺癌等，抗瘤谱广，但是容易产生耐药作用。目前，补骨脂素和阿霉素都有单独作用于临床治疗白血病的研究，但补骨脂素水溶性差，生物利用度低，而盐酸阿霉素水溶性作用强，但细胞外排作用大，易产生耐药。因此需要寻求一种有效制剂，来增加补骨脂素的溶解性，提高生物利用度，同时减少阿霉素的细胞外排作用，增强抗肿瘤效果，降低毒副作用。

纳米结构脂质载体(NLC)是在固体脂质纳米粒(SLN)基础上发展的新型给药系统，在固体脂质为载体的基础上加入液体脂质，扰乱固态脂质固化后的完美晶型，较少药物的泄露。

发明内容

本发明的目的在于将两个药物制备成复合纳米结构脂质载体，对其处方工艺及理化性质进行优化和考察，制备出较优的纳米结构载体，为进一步研究逆转白血病细胞的多药耐药作用提供基础。

本发明采用的技术方案是：一种包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，包括以下原料按重量份配比制成：

所述固体脂质为硬脂酸、胆固醇、棕榈酸、山嵛酸、单硬脂酸甘油酯(GMS)、甘油棕榈酸硬脂酸酯Precirol ATO5)、双硬脂酸甘油酯、豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、山嵛酸甘油酯或月桂酸甘油酯的一种或二种以上的组合。

所述液体脂质为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、辛酸癸酸甘油三酯(LABRATAC LIPOPHIEWL1349)、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、液体石蜡、大豆油或油酸的一种或二种以上的混合。

所述脂溶性乳化剂为大豆卵磷脂或合成磷脂。

所述水溶性乳化剂为泊洛沙姆、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、胆酸钠或脱氧胆酸钠的一种或二种以上的混合。

所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407、泊洛沙姆338或泊洛沙姆188；优选泊洛沙姆188。

所述表面活性剂为吐温80、吐温60或吐温20；优选吐温80。

上述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂的制备方法如下：

1)将补骨脂素、固体脂质、液体脂质和脂溶性乳化剂依次加入适量有机溶剂中，70～80℃水浴中加热溶解，超声(200～400W，2～5min)分散混匀，作为有机相；

所述有机溶剂为无水乙醇；

2)将阿霉素和水溶性乳化剂溶于适量注射用水中，70～80℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为内水相；

3)将表面活性剂溶于适量注射用水中，70～80℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；

4)在800～1000r/min搅拌下，将内水相缓慢注入有机相中，搅拌5～15min形成初乳；

5)在800～1000r/min搅拌下，将初乳缓慢注入外水相中，搅拌乳化形成复乳；

6)将复乳浓缩后迅速倒入冰水中，低温固化0.5～1.5h，微孔滤膜过滤，得液相包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂；

所述冰水为0～4℃注射用水；

优选的，所述微孔过滤为采用孔径为0.22μm或0.45μm的滤膜过滤；

7)向液相包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂中加入冻干保护剂溶液，冷冻干燥，得固相包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂。

优选的，所述冻干保护剂溶液的质量百分比浓度为2～10％；所述冻干保护剂为葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、果糖、山梨醇、海藻糖、麦芽糖、右旋糖酐或氨基酸中的一种或二种以上的混合。

本发明的有益效果是：本发明，采用纳米结构脂质载体(NLC)将补骨脂素和阿霉素进行包裹，制成一种新型纳米给药体系，将与固态脂质不相溶的液体脂质加入到固体脂质中形成不完整的晶型，有效防止药物的泄露。通过本发明的方法制备的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)为圆形、类圆形实体球，粒径为(128.7±1.8)nm，多分散系数为0.22±0.01，Zeta电位为(20.17±0.31)mV，PSO包封率可达70％以上，DOX包封率可达80％以上，体外释放符合双向动力学模型，PSO和DOX药物溶液在12h内基本释放完全，PSO-DOX-NLC纳米溶液中PSO在前8h内存在突释效应，DOX则缓释较好，因此本发明的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂具有良好的缓释性能。本发明，通过将补骨脂素和阿霉素通过制备成NLC，可以提高生物利用度，增大抗肿瘤效果。

本发明通过将补骨脂素和阿霉素联合使用制备成复合纳米结构脂质载体，水溶性的阿霉素发挥治疗作用，脂溶性的补骨脂素同时发挥治疗和逆转白血病细胞的耐药作用，从而有效提高药物在细胞内的聚集，增加治疗效果，同时由于其剂型的优势，可以减缓药物的排泄，达到缓释作用。本发明利用简单的制备工艺将两者进行复合制备，并均得到70％以上的包封率，粒径在100nm左右，工艺简单，便于工业化生产。

附图说明

图1A是实施例1中PSO溶液的色谱图。

图1B是实施例1中DOX溶液的色谱图。

图1C是实施例1中PSO-DOX混合溶液的色谱图。

图1D是实施例1中空白NLC的色谱图。

图1E是实施例1中PSO-DOX-NLC溶液的色谱图。

图2是实施例1制备的PSO-DOX-NLC的投射电镜图。

图3是实施例1制备的PSO-DOX-NLC的粒径分布图。

图4是实施例1制备的PSO-DOX-NLC的Zeta电位分布图。

图5A是实施例1中DOX和PSO-DOX-NLC体外药物释放曲线。

图5B是实施例1中PSO和PSO-DOX-NLC体外药物释放曲线。

具体实施方式

实施例1 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)

(一)制备方法如下：

1)将3mg补骨脂素(PSO)、104mg固体脂质(重量比，GMS：Precirol ATO5＝1:1)、26mg液体脂质(辛酸癸酸甘油三酯(LABRATAC LIPOPHIE WL1349))和250mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)依次加入20ml无水乙醇中，78℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

2)将3mg阿霉素(DOX)、25mg水溶性乳化剂(泊洛沙姆188)溶于1ml注射用水中，78℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为内水相；

3)将520mg表面活性剂(吐温80)溶于20ml注射用水中，78℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；

4)在1000r/min搅拌下，将1ml内水相缓慢注入20ml有机相中，搅拌10min形成初乳；

5)在1000r/min搅拌下，将上述初乳缓慢注入20ml外水相中，搅拌乳化形成复乳；

6)复乳蒸发浓缩至约5ml时，将复乳迅速倒入冰水中，低温固化1h，0.45um的滤膜过滤，得液相PSO-DOX-NLC；

7)向2ml液相PSO-DOX-NLC中加入15％甘露醇+海藻糖溶液1ml，冷冻干燥，得固相PSO-DOX-NLC。

(二)检测结果

1.专属性实验

色谱柱：Syncronis C18250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-醋酸钠缓冲液冰醋酸调pH3.6(65:35)；流速:1.0mL/min；紫外检测波长:254nm；柱温：室温；进样量：20μL。

方法：按上述步骤同时做空白NLC(不加PSO和DOX)，量取适量空白NLC及PSO-DOX-NLC加入流动相超声破乳，过0.45μm滤膜备用。并称取一定量的PSO和DOX各适量于10ml容量瓶中，加流动相超声溶解，过0.45μm滤膜保存备用。精密称取5mgPSO和5mgDOX置于100ml容量瓶中，加入流动相超声溶解，并定容，配置成50μg/ml的PSO-DOX混合对照品溶液。按上述条件配置的五个溶液分别进样观察各成分的干扰情况。

结果如图1A-图1E所示。由图1A-图1E可见PSO、DOX、空白NLC、PSO-DOX–NLC和PSO-DOX各样品之间无干扰，分离度R>1.5。说明本发明的方法可行。

2.线性关系考察

方法：精密量取对照品PSO(或对照品DOX)溶液适量于10ml容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，配置成浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μg/ml的系列浓度，HPLC测其峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，进行线性回归。

结果：PSO的标准曲线方程Y＝1.1×10⁵X+14742(r＝0.9998)；DOX的标准曲线方程Y＝54195X+1877.9(r＝0.9999)，表明PSO和DOX在1～32μg/mL范围内线性关系良好。

3.精密度实验

方法：精密量取对照品PSO(或对照品DOX)溶液适量于10ml容量瓶中，配置浓度为4、16、32μg/ml的低、中、高三个浓度溶液，HPLC测定，分别于1天内平行测定5次，连续测定5天，计算日内和日间精密度RSD。

结果见表1。由表1表明精密度良好。

表1 日内和日间精密度结果(n＝5)

4.回收率实验

方法：取1ml空白NLC，分别加入对照品PSO(或对照品DOX)溶液0.8、3.2、6.4ml于10ml容量瓶，用流动相配成低、中、高三个浓度的样品，超声破乳，0.45μm滤膜过滤，20μL进样，计算回收率。

结果：结果如表2。结果显示PSO和DOX的三个浓度溶液回收率均在95％～103％之间，RSD<3％，表明该方法回收率良好。

表2 回收率实验结果(n＝3)

5.稳定性实验

方法：取对照品PSO(或对照品DOX)溶液适量配置8μg/ml的PSO-DOX溶液，分别于0、2、4、6、12、24h内进样，计算RSD。

结果显示，PSO和DOX在24h内RSD分别为0.79％和1.55％，表明溶液在24h内稳定。

6.包封率测定方法

方法：实验采用超滤离心法测其包封率。取适量PSO-DOX-NLC溶液于超滤离心管中，12000r/min离心20min，取20ul滤液注入色谱仪，测定游离药物量(W_F)；另取1.0mlPSO-DOX-NLC溶液于10ml容量瓶中，加流动相定容、破乳，0.45um滤膜过滤，取20ul滤液注入色谱仪，计算总药量(W_T)。包封率＝(W_T-W_F)/W_T×100％。

结果：PSO包封率为76.56％，DOX包封率为89.48％。

7.形态学考察

方法：取PSO-DOX-NLC适量于带有碳膜的铜网上，用2％磷钨酸染色，自然晾干后置于透射电镜下观察。

结果如图2所示，由图2可见，纳米粒为圆形或类圆形实体小球，分散较好，基本无黏连。

8.粒径及Zeta电位测定

方法：取PSO-DOX-NLC适量进行稀释，采用Zetasizer纳米激光粒度仪进行粒径与电位的测定。

结果如图3和图4所示，由图3和图4可见，纳米粒的粒径为(128.7±1.8)nm，PDI为0.22±0.01(n＝3)，电位为(-20.17±0.31)mV，可见制备的纳米载体粒径小，分散均匀，具有较好的稳定性。

9.释放曲线的建立

方法：取5ml PSO-DOX-NLC于截留分子量为10KDa的透析袋中，同时配置适宜浓度的PSO和DOX溶液5ml于透析袋中，将透析袋置于含5％吐温80的150mlPBS释放介质中，转速50r/min，(37±0.5)℃动态透析，分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36h时间点取样1m，同时补加同温度溶出介质1ml。采用HPLC法测定释放介质中药物浓度，并计算累积释放率。

结果如图5A和图5B所示，由图5A和图5B可见，对其进行模型拟合，符合双向动力学方程。PSO和DOX药物溶液在12h内已基本释放完全，PSO-DOX-NLC纳米溶液中PSO在前8h内存在突释效应，DOX则缓释较好，因此该纳米载体具有良好的缓释性能。

实施例2 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)

制备方法如下：

1)将3mg补骨脂素(PSO)、56mg固体脂质(山俞酸甘油酯)、14mg液体脂质(肉

豆蔻酸异丙酯)和140mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)依次加入20ml乙醇中，78

℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

5)在1000r/min搅拌下，将5ml初乳缓慢注入20ml外水相中，搅拌乳化形成复乳；

6)复乳蒸发浓缩至5ml时，将复乳迅速倒入冰水中，低温固化1h，0.45um的滤膜过滤，得液相PSO-DOX-NLC；

PSO-DOX-NLC为圆形、类圆形实体球，PSO包封率可达78.8％，DOX包封率可达84.0％。

实施例3 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)

制备方法如下：

1)将3mg补骨脂素(PSO)、56mg固体脂质(重量比，单硬脂酸甘油酯：山俞酸甘油酯＝1：1)、14mg液体脂质(油酸)和70mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)依次加入20ml乙醇中，78℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

5)在1000r/min搅拌下，将7ml初乳缓慢注入20ml外水相中，搅拌乳化形成复乳；

6)复乳蒸发浓缩至5ml时，将复乳迅速倒入冰水中，低温固化0.5h，0.45um的滤膜过滤，得液相PSO-DOX-NLC；

7)向2ml液相PSO-DOX-NLC中加入15％蔗糖+海藻糖溶液1ml，冷冻干燥，得固相PSO-DOX-NLC。

PSO-DOX-NLC为圆形、类圆形实体球，PSO包封率可达74.8％，DOX包封率可达79.3％。

实施例4 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)

制备方法如下：

1)将3mg补骨脂素(PSO)、80mg固体脂质(重量比，GMS：Precirol ATO5＝1:1)、20mg液体脂质(辛酸癸酸甘油三酯(LABRATAC LIPOPHIE WL1349))和150mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)依次加入20ml乙醇中，78℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

3)将400mg表面活性剂(吐温80)溶于20ml注射用水中，78℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；

6)复乳蒸发浓缩至约10ml时，将复乳迅速倒入冰水中，低温固化1.5h，0.45um的滤膜过滤，得液相PSO-DOX-NLC；

PSO-DOX-NLC为圆形、类圆形实体球，PSO包封率可达72.2％，DOX包封率可达86.7％。

实施例5 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)

制备方法如下：

1)将3mg补骨脂素(PSO)、104mg固体脂质(重量比，GMS：Precirol ATO5＝1:1)、26mg液体脂质(辛酸癸酸甘油三酯(LABRATAC LIPOPHIE WL1349))和130mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)依次加入20ml乙醇中，78℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

2)将3mg阿霉素(DOX)、25mg水溶性乳化剂(脱氧胆酸钠)溶于1ml注射用水中，78℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为内水相；

6)复乳蒸发浓缩至约7ml时，将复乳迅速倒入冰水中，低温固化1h，0.45um的滤膜过滤，得液相PSO-DOX-NLC；

PSO-DOX-NLC为圆形、类圆形实体球，PSO包封率可达77.5％，DOX包封率可达89.0％。

实施例6 包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂(PSO-DOX-NLC)

制备方法：

1)将3mg补骨脂素(PSO)、120mg固体脂质(重量比，GMS：Precirol ATO5＝1:1)、30mg液体脂质(辛酸癸酸甘油三酯(LABRATAC LIPOPHIE WL1349))和225mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)依次加入20ml乙醇中，78℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

5)在固体脂质搅拌下，将10ml初乳缓慢注入20ml外水相中，搅拌乳化形成复乳；

6)复乳蒸发浓缩至约5ml时，将复乳迅速倒入冰水中，低温固化2h，0.45um的滤膜过滤，得液相PSO-DOX-NLC；

PSO-DOX-NLC为圆形、类圆形实体球，PSO包封率可达74.9％，DOX包封率可达87.4％。

Claims

1.一种包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，其特征在于：包括以下原料药按重量份配比制成：

2.如权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，其特征在于：所述固体脂质为硬脂酸、胆固醇、棕榈酸、山嵛酸、单硬脂酸甘油酯、甘油棕榈酸硬脂酸酯、双硬脂酸甘油酯、豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、山嵛酸甘油酯或月桂酸甘油酯的一种或二种以上的组合。

3.如权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，其特征在于：所述液体脂质为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、辛酸癸酸甘油三酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、液体石蜡、大豆油或油酸的一种或二种以上的混合。

4.如权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，其特征在于：所述脂溶性乳化剂为大豆卵磷脂或合成磷脂。

5.如权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，其特征在于：所述水溶性乳化剂为泊洛沙姆、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、胆酸钠或脱氧胆酸钠的一种或二种以上的混合。

6.如权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂，其特征在于：所述的表面活性剂为吐温80、吐温60或吐温20。

7.一种权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂的制备方法，其特征在于方法如下：

1)将补骨脂素、固体脂质、液体脂质和脂溶性乳化剂依次加入有机溶剂中，70-80℃水浴中加热溶解，超声分散混匀，作为有机相；

2)将阿霉素和水溶性乳化剂溶于适量注射用水中，70-80℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为内水相；

3)将表面活性剂溶于适量注射用水中，70-80℃水浴中加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；

4)在搅拌下，将内水相缓慢注入有机相中，搅拌5-15min，形成初乳；

5)在搅拌下，将初乳缓慢注入外水相中，搅拌乳化形成复乳；

6)将复乳蒸发浓缩后迅速倒入冰水中，低温固化0.5～1.5h，微孔过滤，得液相包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于还包括如下步骤：

7)向液相包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂中加入冻干保护剂溶液，干燥，得固相包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂。

9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：步骤6)中所述的微孔过滤为采用孔径为0.22um或0.45um的水系滤膜过滤。

10.权利要求1所述的包载补骨脂素-阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。