CN104328138A - 基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒。该方法包括构建pPTD-NLS-Cas9；体外表达、纯化并获得PTD-NLS-Cas9融合蛋白；将其与向导RNA共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；将PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使其进入靶细胞进行目的基因的定向敲除。该复合物利用蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的穿膜定位机制，实现Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中的效果；克服了现有技术中Cas9核酸内切酶难以导入靶细胞的技术问题。

Description

基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒。

背景技术

基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。目前，锌核酸酶(ZFN)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术被广泛应用于基因定向修饰，但是这些技术操作过程复杂，成本高，技术难度较大，而且受到表观遗传修饰的限制，无法同时针对同一细胞中的多个位点进行靶向敲除，因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的基因打靶技术。

CRISPR(成簇规律性间隔短回文重复序列)是一类特殊的DNA重复序列家族。CRISPR是细菌和古生菌为应对病毒和核酸不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，广泛存在于众多原核生物基因中。其中，第二类CRISPR/Cas系统依赖Cas9核酸内切酶靶向和剪切外源DNA。因此，CRISPR/Cas系统逐渐成为另一个基因组改造的方法。

在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成向导RNA，向导RNA指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA，通过诱导细胞自身DNA修复机制，在细胞基因组中进行基因敲除。

另外，研究表明，多个向导RNA可指导Cas9蛋白实现同时对哺乳动物细胞、人干细胞、酵母等基因组中多位点的瞬时剪切。但是，相关及时中，该系统涉及到多个质粒或分子量很大的质粒的转染，转染效率低，特别是针对难转染的细胞系、干细胞、处于静息期的细胞等，转染效率及基因敲除效率更低。可见，如何将Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中成为影响基因组靶向修饰效率的重要因素；因此，提供一种能够快速、高效将Cas9核酸内切酶和向导RNA导入靶细胞中并进行细胞基因组靶标目的基因的定向敲除的方法是人们亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，以解决上述的技术问题。

在本发明的实施例中提供了一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，包括以下步骤：

1)、构建包含蛋白转导结构域PTD、细胞核定位结构域NLS的重组载体pPTD-NLS；并利用限制性酶切连接或体外重组方法将重组载体与Cas9DNA片段进行连接，得到连接产物pPTD-NLS-Cas9；

2)、将所述连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、鉴定后获得包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆；将所述包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆在体外诱导表达，表达的蛋白经纯化后，得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白；

3)、将所述PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；

4)、将所述PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得所述PTD-NLS-Cas9/RNA复合物进入所述靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除；

本发明提供的这种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，实现了PTD-NLS-Cas9融合蛋白的获取，其中，PTD为蛋白转导结构域：是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，也称为细胞穿膜肽；可以有效地将多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA、RNA甚至颗粒性物质等在短时间内输送到细胞内，且不受细胞类型的限制。而NLS为细胞核定位结构域可以实现所携带的大分子物质定位在细胞核的效果。

进一步的，再将PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物同时包含了PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA；在PTD-NLS(蛋白转导结构域和细胞核定位结构域)的作用下，可以实现将Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞细胞核的效果；另外，向导RNA能够与目的基因互补结合，进而指导该复合物定向结合，并且通过Cas9实现定向剪切目的基因上的双链靶标片段的效果，最后通过靶细胞的自身DNA修复功能中的非同源末端连接功能，实现靶细胞基因组的高效定点靶向敲除的效果。

本发明实施例提供的这种方法，通过体外表达并纯化得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白，再将PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物利用蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的穿膜定位机制，以实现Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中的效果；克服了现有技术中Cas9核酸内切酶难以导入靶细胞的技术问题。可以很好的应用到针对肿瘤相关致癌基因、整合在细胞染色体上的病毒基因组等进行特异性的靶向敲除的实际操作中，为肿瘤、病毒治疗等方面提供更为便捷高效的实践指导方法。

可选的，在步骤1)中，具体包括：

将编码PTD和NLS的引物进行退火，得到双链DNA，并将所述双链DNA插入到出发载体中，得到包含PTD、NLS的重组载体pPTD-NLS；

在全长Cas9DNA片段的5’和3’端加入2个限制性内切酶位点，并利用限制性内切酶消化所述Cas9DNA片段和所述重组载体pPTD-NLS后，用T4DNA连接酶进行连接，得到体外表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9。

或，在全长Cas9DNA片段两端加入体外重组酶识别位点，利用体外重组系统将全长Cas9DNA片段插入重组载体pPTD-NLS，得到体外表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9。

可选的，在步骤1)中，编码PTD和NLS的所述引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

可选的，所述蛋白转导结构域PTD为能够携带大分子物质进行细胞的多肽；所述细胞核定位结构域NLS为能够携带大分子物质实现细胞核定位的肽段。

可选的，在步骤2)中，所述体外诱导表达采用原核体外表达菌株或真核体外表达细胞。

可选的，在步骤3)中，所述向导RNA的制备方法包括：将向导RNA的表达序列克隆到克隆载体中，得到重组克隆载体；以所述重组克隆载体为模板，进行体外转录，得到向导RNA。

可选的，在步骤4)中，所述靶细胞来源为真核细胞。

可选的，在步骤4)中，所述目的基因的靶标片段的一条链具有如下结构：5’-Nx-NGG-3’，其中，N为A、T、G和C中的任一种，19≤X≤30。

实现上述方法的基因组靶标目的基因的定向敲除的试剂盒。

可选的，该试剂盒包括：

Cas9核酸内切酶的编码基因；带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因；

含有Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；含有带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；

经体外表达并纯化后的具有蛋白转导功能及细胞核定位功能的Cas9核酸内切酶；

含有依次由启动子、两种或多种限制性内切酶特异性识别位点和向导RNA片段的编码DNA依次连接而成的DNA片段的重组克隆载体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例一提供的基因组靶标目的基因的定向敲除的方法流程示意图；

图2为本发明实施例二提供的PTD-NLS-Cas9融合蛋白的体外表达纯化结果和western-blot结果图；

图3为本发明实施例二提供的PTD-NLS-Cas9/RNA复合物的体外酶切活性验证结果图；

图4为本发明实施例二提供的TAT PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物进入293T细胞免疫荧光结果图；

图5为本发明实施例二提供的TAT PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物对于293T细胞染色体上hEmx1基因的敲除结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例一

请参考图1，本发明提供的这种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，包括以下步骤：

步骤101：构建包含蛋白转导结构域PTD、细胞核定位结构域NLS的重组载体pPTD-NLS；并利用限制性酶切连接或体外重组方法将重组载体与Cas9DNA片段进行连接，得到连接产物pPTD-NLS-Cas9；

在步骤101中，通过定制合成的根据大肠杆菌密码子优化后的编码蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的DNA引物，退火形成DNA双链并将其插入到出发体外表达载体中，进而构建出重组表达载体pPTD-NLS。

重组表达载体pPTD-NLS在T4DNA连接酶的作用下能够与Cas9DNA片段连接，进而获得连接产物；以备后续的转化以及体外表达所用。

步骤102：将连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、鉴定后获得包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆；将包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆在体外诱导表达，表达的蛋白经纯化后，得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白；

具体的，在步骤102中，将连接产物先转化到大肠杆菌中实现重组质粒的扩增，通过将转化后的大肠杆菌进行质粒抽提、酶切鉴定后，获得所需的pPTD-NLS-Cas9阳性克隆。

获得的pPTD-NLS-Cas9阳性克隆再转入原核体外表达菌株或真核体外表达细胞进行体外表达和纯化进而可获得能够与向导RNA结合的PTD-NLS-Cas9融合蛋白，表达和纯化的步骤按照常规操作进行即可。

步骤103：将PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；

在步骤103中，纯化后的PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育，进而获得PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物具备快速、高效进入靶细胞的细胞核效果，而且所含的Cas9核酸内切酶具备定向剪切的效果。

步骤104：将PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得PTD-NLS-Cas9/RNA复合物进入靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除。

PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育(孵育时间和其他工艺条件根据实际孵育效果设定)后，即可实现基因组靶标目的基因定向敲除的效果。

本发明提供的这种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，实现了PTD-NLS-Cas9融合蛋白的获取，其中，PTD为蛋白转导结构域；可以有效地将多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA、RNA甚至颗粒性物质等在短时间内输送到细胞内，且不受细胞类型的限制；而NLS为细胞核定位结构域可以实现所携带的大分子物质定位在细胞核的效果。

PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育后，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；由于该复合物同时包含了PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA；在PTD-NLS(蛋白转导结构域和细胞核定位结构域)的作用下，可以实现将Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞细胞核的效果。向导RNA能够与目的基因互补结合，进而指导该复合物定定向结合，并且通过Cas9实现定向剪切目的基因上的双链靶标片段的效果，最后通过靶细胞的自身DNA修复功能中的非同源末端连接功能，实现靶细胞基因组的高效定点靶向敲除的效果。

简而言之，本发明实施例提供的这种方法，通过体外表达并纯化得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白，再将PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物利用蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的穿膜定位机制，以实现Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中的效果；克服了现有技术中Cas9核酸内切酶难以导入靶细胞的技术问题。可以很好的应用到针对肿瘤相关致癌基因、整合在细胞染色体上的病毒基因组等进行特异性的靶向敲除的实际操作中，为肿瘤、病毒治疗等方面提供更为便捷高效的实践指导方法。

为了使得本发明上述实施例的基因组靶标目的基因的定向敲除的方法得到更好的应用，更加有效地应用到目的基因的修饰领域中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例二，实施例二给是上述实施例的方法的进一步限定和增加，现做详细的阐述和解释：

实施例二

在本实施例中，基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，包括以下步骤：

S1：将编码蛋白转导结构域(PTD)和细胞核定位结构域(NLS)的引物进行退火，得到双链DNA，并将双链DNA插入到出发载体中，得到包含PTD、NLS的重组载体pPTD-NLS；

优选的，编码蛋白转导结构域PTD和细胞核定位结构域NLS的引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

另外，蛋白转导结构域为能够携带大分子物质进行细胞的多肽；细胞核定位结构域为能够携带大分子物质实现细胞核定位的肽段。在本实施例中，优选的蛋白转导结构域为TAT蛋白转导结构域，优选的细胞核定位结构域为SV40细胞核定位结构域。

需要指出的是，在进一步的技术方案中，除了上述所举的蛋白转导结构域和细胞核定位结构域外，蛋白转导结构域还可以包括：天然存在的PTD和人工合成的PTD；具体的，天然PTD含有大量的精氨酸、赖氨酸残基，且含有一个高度正电荷区和一个螺旋结构，典型的有HIV-1病毒的TAT结构域、Antp、B型肝炎病毒蛋白PreS2和纯疱疹病毒转录调节蛋白(VP22)等；人工合成的PTD包括Transportan、MPG、细胞质转导肽CTP，RGD、iRGD、MPP、ACPP、NGR、AMP、CREKA肽、CLT1肽、CLT2肽等。

细胞核定位结构域还可以包括：病毒SV40的大T抗原、H2B、v-Jun、NIN2、RB、SWI5、Pho4、rpL25、rpL23a、HnRNP和PTHrP等蛋白中的细胞核定位结构域。

并且，在本发明中，对于蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的种类，并不限于以上所举出的实例，只要满足能够携带大分子物质进入细胞的任一短肽均可作为蛋白转导结构域；而能携带大分子物质实现细胞核定位功能的任一肽段均可作为细胞核定位结构域。

S2：在全长Cas9DNA片段的5’和3’端加入2个限制性内切酶位点，并利用限制性内切酶消化Cas9DNA片段和重组载体pET-TATPTD-SV40NLS后，用T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物(体外表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9)。

其中，全长Cas9DNA片段按照Cas9基因全序列，经原核密码子优化后，以分段合成、退火、连接的方式获得。

S3：将连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、酶切鉴定后获得pET-TAT PTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆；将pET-TATPTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆转入原核体外表达菌株中，体外表达后纯化，得到TAT PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白；

其中，pET-TAT PTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆的获取与步骤102一致，在此不作赘述，只是将PTD-NLS具体限定为TAT-SV40。而获得的pET-TAT PTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆除含有载体pET和全长Cas9所有序列外，还有一个带有6个组蛋白标签的序列、一个编码蛋白转导结构域TAT和一个细胞核定位结构域SV40NLS。

TAT PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白体外表达和纯化的具体操作优选按照以下操作进行：

a)将获得的阳性克隆pET-TAT PTD-SV40NLS-Cas9转化到大肠杆菌表达菌株中，37℃培养过夜后形成单菌落；

b)挑取一个单菌落于少量液体培养基中，37℃,200rpm震荡过夜培养后，再移入大体积液体培养基中，大规模培养，37℃,200rpm震荡培养至OD₆₀₀到达0.6左右；

c)将温度调至10-25℃培养并加入一定量的IPTG，200rpm震荡诱导过夜；

d)离心收集菌体后加入一定量冷的裂解液，并加入一定量的蛋白酶抑制剂混合液；

e)用细胞超声破碎法破碎菌体细胞；

f)用高速冷冻离心机，4℃，48000×g条件下离心30min后收集上清于；

g)加入50％的Ni-NTA agarose beads(qiagen公司)，4℃条件下震荡孵育2-3h；

h)上分离柱收集Ni-NTA agarose beads，并用5-10倍柱体积的裂解液清洗；

i)使用含有不同咪唑浓度的洗脱液洗脱，收集洗脱液并用SDS-PAGE检测含有蛋白转导和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶蛋白的表达状况及其纯度；

另外，将纯化得到的蛋白进一步使用His-Tag(2A8)Mouse mAb进行western-blot验证其是否为带有his融合标签的Cas9核酸内切酶蛋白；结果如图2所示；

在图2中，a结果表明所构建的pET-TAT PTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆可在大肠杆菌表达菌中大量表达获得150kD左右的蛋白。b是表达得到的TAT-PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白的western-blot结果，证实该蛋白带有his融合标签，故为TAT-PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白。

SEQ ID No.3示出了含有蛋白转导和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶蛋白(TAT-PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白)的氨基酸序列。

S4：将向导RNA的表达序列克隆到克隆载体中；得到重组克隆载体；以重组克隆载体为模板，进行体外转录，得到向导RNA；

具体的，在该步骤中，举出了靶向人源Emx1基因的向导RNA具体设计、构建以及体外转录的操作，包括以下两个方面：

A、含有向导RNA的表达盒的重组克隆载体的构建步骤：

1、按5’-Nx-NGG-3’的原则设计带有hEmx1靶标片段及骨架RNA编码基因，并按照分段合成、退火、连接的方式获得带有限制性酶切位点粘性末端的hEmx1gRNA全长序列；其中，SEQ ID No.4中第53–160位核苷酸序列所示是编码hEmx1gRNA的全长序列；

2、将获得的带有粘性末端的hEmx1靶标片段和骨架RNA的编码基因序列插入到带有T7启动子的出发克隆载体中，构建含有向导RNA的表达盒的重组克隆载体pET-gRNA-hEmx1；

B、含有向导RNA的表达盒的重组克隆载体pET-gRNA-hEmx1的体外转录具体步骤：

1、将重组克隆载体pET-gRNA-hEmx1使用合适的限制性内切酶酶切形成线性化质粒；

2、以形成的线性化质粒pET-gRNA-hEmx1作为体外转录模板，利用System—T7Kit体外转录试剂盒体外转录出向导RNA，命名为hEmx1-gRNA(即向导RNA)。

S5：将TAT-PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育，得到TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物。

该步骤实现了TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物的制备过程，具体的，为了检测其是否具有高效迅速仅进入靶细胞，且是否具有体外酶切活性的效果，本实施例将PTD-NLS-Cas9融合蛋白(TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白)与向导RNA形成的复合物的体外酶切酶活验证实验具体步骤如下：

(1)、将体外转录得到的hEmx1-gRNA(向导RNA)重新变性退火；

(2)、在hEmx1靶标片段的上下游设计和合成一对引物hEmx1-F和hEmx1-R(引物序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)，以293T细胞genomic DNA为模板，PCR并柱回收获得一段包含靶标片段的hEmx1基因片段；

(3)、取5个1.5ml EP管，分别标记为A、B、C、D、E；各管按照表1分别加入一定量相应溶液；

表1不同组成的混合物

(4)、将上述A、B、C、D和E管混匀后于适合温度水浴孵育30min；

(5)、A管中加入缓冲液和一定量DEPC处理过的纯水，其余各管加入一定量包含靶标片段的hEmx1基因片段；混匀后适合温度继续水浴孵育2h；

(6)、将上述A、B、C、D和E管置于95℃加热10min，缓慢降温至室温；

(7)、从各管中各取少量样本，加入适量的含GelRed的6×DNALoading buffer混匀上样于5％PAGE后，150V电泳30min；

(8)、电泳结束后用凝胶成像仪紫外条件下拍照观察。

TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白的体外酶切活性验证结果见图3。图3结果表明只有当TAT PTD-SV40NLS-Cas9(pET-PTD-NLS-Cas9融合蛋白)与hEmx1-gRNA(向导RNA)形成复合物后才能特异性识别hEmx1靶标片段并将684bp hEmx1切割形成367bp和317bp两个小片段。因此，证实体外纯化得到的TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白具有体外酶切活性。

S6：将TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物进入靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除。

在该步骤中，优选的，靶细胞取自真核细胞，具体为哺乳动物细胞，而且，在具体操作的过程中，优选的，目的基因的靶标片段的一条链具有如下结构：5’-Nx-NGG-3’，其中，N为A、T、G和C中的任一种，19≤X≤30。

进一步的，本发明对TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物(TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶蛋白与向导RNA形成的复合物)高效进入哺乳动物细胞效果进行了验证：

将体外表达纯化得到的PTD-NLS-Cas9/RNA复合物(本实施例中具体为TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶蛋白与hEmx1-gRNA形成复合物)后导入293T细胞，利用细胞免疫荧光验证复合物进入细胞效果，具体步骤如下：

(1)、293T细胞以一定细胞密度接种于一个CELLview玻璃底细胞培养皿(Greiner Bio-one公司)，加入完全培养基，5％CO₂温箱37℃培养24h；

(2)、取5μl 10X缓冲液、TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白以及体外转录hEmx1-gRNA并用DEPC-H₂O补齐至50μl混匀后，适合温度孵育一定时间；

(3)、取40μl上述复合物溶液加入到CELLview玻璃底细胞培养皿中，5％CO₂温箱37℃继续培养；

(4)、24h后更换新鲜的完全培养基，5％CO₂温箱37℃继续培养；

(5)、24h后从细胞培养箱中取出CELLview玻璃底细胞培养皿，弃去培养基；

(6)、用预温或室温的1×PBS洗涤3次，每次10min；

(7)、4％的冷甲醛室温固定细胞一定时间；

(8)、1×PBS洗涤细胞3次，每次10min；

(9)、0.2％Triton X-100透膜10-20min；

(10)1×PBS洗涤细胞3次，每次10min；

(11)、5％FBS 37℃封闭30min；

(12)、1×PBS洗涤细胞3次，每次10min；

(13)、加入按一定比例稀释的HIV-1Tat Antibody(Millipore公司)，37℃孵育一定时间；

(14)、1×PBS洗涤细胞3次，每次10min；

(15)、加入按一定比例稀释的goat anti-mouse IgG-FITC(CST公司)，37℃孵育一定时间；

(16)、1×PBS洗涤细胞3次，每次10min；

(17)、荧光显微镜下观察荧光强度；

(18)、用DAPI(sigma公司)染细胞核后，荧光显微镜下紫外观察细胞。

TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物进入293T细胞免疫荧光结果请参考图4。图4表明体外形成的TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物可以高效进入近100％的293T细胞中，并定位于细胞核上。

另外，本发明实施例还对TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物(TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶蛋白与向导RNA形成的复合物)对哺乳动物细胞内基因组敲除的效果进行了验证：

体外表达纯化得到的TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶蛋白与hEmx1-gRNA体外孵育，结合成复合物后，加入到293T细胞培养液中，共孵育72h后，用surveyor assay方法分析TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物对细胞内源基因hEmx1的敲除结果，其具体步骤如下：

(1)、293T细胞以一定细胞密度铺于24孔板，5％CO₂温箱37℃培养；

(2)、取5μl 10X缓冲液、一定量TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白以及一定量体外转录hEmx1-gRNA，并用DEPC-H2O补齐至50μl混匀后，适合温度孵育一定时间后形成TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物；(具体的，TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白和体外转录hEmx1-gRNA的摩尔比可为：1:0.5～1:5,本实施例较优为1:2)。

(3)、取40μlTAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物加入到其中一个24孔293T细胞中作为实验孔，另一个24孔293T细胞加入相同体积的复合物反应液作为对照孔，5％CO₂温箱37℃继续培养；

(4)、24h后，两孔同时更换新鲜完全培养基继续培养48h；

(5)、细胞继续培养48h后，分别收集实验孔和对照孔细胞，使用基因组抽提试剂盒(上海缔达生物科技有限公司)，按照试剂盒所示操作步骤提取基因组DNA；

(6)、以该基因组DNA为模板，利用两条特异性引物hEmx1-F和hEmx1-R(引物序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到一段684bp DNA片段；

(7)、PCR产物经1％琼脂糖凝胶分离后，使用胶回收试剂盒(上海缔达生物科技有限公司)并按照该试剂盒所示操作步骤回收DNA产物；

(8)、回收得到的DNA产物重新变性退火后，使用surveyorassay kit(Transgenomic公司)按照该试剂盒所示操作进行酶切反应；

(9)、分别加入适量的含GelRed的6×DNA Loading buffer混匀上样于5％PAGE后，150V电泳30min；

(10)、电泳结束后用凝胶成像仪紫外条件下拍照观察。

hEmx1的敲除结果见图5。图5中的1是实验孔的surveyor assay结果显示DNA产物被切割形成367bp和317bp两个小片段；而图5中的2是对照孔的surveyor assay结果显示DNA产物未被切割形成小片段。因此表明以实验孔细胞genomic DNA获得的DNA片段中的靶序列经TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基，从而证实体外表达纯化得到的TAT PTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶蛋白与hEmx1-gRNA形成的复合物能够在细胞内实验基因组定点靶向敲除。

为了使得上述实施例提供的方法得到更好的实现，本发明还依据上述实施例所示的方法提供了一种基因组靶标目的基因的定向敲除的试剂盒，以实现上述的方法。

具体的，在该试剂盒中，包括Cas9核酸内切酶的编码基因；带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因；

含有Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；含有带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；

经体外表达并纯化后的具有蛋白转导功能及细胞核定位功能的Cas9核酸内切酶；

含有依次由启动子、两种或多种限制性内切酶特异性识别位点和骨架RNA片段的编码DNA依次连接而成的DNA片段的重组克隆载体；上述所示的样品可以满足基因组靶标目的基因的定向敲除的方法的操作所需。

本发明实施例的基因组靶标目的基因的定向敲除方法通过创新性的将蛋白转导寡肽(结构域)与Cas9核酸内切酶重组并体外表达,然后与向导RNA组装形成融合Cas9/RNA复合物，在蛋白转导结构域的帮助下快速、高效地导入靶细胞中，特异性地对细胞中的基因组进行敲除。

本发明提供的这种试剂盒相较其他商业化基因敲除试剂盒，具有高效率、低毒、操作简便，尤其是针对难转染的细胞系、干细胞和处于静息状态的细胞等。利用本试剂盒可以对肿瘤相关致癌基因、整合在细胞内的病毒基因组进行特异性的靶向敲除，为肿瘤、病毒治疗等方面提供更为便捷高效的工具。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、构建包含蛋白转导结构域PTD、细胞核定位结构域NLS的重组载体pPTD-NLS；并利用限制性酶切连接或体外重组方法将重组载体与Cas9DNA片段进行连接，得到连接产物pPTD-NLS-Cas9；

2)、将所述连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、鉴定后获得包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆；将所述包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆在体外诱导表达，表达的蛋白经纯化后，得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白；

3)、将所述PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；

4)、将所述PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得所述PTD-NLS-Cas9/RNA复合物进入所述靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，具体包括：

将编码PTD和NLS的引物进行退火，得到双链DNA，并将所述双链DNA插入到出发载体中，得到包含PTD、NLS的重组载体pPTD-NLS；

在全长Cas9DNA片段的5’和3’端加入2个限制性内切酶位点，并利用限制性内切酶消化所述Cas9DNA片段和所述重组载体pPTD-NLS后，用T4DNA连接酶进行连接，得到体外表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，编码PTD和NLS的所述引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白转导结构域PTD为能够携带大分子物质进行细胞的多肽；

所述细胞核定位结构域NLS为能够携带大分子物质实现细胞核定位的肽段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述体外诱导表达采用原核表达菌株或真核表达细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述向导RNA的制备方法包括：

将向导RNA的表达序列克隆到克隆载体中，得到重组克隆载体；以所述重组克隆载体为模板，进行体外转录，得到向导RNA。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述靶细胞来源为真核细胞。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述目的基因的靶标片段的一条链具有如下结构：

5’-Nx-NGG-3’，其中，N为A、T、G和C中的任一种，19≤X≤30。

9.一种实现根据权利要求1所述的方法的基因组靶标目的基因的定向敲除的试剂盒。

10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

Cas9核酸内切酶的编码基因；带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因；

含有Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；含有带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；

经体外表达并纯化后的具有蛋白转导功能及细胞核定位功能的Cas9核酸内切酶；

含有依次由启动子、两种或多种限制性内切酶特异性识别位点和向导RNA片段的编码DNA依次连接而成的DNA片段的重组克隆载体。