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CN104271588B - 具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的多肽 - Google Patents

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CN104271588B CN201280043730.9A CN201280043730A CN104271588B CN 104271588 B CN104271588 B CN 104271588B CN 201280043730 A CN201280043730 A CN 201280043730A CN 104271588 B CN104271588 B CN 104271588B
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A.沙马
L.马梅多瓦
O.E.莱维
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Abstract

提供具有特别良好的作用持续时间、高效能和/或方便的给药方案(包括口服给药)以及降低的免疫原性的化合物。所述化合物是工程改造的多肽，其包含白蛋白结合结构域与一种或多种生物活性多肽的组合。还提供治疗疾病和病症的药物组合物和方法，所述疾病和病症包括肥胖和超重、糖尿病、血脂障碍、高血脂、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、短肠综合征、帕金森病和心血管病。

Description

具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的 多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2011年7月8日的USSN 61/505982和提交于2012年1月11日的USSN 61/585577的优先权，这两者通过引用予以结合用于所有目的。
序列表
本申请包含序列表，其通过EFS-Web以ASCII格式提交，并通过引用以其整体予以结合。所述ASCII副本创建于2012年6月22日，命名为0263WO1.txt，大小为366,392字节。
发明背景
本申请涉及具有良好的作用持续时间、高效能和/或方便的给药方案(包括口服给药)的化合物以及其使用方法。本文提供了工程改造的多肽，其包含白蛋白结合结构域与生物活性肽的组合。不希望被任何理论所束缚，认为因为本文所述的工程改造的多肽可结合白蛋白，因此当在循环时所述化合物可被螯合(例如，结合到白蛋白)，由于例如肾清除率和/或降解减少而导致作用持续时间增加。可顺从所述治疗的疾病包括肥胖和超重、糖尿病、血脂障碍、高血脂、短肠综合征、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、帕金森病、心血管病和其它中枢神经系统病症或其组合。
仍有需要开发可用于上文所述代谢疾病、病况和病症的多肽。因此，本发明的一个目标是提供可用于治疗上述病况的具有延长半寿期的工程改造的多肽和制备及利用所述多肽的方法。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
发明简述
提供了具有对白蛋白的结合亲和力和另外治疗效用的工程改造的多肽化合物。所述化合物是工程改造的多肽，其包含能够结合白蛋白的如本文所定义的白蛋白结合结构域(ABD)多肽和激素结构域(HD)多肽，所述HD多肽与ABD共价连接，可具有生物学活性并且可诱发有益的生物学反应。本文所述的ABD或HD多肽中的任一个可任选在工程改造的多肽中通过接头L (例如，如本文所述的L1)共价键合。不希望受任何理论的束缚，认为因为本文所述的工程改造的多肽可结合白蛋白，所述化合物可在受试者中被螯合，导致在受试者中的作用持续时间增加。
在第一方面，提供如本文所述的工程改造的多肽。所述工程改造的多肽包含如本文所述的白蛋白结合结构域多肽(ABD)和激素结构域(HD1)。所述激素结构域包含其为毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽的片段或毒蜥外泌肽的类似物的多肽。
在另一方面，提供用于在需要治疗的受试者中治疗疾病或病症的方法。所述方法包括将如本文所述的工程改造的多肽给予受试者。
在仍另一方面，提供药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂组合的本文所述的工程改造的多肽化合物。
在仍另一方面，提供编码工程改造的多肽的多核苷酸和它们的中间体、带有所述多核苷酸的表达载体、表达所述多核苷酸的宿主细胞和用于它们表达、合成、翻译后修饰和分离的手段。
本发明的一个优势是所述工程改造的多肽可完全通过重组方法合成，避免了复杂的或额外的合成步骤或化学步骤和相关的反应试剂和催化剂。因此，与具有延长的作用持续时间的化学来源的化合物相比，本发明的多肽可以低得多的成本合成。除了长的作用持续时间(例如，在人受试者中至少1周，尽管如果需要的化，每日一次也可实现)以外，另一优势是它们相对小的尺寸，这可允许口服递送以提高患者顺应性。
本文所公开的化合物在小鼠中在OGTTDOA (针对作用持续时间的口服葡萄糖耐量试验)测试中显示至少24小时以及甚至更长至两天的令人惊讶的功效(在人中其转变为5-7天或更长)、稳健的血糖控制、体重减轻、食物摄取和体重的剂量依赖性减少。在大鼠中，单次给予时化合物暴露持续4-7天，在人中其转变为至少一周1次暴露。化合物在血浆中以及对血浆蛋白酶稳定，当与血清白蛋白结合时有活性，并且可在体内提供类似于或大于毒蜥外泌肽-4的最大功效。甚至更令人惊讶的是，所述化合物适合于口服递送。
附图简述
图1是可用于本文公开的工程改造的多肽的白蛋白结合多肽(SEQ ID NO:301-452、SEQ ID NO:455-461)、通过N-端甘氨酸残基而延长的来自链球菌菌株G148的蛋白G的GA3结构域(SEQ ID NO:453)和先前由Jonsson等(Protein Eng. Design & Selection,2008, 21:515-527)所述的源自G148-GA3的白蛋白结合多肽(SEQ ID NO:454)的实例的氨基酸序列列表。
图2显示在Biacore仪器上进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP07912 (SEQ ID NO: 457)与人血清白蛋白的结合。将三个不同浓度的纯化蛋白(40 nM，粗灰线；10 nM，黑线；2.5 nM，灰线)注入到具有955 RU的固定人血清白蛋白的表面上。
图3A-C显示通过ELISA进行的结合分析的结果，其用于研究白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968 (即，与PEP07911 (SEQ ID NO:459)缀合的DOTA)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)与存在于126份单独的正常人血清中的IgG分子的结合，其中A)显示平均OD值，B)显示阴性血清的百分比(由OD <0.15定义)，和C)显示阳性血清的百分比(由OD >1.0定义)。
图4A-C为显示在CD3+ CD4+细胞增殖测定法中白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ IDNO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (即，与PEP07911 (SEQ ID NO:459)缀合的DOTA)的免疫原性评估的图示。A)显示，在52个高加索人供体中，与重组人白蛋白比较，响应所述白蛋白结合多肽的个体的数量。B)显示与含有重组人白蛋白的阴性对照相比，PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968的平均刺激指数(SI)。C)显示与缓冲液对照相比，对研究中所有蛋白有响应的个体的数量。
图5A-5C。给予四周后，白蛋白结合的工程改造的多肽在ob/ob小鼠中的作用。图5A：与以7.2或100纳摩尔/kg/天持续输注(CSI)毒蜥外泌肽-4比较，在以25或250 nmol/kg每周两次注射Cmpd 088后在指定天时HbA1c (血红蛋白A1c)的改变。图5B：在如图5A所述的剂量后血糖的改变。图5C：在如图5A所述的剂量后体重的改变。* p<0.5 vs.溶媒对照；Anova, Dunnett’s检验。
图6A-6C。在正常的Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠中给予的示例性工程改造的多肽Cmpd 11的药代动力学(PK)概况和生物学活性。图6A显示化合物对减少食物摄取的影响。图6B显示化合物对减少体重的影响。图6C显示单次剂量后化合物的PK概况。在图中，溶媒是实心正方形，工程改造的多肽是空心倒三角形。
图7A-7C。在正常的Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠中给予的示例性工程改造的多肽Cmpd 9的药代动力学(PK)概况和生物学活性。图7A显示化合物对减少食物摄取的影响。图7B显示化合物对减少体重的影响。图7C显示单次剂量后化合物的PK概况。在图中，溶媒是实心正方形，工程改造的多肽是实心三角形。
图8A-8C。图8A-8C显示，在正常的Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠中，与静脉内给予的未缀合的毒蜥外泌肽类似物相比，示例性工程改造的多肽Cmpd 11的药代动力学(PK)概况和生物学活性。图8A显示化合物对减少食物摄取的影响。图8B显示化合物对减少体重的影响。图8C显示单次静脉内剂量后示例性化合物的PK概况。结果以皮摩尔血浆水平显示。图例：溶媒(菱形)；以2 nmol/kg IV的[14Leu]毒蜥外泌肽-4 (框)；以2 nmol/kg IV的毒蜥外泌肽-4 (圆形)；以2 nmol/kg IV的Cmpd 11 (空心三角形和实心三角形)。
图9A-9F。图9A-9F显示每日一次或每周两次经亚长期给予的示例性工程改造的多肽Cmpd 11的药代动力学(PK)概况和生物学活性。如向下箭头指示的每周两次(BIW；空心倒三角形)或每日一次(QD；空心正方形)经14天以25 nmol/kg皮下给予Cmpd 11，并与溶媒比较(实心圆形)。图9A显示累积的食物摄取。图9B显示每日食物摄取的百分比变化。图9C显示累积的食物摄取的百分比变化。图9D显示总体重。图9E显示体重的百分比变化。图9F显示BIW或QD给予的Cmpd 11的PK概况。
图10。该图显示，与未缀合的毒蜥外泌肽类似物相比，多肽(Cmpd 088)在口服递送后对较低血糖的生物学活性时间进程。参见实施例。平均治疗前葡萄糖：约623 mg/dL。图例：溶媒(实心正方形)；毒蜥外泌肽-4类似物(空心框)；Cmpd 088 (菱形)。
发明详述
I. 定义
“肥胖”和“超重”是指体重大于正常预期的哺乳动物，并且可通过例如身体外观、本领域已知的体重指数(BMI)、腰臀围比率、皮褶厚度、腰围等确定。疾病控制与预防中心(CDC)将超重定义为具有25-29.9 BMI的成人；并将肥胖定义为具有30或更高BMI的成人。存在确定肥胖的其他测定法。例如，CDC规定腰臀围比率大于1.0的人为超重。
“瘦体重”是指身体的无脂肪质量，即总体重减去身体脂肪重量为瘦体重。瘦体重可通过例如本领域已知的流体静力学称重(hydrostatic weighing)、计算机化室(computerized chamber)、双能X-射线吸收测定法、皮肤测径器、磁共振成像(MRI)和生物电阻抗分析(BIA)等方法测量。
“哺乳动物”是指通常具有毛皮或毛发的温血动物，其活胎产后代并用乳喂养其后代。哺乳动物包括人类、伴侣动物(例如狗、猫)、农畜(例如奶牛、马、绵羊、猪、山羊)、野生动物等。在一个实施方案中，所述哺乳动物为雌性。在一个实施方案中，所述哺乳动物为女人。在一个实施方案中，所述哺乳动物为猫或狗。在一个实施方案中，所述哺乳动物是糖尿病哺乳动物，例如具有2型糖尿病的人类。在一个实施方案中，所述哺乳动物是肥胖型糖尿病哺乳动物，例如具有2型糖尿病的肥胖哺乳动物。在本文所述方法的背景下，术语“受试者”是指哺乳动物。
多肽背景下的“片段”在惯例的化学意义上在本文是指多肽的一部分。例如，片段可由母体多肽N-端缺失或C-端缺失一个或多个残基产生，和/或片段可由母体多肽内部缺失一个或多个残基产生。抗体背景下的“片段”是指抗体的一部分，其可与生物学活性分子连接以调节在受试者内的溶解性、分布等。例如，毒蜥外泌肽-4 (1-30)描述毒蜥外泌肽-4的生物学活性片段，其中毒蜥外泌肽第31-39位氨基酸的C-端“尾”缺失。多肽背景下的术语“母体”在惯例意义上是指作为修饰(例如插入、缺失和/或取代)前的参照结构的多肽。本文所述的工程改造的多肽背景下的术语“缀合物”是指组分多肽(例如ABD、HD1等)之间的共价连接。本文所述的工程改造的多肽背景下的术语“融合物”是指组分多肽(例如ABD、HD1等)之间通过肽骨架的末端氨基或羧基官能团的任一个或两者的共价连接。工程改造的多肽可合成制备或重组制备。通常，融合物使用重组生物技术制备，然而还可通过化学合成和缀合方法制备。
多肽背景下本文所用的“类似物”是指相对于母体化合物，具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的化合物。多肽背景下本文所用的“类似物序列”是指相对于母体氨基酸序列(例如野生型序列、天然序列)，具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。类似物可具有优良的稳定性、溶解性、功效、半寿期等。在一些实施方案中，类似物是与母体化合物具有至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性的化合物。在一个优选的实施方案中，类似物具有1-5个氨基酸修饰，所述修饰独立选自插入、缺失、添加和取代中的任一个或组合。在任一个本文的实施方案中，毒蜥外泌肽类似物可具有1-5个氨基酸修饰，所述修饰独立选自插入、缺失、添加和取代中的任一个或组合，并且所述类似物优选保留与母体化合物至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性，并且甚至更优选保留与母体化合物至少80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性，并且母体化合物优选是毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4 (1-38)、毒蜥外泌肽-4 (1-37)、毒蜥外泌肽-4 (1-36)、毒蜥外泌肽-4 (1-35)、毒蜥外泌肽-4 (1-34)、毒蜥外泌肽-4 (1-33)、毒蜥外泌肽-4 (1-32)、毒蜥外泌肽-4 (1-31)、毒蜥外泌肽-4 (1-30)、毒蜥外泌肽-4 (1-29)、毒蜥外泌肽-4 (1-28)或它们的Leu-14取代对应物，例如Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-38)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-38)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-37)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-36)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-35)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-34)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-33)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-32)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-31)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-30)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-29)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-28)，并且母体化合物最优选具有毒蜥外泌肽-4或Leu14毒蜥外泌肽-4的序列。在一个优选的实施方案中，毒蜥外泌肽类似物片段不是毒蜥外泌肽-4 (1-28)或其氨基酸取代类似物例如Leu14毒蜥外泌肽-4 (1-28)。毒蜥外泌肽类似物片段长度优选为至少29个氨基酸。在一个实施方案中，至少对应于毒蜥外泌肽-4的第1、4、6、7和9位的氨基酸与天然毒蜥外泌肽-4的氨基酸相同，此外1-5个修饰是在除了毒蜥外泌肽-4的第1、4、6、7和9位之外位置上的保守氨基酸取代。例如，在本文实施方案的又一另外的实施方案中，毒蜥外泌肽类似物保留至少存在于毒蜥外泌肽-4的第3、4、6、5、7、8、9、10、11、13、15、18、19、22、23、25、26和/或30位上的氨基酸，并且进一步优选剩余位置中的不超过1-5个被另一氨基酸、最优选化学保守氨基酸取代。在本文的所有类似物中，在第1和/或2位上的任何取代或修饰将保留对DPP-IV切割的抵抗，同时保留或改进促胰岛素活性，如本领域对毒蜥外泌肽-4类似物例如脱氨基-组氨酰基-毒蜥外泌肽-4所已知。按本领域的惯例，氨基酸取代背景下术语“保守的”是指保持电荷类型的性质(例如阴离子、阳离子、中性、极性等)、疏水性或亲水性、体积(bulk)(例如范德华接触等)和/或官能性(例如羟基、胺、巯基等)的取代。术语“非-保守的”是指不是保守的氨基酸取代。
在比较两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，“同一性”、“序列同一性”等是指相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，在特定区域内约50%同一性、优选50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性)的两个或更多个序列或亚序列，如使用本领域已知的序列比较算法例如BLAST或BLAST 2.0所测定。该定义包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列，以及天然存在的例如多态性或等位基因变体和人工变体。在优选的算法中，如本领域已知的，计算空位等。对于序列比较，通常一个序列作为参照序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，或者可指定备选参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。可例如通过Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444的类似性检索方法，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化执行，或通过人工比对和目测进行序列比较的最优比对。参见例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等编辑，1995年增刊)。适于确定百分比序列同一性和序列类似性的算法的优选实例包括BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等, 1977, Nuci. Acids Res. 25:3389-3402和Altschul等, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410。如本领域已知，使用BLAST和BLAST 2.0确定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列一致性。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的网站公开可得的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短的字码(word)来确定高得分序列对(HSP)，所述查询序列当与数据库序列中相同长度的字码进行比对时，匹配或满足某一正值阈值得分T。将T称为邻近字码得分阈值(Altschul等, Id.)。这些起始的邻近字码命中(hit)作为用于开始检索发现含有它们的更长HSP的种子。字码命中在两个方向上沿每个序列延伸，直到累积的比对得分可增加。使用例如用于核苷酸序列的参数M (对于匹配残基对的奖分；总是大于0)和N (对于错配残基的罚分；总是小于0)计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积的得分。在以下情况时，停止在每个方向上字码命中的延伸：累积比对得分从其最大获取值减少了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积聚，累积得分转为零或零以下；或者到达任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N=-4，以及双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff &Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=-4以及双链比较。
在数值背景下术语“约”是指数值的+/- 10%。
在本文所述的工程改造的多肽的组分背景下，术语“肽”和“多肽”是同义的。
II. 化合物
在第一方面，工程改造的多肽化合物提供有序列，其包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和至少一个多肽激素结构域(HD1)序列。术语“白蛋白结合结构域”、“ABD”等是指能够结合本文所述的白蛋白的多肽。术语“激素结构域”、“激素结构域多肽”等是指能够在受试者中激发生物学反应的GLP-1受体激动剂多肽。示例性激素结构域包括但不限于毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽片段或毒蜥外泌肽类似物。
令人惊讶地发现，毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物或活性片段可与极高亲和力的白蛋白结合结构域(ABD)融合(所述ABD源自链球菌菌株G148的细菌G蛋白的白蛋白结合结构域并与其具有显著的氨基酸序列同一性)，同时保留足够的毒蜥外泌肽-4生物学活性和具有延长的作用持续时间，例如在啮齿动物中至少3天和甚至5天，其在人受试者中转变为至少1周或更长的持续时间。“持续时间”在惯常意义上是指在治疗方案中允许更不频繁的给药。因此，延长的作用持续时间将允许更不频繁和/或更方便的给药方案。这令人吃惊，部分是因为所述ABD肽未曾广泛证实作为治疗蛋白载体是一个稳健的平台，它们相对疏水，其可不利地与所连接的治疗肽相互作用，并且对于至少一个家族的肽激素而言其不能作为载体。特别地，大鼠胰岛淀粉样多肽当与本文所述的ABD缀合或融合时，在相同的啮齿动物模型未显示出任何明显的或长效的体内活性，其中发现各种毒蜥外泌肽-ABD构建体具有活性和长的作用持续时间。
此外，本文的治疗缀合物或融合物化合物令人惊讶地保留了白蛋白结合亲和力和特异性，同时具有较低的免疫原性和毒蜥外泌肽-4治疗活性。所述化合物令人惊讶地具有活性，尽管在毒蜥外泌肽和ABD之间不存在血浆蛋白酶切割位点。更令人惊讶的是，认为治疗化合物即使当与白蛋白结合时也具有活性。本文所述的ABD化合物提供白蛋白结合亲和力和特异性，同时具有比之前描述的ABD化合物更低的免疫原性，所述之前描述的ABD化合物基于链球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白结合区并在Jonsson 等(Protein Eng.Design & Selection, 2008, 21:515-527)中。最近，通过实验鉴定了在链球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白结合区内的几个T-细胞和B-细胞表位(Goetsch等, Clin. Diagn.Lab. Immunol. 10:125-32, 2003)。作者对在疫苗中利用G148的T-细胞表位感兴趣，即利用白蛋白结合区的固有免疫刺激特性。Goetsch等另外在G148序列中发现一个B-细胞表位，即免疫后与抗体结合的区域。在用于人给药的药物组合物中，无免疫反应是合乎需要的。因此，由于白蛋白结合结构域G148的上述免疫刺激特性，从而不优选用于所述组合物中。
生物学活性组分
预期用于本文所述的化合物和方法的生物学活性化合物组分包括毒蜥外泌肽。术语“生物学活性化合物”等在惯常意义上是指化合物例如多肽等，其可诱发生物学反应。
毒蜥外泌肽。毒蜥外泌肽是亚利桑那州和北墨西哥内生的爬行动物毒蜥(Gilamonster)和墨西哥鬃狮蜥(Mexican Bearded Lizard)的唾液分泌物中发现的肽。毒蜥外泌肽-3存在于墨西哥珠毒蜥(Heloderma horridum )(墨西哥鬃狮蜥)的唾液分泌物中，毒蜥外泌肽-4存在于钝尾毒蜥(Heloderma suspectum)(毒蜥)的唾液分泌物中。参见Eng等,1990, J. Biol. Chem., 265:20259-62；Eng等, 1992, J. Biol. Chem., 267:7402-7405。毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的序列分别如下：HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:1)；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:2)。
Hargrove等(Regulatory Peptides, 2007, 141:113-119)报道一种毒蜥外泌肽-4肽类似物，其为全长的C-端酰胺化的毒蜥外泌肽-4肽类似物，与天然毒蜥外泌肽-4相比，在第14位上具有单个的核苷酸差异。[14Leu]毒蜥外泌肽-4的序列如下：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:3)。Leu14毒蜥外泌肽-4是用于工程改造的多肽的优选类似物，所述多肽的用途在本文描述。另一个毒蜥外泌肽-4肽类似物是一种嵌合体，所述嵌合体为在第14和28位上具有氨基酸取代的毒蜥外泌肽-4的起始32个氨基酸和随后的来自非哺乳动物(青蛙) GLP1的C-端的5个氨基酸的序列：[Leu14,Gln28]毒蜥外泌肽-4(1-32)-fGLP-1(33-37)。该化合物具有下列序列：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:4)。本领域还已知毒蜥外泌肽-4的C-端截短的生物学活性形式，例如毒蜥外泌肽-4 (1-28)、毒蜥外泌肽-4 (1-29)、毒蜥外泌肽-4 (1-30)、毒蜥外泌肽-4 (1-31)、毒蜥外泌肽-4 (1-32)和它们的酰胺化形式。所有的这些毒蜥外泌肽类似物都适于作为本发明的工程改造的多肽的组分。如本领域惯例的，在肽化合物名称中的方括号(即“[]”)表示方括号内的残基取代或化学特征。例如，[14Leu]毒蜥外泌肽-4、[14Leu]Ex-4等是指在第14位上具有亮氨酸的毒蜥外泌肽-4。氨基酸的数字位置可以本领域常规采用的多种方式通过前置或后置的数字表示。例如，术语14Leu、Leu14、14Leu、Leu14等在指第14位的亮氨酸时是同义的。
应理解，在一些实施方案中，C-端酰胺或其他C-端封端部分可存在于本文所述的化合物中。
尽管毒蜥外泌肽与胰高血糖素样肽家族的数个成员具有一定的序列相似性，与GLP-1 (7-36)NH2 (Goke等, 1993, J. Biol. Chem., 268:19650-55) [GLP-1(7-37)NH2的序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO:5，有时亦称为“GLP-1”)]具有53%的最高同源性，所述GLP-1具有刺激胰腺β-细胞的胰岛素分泌的促胰岛素作用，但毒蜥外泌肽不是GLP-1的同源物。
药理学研究已产生报道，毒蜥外泌肽-4可在某些胰岛素分泌细胞中体外作用于GLP-1受体，然而，还报道毒蜥外泌肽-4可作用于不通过GLP-1起作用的受体。此外，毒蜥外泌肽-4与GLP-1在体内共有一些但不是全部的生物学性质，并且其具有比GLP-1明显更长的作用持续时间。基于它们的促胰岛素活性，已提议了毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4在治疗糖尿病和预防高血糖症中的用途(Eng, U.S. Pat. No. 5,424,286，通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的)，事实上，毒蜥外泌肽-4已在美国和欧洲被批准用作用于治疗2型糖尿病的治疗剂。
事实上，认为毒蜥外泌肽不是哺乳动物GLP-1的物种同源物，如从毒蜥中克隆了毒蜥外泌肽基因的Chen和Drucker所报道(J. Biol. Chem. 272:4108-15 (1997))。毒蜥还具有单独的胰高血糖素原(由此加工GLP-1，其中与毒蜥外泌肽相比，所述胰高血糖素原更类似于哺乳动物胰高血糖素原)基因的观测结果表明毒蜥外泌肽不仅仅是GLP-1的物种同源物。
使用毒蜥外泌肽激动剂调节胃肠运动的方法描述于美国专利号6,858,576 (即，基于提交于1997年8月8日的美国申请序列号08/908,867，其是提交于1996年8月8日的美国申请序列号08/694,954的部分继续申请)。使用毒蜥外泌肽激动剂减少食物摄取的方法描述于美国专利号6,956,026 (即，基于提交于1998年1月7日的美国申请序列号09/003,869，其要求提交于1997年1月7日的美国申请号60/034,905、提交于1997年8月7日的美国申请号60/055,404、提交于1997年11月14日的美国申请号60/065,442和提交于1997年11月14日的美国申请号60/066,029的权益)。
可用于本文所述的工程改造的多肽的新的毒蜥外泌肽激动剂化合物序列描述于WO 99/07404 (即，提交于1998年8月6日的PCT/US98/16387)、WO 99/25727 (即，提交于1998年11月13日的PCT/US98/24210)、WO 99/25728 (即，提交于1998年11月13日的PCT/US98/24273)、WO 99/40788、WO 00/41546和WO 00/41548，其连同它们授权的对应美国专利一起通过引用结合到本文中并用于所有目的。本领域已知的体外和体内测定毒蜥外泌肽活性的方法(包括促胰岛素、食物摄取抑制活性和体重减少活性)在本文以及上述参考文献和本文列举的其他参考文献中描述。
某些示例性毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激动剂和毒蜥外泌肽类似物激动剂包括：毒蜥外泌肽片段毒蜥外泌肽-4 (1-30) (His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu SerLys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly)(SEQ ID NO: 680)；毒蜥外泌肽-4 (1-28)、毒蜥外泌肽-4 (1-298)、毒蜥外泌肽-4 (1-30)、毒蜥外泌肽-4 (1-31)和毒蜥外泌肽-4 (1-32)。类似物包括在14Met位置(即，14Met)上用非氧化氨基酸例如亮氨酸的取代。实例包括[14Leu]毒蜥外泌肽-4、[14Leu]毒蜥外泌肽-4(1-30)、[14Leu]毒蜥外泌肽-4(1-28)和[14Leu,25Phe]毒蜥外泌肽-4。
用于本文所述的工程改造的多肽的毒蜥外泌肽类似物激动剂包括描述于美国专利号7,223,725 (通过引用结合到本文并用于所有目的)中的那些，例如下式的化合物：Xaa1 Xaa2 Xaa3 Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z1；其中Xaa1为His、Arg或Tyr；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala、Phe、Tyr；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Ala、Phe、Tyr；Xaa23为Ile、Val、Leu或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、Gly Gly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser-Z2 (SEQ ID NO:681)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2 (SEQ ID NO: 682)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2(SEQ ID NO: 683)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2 (SEQ ID NO: 684)、Gly GlyXaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2 (SEQ ID NO: 685)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly AlaXaa36 Xaa37-Z2 (SEQ ID NO: 686)或Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2 (SEQ ID NO: 687)；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地为Pro或不存在；和Z2为-OH或-NH2。在上文所述的毒蜥外泌肽类似物中的任一个和每一个中，还特别预期的是其中对应于Xaa1的组氨酸被置换为以下中的任一个的那些类似物：D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、N-α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙酰基、脱氨基-组氨酰基(咪唑并丙酰基)、β-羟基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-组氨酰基或β-羧基-咪唑并丙酰基。本文进一步特别预期的是本文描述的毒蜥外泌肽类似物，其中在Xaa2上的甘氨酸被置换为以下中的任一个：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸。
根据一个实施方案，示例性化合物包括上式的那些化合物，其中Xaa1为His或Arg；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala或Phe；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala或Leu；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala或Leu；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe；Xaa23为Ile、Val；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、Gly Gly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser-Z2 (SEQ IDNO: 681)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2 (SEQ ID NO: 682)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2(SEQ ID NO: 683)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2 (SEQ ID NO: 684)、Gly GlyXaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2 (SEQ ID NO: 685)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly AlaXaa36 Xaa37-Z2 (SEQ ID NO: 686)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2(SEQ ID NO: 687)；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立为Pro或不存在并且Z2为-OH或-NH2；条件是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27 and Xaa28中的不超过三个是Ala。在上文所述的毒蜥外泌肽类似物中的任一个和每一个中，还特别预期的是其中对应于Xaa1位上的组氨酸被置换为以下中的任一个的那些类似物：D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、N-α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙酰基、脱氨基-组氨酰基(咪唑并丙酰基)、β-羟基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-组氨酰基或β-羧基-咪唑并丙酰基。本文进一步特别预期的是本文描述的毒蜥外泌肽类似物，其中在Xaa2上的甘氨酸被置换为以下中的任一个：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸。
其他示例性化合物包括在WO 99/25727中所列举的那些化合物，在其中它们被鉴定为化合物2-23。根据另一实施方案，提供这样的化合物，其中Xaa14是Leu、Ile或Val，更优选Leu，和/或Xaa25是Trp、Phe或Tyr，更优选Trp或Phe。这些化合物在体内和体外两者中以及在化合物的合成期间对氧化降解较不敏感。
适合用于本发明融合多肽的毒蜥外泌肽类似物的其他实例包括在公布于2003年3月4日的美国专利6528486 (通过引用结合到本文并用于所有目的)中描述的那些类似物。特别地，毒蜥外泌肽类似物包括由毒蜥外泌肽或与毒蜥外泌肽-4具有至少90%同源性的毒蜥外泌肽类似物组成的那些类似物，所述毒蜥外泌肽-4任选在第34-39位上具有1-5个缺失和与所述毒蜥外泌肽共价结合的4-20个氨基酸单位的肽序列C-端延伸，其中在所述肽延伸序列中的每一个氨基酸单位选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His和Met。更优选所述延伸为4-20个氨基酸残基的肽序列，例如在4-15的范围内，更优选在4-10的范围内，特别是在4-7个氨基酸残基的范围内，例如4、5、6、7、8或10个氨基酸残基，其中优选6个氨基酸残基。最优选地是，根据美国专利6528486，延伸肽包含至少1个Lys残基，并且甚至更优选3-7个赖氨酸，并且甚至最优选6个赖氨酸。
例如，一个类似物为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPSKKKKKK (SEQID NO:118) (亦称为[脱-36Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6)。另外的示例性类似物包括Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6 (H-Lys6-脱Pro 36毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6) (SEQ ID NO: 688)、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H-[脱36Pro, 37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2) (SEQ ID NO: 689)、Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H-(Lys)6-[脱36Pro, 37,38Pro]exendin-4(1-39) (SEQ ID NO: 690)、Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H-Asn-(Glu)5-[脱36Pro, 37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39) (SEQ ID NO: 691)、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6 ([脱36Pro, 37, 38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6) (SEQ ID NO: 692)、(Lys)6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6 (H-(Lys)6-[脱36Pro, 37, 38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6) (SEQ ID NO: 693)和Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6 (Asn-(Glu)5-[脱36Pro, 37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6) (SEQ ID NO: 694)。如本领域惯例，氨基酸的重复可通过说明重复数量的下标数字表示，即Lys6 (SEQ ID NO:695)、(Lys)6 (SEQ ID NO: 695)等是指六赖氨酰(SEQ ID NO: 695)。在上文所述的毒蜥外泌肽类似物的任一个和每一个中，特别预期的是其中对应于第1位的组氨酸被置换为以下中的任一个的那些类似物：D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、N-α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙酰基、脱氨基-组氨酰基(咪唑并丙酰基)、β-羟基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-组氨酰基或β-羧基-咪唑并丙酰基。本文进一步特别预期的是本文描述的毒蜥外泌肽类似物，其中在第2位上的甘氨酸被置换为以下中的任一个：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸。
适合用于工程改造的多肽构建体的毒蜥外泌肽类似物的其他实例是在公布的PCT申请WO2004035623 (通过引用结合到本文中并用于所有目的)中所描述的那些，特别是由天然存在的氨基酸组成的那些，所述申请描述了具有特别是在13Gln、14Met、25Trp或28Asn位置上(参考毒蜥外泌肽-4 (1-39)的相应位置)的至少一个修饰的氨基酸残基的毒蜥外泌肽类似物。根据该公布，另外的所述类似物还包含1-7个氨基酸的C-端延伸，其包括至少1个Lys氨基酸和更优选至少5个Lys氨基酸单位，例如6个或7个Lys氨基酸单位。
适合用于工程改造的多肽构建体的毒蜥外泌肽类似物的又一实例为在公布的标题为“N-Terminus Conformationally Constrained GLP-1 Receptor Agonist Compounds(N-端构象限制的GLP-1受体激动剂化合物)”PCT申请WO/2010/120476 (通过引用结合到本文并用于所有目的)中描述的那些，所述申请描述了在毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物的N-端部分上具有修饰的氨基酸残基以在该区域创建高β-转角特征的毒蜥外泌肽类似物。例如，设计类似物为通过创建构象限制区域来模拟氨基酸残基His1 Gly2 Glu3，包括在His1Gly2 Glu3含有噻唑烷-脯氨酸肽模拟物的毒蜥外泌肽类似物(参见例如在其中的图17A-F中描述的化合物)，所述肽模拟物可在毒蜥外泌肽-4、利西拉肽(lixisenatide)或本文所述的其他类似物中用作修饰。
在所述毒蜥外泌肽中的任一个和每一个中，例如本文所述的毒蜥外泌肽-4、类似物和式，特别预期的是其中对应于第一位的组氨酸被置换为以下中的任一个的那些：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、N-α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙酰基、脱氨基-组氨酰基(咪唑并丙酰基)、β-羟基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-组氨酰基或β-羧基-咪唑并丙酰基。例如，用于本文所述的工程改造的多肽缀合物的优选毒蜥外泌肽类似物(其中His1位被修饰)为(4-咪唑并乙酰基)毒蜥外泌肽-4、(脱氨基-组氨酰基)毒蜥外泌肽-4(或(咪唑并丙酰基)毒蜥外泌肽-4)、(β-羟基-咪唑并丙酰基)毒蜥外泌肽-4、(N-二甲基-组氨酰基)毒蜥外泌肽-4和(β-羧基-咪唑并丙酰基)毒蜥外泌肽-4。本文进一步特别预期的是本文所述的毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物，其中第2位上的甘氨酸被置换为以下中的任一个：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸。因此例如，所述工程改造的多肽包括(4-咪唑并乙酰基)毒蜥外泌肽-4—Gly—PEP07986，其中所述毒蜥外泌肽-4类似物通过其C-端α羧基上的肽键连接到作为接头的甘氨酸，所述接头通过肽键连接到PEP07986序列的N-端。
上文的毒蜥外泌肽类似物或它们的活性片段中的任一个适合用于本发明的工程改造的多肽，带有或不带有连接到ABD的接头。
白蛋白结合结构域(ABD)肽。对于之前所公开的源自链球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白结合结构域和对于对白蛋白具有高亲和力的一些变体，例如WO09/016043，较高的亲和力以降低热稳定性为代价获得。此外，已报道在G148的白蛋白结合区内实验性地鉴定了T-细胞和B-细胞表位(Goetsch等, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003)。研究背后的作者对在疫苗中利用G148的T-细胞表位感兴趣，即利用白蛋白结合区的固有免疫刺激特性。Goetsch等另外发现了在G148序列中的一个B-细胞表位，即免疫后与抗体结合的区域。因此，白蛋白结合结构域G148和源自G148的多肽以及由此含有它们的融合物/缀合物，具有上述免疫刺激特性的风险。在用于人给药的药物组合物中，没有(或降低)免疫反应是合乎需要的。
所述融合物和/或缀合物的上述缺点和缺陷通过使用本文所公开的用于本发明的工程改造的多肽的改进的白蛋白结合结构域(ABD)肽来克服或降低。所述ABD是具有可比较的对白蛋白高亲和力的那些结构域，其源自链球菌菌株G148的细菌G蛋白的白蛋白结合结构域并与其具有显著的氨基酸序列同一性，然而其如本文所述被修饰以提供所需要的免疫学性质，例如降低的免疫原性。因此，包含本文所述的长持续时间的工程改造的多肽缀合物或融合物的白蛋白结合结构域多肽是三螺旋束蛋白结构域，其包含白蛋白结合基序和包括三螺旋构象的其他序列。本文所述的和预期用于本文所述的工程改造的多肽的ABD肽优于如Jonsson等(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)所述具有白蛋白结合序列的那些肽以及其中所述的ABD肽，并且那些ABD肽还描述于PCT公布申请号WO2009/016043。将本文所述的ABD多肽与毒蜥外泌肽或其类似物或其活性片段融合以创建本文所述的工程改造的多肽。适合用于与毒蜥外泌肽化合物缀合或融合的白蛋白结合结构域多肽可包含改进的ABD氨基酸序列，其包含选自下式的序列：
式(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)
其中彼此独立地，
X3选自E、S、Q和C；
X6选自E、S和C；
X7选自A和S；
X14选自A、S、C和K；
X10选自A、S和R；
X26选自D和E；
X39选自D和E；
X40选自A和E；
X43选自A和K；
X44选自A、S和E；
第45位上的亮氨酸是存在或不存在的；并且
第46位上的脯氨酸是存在或不存在的；和
式(ii) 与(i)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，
条件是X7不是L、E或D；
或者备选地，
条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L、E和D；
Xc选自N、L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；和
X5选自Y和F；
X8选自N、R和S；
X9选自V、I、L、M、F和Y；
X11选自N、S、E和D；
X12选自R、K和N；
X14选自K和R；
X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；
X23选自K、I和T；
X24选自A、S、T、G、H、L和D；和
X25选自H、E和D。
在根据上文第一方面—式(i)或(ii)的白蛋白结合多肽的其他实施方案中，X6为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X6为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X7为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X7为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为C。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为K。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X26为D。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X26为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X39为D。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X39为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X40为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X40为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X43为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X43为K。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X44为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X44为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X44为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第45位上的亮氨酸是存在的。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第45位上的亮氨酸是不存在的。在另一实施方案中，第46位上的脯氨酸是存在的。在另一实施方案中，第46位上的脯氨酸是不存在的。
在其他优选的实施方案中，适合于与毒蜥外泌肽化合物缀合或融合的白蛋白结合结构域多肽可包含改进的ABD氨基酸序列，其选自：
式(iii) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 678)
其中彼此独立地，
X3选自E、S、Q和C；
X6选自E、S和C；
X7选自A和S；
X10选自A、S和R；
X14选自A、S、C和K；
第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和
第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和
式(iv) 与(iii)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，
条件是X7不是L、E或D；
或者备选地，
条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L、E和D；
Xc选自N、L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；和
X5选自Y和F；
X8选自N、R和S；
X9选自V、I、L、M、F和Y；
X11选自N、S、E和D；
X12选自R、K和N；
X14选自K和R；
X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；
X23选自K、I和T；
X24选自A、S、T、G、H、L和D；和
X25选自H、E和D。
在根据该方面——式(iii)或(iv)的白蛋白结合多肽的其他实施方案中，X6为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X6为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X7为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X7为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为C。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为K。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第45位上的亮氨酸是存在的。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第45位上的亮氨酸是不存在的。在另一实施方案中，第46位上的脯氨酸是存在的。在另一实施方案中，第46位上的脯氨酸是不存在的。
在式(i)-(iv)中的任一个的另一实施方案中，ABD包含一个或多个N-端螺旋封端的氨基酸，并且在另一实施方案中，所述螺旋封端的氨基酸可以是丝氨酸，或者可以是甘氨酸-丝氨酸。因此对于本文所公开的每个白蛋白结合结构域序列，包括在附图和序列表中的那些，对在工程改造的多肽中如本文公开的所有方面所特别预期的还为对应于包含在其中的式(i)-(iv)中任一个的ABD的白蛋白结合结构域、它们的Ser-ABD、Gly-Ser-ABD、Gly-ABD、Ala-ABD和它们的脱C-端-脯氨酸序列。
因此，还包括(i)或(iii)的修饰变体，其使得得到的序列与属于(i)或(iii)所定义的类别的序列具有至少95%同一性。例如，有可能的是，属于氨基酸残基的某一功能性分类(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可替换为来自相同功能组的其他氨基酸残基。
对白蛋白具有结合亲和力的上文定义的序列相关ABD多肽类别源自共同的母体多肽序列，其折叠成三α螺旋束结构域。更具体地，上述多肽源自基于血清白蛋白和白蛋白结合结构域(G148-GA3)之间的复合物结构的模型构建(Lejon等, J. Biol. Chem. 279:42924-8, 2004)，以及共同母体多肽序列的大量突变变体的结合和结构特征分析。与母体多肽序列相比，式(i)-(iv)中任一个的上文定义的氨基酸序列包含氨基酸取代，其产生了一类多肽，所述多肽期望折叠成几乎相同的三螺旋束结构域。当母体多肽序列已经包含与白蛋白相互作用的结合表面时，所述结合表面通过一些上文定义的取代来修饰。与母体多肽序列相比，上文定义的取代提供改进的白蛋白结合能力。重要及令人惊讶的是，除了保留和/或改进对白蛋白的强亲和力之外，上文定义的取代还提供增强的免疫学性质。
因此，根据公开内容的第一方面，改进的ABD多肽显示一组特性，所述特性例如使它们适合用作用于人给药的治疗性分子的融合物或缀合物配偶体。重要及令人惊讶的是，例如与相关的白蛋白结合多肽例如白蛋白结合结构域G148-GA3和公开于WO09/016043中的白蛋白结合多肽相比较，本公开内容的改进的ABD显示下列6个特性中的至少5个：
(1)与例如G148-GA3和其他细菌来源的白蛋白结合结构域相比，所述ABD多肽显示不同的表面。该差异可降低或消除受试者(例如人)中抗体反应的任何风险，所述受试者先前已暴露于这类细菌蛋白。
(2)所述ABD多肽包含比，例如，G148-GA3和共同母体多肽序列的其他相关但不同的突变变体更少的潜在T-表位，由此当给予受试者(例如人)时显示低和/或较低的免疫原性。
(3)所述多肽当给予受试者(例如人)时，显示较低的与循环抗体的反应性。因此，通过在暴露于循环抗体的多肽表面上(即，在不涉及与白蛋白结合相互作用的多肽表面上)的氨基酸取代，如在测试组的人血清中所测量，与例如由G148-GA3引起的抗体交叉反应性相比，降低了抗体交叉反应性。
(4)根据比，例如，已知天然存在的白蛋白结合多肽(例如源自细菌蛋白的白蛋白结合结构域)更高的由KD值定义的结合亲和力和更慢的由koff值定义的解离速率两者，所述多肽具有高白蛋白结合能力。
(5)所述多肽包含比，例如，已知天然存在的白蛋白结合多肽(例如源自细菌蛋白的白蛋白结合结构域)更少的氨基酸残基，所述氨基酸残基与多肽的稳定性问题相关。因此，例如所述多肽不包含氧化倾向的甲硫氨酸或色氨酸，和仅包含一个天冬酰胺。
(6)所述多肽具有比先前的白蛋白结合多肽(例如在WO09/016043中公开的那些)更高的结构稳定性，如由大于55℃的熔点所定义。
在一个实施方案中，根据第一方面的缀合物/融合物的白蛋白结合多肽显示所有6个上文所列的特性。在另一实施方案中，根据第一方面的白蛋白结合多肽当与白蛋白结合时，显示比，例如，先前的白蛋白结合多肽(例如在WO09/016043中公开的那些)更具亲水性的特征。当所述多肽与白蛋白相互作用时，暴露于环境的白蛋白结合多肽的表面包含较少的赋予表面疏水性的氨基酸残基。
对于ABD序列的本文每一个实施方案而言进一步的是，C-端脯氨酸(对应于上文的第46位)可任选不存在。对于ABD序列的每一个实施方案而言更进一步的是，第45位的亮氨酸可任选存在或不存在。“ABD序列”是其为单价或二价的ABD化合物的序列，如合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。“肽激素结构域(HD1)序列”是其为单价或二价的肽激素结构域(HD1)化合物的序列，如果合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。“毒蜥外泌肽序列”是其为单价或二价的毒蜥外泌肽化合物的序列，如果合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。“毒蜥外泌肽类似物序列”是其为单价或二价的毒蜥外泌肽类似物化合物的序列，如果合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。“毒蜥外泌肽活性片段序列”是其为单价或二价的毒蜥外泌肽活性片段化合物的序列，如果合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。“毒蜥外泌肽类似物活性片段序列”是其为单价或二价的毒蜥外泌肽类似物活性片段化合物的序列，如果合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。“白蛋白结合基序(ABM)序列”是其为单价或二价的ABM的序列，如果合适的话，其形成本文公开的工程改造的多肽的一部分。除非另外说明，否则应理解为，当工程改造的多肽“包含”化合物(例如ABD或HD1)时，所述工程改造的多肽的序列包括所述化合物的序列(例如ABD序列或HD1序列)。
因为白蛋白结合基序的存在，ABD肽与白蛋白以至多1 x 10-6 M、甚至更优选至多1x 10-9 M (甚至更紧密的亲和力)的相互作用的KD值结合。更优选相互作用的KD值为至多1x 10-10 M、甚至更优选至多1 x 10-11 M、甚至更优选至多1 x 10-12 M和甚至进一步至多1 x10-13 M。所述值最优选是对人血清白蛋白(“HSA”)的亲和力。
本文所用的术语“白蛋白结合”和“白蛋白结合亲和力”是指多肽的一种性质，其可通过例如使用表面等离振子共振技术，例如在本领域已知的Biacore仪器上检测。例如，如下文实施例中所述，白蛋白结合亲和力可在这样的实验中检测，在所述实验中，将白蛋白或其片段固定在仪器的传感器芯片上，并且使含有待检测多肽的样品通过所述芯片。或者，将待检测的多肽固定在仪器的传感器芯片上，并使含有白蛋白或其片段的样品通过所述芯片。在这点上，白蛋白可以是来自哺乳动物的血清白蛋白，例如人血清白蛋白。然后，技术人员可分析通过所述实验获得的结果，以至少建立多肽对白蛋白的结合亲和力的定性测量。如果需要定量测量，例如测定相互作用的KD值，也可使用表面等离振子共振方法。可例如在Biacore2000仪器(GE Healthcare)上确定结合值。将白蛋白合适地固定在测量的传感器芯片上，通过连续稀释制备其亲和力待测定的多肽样品，并将其注入。然后，可使用例如由仪器制造商(GE Healthcare)提供的BIAevaluation 4.1软件的1:1 Langmuir结合模型从结果计算KD值。
在一个实施方案中，根据该方面的白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-5 s-1、例如至多5 x 10-6 s-1。
在另一实施方案中，白蛋白结合多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:301-344中的任一个。更具体的，氨基酸序列选自SEQ ID NO:304-305、SEQ ID NO:307-308、SEQ ID NO:310-311、SEQ ID NO:313-314、SEQ ID NO:316-317、SEQ ID NO:319-320、SEQ ID NO:322-323、SEQ ID NO:325-326、SEQ ID NO:328-329、SEQ ID NO:331-332、SEQ ID NO:334-335、SEQ ID NO:337-338、SEQ ID NO:341-342和SEQ ID NO:349-350。
在用于本文所述的工程改造的多肽的ABD的另一优选的实施方案中，工程改造的多肽的白蛋白结合多肽部分的氨基酸序列包含选自本文所述序列中的任一个的ABD，包括来自表1或图1、本文的序列表中的那些，并还包括它们的脱-Pro46和/或脱-Leu45形式。
在一个实施方案中，根据该方面的白蛋白结合多肽还包含一个或多个另外的氨基酸残基，其位于在(i)或(iii)中定义的ABD序列的N-端和/或C-端。这些另外的氨基酸残基可起进一步增强白蛋白与多肽结合和改进所折叠的白蛋白结合结构域的构象稳定性的作用，但可等同地良好用于其他目的，例如涉及多肽的生产、纯化、体内或体外的稳定性、偶联、标记或检测中的一个或多个以及其任何组合。所述另外的氨基酸残基可包括添加用于与例如HD1化学偶联目的的一个或多个氨基酸残基。
例如，在一个实施方案中，紧接ABD氨基酸序列(i)或(iii)的N-端或C-端上的α螺旋之前或之后的氨基酸可由此影响构象的稳定性。可有助于改善构象稳定性的氨基酸残基的一个实例是位于上文所定义的ABD氨基酸序列(i)或(iii)的N-端的丝氨酸残基。在某些情况下，N-端丝氨酸残基可通过包括丝氨酸侧链的γ氧和谷氨酸残基的多肽骨架NH之间的氢键，形成典型的S-X-X-E封端盒。该N-端封端可有助于构成本公开内容第一方面的白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第一α螺旋的稳定。
因此，在一个实施方案中，所述另外的氨基酸残基包括在多肽的N-端上的至少一个丝氨酸残基。换言之，一个或多个丝氨酸残基在ABD氨基酸序列之前。在白蛋白结合多肽的另一实施方案中，所述另外的氨基酸包括在ABD序列的N-端上的甘氨酸残基。应理解，ABD氨基酸序列(i)或(iii)的前面可以有1个、2个、3个、4个或任何合适数量的氨基酸残基。因此，ABD氨基酸序列的前面可以有单一的丝氨酸残基、单一的甘氨酸残基或两者的组合，例如甘氨酸-丝氨酸(GS)组合或甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸(GSS)组合。在N-端包含另外的氨基酸残基的白蛋白结合多肽的实例在SEQ ID NO:445-463、例如SEQ ID NO:445-448和SEQ IDNO:462-463中以及在表1和图1中列出。在又一实施方案中，所述另外的氨基酸残基包含在如序列式(i)或(iii)所定义的多肽的N-端上的丝氨酸。一个这样的具有N-端丝氨酸的ABD的实例为SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO. 696)。对应的脱-脯氨酸形式为SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ IDNO: 697)。对应的脱-Leu形式为SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAP(SEQ ID NO: 698)。对应的脱-Pro脱-Leu形式为SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 699)。
在又一实施方案中，另外的一个或多个氨基酸残基包括在本文定义的ABD多肽的N-端上的丙氨酸，或与丝氨酸组合作为在上述ABD序列的N-端上的丙氨酸-丝氨酸序列。在又一实施方案中，所述另外的一个或多个氨基酸残基包括在本文定义的ABD多肽的N-端上的谷氨酸。在又一实施方案中，所述另外的一个或多个氨基酸残基包括在本文定义的ABD多肽的N-端上的半胱氨酸。所述另外的残基当存在时优选为1-5个氨基酸。
类似地，可利用C-端封端以提高构成白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第三α螺旋的稳定性。在(i)或(iii)定义的ABD氨基酸序列的C-端存在的C-端脯氨酸残基可至少部分起到封端残基的作用。C-端上脯氨酸残基后的赖氨酸残基通过赖氨酸残基的ε氨基和在多肽骨架上位于赖氨酸之前的两个和三个残基的氨基酸的羰基(例如(i)或(iii)定义的ABD氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸残基的羰基)之间的氢键，可有助于白蛋白结合多肽的第三螺旋的进一步稳定。因此，在一个实施方案中，所述另外的氨基酸包括在多肽的C-端上的赖氨酸残基。所述另外的残基当存在时优选为1-5个氨基酸。
如上所述，所述另外的氨基酸可与白蛋白结合多肽的生产有关。具体而言，当通过化学肽合成来生产第一方面的白蛋白结合多肽时，C-端脯氨酸后的一个或多个可选的氨基酸残基可提供优势。所述另外的氨基酸残基可例如阻止形成非所需的物质，例如在合成的二肽阶段的二酮哌嗪。所述氨基酸残基的一个实例是甘氨酸。因此，在一个实施方案中，所述另外的氨基酸包括在多肽C-端的甘氨酸残基，其紧接脯氨酸残基或紧接如上文所说明的另外的赖氨酸和/或甘氨酸残基之后。或者，多肽生产可获益于ABD氨基酸序列(i)或(iii)的C-端脯氨酸残基的酰胺化。在这种情况下，C-端脯氨酸在羧基碳上包含另外的胺基。
在C-端包含另外的氨基酸残基的白蛋白结合多肽的实例在SEQ ID NO:445-452、例如SEQ ID NO:449-450中以及表1和图1中列出。技术人员知道实现C-端修饰的方法，例如通过用于肽合成的不同类型的预制基质。
在另一实施方案中，所述另外的氨基酸残基包括在多肽的N-端和/或C-端上的半胱氨酸残基。所述半胱氨酸残基可紧接(i)或(iii)定义的ABD氨基酸序列之前和/或之后，或者可在上述任何其他另外的氨基酸残基之前和/或之后。在多肽链的N-端和/或C-端包含半胱氨酸残基的白蛋白结合多肽的实例在SEQ ID NO:449-450 (C-端)和SEQ ID NO:451-452 (N-端)中以及表1和图1中列出。通过将半胱氨酸残基添加到多肽链中，可获得用于白蛋白结合多肽的位点定向缀合的巯基。或者，可将硒代半胱氨酸残基以与引入半胱氨酸残基类似的方式引入到多肽链的C-端，以利于位点特异性缀合(Cheng等, Nat Prot 1:2,2006)。
在一个实施方案中，白蛋白结合多肽包含不超过两个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，白蛋白结合多肽包含不超过一个半胱氨酸残基。
在另一实施方案中，白蛋白结合多肽的另外的氨基酸残基包含用于纯化或检测多肽的“标签”，例如六组氨酰基(His6)标签(SEQ ID NO: 49)、或“myc”(“c-Myc”)标签或“FLAG”标签，用于与特异性针对标签的抗体相互作用和/或用于纯化。技术人员知道其他替代物。
示例性ABD种类包括但不限于以下表1和实施例中所列的化合物。
表1 所选的ABD肽。
名称 ABD肽序列 SEQ ID NO:
PEP07271 GSSLASAKEAANAELDAYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 455
PEP07554 GSSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 456
PEP07912 GLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 457
PEP07914 GLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 458
PEP07911 GLASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 459
PEP07834 ALASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 460
PEP07844 GSSLASAKEAANAELDKYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 461
PEP07983 GSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 462
PEP07986 GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 463
PEP08185 GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG 448
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 313
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 500
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG 501
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG 502
(脱C-端Pro) PEP07986 GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 700
(脱C-端Pro-Gly) PEP08185 GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 701
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 702
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 703
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 704
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 705
GSSLASAKEAANAELDAYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 455
GSSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 456
GLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 457
GLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 458
GLASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 459
ALASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 460
GSSLASAKEAANAELDKYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 461
GSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 462
GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 463
GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG 448
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 313
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 500
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG 501
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG 502
GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 700
GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 701
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 702
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 703
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 704
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 705
GSSLASAKEAANAELDAYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 706
GSSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 707
GLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 708
GLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 709
GLASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 710
ALASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 711
GSSLASAKEAANAELDKYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 712
GSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 713
GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 714
GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 715
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 716
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 717
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 718
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 719
GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 714
GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 715
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 717
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 719
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 716
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 718
GSSLASAKEAANAELDAYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 706
GSSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 707
GLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 708
GLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 709
GLASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 710
ALASAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 711
GSSLASAKEAANAELDKYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 712
GSLASAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 713
GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 714
GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 715
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 704
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 717
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 718
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 719
GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 714
GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 715
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 717
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 719
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 716
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 718
例如，在优选的工程改造的多肽实施方案中，ABD包含LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 313)和其N-端延伸的ABD序列形式，所述延伸形式包括SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 500)和GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO:463；PEP07986)。在第2位的丝氨酸将序列封端，与在该位置上具有甘氨酸或丙氨酸相比，提高Tm约2℃。丙氨酸也可紧接丝氨酸之前，如AGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQID NO. 720)。还优选的是其中在上述ABD序列的每个中C-端脯氨酸、甘氨酸或两者是不存在的相应多肽。因此，还优选的是其中ABD包含脱-脯氨酸形式的序列：LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 704) (其与母体形式相比提高了产率)和其N-端延伸的ABD序列形式，所述延伸形式包括SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO:702)和GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQID NO:700)。还优选的是每个ABD的脱-Leu45形式。
在优选的工程改造的多肽实施方案(其中Cys-缀合是合乎需要的)中，优选的ABD可包含LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG (SEQ ID 501)和其N-端延伸的ABD序列形式，所述延伸形式包括SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG (SEQ ID 502)和GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG (SEQ IDNO: 448；PEP08185)。还优选的是其中在上述ABD序列的每个中C-端脯氨酸或甘氨酸或两者是不存在的多肽。
在本文公开的ABD序列中任一个的一个方面，连接毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽类似物序列的接头是如本文所公开的包含甘氨酸的接头，例如G、GGG、GGS、GGGS (SEQ ID NO:192)、TGGGGAS (SEQ ID NO:193)、TGGGGGAS (SEQ ID NO:194)或TGGGGSAS (SEQ ID NO:195)。
在本文所述的工程改造的多肽、特别是在其C-端以脯氨酸或多肽合成期间已知外消旋的其他氨基酸结尾的那些多肽的一个实施方案中，可将甘氨酸添加到C-端以克服与C-端氨基酸残基的外消旋有关的潜在问题。或者，C-端氨基酸可呈其(α-氨基)酰胺化形式，例如脯氨酸vs.脯氨酰胺，而非以甘氨酸结尾。然而，如果需要通过重组而非化学合成来产生酰胺化多肽，那么C-端氨基酸的酰胺化可通过本领域已知的数种方法进行，例如使用酰胺化PAM酶。通过重组生产可获得的工程改造的多肽是优选的。
本文的ABD完全可逆地折叠，即它们可变性并自发再折叠成所需的活性三级结构。这通过例如ABD SEQ ID NO:463的圆二色性波谱分析进行评价，其中比较在20℃下(折叠状态)采集的波谱和在加热到90℃后(热变性)采集的第二波谱以及在回到20℃后(重折叠状态)采集的第三波谱。在该程序期间可测定Tm。
工程改造的多肽的另一方面是ABD可提供在溶解性差或低的毒蜥外泌肽变体的水性溶液中溶解度增加。该性质可通过ABD自身或因为在体内或体外与高溶解性白蛋白结合的工程改造的多肽的后续复合物而赋予，该结合增加了在水性溶液中工程改造的多肽的溶解度。因此，在该又一方面的一个实施方案中，提供包含与白蛋白结合结构域(作为如本文所述的融合蛋白或缀合物)共价偶联的毒蜥外泌肽化合物的组合物，所述毒蜥外泌肽化合物本身具有在水中不超过1 mg/ml或者不超过2 mg/ml或不超过5 mg/ml的溶解度，其中所述化合物和所述白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物共价偶联，并且工程改造的多肽的溶解度大于未融合的(或未缀合的)天然毒蜥外泌肽化合物的溶解度。
与白蛋白的结合。血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质(40 g/L；在人类中约0.7 mM)，其中它结合多种分子，包括但不限于脂质和胆红素(Peters T, 1985,Advances in Protein Chemistry37:161)。已观察到血清白蛋白的半寿期与动物的大小成正比，例如人血清白蛋白(HSA)具有19天的半寿期，而兔血清白蛋白具有约5天的半寿期(McCurdy TR等, J. Lab. Clin. Med. 143:115,2004)。人血清白蛋白广泛分布于整个身体，特别是在肠区室和血液区室，其中它主要涉及摩尔渗透压浓度的维持。在结构上，白蛋白是单链蛋白，包含三个同源结构域和总共584或585个氨基酸(Dugaiczyk L等, 1982,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:71)。白蛋白含有17个二硫桥和单一的活性巯基C34，但缺少N-连接和O-连接的糖部分(Peters, 1985, Id.; Nicholson JP等, 2000, Br J Anaesth85:599)。缺少糖基化简化了白蛋白的重组表达。白蛋白的该性质以及其三维结构已知的事实(He, XM和Carter, DC, Nature358:209 1992)使其成为用于重组融合蛋白的有吸引力的候选物。所述融合蛋白通常在单一的多肽链中组合了治疗性蛋白(给予该蛋白本身后将快速地从机体中清除)和血浆蛋白(其显示天然的慢清除率) (Sheffield WP,Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol. Disord.1:1 2001)。所述融合蛋白可在需要较不频繁注射以及体内较高水平的治疗性蛋白中提供临床益处。然而，本文的工程改造的多肽不与白蛋白缀合，而是改为含有允许与白蛋白非共价结合的基序。
白蛋白半寿期。已观察到，在不同物种中白蛋白的半寿期通常遵循基于动物体重的异速生长比例分析(allometric scaling)。例如，已估计在小鼠、大鼠、兔和人中的白蛋白半寿期分别为1、1.9、5.6和19天。实际上，幂拟合分析(Davies & Morris, 1993, Pharm. Res. (N.Y.)10:1093-1095)提供公式：
白蛋白半寿期(天数)=3.75*体重(kg)0.368。
其他实施方案。应理解，本文公开的多肽中的每个还预期在N-端上包含甲硫氨酸，该甲硫氨酸与其天然存在的第一个氨基酸是符合读框的，例如Met-毒蜥外泌肽-4，其为具有添加N-端甲硫氨酸的毒蜥外泌肽-4。还应理解，当在本文所列的工程改造的多肽序列内出现C-端Gly时，该残基可在随后的酰胺化期间丢失。一些实施方案为合成中的中间体，例如具有“His标签”的那些，所述标签用于如本领域已知的亲和纯化并且可任选随后被去除以获得适于治疗应用的成熟的工程改造的多肽。
在本文所述的工程改造的多肽中任一个的一些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物相对于母体毒蜥外泌肽序列可具有至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性。在一些实施方案中，母体毒蜥外泌肽为毒蜥外泌肽-4，并且毒蜥外泌肽类似物相对于毒蜥外泌肽-4可具有至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性。如本领域已知，GLP-1 (胰高血糖素样肽1)不是毒蜥外泌肽；并且GLP-1的序列特别从适于本文所述的工程改造的多肽的毒蜥外泌肽序列中排除。
在一些实施方案中，提供具有接头的化合物，所述接头例如本文所述的L1，其将多肽激素结构域与ABD肽共价连接。在一些实施方案中，第一接头(L1)在工程改造的多肽内共价连接HD1。在一些实施方案中，L1是键。在一些实施方案中，多肽激素结构域(例如本文所述的HD1)可经过肽接头共价连接到ABD肽。任何接头都是任选的；即，任何接头可仅为键。当存在时，接头的化学结构不是关键的，因为其主要起间隔基的作用。在一个实施方案中，接头包含1-30个或更少的通过肽键连接的氨基酸。氨基酸可选自20种天然存在的(即生理学的)氨基酸。或者，可通过化学合成、翻译后化学修饰或通过宿主细胞内重组表达的体内掺入将非天然的氨基酸掺入。这些氨基酸中的一些可以被糖基化。在另一实施方案中，1-30个或更少的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸，并且还选自天冬氨酸和谷氨酸。在其他实施方案中，接头由大部分无空间位阻的氨基酸组成，例如甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸。“无空间位阻”在惯常意义上是指这样的氨基酸，其具有小的侧链(例如0-2个非氢原子)，使得相对于具有较大侧链的氨基酸(例如Leu、Trp、Tyr、Phe等)，空间位阻最小化。特别可使用多聚甘氨酸，例如(Gly)3、(Gly)4 (SEQ ID NO:125)、(Gly)5(SEQ ID NO:126)，同样可使用多聚丙氨酸poly(Gly-Ala)和poly(Gly-Ser)。可使用带电的多聚甘氨酸，并包括例如多聚(Glyn -Glu) (SEQ ID NO:127)、多聚(Glyn -Lys) (SEQ IDNO:128)、多聚(Glyn -Asp) (SEQ ID NO:129)和多聚(Glyn-Arg) (SEQ ID NO:130)基序(其中n可以是1-6)。接头的其他具体实例为(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO:131)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO:132)、(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO:133)和GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO:134)。特别可使用Gly和Ala的组合，Gly和Ser的组合同样如此。因此，在另外的实施方案中，肽接头选自富含甘氨酸的肽，例如Gly-Gly-Gly；序列[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:135)、[Gly- Gly- Ser]n(SEQ ID NO:136)、[Gly-Gly-Gly- Ser]n (SEQID NO:137)和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO:138)，其中n为1、2、3、4、5或6，例如[Gly-Gly-Gly-Gly Ser]3 (SEQ ID NO: 721)。“富含甘氨酸的肽”是指包含多个甘氨酸残基，优选大部分甘氨酸残基，更优选甘氨酸残基占优势的多肽。
在某些实施方案中，可使用带电接头。所述带电接头可包含大量的酸性残基(例如Asp、Glu等)，或者可包含大量的碱性残基(例如Lys、Arg等)，使得接头分别具有低于7或高于7的pI。如技术人员所理解，并且其他条件都相同，给定接头中的酸性或碱性残基的相对量越大，接头的pI将分别越低或越高。所述接头可赋予本文公开的工程改造的多肽有利的性质，例如改变肽的pI (等电点)，在特定的pH、例如生理pH (例如pH 7.2和pH 7.6之间，包括pH 7.2和pH 7.6)下或者在包含所述多肽的药物组合物中，所述pI可反过来提高所述多肽的溶解度和/或稳定性特征。如本领域所已知，多肽的溶解度可通过在组合物中配制而提高，所述组合物具有从肽的pI加或减至少或超过1个pH单位的pH。
例如，“酸性接头”是具有以下pI的接头：小于7；6-7，包括6和7；5-6，包括5和6；4-5，包括4和5；3-4，包括3和4；2-3，包括2和3；或1-2，包括1和2。同样的，“碱性接头”是具有以下pI的接头：大于7；7-8，包括7和8；8-9，包括8和9；9-10，包括9和10；10-11，包括10和11；11-12，包括11和12；或12-13，包括12和13。在某些实施方案中，酸性接头包含选自以下的序列：[Gly-Glu]n (SEQ ID NO:139)、[Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:140)、[Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:141)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:142)、[Gly-Asp]n (SEQ IDNO:143)、[Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:144)、[Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:145)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:146)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如[Gly-Gly-Glu]6 (SEQ ID NO: 722)。在某些实施方案中，碱性接头包含选自以下的序列：[Gly-Lys]n (SEQ ID NO:147)、[Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO:148)、[Gly-Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO:149)、[Gly-Gly-Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO:150)、[Gly- Arg]n (SEQ IDNO:151)、[Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO:152)、[Gly-Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO:153)、[Gly-Gly-Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO:154)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如[Gly-Gly-Lys]6 (SEQ ID NO: 723)。
此外，可制备具有某些结构基序或特性(例如α螺旋)的接头。例如，这类接头可包含选自[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n (SEQ ID NO:155)的序列，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3 (SEQ ID NO: 724)、[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4 (SEQID NO: 725)或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5 (SEQ ID NO: 726)。本领域技术人员可易于确定任何具体接头序列的螺旋含量。
非肽接头的生物相容性接头可用于共价连接毒蜥外泌肽的C-端与ABD序列的N-端。接头可以是生物相容性聚合物，优选水溶性的，更优选约50 kD-约5000 kD、或约50 kD-500 kD、或约100 kD-500 kD。示例性的生物相容性、水溶性聚合物接头为PEG接头，例如–(CH2-CH2-O)n-，其中n使得PEG接头可具有100-5000 kD的分子量，优选100-500 kD。所述接头可以是–NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-CO-，其中n使得PEG接头分子量为100 kD-5000kD，优选10 kD-500 kD。可使用其他生物相容性聚合物，例如包括但不限于聚糖、聚丙二醇以及丙烯和乙二醇的共聚物。通常所述接头包含在各个末端的反应基团，其可以是相同或不同的反应基团。所述具有反应基团的接头是已知并可获得的。优选反应基团与肽的N-端氨基或C-端羧基具有反应性。例如，反应基团可以是丁醛、丙醛、乙醛、琥珀酰亚胺或马来酰亚胺部分，如本领域已知。较不优选的是烷基接头例如-NH-(CH2)n-C(O)-，其中n=2-10，并且其可进一步被不空间阻碍肽功能的任何基团取代，例如低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素、CN和NH2。
还应理解，根据本发明适于使用的接头可具有上文和此处所述特性和基序中的一个或多个。例如，接头可包含酸性接头以及结构基序例如α螺旋。同样地，接头可包含碱性接头和结构基序例如α螺旋。接头可包含酸性接头、碱性接头和结构基序例如α螺旋。此外，还应理解，根据本发明的工程改造的多肽可具有超过一个接头，每个这样的接头可具有本文所述特性中的一个或多个。
本文所述接头为示例性的，并且本发明范围内的接头可更长以及可包含其他残基。在一个实施方案中，明确排除以下工程改造的多肽：其中毒蜥外泌肽序列直接连接到ABD序列而没有接头。
在一些实施方案中，工程改造的多肽包含C-端上的ABD序列和N-端上的HD1序列。在某些优选的实施方案中，N-端为毒蜥外泌肽序列、毒蜥外泌肽片段序列或毒蜥外泌肽类似物序列。进一步对于包含ABD和HD1的实施方案，工程改造的多肽可具有结构HD1-ABD。
应理解，在缺少明确指示本文所述工程改造的多肽的N-端和/或C-端的情况下，工程改造的多肽以N-端至C-端方向读出。例如，当HD1具有毒蜥外泌肽化合物或其类似物的序列时，术语HD1-ABD、HD1-L1-ABD、HD1-ABD等在缺少明确指示N-端和/或C-端的情况下，意指毒蜥外泌肽序列或其类似物位于工程改造的多肽的N-端，而ABD位于C-端。反过来，如果明确指出N-端和/或C-端，则工程改造的多肽根据末端的明确指示读出。例如，术语HD1C-端-ABD、HD1-L1-ABDN-端等意指ABD位于工程改造的多肽的N-端，而HD1位于C-端。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的多肽对血清白蛋白具有不同于单独ABD多肽(即，不存在融合的激素结构域)的亲和力的亲和力。为获得有效的结合，工程改造的多肽可具有对血清白蛋白的结合亲和力，使得离解常数KD为例如小于约10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M、10-13 M、10-14 M或甚至10-15 M。在一些实施方案中，亲和力不是过度紧密，使得工程改造的多肽可从白蛋白离解并诱发生物学反应，例如结合到受体，例如GLP-1受体。可按PCT公布申请号WO2009/016043中所述，优选测量对人血清白蛋白的亲和力，所述申请通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的，包括但不限于测定法和合成法。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的多肽优于具有不同部分的相应化合物，所述部分与激素结构域缀合并可延长血浆半寿期(例如PEG或Fc或白蛋白)。在该背景下，术语“优于”是指各种功能性性质，其可在疾病或病症的治疗评价中衡量。例如，本文所述的工程改造的多肽可需要比具有与激素结构域缀合的不同部分的相应化合物更少的生物学活性(激素结构域)组分，例如1X、1/2、1/3、1/4、1/5或甚至更少。对于其他实例，本文所述的工程改造的多肽可具有更高的效能，例如1.5X、2X、3X、4X、5X、10X、20X、50X或甚至更高的效能。
本文预期的工程改造的多肽化合物包括在以下表2中所示的化合物。优选的化合物为Cmpd 5、Cmpd 9和Cmpd 11。
表2 所选的示例性工程改造的多肽。
Cmpd 序列 SEQ IDNO:
5 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 727
6 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 728
7 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 729
8 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 730
9 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 731
10 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 732
11 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 733
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 734
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 735
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HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 737
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 738
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 739
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 740
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 741
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 742
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 743
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 744
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 745
本文特别预期的其他工程改造的多肽化合物(如特别列出的)具有HD1和ABD组分中的任一个，任选具有本文公开的L1序列中的任一个，并包括具有本文表格和列表的工程改造的多肽中任一个的结构的化合物，包括在以下表3中所公开的那些。
表3 所选的示例性工程改造的多肽。
Cmpd 序列 SEQ IDNO:
5 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 727
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 734
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 746
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA 740
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 747
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 748
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 749
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 750
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 751
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 752
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 753
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 754
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HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 756
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 757
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 985
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 986
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 987
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 988
6 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 728
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL 735
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 758
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HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSGGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP 764
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其中不存在任何N-端甲硫氨酸的上述序列的化合物是特别预期的。可存在N-端甲硫氨酸主要便于细菌表达。然而，本发明的工程改造的肽可在真核宿主细胞(例如酵母(例如毕赤酵母)、哺乳动物、杆状病毒)或具有翻译后N-端蛋白水解加工的其他宿主细胞中表达，以得到如同在所需激素或ABD序列天然存在的成熟肽对应物中存在的N-端氨基酸，即没有添加甲硫氨酸或其他前导序列。或者，用于表达和/或分泌(和甚至纯化)的N-端序列可以是在翻译后除去(例如通过使用蛋白酶例如TEV)的N-端序列。
III. 设计和生产方法
构建体设计。本文所述的工程改造的多肽可在氨基酸水平上进行设计。然后可使用本领域已知的多种软件产品将这些序列逆翻译，使得核苷酸序列对所需的表达宿主(例如基于其的蛋白质表达)、密码子优化、限制性位点含量而言是最优化的。例如，核苷酸序列可对基于大肠杆菌(E.coli)的蛋白质表达和对限制性位点含量而言是最优化的。根据目的核苷酸序列，如本领域已知，可提供重叠寡核苷酸用于多级PCR。这些寡核苷酸可在本领域熟知的条件下用于多重PCR反应，以构建编码目的蛋白的cDNA。一个实例是1X Amplitaq缓冲液、1.3 mM MgCl2、200uM dNTPs、4 U Amplitaq Gold、0.2 uM各引物(AmpliTaq Gold,ABI)，循环参数：(94C:30s、58C:1 min、72C:1min)、35个循环。
可将限制性位点添加到PCR产物的末端，用于本领域已知的载体连接。特定的位点可包括Nde1和Xho1，使得cDNA可随后在pET45b表达载体(Novagen)中处于正确的阅读框内。通过使用这些位点，在该载体中的任何N-端His标签可被除去，因为翻译起始位点将在所述标签的下游。一旦表达构建体完成，可通过使用例如本领域已知的T7启动子引物、T7终止子引物和标准的ABI BigDye Term v3.1方案测序进行鉴定。序列信息可自例如ABI 3730 DNA分析仪获得，并且可使用Vector NTI v.10软件(Invitrogen)进行分析。表达构建体可以模块化方式设计，使得接头序列可容易切除和改变，如本领域已知。
可将本领域已知或本文所述的蛋白酶识别位点掺入到可用于本文所述重组工程改造的多肽的设计、构建、操作和生产的构建体中。
示例性构建体。可用于生产本文预期的工程改造的多肽的构建体包括在以下表4中所列的编码多肽的构建体。
表4 用于重组生产工程改造的多肽的所选示例性构建体。
一般生产方法。本文所述的工程改造的多肽化合物可使用本领域已知的生物学、化学和/或重组DNA技术制备。示例性方法在本文以及美国专利号6,872,700、WO 2007/139941、WO 2007/140284、WO 2008/082274、WO 2009/011544和美国公布号2007/0238669中描述，它们的公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。用于制备该化合物的其他方法在本文中列出。
本文所述的工程改造的多肽化合物可使用标准固相肽合成技术制备，例如自动化或半自动化肽合成仪。简要且概括地讲，ABD和治疗性激素肽可单独制备，然后缀合在一起，或者可作为单一多肽制备。因此，白蛋白结合多肽、治疗性激素或工程改造的多肽可备选使用氨基酸和/或具有受保护的反应性侧链的氨基酸衍生物通过非生物学肽合成生产，所述非生物学肽合成包括逐步偶联氨基酸和/或氨基酸衍生物以形成具有受保护的反应性侧链的第一方面的多肽，从多肽的反应性侧链上除去保护基，以及在水溶液中折叠多肽。因此，使用正常氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)和预保护的氨基酸衍生物以在溶液中或在有机溶剂中的固体载体上序贯构建多肽序列。当构建了完整多肽序列时，除去保护基并使多肽在水溶液中折叠。
本公开内容的每个多肽可逆折叠，其中ABD结构域无附加因素而可逆折叠成三螺旋束结构域，因此自发折叠。工程改造的缀合物可通过以下方法生产，包括：根据例如本文所述的任何方法(例如通过非生物学肽合成)生产白蛋白结合多肽，和将所生产的ABD多肽与本文所定义的治疗性激素缀合。本文的ABD完全可逆地折叠。这通过圆二色性波谱分析进行评价；一个波谱在20℃采集，而另一波谱在加热到90℃然后返回到20℃后采集。在该程序期间，测定本领域已知的Tm，发现其在变性多肽的折叠后未改变。
通常，使用所述技术，将α-N-氨甲酰基保护的氨基酸与连接到树脂上成长中的肽链的氨基酸在RT下在惰性溶剂(例如二甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、亚甲基氯等)中在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑等)的存在下在碱(例如二异丙基乙胺等)存在下偶联。使用试剂(例如三氟乙酸、哌啶等)将α-N-氨甲酰基保护基从得到的肽-树脂上除去，并且用待加入到肽链的下一个所需N-保护的氨基酸重复偶联反应。合适的N-保护基是本领域熟知的，例如叔-丁氧羰基(tBoc)、芴甲氧羰基(Fmoc)等。用于肽合成仪的溶剂、氨基酸衍生物和4-甲基二苯甲基-胺树脂可购自Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA)。
对于化学合成，可将固相肽合成用于工程改造的多肽，因为通常固相合成是直接的方法，对于工业规模具有优良的可伸缩性，并且其通常与相对长的工程改造的多肽相容。可用自动化肽合成仪(430A型, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)进行固相肽合成，使用带封端的NMP/HOBt (选项1)系统和tBoc或Fmoc化学(参见AppliedBiosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, 版本1.3B Jul.1, 1988, 第6章, 第49-70页, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)。可用HF裂解Boc-肽-树脂(-5℃-0℃，1小时)。可交替使用水和乙酸从树脂中提取肽，并将滤液冻干。可按标准方法(例如，Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems,Inc., 1990, 第6-12页)裂解Fmoc-肽树脂。还可用Advanced Chem Tech Synthesizer(Model MPS 350, Louisville, Ky.)将肽装配。
提供较好产率的化学合成方法对于Cmpd 11举例如下。利用Fomc-Pro-NovasynTGT树脂(0.2 mmole/g)使用默认的“双重偶联”设置，使用Prelude 6通道肽合成仪(Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ, USA)进行固相合成。然而，对于VS (第59-60位氨基酸)和KT (第71-72位氨基酸)序列，使用假脯氨酸双重偶联，并且对于氨基酸V19、R20、I23和P37，使用三重偶联。对于His1至Ser39的毒蜥外泌肽部分，进行HATU/DIEA双重或三重偶联(各约60分钟，6X过量的试剂)，除非另外指示，并用20%哌啶去封闭2X15分钟。对于接头和ABD部分，进行HATU/DIEA双重偶联，除非另外指示(各约60分钟，3X过量的试剂)，并用20%哌啶去封闭2X15分钟。使用乙腈作为溶剂在C5柱上使用RP-HPLC纯化进行多肽纯化，其中使用乙腈作为溶剂在C18柱上通过在分析型RP-HPLC上分析而鉴定所洗脱样品，然后使用比第一RP-HPLC更窄的梯度和乙腈(作为溶剂)在C18柱上进行制备型RP-HPLC。合并含有所需工程改造的多肽的流分并冻干。
本文所述的化合物(毒蜥外泌肽、ABD、接头、工程改造的多肽)还可使用本领域已知的方法利用重组DNA技术制备，所述方法例如Sambrook等, 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor。非肽化合物可通过本领域已知的方法制备。例如含磷酸基的氨基酸和含有所述氨基酸的肽可使用本领域已知的方法制备，例如在Bartlett等, 1986, Biorg. Chem., 14:356-377中所描述。可使用本领域的方法或如本文所述将化合物缀合。
或者，可通过本领域熟知的重组技术生产工程改造的多肽。参见例如Sambrook等,1989 (同上)。通过重组技术生产的这些工程改造的多肽可自多核苷酸表达。本领域技术人员将理解，编码所述工程改造的多肽的多核苷酸，包括DNA和RNA，可获自野生型cDNA，例如毒蜥外泌肽-4，考虑到密码子使用的简并性，并且可进一步按所需进行工程改造以掺入所指示的取代。这些多核苷酸序列可包括利于mRNA在微生物宿主中转录和翻译的密码子。这样的生产序列可易于按本领域熟知的方法构建。参见例如WO 83/04053，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。上文的多核苷酸还可任选编码N-端甲硫酰胺残基。可用于本发明的非肽化合物可通过本领域已知的方法制备。例如含磷酸基的氨基酸和含所述氨基酸的肽可使用本领域已知的方法制备。参见例如Bartlett和Landen, 1986, Bioorg. Chem.14: 356-77。
可利用多种表达载体/宿主系统以包含和表达工程改造的多肽的编码序列。这些包括但不限于微生物例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。可用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。用于蛋白质的重组表达的示例性方案在本文描述和/或是本领域已知的。
同样地，多核苷酸序列可用于产生新的和有用的病毒和质粒DNA载体、新的和有用的转化和转染的原核和真核宿主细胞(包括在培养中生长的细菌、酵母和哺乳动物细胞)以及用于培养生长能够表达本发明工程改造的多肽的所述宿主细胞的新的和有用的方法。在工程改造的多肽生产不足可被减轻或者可满足对于增加水平的所述多肽的需要情况下，编码本文工程改造的多肽的多核苷酸序列可用于基因疗法。
本发明还提供用于重组DNA生产本发明工程改造的多肽的方法。提供了用于从包含编码工程改造的多肽的核酸的宿主细胞中生产工程改造的多肽的方法，包括：(a)在利于DNA分子表达的条件下，培养包含编码工程改造的多肽的多核苷酸的宿主细胞；和(b)获得工程改造的多肽。
宿主细胞可以是原核或真核的，并且包括细菌、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼地鼠肾细胞、癌细胞或其他细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统亦为本领域技术人员所熟知。宿主细胞株可针对加工所表达的蛋白或产生某些翻译后修饰的特定能力进行选择，所述修饰可用于提供蛋白质活性。所述多肽的修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白的“前-原(pre-pro)”形式的翻译后加工对于正确插入、折叠和/或功能亦可为重要的。不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对所述翻译后活性具有特定的细胞机构和特有的机制，并且可选择以确保所引入的异种蛋白的正确修饰和加工。
或者，可使用酵母系统以产生本发明的工程改造的多肽。工程改造的多肽的DNA的编码区通过PCR扩增。在PCR反应中将编码酵母前-原-α前导序列的DNA从酵母基因组DNA中扩增，使用一个包含α交配因子基因的核苷酸1-20的引物和另一与该基因的核苷酸255-235互补的引物(Kurjan和Herskowitz, 1982, Cell, 30: 933-43)。将前-原-α前导编码序列和工程改造的多肽的编码序列片段连接到包含酵母醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，使得启动子指导由与成熟工程改造的多肽融合的前-原-α因子组成的融合蛋白的表达。如Rose和Broach, (Rose & Broach, 1990, Meth. Enz., 185: 234-79, Goeddel编辑,Academic Press, Inc., San Diego, CA)所教导，所述载体还包含在克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2-micron”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别提供细菌和酵母的选择。Leu-2d基因还利于增加酵母中质粒的拷贝数，诱导更高水平的表达。REP1和REP2基因编码与质粒拷贝数的调节有关的蛋白质。
使用已知的方法将上述段落中描述的DNA构建体转化到酵母细胞中，所述方法例如醋酸锂处理(Steams等, 1990,. Meth. Enz. 185: 280-297)。生长培养基中的葡萄糖耗尽后，ADH2启动子受诱导(Price等, 1987, Gene55:287)。前-原-α序列影响融合蛋白从细胞中的分泌。同时，酵母KEX2蛋白从成熟的工程改造的多肽切割前-原序列(Bitter等,1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330-5334)。
遵循制造商的说明书，使用市购的表达系统例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen,San Diego, CA)，本发明的工程改造的多肽还可在酵母、例如毕赤酵母中重组表达。该系统亦依赖于前-原-α序列以指导分泌，但插入物的转录受醇氧化酶(AOX1)启动子(经甲醇诱导)的驱动。所分泌的工程改造的多肽通过例如用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化所述工程改造的多肽的方法从酵母生长培养基中纯化。
或者，可将编码工程改造的多肽的DNA克隆至杆状病毒表达载体，例如pVL1393(PharMingen, San Diego, CA)。随后根据制造商说明书(PharMingen)或已知技术，用工程改造的多肽的编码载体感染培养在例如无sF9蛋白的培养基中的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞，并生产重组蛋白。使用本领域已知的方法，例如肝素-琼脂糖柱(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)和连续分子筛分柱(Amicon, Beverly,Massachusetts)，从培养基中纯化并浓缩蛋白质，并将其重悬浮于合适溶液(例如PBS)中。可使用SDS-PAGE分析，例如通过显示证实所需工程改造的多肽的大小的单一条带来表征蛋白质，同样可使用例如在Proton 2090 Peptide Sequencer上的Edman测序进行全长的氨基酸序列分析，或者证实其N-端序列。
例如，可将编码所预测的成熟工程改造的多肽的DNA序列克隆至含有所需启动子和任选前导序列的质粒中(参见例如Better等, 1988, Science240:1041-1043)。可通过自动化测序来证实该构建体的序列。然后使用利用CaCl2孵育和热激处理细菌的标准程序(Sambrook等, Id.)，将质粒转化到大肠杆菌菌株MC1061中。将转化的细菌在添加有羧苄青霉素的LB培养基中培养，通过在合适的培养基中生长来诱导产生所表达的蛋白质。如果存在的话，前导序列将影响成熟的工程改造的多肽的分泌，因而其将在分泌期间被切除。通过本文所述方法从细菌培养基中纯化所分泌的重组的工程改造的多肽。
或者，工程改造的多肽可在昆虫系统中表达。用于蛋白质表达的昆虫系统是本领域技术人员所熟知的。在一个这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地贪夜蛾细胞中或在粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。将工程改造的多肽的编码序列克隆至病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入工程改造的多肽将使多角体蛋白基因失活，并产生缺少外壳蛋白外壳的重组病毒。然后使用重组病毒感染草地贪夜蛾(S. frugiperda)细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中表达本发明的工程改造的多肽(Smith等,1983, J. Virol. 46:584; Engelhard等, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91:3224-3227)。
在另一实例中，编码工程改造的多肽的DNA序列可通过PCR扩增并克隆至合适的载体，例如pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey)。设计pGEX载体以产生包含由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶和由插入到载体克隆位点的DNA片段编码的蛋白的融合蛋白。可产生用于PCR的引物，其包含例如合适的切割位点。然后可将重组的融合蛋白从融合蛋白的GST蛋白上切割下来。将pGEX-3X/工程改造的多肽的构建体转化到大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene, La Jolla, CA)，分离单独的转化株并于37℃在LB培养基(添加有羧苄青霉素)中生长至600 nm波长下的光密度为0.4，然后在0.5 mM异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri)的存在下进一步孵育4小时。纯化来自单独的转化株的质粒DNA，并使用自动化测序仪部分地测序以证实在正确的方向上存在所需的工程改造的多肽的编码基因插入物。
当融合蛋白在细菌中预期以不可溶的包涵体产生时，其可按上文所述或如下进行纯化。通过离心收获细胞；在0.15 M NaCl、10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA中洗涤；并用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)在室温下处理15分钟。通过超声处理使裂解物变澄清，并且通过在12000xg下离心10分钟使细胞碎片沉淀。将包含融合蛋白的沉淀物重悬于50 mMTris pH 8和10 mM EDTA中，经50%甘油分层，并在6000xg离心30分钟。将沉淀物重悬于无Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。通过使重悬的沉淀物在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级进一步纯化融合蛋白(Sambrook等, 上述)。将凝胶浸泡在0.4 M KCl中以显现蛋白，其经切除并在缺少SDS的凝胶运行缓冲液中电洗脱。如果GST/工程改造的多肽的融合蛋白在细菌中作为可溶蛋白产生，则其可使用GST Purification Module (PharmaciaBiotech)纯化。
可将融合蛋白经受消化以将GST从成熟的工程改造的多肽上切割。将消化反应物(20-40 µg融合蛋白、20-30单位人凝血酶(4000 U/mg (Sigma)，在0.5 mL PBS中)在室温下孵育16-48小时，并加载到变性SDS-PAGE凝胶上以将反应产物分级。将凝胶浸泡在0.4 MKCl中使蛋白条带显现。可使用自动化测序仪(Applied Biosystems Model 473A, FosterCity, CA)通过部分氨基酸序列分析，证实对应于工程改造的多肽的期望分子量的蛋白条带的身份。
在本发明的工程改造的多肽的重组表达的一个具体示例性方法中，可通过磷酸钙方法，用在pCMV载体(5’ CMV启动子、3’ HGH聚A序列)和pSV2neo (包含neo抗性基因)中包含工程改造的多肽的cDNA的质粒共转染哺乳动物293细胞。在一个实施方案中，在转染之前应该用ScaI将载体线性化。同样地，可使用备选的构建体(使用掺入neo基因的类似pCMV载体)。通过在包含0.5 mg/mL G418 (新霉素样抗生素)的生长培养基中限制性稀释10-14天，从单一细胞克隆中选择稳定的细胞系。通过ELISA或蛋白质印迹针对工程改造的多肽表达而筛选细胞系，将高表达细胞系扩增以大规模生长。
优选的是，将转化的细胞用于长期高产率的蛋白生产，并且稳定表达同样是所需的。一旦这样的细胞用包含选择标记连同所需表达盒的载体转化，可允许所述细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转换到选择培养基。选择标记设计为赋予选择抗性，并且其存在允许成功表达所引入序列的细胞的生长和回收。可使用适于所述细胞的组织培养技术扩增稳定转化的细胞的抗性团(Resistant clump)。
可使用多种选择系统以回收经转化用于重组蛋白生产的细胞。这样的选择系统包括但不限于分别在tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶基因、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。同样，可使用抗代谢物抗性作为对赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr、赋予霉酚酸抗性的gpt、赋予氨基糖苷G418抗性的neo、赋予氯磺隆(chlorsulfuron)抗性的also和赋予潮霉素抗性的hygro的选择基础。可使用的另外的选择基因包括允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB或允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD。产生用于鉴定转化株的可见指示的标记物包括花色素苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS和荧光素酶及其底物荧光素。
可使用自动化肽合成和重组技术两者的组合来生产本发明的工程改造的多肽。例如，可合成或重组制备毒蜥外泌肽化合物和ABD的任一个或两者以及任选接头，然后使用本领域已知的技术例如“天然化学连接”和其已知的变化将其连接在一起，其中形成酰胺键将母体化合物连接。参见例如美国专利号6326468，其通过引用结合到本文中并用于所有目的。或者，例如，本发明的工程改造的多肽可包含修饰的组合，所述修饰包括缺失、取代、插入和通过PEG化(或其他部分，例如聚合物、脂肪酰基链、C-端酰胺化)的衍生。这样的工程改造的多肽可在多个阶段中产生。在第一阶段，包含缺失、取代、插入和其任何组合的修饰的工程改造的中间体多肽可通过所述的重组技术产生。然后，在本文所述的任选纯化步骤之后，使用合适的PEG化试剂(例如，来自NeKtar Transforming Therapeutics, San Carlos,CA)通过化学修饰，将该工程改造的中间体多肽PEG化(或经受其他化学衍生，例如酰化、C-端酰胺化)，得到所需的工程改造的多肽衍生物。本领域的技术人员将理解，上述程序可普遍化以应用于包含选自以下修饰的组合的工程改造的多肽：缺失、取代、插入、衍生和本领域熟知并且本发明所预期的其他修饰方式。
C-端酰胺化可通过使用甘氨酸氨基酸C-端延伸的前体获得，例如在酵母(例如毕赤酵母)中作为分泌到培养基中的α-因子融合蛋白合成。纯化后，工程改造的多肽前体的C-端甘氨酸可通过酶促酰胺化(例如肽基甘氨酸α-酰胺化单氧化酶(PAM))转化为酰胺。参见例如Cooper等, 1989, Biochem. Biophys. Acta,1014:247-258。亦参见美国专利6319685，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的，其教导用于酶促酰胺化的方法，包括来自大鼠的α-酰胺化酶，其是足够纯化的α-酰胺化酶以显示出至少约25 mU/mg蛋白的比活，并且其充分不含蛋白水解杂质以适合用于从天然来源纯化的或通过重组DNA技术产生的底物。
肽可通过本领域已知的多种方法纯化，包括如本文所述。在一个方法中，使用Waters Delta Prep 3000系统，通过RP-HPLC (制备型和分析型)纯化肽。可使用C4、C8或C18制备柱(10μ，2.2X25 cm；Vydac, Hesperia, CA)分离肽，并且可使用C4、C8或C18分析柱(5微米, 0.46X25 cm；Vydac)测定纯度。溶剂(A=0.1% TFA/水和B=0.1% TFA/CH3CN)可以1.0 ml/min的流速递送到分析柱，以15 ml/min递送到制备柱。氨基酸分析可在WatersPico Tag系统上进行，并且使用Maxima程序处理。肽可通过蒸气相酸水解法(115℃，20-24小时)水解。水解产物可通过标准方法(Cohen等, The Pico Tag Method: A Manual ofAdvanced Techniques for Amino Acid Analysis, 第11-52页, MilliporeCorporation, Milford, Mass. (1989))衍生和分析。可通过M-Scan，Incorporated (WestChester, Pa.)进行快速原子轰击分析。可使用碘化铯或碘化铯/甘油进行质量校准。可在Applied Biosystems Bio-Ion 20质谱仪上进行使用飞行时间检测的等离子体解吸电离分析。
工程改造的多肽的表达测定。可利用用于测定宿主细胞的蛋白表达水平的方法。可用于测定宿主细胞的蛋白表达水平的程序例示于以下代表性的方案。用2 ul质粒DNA(用于工程改造的多核苷酸的表达载体)转化约25 ul BL21大肠杆菌细胞。将细胞涂板并在37℃下孵育过夜或在室温(RT)下孵育48小时。选择单菌落并用于在4 ml LB培养基(带有合适的抗生素)中生长起子培养物约6小时。可通过将100 ul 80%无菌甘油加入到900 ul储液中制备甘油储液，然后可将其轻轻混合并储存于-80℃。移出250 ul样品用于TCP非诱导样品。可用5 ul的起子培养物接种等份试样例如2 ml的Magic培养基(含有适当的抗生素)，然后将其在37℃下以300 rpm孵育过夜(至多24小时)。如本领域已知，Magic培养基是自身诱导的。或者，可用250 ml或125 ml Thompson烧瓶中的60 ul起子培养物接种60 ml含有适当抗生素的Magic培养基，然后将其在30℃下以300 rpm孵育过夜(至多24小时)。孵育后，可从每个管中移出250 ul培养物，并将细胞沉淀。可将细胞重悬于1 ml 50 mM Tris pH 8、150mM NaCl中，可向其中加入0.1体积(100 ul)的POP培养试剂和1 ul r-溶菌酶(1:750稀释于r-溶菌酶缓冲液)。可将混合物充分混合并在RT下孵育至少10分钟。然后可将制备物以14000 x G离心10分钟。可将上清液(可溶部分)移出并保留，并且可将样品准备用于凝胶分析(15 ul + 5 ul LDS)。可将剩余的包涵体沉淀重悬于1 ml 1% SDS中超声处理。可将样品准备用于凝胶分析(15 ul + 5 ul LDS)。对于非诱导样品，可加入1.0体积POP培养试剂和1ul r-溶菌酶(1:750稀释于r-溶菌酶缓冲液)。将混合物充分混合并在RT下孵育至少10分钟。这些样品可不需要离心。然后可将样品准备用于凝胶分析(15 ul + 5 ul LDS)。可将在1XMES缓冲液中的非还原NU-PAGE (4-12%)凝胶运行并用SimplyBlue微波方案染色。可进行脱染色过夜，如本领域已知。可保留凝胶成像，并分析以确定蛋白表达水平。
可如下表达和分离工程改造的多肽。设计所需工程改造的多肽的蛋白序列，并使用商业化软件将该序列逆翻译成DNA序列以将其克隆至大肠杆菌表达载体。核酸序列以寡核苷酸获得并使用标准PCR扩增技术连接，或者使用标准限制酶从已有的表达构建体中消化，然后连接在一起。将表达目的蛋白的序列置于带有T7启动子的质粒pET45中用于可诱导表达。在构建体通过测序验证后，将载体DNA纯化并转化至表达宿主，通常是BL21 (DE3)。选择单克隆以在4 ml LB培养基中生长起子培养物约6小时。通过将100 ul 80%甘油加入到900 ul储液中制备甘油储液，并储存于-80℃。任选保留500 ul非诱导样品用于凝胶分析。在125 ml Thompson烧瓶中使用60 ul起子培养物接种60 ml培养物(例如MagicMedia™大肠杆菌表达培养基；Invitrogen, USA；参见Glenn等, J. Biol. Chem. 2008, 283(19):12717-29)，并在30℃下孵育过夜。移出250 ul样品用于分析。通过离心以沉淀形式收集细胞，并冷冻用于后续处理。如下进行细胞提取物的制备和用镍树脂的首过(first pass)纯化。将大肠杆菌细胞沉淀完全重悬于与起始培养物体积相同体积的裂解缓冲液(50 mMTrisHCl、150 mM NaCl、pH 8.0)中。然后将细胞以100 psi经历微流化器(Microfluidics,MA)三次。将细胞提取物以16,000 x g离心30分钟以除去碎片。将EGTA (150 mM储液)加入细胞提取物中至终浓度为3 mM EGTA。然后将裂解物应用于已经洗涤和预平衡的Ni-NTASuperflow柱。然后用加有EGTA的裂解缓冲液(50 mM TrisHCl、150 mM NaCl、pH8.0、3 mMEGTA)洗涤与柱结合的蛋白，之后用50 mL洗脱缓冲液(25 mM TrisHCl、50 mM NaCl、250 mM咪唑、pH8.0)洗脱结合的蛋白。His-Tag的切割和随后的纯化如下进行。用Amicon-Ultra15离心过滤单元(Millipore, USA)浓缩所洗脱的蛋白，然后用25 mM TrisHCl、pH8.0、50 mMNaCl稀释以准备蛋白酶消化，所述消化从所需蛋白的N-端除去HisTag。向蛋白溶液中加入0.1%的β-巯基乙醇和1%的Turbo TEV蛋白酶(2 mg/mL，10,000单位/mg; Excellgen, USA)，将其混合并在室温下孵育4小时，然后在4℃下过夜。用50 mM TrisHCl、100 mM NaCl、45 mM咪唑、pH8.0预平衡Ni-NTA Superflow柱(Qiagen, USA)。用50 mM TrisHCl、150 mM NaCl、pH8.0将TEV消化反应物稀释2倍。将稀释的消化反应物小心应用到Ni-NTA柱的顶端，并收集穿流液(flow-through)。向柱中加入10 mL 50 mM trisHCl、100 mM NaCl、45 mM咪唑、pH8.0以洗脱任何未结合的蛋白。收集从柱上洗脱的蛋白并合并，然后使用分子排阻色谱法(2x Superdex 75 HiLoad 26/60柱；GE Healthcare Biosciences, USA)精制。按照制造商说明书，使用EndoTrap Red (Lonza, Switzerland)除去任何残留的细菌内毒素。
包涵体制备。对于在包涵体部分中存在的工程改造的多肽，可使用下列程序。将细胞沉淀重悬于对每50 ml培养物最小100 ml的裂解缓冲液中。加入30 ml后，可使用10 ml移液管重悬，然后用另外70 ml洗涤管。通过微流化器以100 PSI (min)多次(例如4次)运行所重悬的细胞液，在整个过程期间小心保持室在冰水中。可以14000 x g离心流化浆液20分钟(例如JLA 10.5，10,000rpm，使用250 ml nalgene瓶)。用移液管尖头破坏后，于4℃用搅拌棒和搅拌板将包涵体沉淀在冰上重悬于冷却的裂解缓冲液中1小时。用移液管尖头破坏后，于4℃将沉淀物再次用搅拌棒和搅拌板重悬于蒸馏水中1小时，然后以14000 x g离心15分钟。移除上清液并丢弃。将所得物储存于-80℃。
蛋白纯化。如本文所述，已知多种方法用于分离所表达的多肽。分泌的工程改造的多肽是优选的。然而，如果形成包涵体，以下是一个实例。可将包涵体沉淀在RT下溶解于合适体积的溶解缓冲液(8M尿素或8M胍、50 mM Tris、10 mM DTT、pH 7.75)中1小时。将所溶解的沉淀以27000 g离心20分钟。将过滤(例如0.4 um)的上清液在RT下逐滴转移至合适体积的重折叠缓冲液(50 mM Tris-HCl、1 M尿素、0.8 M精氨酸、4 mM半胱氨酸、1 mM胱胺；pH 8)中。然后可将所得物于4℃在轻微混合下放置过夜或更长。将样品浓缩，并使用GEHealthsciences AKTA FPLC，在4℃环境中以1-2 ml/min在凝胶过滤柱(Superdex75 26/60)上运行。适当的含蛋白流分可通过SDS-PAGE鉴定，合并并通过另一凝胶过滤柱运行。然后将合并的蛋白在Amicon过滤器上浓缩至适当浓度，并使用例如本领域已知的EndosafePTS Reader (Charles River)测定内毒素水平。一旦蛋白样品通过内毒素标准，可将其无菌过滤，分配成等分试样并进行质量控制测定。质量控制测定可包括分析型HPLC-SEC，非还原型SDS PAGE和RP HPLC-MS以得到近似质量。可在1xPBS (137 mM氯化钠、2.7 mM氯化钾、4.3 mM磷酸二钠、1.4 mM磷酸一钾、pH7.2)中获得蛋白，分配成等分试样并急速冷冻以储存在-70至-80℃。
IV. 使用和治疗疾病的方法
适应症。预期多种疾病和病症可通过本文所述的多肽化合物和方法而受益地治疗，主要基于对通过与GLP-1受体相互作用(例如通过毒蜥外泌肽-4)的治疗顺从的那些疾病和病症。
肥胖和超重。在美国和全球，肥胖和其相关的病症(包括超重)是常见及严重的公众健康问题。上身肥胖是对2型糖尿病已知的最强风险因素，并且是对心血管疾病的强风险因素。肥胖是以下疾病的公认风险因素：高血压、动脉硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠性呼吸暂停、生殖病症例如多囊卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和增加发病率的全身麻醉并发症。参见例如Kopelman, 2000, Nature404:635-43。
肥胖降低寿命和带有严重风险的上文所列共发病以及病症例如感染、静脉曲张、黑棘皮病、湿疹、运动不耐(exercise intolerance)、胰岛素抵抗、高血压、血胆固醇过多、胆石症、矫形外科损伤和血栓栓塞性疾病。参见例如Rissanen等, 1990, Br. Med. J.,301:835-7。肥胖还是对一组称为胰岛素抵抗综合征或“X综合征”和代谢综合征的病况的风险因素。肥胖和相关病症的全球医疗费用是巨大的。
认为肥胖的发病机理是多因素的。一个问题是在肥胖受试者中，营养利用率和能量支出失去平衡，直到产生过量的脂肪组织。中枢神经系统(CNS)控制能量平衡，并协调适于动物的代谢状态的各种行为活动、自主活动和内分泌活动。控制这些活动的机制或系统广泛分布在前脑(例如下丘脑)、后脑(例如脑干)和脊髓中。最终，来自这些系统的代谢(即，能量利用率)和认知(即，学习偏好)信息被整合，并且开启(进食获取并起始)或关闭(进食终止)参与食欲(食物寻觅)和消费(摄食)行为的决定。认为下丘脑主要负责整合这些信号并随后发出指令给脑干。脑干神经核控制消费型运动控制系统的元件(例如，肌肉负责咀嚼和吞咽)。因此，这些CNS神经核已完全被称为构成摄食行为的“最终共同途径”。
神经解剖学和药理学证据支持能量和营养稳态信号整合在前脑神经核中，并支持消费型运动控制系统存在于脑干神经核，可能在三叉神经运动神经核周围的区域。在下丘脑和脑干之间存在广泛的交互连接。各种CNS定向的抗肥胖疗法(例如，小分子和肽)主要聚焦在存在于下丘脑中的前脑基质和/或存在于脑干中的后脑基质。
肥胖仍是一种难以治疗、慢性、基本难治的代谢性病症。因此，存在用于在受试者中体重减轻和/或体重维持的新疗法的需求。这样的疗法将对受试者的健康产生深远的有益影响。
糖尿病和心血管病。认为糖尿病是一种复杂的慢性疾病，其中糖尿病患者中所有死亡病例的60%至70%是心血管并发症的结果。糖尿病不仅被认为是冠心病风险的等价物，而且还被鉴定为不良事件的独立预测因子，所述不良事件包括复发性心肌梗死、充血性心力衰竭和心血管意外后的死亡。预期对心血管风险因素采用较严格的葡萄糖控制和强力治疗将降低冠心病并发症的风险和提高糖尿病患者中的总体存活率。至今，糖尿病患者经历急性心肌梗死的可能性是非糖尿病患者的2-3倍，并且糖尿病患者比非糖尿病患者少活8-13年。
理解糖尿病/极性心肌梗死患者的高风险性质，美国心脏病学会/美国心脏病协会(“ACC/AHA”)对处理患有不稳定心绞痛或非-ST-上升的心肌梗死(统称为“ACS”)的住院患者的临床实践指导方针最近认为住院的糖尿病患者是需要强力处理高血糖症的特殊群体。特别是，指导方针规定对住院的糖尿病/ACS患者的葡萄糖降低疗法的目标应为实现餐前葡萄糖低于10 mg/dL，最大每日目标低于180 mg/dL，和出院后血红蛋白A1c低于7%。
在全国性的老年ACS患者样品中，证实糖尿病患者中30天死亡率的增加与住院后具有较高葡萄糖值的患者一致。参见“Diabetic Coronary Artery Disease &Intervention,” Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, September 20, 2002。存在越来越多的证据表明，住院后持续的高血糖症而非短暂升高的葡萄糖与严重的不良事件有关。尽管对患者中高血糖症和血管风险的理想量度不易知道，但似乎在住院期间的平均葡萄糖值对死亡率最具预测性。在来自美国超过40家医院的ACS患者的单独研究中发现，与住院后的随机葡萄糖值相反，持久性高血糖症对住院期间的死亡率更具预测性。参见Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO,September 21, 2002。与住院后的葡萄糖值相比，在整个住院期间葡萄糖控制的对数回归模型对死亡率最具预测性。在住院期间对超过120 mg/dL葡萄糖中每10 mg/dL的增加，存在几乎2倍增加的死亡率风险。在较小组的连续糖尿病/ACS患者中，随着住院后葡萄糖水平增加，一年死亡率存在分级增加。在医院环境中，ACC/AHA指导方针建议开始强力胰岛素疗法以实现住院期间较低的血糖。
脂质调节疾病。血脂障碍是血液中正常脂质组分的破坏。认为胰岛素水平的长时间上升可导致血脂异常。高血脂是血液中存在升高或异常水平的脂质和/或脂蛋白。脂肪肝病，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，是指广谱的肝病，范围从简单性脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪肝炎，到肝硬化(肝脏的不可逆、晚期瘢痕化)。所有阶段的NAFLD在肝脏细胞(肝细胞)中共同具有脂肪的积聚(脂肪侵润)。
此外，不希望受任何理论束缚，认为2型糖尿病中的相对胰岛素缺乏、葡萄糖毒性和通过从腹内脂肪组织经由门静脉提高递送而增加的肝游离脂肪酸负载涉及作为脂肪肝病症的可能原因。实际上，已推测进食行为是驱动肥胖的代谢综合征与其许多结果(包括NASH)的关键因素。因此，目的在于减少食物摄取和增加少量进餐数量的治疗，如已在2型糖尿病中所证实，可有效治疗和预防NASH。促进胰岛素分泌和体重减轻以及延缓胃排空的药物亦对提高葡萄糖耐受有效，并因此可改善脂肪肝与其伴随的高胰岛素血症。因此，使用毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物激动剂、毒蜥外泌肽衍生物激动剂、特别是毒蜥外泌肽-4，可很好地适于作为对该病况的治疗方式。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括毒蜥外泌肽或其生物学活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物，可用于治疗脂肪肝病症。
阿尔茨海默氏病。阿尔茨海默氏病(AD)，如本领域已知，与脑中的斑块和缠结有关，其包括A-β蛋白的失调。已报道神经元GLP-1受体的刺激在调节神经元可塑性和细胞存活中起重要的作用。已报道GLP-1受体的刺激在培养的神经元细胞中诱导轴突向外生长并且防护免于兴奋性毒性细胞死亡和氧化损伤。报道GLP-1和毒蜥外泌肽-4降低小鼠脑中淀粉样-β肽(A-β蛋白)的内源水平，并降低神经元中β-淀粉样前体蛋白(β-APP)的水平。参见例如Perry等, 2004, Curr. Drug Targets5(6):565-571。用本文公开的工程改造的化合物的治疗可对与阿尔茨海默氏病相关的治疗靶提供益处。
帕金森病。帕金森病(PD)与“原发性帕金森病”同义，即由于神经变性过程而没有任何其他次级系统原因引起的单独的帕金森病。帕金森病被表征为由缺失多巴胺引起的震颤、僵硬和运动迟缓。不希望受任何理论束缚，认为毒蜥外泌肽-4可通过起小胶质细胞失活因子的作用而作为多巴胺能神经元的存活因子，并且暗示毒蜥外泌肽-4可以是神经变性疾病例如PD的有价值的治疗剂。
代谢综合征X。代谢综合征X被表征为胰岛素抵抗、血脂障碍、高血压和脂肪组织的内脏分布，并在2型糖尿病的病理生理学中起关键的作用。还发现其与肝脏的NASH、纤维化和肝硬化强相关。因此，本文所述的工程改造的多肽可用于治疗代谢综合征X。
类固醇诱导的糖尿病。众所周知，糖皮质激素影响碳水化合物代谢。响应外源糖皮质激素的给予，观察到肝葡萄糖产生增加，以及胰岛素分泌减少和外周组织中胰岛素刺激的葡萄糖吸收减少。此外，糖皮质激素治疗改变胰岛素原(PI)/免疫反应性胰岛素(IRI)比率，如本领域已知。在无糖尿病的受试者中由糖皮质激素诱导的高血糖症的典型特征包括禁食血糖的少量上升、过大的餐后高血糖、对外源胰岛素不敏感和对二甲双胍或磺酰脲治疗无反应性。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括毒蜥外泌肽、其生物学活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物，可用于治疗类固醇诱导的糖尿病。
人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱导的糖尿病。在将人免疫缺陷病毒(HIV)-1蛋白酶抑制剂(PI)引入到常规临床应用后不久，开始出现将PI应用与高血糖症的发展联系起来的报道。尽管用PI治疗的HIV感染受试者中的约1%-6%发展为糖尿病，但明显更大的比例发展为胰岛素抵抗和葡萄糖耐量降低。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括毒蜥外泌肽、其生物学活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物，可用于治疗HIV治疗诱导的糖尿病。
成人中潜在的自体免疫糖尿病(LADA)。进行性自体免疫糖尿病，亦称为成人中潜在的自体免疫糖尿病(LADA)，被认为在诊断为2型糖尿病的患者的约10%中存在。LADA患者具有对胰岛细胞的细胞质抗原的循环抗体，或更常见具有对谷氨酸脱羧酶的循环抗体。这些受试者显示1型和2型糖尿病两者特有的临床特征。尽管在缓慢进展形式的自体免疫糖尿病中比在快速进展形式的自体免疫糖尿病中更好地保持胰岛素的分泌，但在LADA受试者中胰岛素分泌随时间趋于恶化。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括毒蜥外泌肽、其生物学活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物，可用于治疗LADA。
无症状性低血糖症(Hypoglycemia Unawareness, HU)。缺陷性葡萄糖反向调节可甚至在仅仅低血糖症的单一新近发作之后发生。经历重复低血糖症发作的受试者经常失去其识别通常与低血糖症或迫近的胰岛素休克(称为“无症状性低血糖”的病症)相关症状的能力。因为患者没有意识到他或她自身的状况，因而血糖水平可随后降至很低，以至于严重的神经学问题接着发生，包括昏迷和癫痫。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括毒蜥外泌肽、其生物学活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物，可用于治疗HU。
限制性肺病。GLP-1受体已定位于肺中。毒蜥外泌肽可通过GLP-1受体诱发生物学反应。具体而言，结节病是系统性肉芽肿病，其经常涉及到肺。尽管传统认为气道阻塞为限制性肺病，但在过去多年中，气道阻塞已成为该疾病的公认特征。结节病可在任何水平上影响气道，并且当累及(involvement)包括小气道时，其可类似于更常见的阻碍性气道病，例如哮喘和慢性支气管炎。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括毒蜥外泌肽、其生物学活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物，可用于治疗限制性肺病，因为所述激素结构域肽可提高肺的弹性或延缓僵硬。
短肠综合征(SBS)。已报道毒蜥外泌肽-4有效用于治疗短肠综合征。参见Kunkel等Neurogastroenterol. Motil. (2011)。SBS为表征为腹泻和营养剥夺的严重临床病症。在回肠中由L-细胞产生的胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)调节邻近的肠转运。当广泛的回肠切除发生时，例如在SBS中，GLP-1水平可不足。毒蜥外泌肽(exenatide)改善SBS患者的营养状态和肠症状。因此，SBS患者可顺从于用本文所述的工程改造的多肽的治疗。可实现肠频率和形式上的改进，以及获得不再与膳食有关的肠运动。另外的益处是可停止全部的胃肠外营养。本文的这些化合物在SBS患者中提供肠习惯、营养状态和生活质量上的显著改进，并进一步可降低对胃肠外营养和小肠移植的需求。
因此，一方面，提供用于治疗受试者中的疾病或病症的方法。受试者需要治疗所述疾病或病症。在一些实施方案中，需要治疗的受试者是肥胖的。所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、血脂异常、冠心病、中风、SBS或高血脂或本文所述的其他疾病。糖尿病可包括I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病或前驱糖尿病以及HIV或类固醇诱导的糖尿病。治疗方法包括以有效治疗疾病或病症的量给予受试者如本文所述的工程改造的多肽。对这些疾病特别有用的是本文所述的化合物，其具有葡萄糖降低活性(例如与ABD连接的毒蜥外泌肽-4或其片段或类似物)、具有体重减少或食物摄取减少活性、降低HbA1c、延迟胃排空、降低血浆胰高血糖素和/或肠运动益处。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是糖尿病、超重或肥胖、或血脂障碍或高血脂。工程改造的多肽可包含ABD和HD1多肽以及任选的接头K1，其中HD1是毒蜥外泌肽或其片段或类似物。因此，工程改造的多肽可具有下列结构中的一个：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽优选为毒蜥外泌肽-4或Leu14毒蜥外泌肽-4。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、血脂异常、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、SBS或高血脂。工程改造的多肽可包含毒蜥外泌肽或其片段或类似物。因此，工程改造的多肽可具有下列结构中的一个：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些实施方案中，在工程改造的多肽中的毒蜥外泌肽优选为毒蜥外泌肽-4或其类似物Leu14毒蜥外泌肽-4。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽片段为毒蜥外泌肽-4的片段。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物具有与毒蜥外泌肽-4至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高的同一性。对这些疾病特别有用的是本文所述的化合物，其具有葡萄糖降低活性(例如与ABD连接的毒蜥外泌肽-4或其片段或类似物)、具有体重减少或食物摄取减少活性、降低HbA1c、延迟胃排空、降低血浆胰高血糖素或肠运动益处。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、血脂异常、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、SBS或高血脂。工程改造的多肽可包含毒蜥外泌肽或其片段或类似物。因此，工程改造的多肽可具有下列结构中的一个：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽优选为毒蜥外泌肽-4或其类似物Leu14毒蜥外泌肽-4。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽片段为毒蜥外泌肽-4的片段。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物具有与毒蜥外泌肽-4至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高的同一性。对这些疾病特别有用的是本文所述的化合物，其具有葡萄糖降低活性(例如与ABD连接的毒蜥外泌肽-4或其片段或类似物)、具有体重减少或食物摄取减少活性、延迟胃排空、降低血浆胰高血糖素或肠运动益处。
所述疾病或病症可以是糖尿病、超重、肥胖、血脂异常、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、SBS、高血脂、帕金森病或心血管病或本文所述的其他疾病。工程改造的多肽可包含毒蜥外泌肽或其片段或类似物。因此，工程改造的多肽可具有下列结构中的一个：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽优选为毒蜥外泌肽-4或其类似物Leu14毒蜥外泌肽-4。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽片段为毒蜥外泌肽-4的片段。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物具有与毒蜥外泌肽-4至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高的同一性。对这些疾病特别有用的是本文所述的化合物，其具有葡萄糖降低活性(例如与ABD连接的毒蜥外泌肽-4或其片段或类似物)、具有体重减少或食物摄取减少活性、降低HbA1c、延迟胃排空、降低血浆胰高血糖素或肠运动益处。
可通过本文所述的化合物和方法治疗的另外的疾病和病症包括类固醇诱导的糖尿病、HIV治疗诱导的糖尿病、成人中潜在的自体免疫糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、无症状性低血糖(HU)、包括结节病的限制性肺病和代谢综合征X。工程改造的多肽可包含毒蜥外泌肽或其片段或类似物。因此，工程改造的多肽可具有下列结构中的一个：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽优选为毒蜥外泌肽-4或其类似物Leu14毒蜥外泌肽-4。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽片段为毒蜥外泌肽-4的片段。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物具有与毒蜥外泌肽-4至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高的同一性。对这些疾病特别有用的是本文所述的化合物，其具有葡萄糖降低活性(例如与ABD连接的毒蜥外泌肽-4或其片段或类似物)、具有体重减少或食物摄取减少活性、延迟胃排空、降低HbA1c、降低血浆胰高血糖素或肠运动益处。工程改造的多肽可仅包含毒蜥外泌肽或其类似物或片段作为激素结构域。所述疾病或病症可以是糖尿病、超重、肥胖、血脂异常、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、SBS、高血脂、帕金森病或心血管病或本文所述的其他疾病。工程改造的多肽可包含毒蜥外泌肽或其片段或类似物。因此，工程改造的多肽可具有以下结构中的一个：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。与ABD连接的毒蜥外泌肽-4或其片段或类似物)、具有体重减少或食物摄取减少活性、延迟胃排空、降低血浆胰高血糖素或肠运动益处。
可通过本文所述的化合物和方法治疗的另外的疾病和病症包括类固醇诱导的糖尿病、HIV治疗诱导的糖尿病、成人中潜在的自体免疫糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、无症状性低血糖(HU)、包括结节病的限制性肺病和代谢综合征X。工程改造的多肽优选具有下列结构中的一个：与ABD连接的HD1-类似物或HD1-L1-ABD。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽优选为毒蜥外泌肽-4或其类似物Leu14毒蜥外泌肽-4。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽片段为毒蜥外泌肽-4的片段。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物具有与毒蜥外泌肽-4至少70%、例如70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高的同一性。
V. 测定法
用于生产和测定本文所述的工程改造的多肽的方法通常是技术人员可得的。此外，特定的方法在本文以及本文引用的专利公布和其他参考文献中描述，所述专利公布和参考文献通过引用予以结合用于该另外目的。
GLP-1受体结合和功能测定：GLP-1受体结合活性和亲和力可以多种已知方法测量。例如，在一个方法中，使用结合置换测定法测量结合活性，其中受体源是RINm5F细胞膜，并且配体是[125I]GLP-1或碘化毒蜥外泌肽(1-39)或碘化毒蜥外泌肽(9-39)。在持续混合下，将均质化的RINm5F细胞膜在含有40,000 cpm [125I]GLP-1 (或毒蜥外泌肽)示踪物的20mM HEPES缓冲液以及不同浓度的测试化合物中在23℃下孵育2小时。将反应混合物通过用0.3% PEI溶液预浸泡的玻璃滤板过滤，并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水漂洗。使用闪烁计数器测定结合数。使用GraphPad Prism®软件(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)计算结合亲和力。
可使用已知的方法和细胞和组织进行用于功能性GLP-1受体活化的体外测定。例如，毒蜥外泌肽-4刺激具有GLP-1受体的细胞可诱导腺苷酸环化酶活化的增加、cAMP合成、膜去极化、细胞内钙增加和葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加。参见例如Holz等, 1995, J. Biol. Chem.270(30):17749-57。使用rMTC 6-23 (克隆6)细胞系的基于细胞的测定法可用于根据所产生的cAMP来测定化合物的GLP-1受体激动剂活性。在生物测定法的一个实施方案中，化合物的GLP-1受体激动剂活性通过在基于细胞的测定法(使用6-23 (克隆6)细胞)中与cAMP产生的相互关系定量测定。基于细胞的测定法使用活的6-23 (克隆6)细胞。6-23(克隆6)细胞可以ATCC® No. CRL-1607™获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)和以ECACC No. 87042206获自欧洲细胞培养物保藏中心(EuropeanCollection of Cell Cultures)。在另一实施方案中，所述基于细胞的测定法是均相时间分辨荧光测定法(HTRF®)。HTRF®试剂盒可市购获自Cisbio International (Bedford,Mass.)。使用HTRF®试剂盒的方法是本领域已知的，并且所述试剂盒通常包含说明书手册，例如关于如何制备样品、标准品、校准曲线和进行实验。基于均相时间分辨荧光细胞的测定法描述于美国专利号5,527,684，其公开内容通过引用结合到本文中，并且文件参考号62AM4PEB rev02 (2007年8月)可自Cisbio HTRF® Product Center中心获得。参见www.htrf.com/products/gper/camp/，其公开内容通过引用结合到本文。在一个优选的方法中，所述生物测定法在基于细胞的测定法中使用大鼠甲状腺癌6-23 (克隆6)细胞，使用可以目录号62AM4PEB获自Cisbio的HTRF® cAMP dynamic 2 1,000测定试剂盒。按试剂盒中的说明书制备HTRF®标准品和校准品。测定法可在白蛋白存在或不存在下进行。
用于作用的活性和持续时间以及药代动力学的体内测定法可使用已知方法进行。例如，可使用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)进行持续时间测定，其中将药物在需要的时间点给予受试者后，将葡萄糖口服给予(以测量药物的作用持续时间；OGTT DOA)并测量葡萄糖的血液水平(例如在小鼠中易于进行)。还可使用静脉内葡萄糖耐受试验(IVGTT)测量活性和持续时间，其中将药物在需要的时间点给与受试者后，将葡萄糖IV给予(IVGTT DOA)，并测量血糖水平(例如可在大鼠中易于进行)。优选的工程改造的化合物对血糖具有以下所需的作用：单剂量药物给予后至少24小时持续时间，优选单剂量药物给予后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天和至少1周持续时间。
例如，将测试的多肽在紧接基线样品后t=0时经皮下注射到NIH/Swiss雌性小鼠。在所需的时间期间采集血样，例如在第1天期间t=2、4和8小时，然后每天1次直到第5天或直到第7天或更长。用OneTouch® Ultra® (LifeScan, Inc., a Johnson & JohnsonCompany, Milpitas, CA)测量血糖。对于活性持续时间测定，例如对于药物的葡萄糖控制活性，可在药物给予后所需的时间点进行OGTT或IVGTT。还可测量体重以及食物摄取，或者其他药理学或药代动力学参数。例如，将雌性NIH/Swiss小鼠(8-20周龄)用12:12小时光照：黑暗周期(在0600光照打开)成群饲养。随意获得水和标准粒状小鼠饲料，除非有所注明。在实验的早上，将动物分到实验组，并在约0630小时时开始禁食。在代表性研究中，n=2笼，其中3小鼠/笼。在时间=0 min时，采集血糖样品，紧接以约1 nmol/kg-25 nmol/kg范围的量进行腹膜内注射溶媒或化合物。可在单次给予后30、60、120、180和240 min以及每天一次持续1周或更长时测量血糖。在实验的变化中，每天一次或甚至每周一次持续较长的时间例如14或28天提供剂量。预治疗百分比通过将在测量时间点(例如60分钟或1天)的血糖除以在时间=0 min时的血糖来计算。通过ANOVA (p<0.05)鉴定显著的治疗效果。当存在显著差异时，使用Dunnett’s检验(Prism® v. 4.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)将测试平均值与对照平均值相比较。可用OneTouch® Ultra® (LifeScan, Inc., a Johnson& Johnson Company, Milpitas, CA)测量血糖。* p<0.05 vs.溶媒对照；ANOVA, Dunnett's检验。还可测量其他参数。
食物摄取抑制的体内测定：可以多种已知方法测试工程改造的多肽对食欲抑制的持续时间和程度，以及对体重减少影响的持续时间和程度。例如，可在小鼠食物摄取测定中测试多肽的食欲抑制，以及在膳食诱导的肥胖(DIO)小鼠测试多肽对体重增加的影响。所述测定法的所有实验方案在下文中描述。
例如，将雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)用12:12小时光照：黑暗周期(在0600光照打开)成群饲养。随意获得水和标准粒状小鼠饲料，除非有所注明。在实验前1天约1500小时时对动物开始禁食。在实验的早上，将动物分到实验组。在代表性研究中，n=4笼，其中3小鼠/笼。在时间=0 min时，所有动物通常以约2 nmol/kg-75 nmol/kg范围的量给予腹膜内注射溶媒或测试化合物，并且立即给予预称重量(10-15 g)的标准饲料。在多个时间，通常30、60和120分钟或更长例如每天，移走食物并称重，以测量消耗的食物量(Morley, Flood等,1994, Am. J. Physiol.267: R178-R184)。通过从起始在时间=0时提供的食物重量减去在例如30或60分钟时间点时剩余的食物重量，计算食物摄取量。通过ANOVA (p<0.05)鉴定显著的治疗效果。当存在显著差异时，使用Dunnett’s检验(Prism® v. 2.01, GraphPadSoftware Inc., San Diego, CA)将测试平均值与对照平均值相比较。还可测量体重。
体重、脂肪再分布和瘦体重测定：还可按以下进行体重和相关效果的测定。在Sprague-Dawley大鼠中膳食诱导的肥胖(DIO)是用于研究肥胖和能量稳态调节的有价值模型。这些大鼠从(Crl:CD®(SD)BR)大鼠系发展，其在脂肪和能量相对高的膳食下易于变得肥胖。参见例如Levin, 1994, Am. J. Physiol.267:R527-R535；Levin等, 1997, Am. J. Physiol.273:R725-R730。DIO雄性大鼠获自Charles River Laboratories, Inc.(Wilmington, MA)。于22℃在12/12小时光照黑暗周期下，将大鼠单独饲养在鞋盒笼(shoebox cage)中。随意以中等高脂肪膳食(32%千卡来自脂肪；Research Diets D1226B)维持大鼠。动物通常获得约500 g的平均体重。使Levin DIO大鼠适应笼养环境7天。在适应的3个晚上期间，动物接受单次腹膜内(IP)注射溶媒。在测试当天，在黑暗周期开始时将大鼠给予单次IP注射化合物或溶媒(例如10% DMSO)。在整个研究期间以5秒间隔，通过自动化食物摄取测量系统(BioDAQ, Research Diets)测量食物摄取量。每夜记录体重。
可在药物治疗之前或之后，使用NMR (Echo Medical Systems, Houston, TX)测量身体组成。对于身体组成测量，将大鼠短暂(约1 min)放于通风良好的有机玻璃管中，所述管随后插入到专门的啮齿动物NMR仪器上。这使得能够计算脂肪和干瘦组织的实际克数的变化(例如，治疗后身体脂肪的克数-基线处身体脂肪的克数=身体脂肪的克数变化)和脂肪和干瘦组织的%体重组成的变化(例如，治疗后%身体脂肪-基线处%身体脂肪=%身体脂肪的变化)。所有数据以平均值± SEM表示。使用方差分析(ANOVA)和事后检验来检验组间差异。认为P值<0.05是显著的。使用PRISM® 4 for Windows (GraphPad Software, Inc.,San Diego, CA)进行统计学分析和作图。图表和结果通常以经溶媒修正的百分数体重变化、身体脂肪变化和身体蛋白变化来表示。
VI. 药物组合物
一方面，提供包含与药学上可接受的赋形剂(例如载体)组合的本文所述化合物的药物组合物。本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指药学上的赋形剂，例如适于肠或胃肠外应用的药学上、生理学上可接受的有机或无机载体物质，其不与活性剂起有害反应。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(例如林格溶液等)、乙醇、油、凝胶和碳水化合物例如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。这样的制剂可以是无菌的，并且如果需要的化，其与辅剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等混合，所述辅剂不与本发明的化合物起有害反应。
在又一方面，提供包含与药学上可接受的赋形剂组合的本文所述的工程改造的多肽的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物为本文所述的口服药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物为长效的药物组合物。在给予药物组合物的背景下，术语“长效的”是指作用持续时间。因此，长效的药物组合物可以例如1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月或甚至更长的间隔给予。在一个实施方案中，1天给予两次(即每天2次)。在优选的实施方案中，1天给予一次(即每天1次)。在更优选的实施方案中，1周给予一次(即，每周1次)。在一些实施方案中，工程改造的多肽选自本文的表2和3中所列的工程改造的多肽。在一些实施方案中，工程改造的多肽选自本文的表2中所列的工程改造的多肽。化合物优选为Cmpd 5、9或11，或者与其具有至少95%的氨基酸序列同一性。
A. 制剂
本文所述的工程改造的多肽可单独给予受试者或可共给予受试者。共给予意在包括单独或组合(超过一种化合物)，同时或序贯给予化合物。例如，已发现可用包括瘦蛋白(例如美曲普汀)和胰岛淀粉样多肽(例如普兰林肽)的组合疗法有益地治疗肥胖。参见例如美国公布申请号2008/0207512。因此，包含ABD和毒蜥外泌肽化合物的可用于治疗例如肥胖和超重的本文所述工程改造的多肽可单独给予以实现所述治疗，或与瘦蛋白或瘦蛋白类似物(例如美曲普汀)和/或胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物(例如普兰林肽)共给予。
在一些实施方案中，本文所述的制剂和方法进一步提供毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物或毒蜥外泌肽类似物激动剂工程改造的多肽与一种或多种抗糖尿病剂共给予，所述抗糖尿病剂例如抗高血糖剂，例如胰岛素(包括常规的、短效的、长效的和基础的胰岛素)、胰岛淀粉样多肽、普兰林肽、二甲双胍和噻唑烷二酮(包括罗格列酮和匹格列酮)。
在一些实施方案中，本文所述的制剂和方法进一步提供毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物或毒蜥外泌肽类似物激动剂工程改造的多肽与一种或多种胆固醇和/或甘油三酯降低剂共给予。示例性药剂包括HMG CoA还原酶抑制剂(例如，阿伐他汀、氟伐地汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀)；胆汁酸螯合剂(例如，考来维仑、考来烯胺、考来替泊)；贝特类(fibrate)(例如，非诺贝特、氯贝特、吉非贝齐)；依泽替米贝、烟酸、普罗布考、洛伐他汀/尼克酸的组合；阿伐他汀/氨氯地平的组合；和辛伐他汀/依泽替米贝的组合。
本公开内容提供用作药物(即，用于治疗)的组合物，这是因为毒蜥外泌肽化合物是治疗上的活性化合物，并且当其与ABD融合时，令人惊讶地保留活性。包含液体形式或干燥形式的工程改造的多肽和任选至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物也是特别预期的，并且在本文中举例说明。
所述组合物具有在体内或体外与白蛋白结合的能力。在某些情况下，与在活生物体外部的白蛋白形成组合物复合物(即，将外源白蛋白添加到组合物)可具有益处。所述组合物可冻干，提供适于在环境温度下储存的制剂。因此，本公开内容还提供如上文定义的组合物，其进一步包含白蛋白(例如，人血清白蛋白)，并且其可任选呈干燥形式。
通过分别给予毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激动剂或毒蜥外泌肽类似物激动剂工程改造的多肽与第二试剂，或者通过给予包含毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激动剂或毒蜥外泌肽激动剂工程改造的多肽和第二试剂的单一药物制剂，可实现共给予。第二试剂的合适剂量方案通常是本领域已知的。
当需要时，所述制剂还可与本领域已知的其他活性物质(例如，以减少代谢降解)或其他治疗上的活性剂共给予。本文所述的毒蜥外泌肽工程改造的多肽可与其他活性抗糖尿病剂或抗肥胖剂一起给予，所述试剂例如瘦蛋白或瘦蛋白激动剂和胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽激动剂化合物，例如胰岛淀粉样多肽，包括davalintide和它们的类似物。
胰岛淀粉样多肽。胰岛淀粉样多肽是由胰腺β-细胞合成的肽激素，其响应营养摄取而与胰岛素共分泌。胰岛淀粉样多肽的序列在哺乳动物物种间高度保守，与降钙素基因相关的肽(CGRP)、降钙素、促黑激素和肾上腺髓质素具有结构上的类似性，如本领域已知。通过调节循环中葡萄糖出现的速率(通过抑制营养刺激的胰高血糖素分泌和减慢胃排空)，胰岛淀粉样多肽的糖调节作用补充胰岛素的糖调节作用。在胰岛素治疗的糖尿病患者中，普兰林肽(人胰岛淀粉样多肽的合成的等效类似物)通过抑制不适当升高的餐后胰高血糖素分泌和减慢胃排空，来降低餐后葡萄糖偏移。大鼠胰岛淀粉样多肽、人胰岛淀粉样多肽和普兰林肽的序列如下：
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:6)；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO:7)；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:8)。
Davalintide。Davalintide，亦称为“AC-2307”，是可用于治疗多种疾病适应症的有效胰岛淀粉样多肽激动剂。参见 WO 2006/083254和WO 2007/114838，每个通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。Davalintide是嵌合肽，具有胰岛淀粉样多肽或降钙素和其类似物的N-端环区域、降钙素或其类似物的α-螺旋区域的至少一部分的α-螺旋区域或者具有胰岛淀粉样多肽α-螺旋区域和降钙素α-螺旋区域或其类似物的至少一部分的α-螺旋区域、和胰岛淀粉样多肽或降钙素的C-端尾部区域。人降钙素、鲑鱼降钙素和davalintide的序列如下：
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO:9)；
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO:10)；
KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO:11)。
不希望受任何理论束缚，认为胰岛淀粉样多肽和davalintide以及其片段和类似物可需要C-端酰胺化以诱发完全的生物学反应。应理解的是，胰岛淀粉样多肽化合物，例如包括胰岛淀粉样多肽和/或davalintide以及其片段和类似物的本文所述的那些，可在C-端酰胺化。
“胰岛淀粉样多肽激动剂化合物”包括天然胰岛淀粉样多肽的肽、胰岛淀粉样多肽类似物的肽和具有胰岛淀粉样多肽激动剂活性的其他化合物(例如，小分子)。“胰岛淀粉样多肽激动剂化合物”可源自天然来源，可是合成的，或者可源自重组DNA技术。胰岛淀粉样多肽激动剂化合物具有胰岛淀粉样多肽激动剂受体结合活性，并且可包括氨基酸(例如，天然、非天然或其组合)、拟肽、化学部分等。技术人员使用胰岛淀粉样多肽受体结合测定或通过在比目鱼肌测定中测量胰岛淀粉样多肽激动剂活性，将识别胰岛淀粉样多肽激动剂化合物。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物在胰岛淀粉样多肽受体结合测定中具有约200 nM或更低的IC50、约100 nM或更低的IC50、或者约50 nM或更低的IC50，所述测定例如在本文、美国专利号5,686,411和美国公布号2008/0176804中所述，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物在比目鱼肌测定中具有约20 nM或更低、约15 nM或更低、约10 nM或更低或约5 nM或更低的EC50，所述测定例如在本文中和美国专利号5,686,411中所述。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物具有与25,28,29Pro-人胰岛淀粉样多肽至少90%或100%的序列同一性。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物是胰岛淀粉样多肽(例如，人胰岛淀粉样多肽、大鼠胰岛淀粉样多肽等)和降钙素(例如，人降钙素、鲑鱼降钙素等)的肽嵌合体。合适的和示例性的胰岛淀粉样多肽激动剂化合物还描述于美国公布号2008/0274952中，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
当与另一活性药剂共给予时，所述化合物可同时或序贯给予，一起或单独配制。由于本文的工程改造的多肽固有是长效的，因此它们适于每天1次、每周1次或更长给予。因此，另一药剂可以一个或多个剂量给予，例如在毒蜥外泌肽工程改造的多肽的给药(例如每周1次)期间按需要，每天1次、每天2次、每天3次、每周1次。
已报道了其它药剂例如胰岛淀粉样多肽化合物的单次或多次使用的制剂。例如，普兰林肽已被配制为每天1次、2次和3次给予，并且已按其成功给予来治疗糖尿病和治疗肥胖。
这些药物化合物可按照常规技术例如在E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中所公开的那些，与药学上可接受的载体或稀释液以及任何其它已知的辅剂和赋形剂一起配制。亦参见Wang等(1988) J. of Parenteral Sci. andTech., Technical Report No. 10, Supp. 42:2 S。
一般而言，工程改造的多肽可配制为用于给予患者的稳定安全的药物组合物。预期用于本发明的方法的药物制剂可包含约0.01-1.0% (w/v)、在某些情况下0.05-1.0%的工程改造的多肽；约0.02-0.5% (w/v)的乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲液，其使最终组合物的pH在约3.0-约7.0；约1.0-10% (w/v)的碳水化合物或多羟基醇张度剂(tonicifier)；和任选约0.005-1.0% (w/v)的选自间-甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯和苯酚的防腐剂。如果所配制的肽包含在多次使用的产品中，则通常包含所述防腐剂。
在具体的实施方案中，本发明工程改造的多肽的药物制剂可包含在这些实施方案中浓度范围为例如约0.01%-约98% w/w、或约1-约98% w/w、或优选80%-90% w/w、或优选约0.01%-约50% w/w、或更优选约10%-约25%的该化合物。可使用足够量的注射用水以获得所需浓度的溶液。
如果需要，还可存在另外的张度调节剂(tonicifying agent)例如氯化钠以及其他已知的赋形剂。在一些情况下，所述赋形剂可用于维持化合物的总张度。赋形剂可以各种浓度包括在本文所述的制剂中。例如，赋形剂可以约0.02%-约20% w/w、优选约0.02%-0.5%w/w、约0.02%-约10% w/v或约1%-约20% w/w的浓度范围包括在内。此外，与本发明制剂本身类似，赋形剂可以固体(包括粉末化的)、液体、半固体或凝胶形式包含在内。
药物制剂可以多种形式构成，例如固体、液体、半固体或液体。本文所用的术语“固体”意指包括该术语的所有常规应用，包括例如粉剂和冻干制剂。本发明所述的制剂可以是冻干的。
术语缓冲液、缓冲溶液和缓冲的溶液，当提及氢离子浓度或pH而使用时，是指系统(特别是水溶液)在加入酸或碱或用溶剂稀释时抵抗pH变化的能力。在加入酸或碱时经历pH小量变化的缓冲溶液的特征是存在弱酸和弱酸的盐、或弱碱和弱碱的盐。前述系统的实例为乙酸和乙酸钠。pH的变化是微小的，只要所加入的水合氢离子或氢氧离子的量未超过中和它的缓冲系统的能力。
如本文所述，多种液体溶媒可适用于工程改造的制剂，例如水或水性溶剂/有机溶剂的混合物或混悬液。
如本文所述使用的工程改造的多肽制剂的稳定性通过维持制剂的pH在由本领域已知的方法测定的范围内而增强。在某些实施方案中，维持制剂的pH在约3.5-5.0、或约3.5-6.5的范围内，在一些实施方案中，约3.7-4.3或约3.8-4.2。在一些实施方案中，pH可以是约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或甚至更高。在一些实施方案中，pH可以在生理学范围、pH 6-8、优选pH 7-7.6内。
在某些实施方案中，工程改造的多肽的缓冲液是乙酸盐缓冲液(优选以约1-5至约60 mM的最终制剂浓度)、磷酸盐缓冲液(优选以约1-5至约30 mM的最终制剂浓度)或谷氨酸盐缓冲液(优选以约1-5至约60 mM的最终制剂浓度)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸盐(优选以约5至约30 mM的最终制剂浓度)。
稳定剂可包括在制剂中，但不是必然需要的。然而，如果包括的话，可用于本发明实践的稳定剂是碳水化合物或多羟基醇。可用于本发明实践的合适稳定剂为约1.0-10%(w/v)的碳水化合物或多羟基醇。多羟基醇和碳水化合物在其骨架上共有相同的特征，即，--CHOH--CHOH--，其是使蛋白稳定的原因。多羟基醇包括例如山梨醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)等化合物。这些化合物是直链分子。另一方面，碳水化合物，例如甘露糖、核糖、蔗糖、果糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇和乳糖，是环状分子，其可包含酮基或醛基。已证实这两类化合物有效稳定蛋白质免于由升高温度或由冷冻-解冻或冷冻-干燥过程引起的变性。合适的碳水化合物包括：半乳糖、阿拉伯糖、乳糖或任何其他碳水化合物，其对糖尿病患者没有不良影响，即，碳水化合物并不在血液中代谢形成不可接受的大浓度的葡萄糖。适用于糖尿病的所述碳水化合物为本领域熟知。在非糖尿病应用(例如，治疗肥胖)中，蔗糖和果糖可适于与化合物一起使用。
在某些实施方案中，如果包含稳定剂的话，化合物用多羟基醇稳定，所述多羟基醇例如山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/乙二醇的共聚物以及分子量为200、400、1450、3350、4000、6000、8000和甚至更高的各种聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，甘露醇是优选的多羟基醇。本发明冻干制剂的另一有用特征是使用用来维持本文所述冻干制剂的稳定性的所述制剂组分维持所述制剂的张度。在一些实施方案中，甘露醇是用于该目的的优选多羟基醇。
美国药典(USP)规定，必须将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到在多剂量容器中所包含的制剂中。它们必须在使用时以足够的浓度存在以阻止微生物的繁殖，在用皮下注射针头和注射器吸取内容物的一部分或使用用于递送的其它入侵式方法(例如笔式注射器)时，所述微生物不注意地引入到制剂中。应评估抗微生物剂以确保其与配方中的所有其他组分相容，并且应评估其在整个配方中的活性以确保在一种制剂中是有效的具体药剂在另一制剂中不是无效的。常见的是发现一种具体的抗微生物剂在一种制剂中有效，而在另一制剂中无效。
在通常的制药学意义上，防腐剂是阻止或抑制微生物生长的物质，并且其可为该目的而添加到药物制剂中以避免随后由微生物引起的制剂腐败。尽管防腐剂的量不是很大，然而其仍可影响肽的总体稳定性。
尽管用于药物组合物的防腐剂范围可为0.005-1.0% (w/v)，但在一些实施方案中，每种防腐剂(单独或与其他组合)的范围为：苯甲醇(0.1-1.0%)、或间-甲酚(0.1-0.6%)、或苯酚(0.1-0.8%)、或对羟基苯甲酸甲酯(0.05-0.25%)和对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯(0.005%-0.03%)的组合。对羟基苯甲酸酯类是对羟基苯甲酸的较低烷基酯。每种防腐剂的详述列于Remington's Pharmaceutical Sciences (同上)中。
工程改造的多肽当呈液体形式时，在玻璃容器内可不具有吸附到玻璃上的倾向，因此，可不需要表面活性剂以进一步稳定药物制剂。然而，对于当呈液体形式时有所述倾向的化合物，应在它们的制剂中使用表面活性剂。这些制剂可然后被冻干。表面活性剂经常引起蛋白变性，其通过疏水性破裂和盐桥分离两者。因为表面活性剂部分和蛋白上的反应性位点之间的强相互作用，相对低浓度的表面活性剂可产生强力的变性活性。然而，正确利用该相互作用可使蛋白稳定，免于界面或表面的变性。可进一步稳定工程改造的多肽的表面活性剂可任选在总制剂的约0.001-0.3% (w/v)的范围内存在，并包括聚山梨醇酯80 (即，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、CHAPS® (即，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]1-丙磺酸盐)、Brij® (例如，Brij® 35，其为聚氧乙烯(23)月桂基醚)、泊洛沙姆或其他非离子型表面活性剂。
根据所选的张度剂，加入氯化钠或其他盐以调节药物制剂的张度亦可为合乎需要的。然而，这是任选的，并依赖于所选的特定制剂。胃肠外制剂优选可以是等渗的或基本上等渗的。
用于胃肠外产品的优选溶媒是水。可通过蒸馏或通过反向渗透制备用于胃肠外给予的合适品质的水。注射用水是用于药物制剂的优选水性溶媒。
药物制剂中可存在其它成分是可能的。这样的其它成分包括例如湿润剂、乳化剂、油剂、抗氧化剂、膨胀剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如，氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。此外，聚合物溶液或聚合物的混合物提供控制释放肽的可能性。当然，这样的其它成分不应不利地影响本发明的药物制剂的总体稳定性。
容器也是注射制剂的一个组成部分，并且可认为是一个组分，因为不存在完全惰性的容器，或者不存在不以某种方式影响其包含的液体的容器，特别是如果液体是水性的。因此，具体注射容器的选择必须基于容器组成以及溶液组成和其将进行的处理的考虑。还可将肽在小瓶玻璃表面的吸附最小化，如有必要，通过使用硼硅玻璃例如Wheaton I型硼硅玻璃#33 (Wheaton I型-33)或其等同物(Wheaton Glass Co.)。生产可接受的类似硼硅玻璃小瓶和药筒的其它供应商包括Kimbel Glass Co.、West Co.、Bunder Glas GMBH和Forma Vitrum。化合物的生物学和化学性质可通过以下来稳定：在Wheaton I型-33硼硅酸盐血清小瓶中配制和冻干至化合物终浓度为0.1 mg/ml和10 mg/ml (在5%甘露醇和0.02%Tween 80存在下)。
对于通过注射递送的制剂，为了允许将皮下注射器的针头引入到多剂量小瓶中，并且在针头抽出后尽可能快地提供再次密封，每个小管的开放末端优选用通过铝带固定在合适位置的橡胶封闭塞密封。
玻璃小瓶的塞子，例如West 4416/50、4416/50 (Teflon表面)和4406/40、Abbott5139或任何等同塞子，可用作注射用药物的封闭。对于包括肽类抗肥胖剂的制剂，这些塞子与肽以及制剂的其它组分相容。本发明人已发现，这些塞子当采用患者使用模式测试时通过塞子完整性测试，例如，塞子可经受至少约100次注射。或者，可将肽冻干至小瓶、注射器或药筒以随后复溶。本发明的液体制剂可装入到一个或两个分室药筒或一个或两个室式注射器。
每一种上述药物制剂组分是本领域已知的，并描述于 Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 第1卷, 第二版, Avis等编辑, Mercel Dekker, NewYork, N.Y. 1992，其通过引用以其整体结合到本文中。
上述液体制剂的制备方法通常包括配料、无菌过滤和填充步骤。配料程序包括已特定的顺序溶解成分(防腐剂，然后稳定剂/张度剂、缓冲剂和肽)或同时溶解。
备选制剂，例如非胃肠外制剂，可不需要灭菌。然而，如果灭菌是需要的或必需的，任何合适的灭菌方法可用于开发本发明的肽药物制剂。典型的灭菌方法包括过滤、蒸汽(湿热)、干热、气体(例如，环氧乙烷、甲醛、二氧化氯、环氧丙烷、β-丙内酯、臭氧、氯化苦、过乙酸、甲基溴等)、暴露于放射源和无菌处理。过滤是本发明液体制剂灭菌的优选方法。无菌过滤包括通过0.45 μm和0.22 μm (1或2)过滤，其可串联连接。过滤后，将溶液填充至合适的小瓶或容器中。
在某些实施方案中，本文所述的工程改造的多肽经外周给予受试者。在一些实施方案中，本发明的液体药物制剂预期胃肠外给予。合适的给药途径包括肌内、静脉内、皮下、皮内、关节内、鞘内等。在一些实施方案中，优选皮下给药途径。在某些实施方案中，还优选粘膜递送。这些途径包括但不限于口服、鼻、舌下、肺和含服途径，其可包括给予呈液体、半固体或固体形式的肽。对于包含工程改造的多肽的制剂，与胃肠外递送相比，通过这些途径的给药由于降低的生物利用度而可能需要显著更多的化合物以获得需要的生物学作用。
此外，胃肠外控制释放递送可通过形成聚合的微胶囊、基质、溶液、植入物和装置并将它们胃肠外给予来实现，或通过手术方式来实现。控制释放制剂的实例描述于美国专利号6,368,630、6,379,704和5,766,627，其通过引用结合到本文中。因为聚合物基质或装置中一些肽的包埋，这些剂型可具有较低的生物利用度。参见例如美国专利号6,379,704、6,379,703和6,296,842，其每一个通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
化合物可以包含一定量的工程改造多肽的剂量单位形式提供，所述一定量的工程改造的多肽将在单剂量或多剂量中有效。
如本领域技术人员所认识，工程改造多肽的有效量将随许多因素而变化，包括受试者的年龄和体重、受试者的身体状态、待治疗的病况和本领域已知的其它因素。工程改造多肽的有效量还将随给予的具体组合而变化。如本文所述，工程改造多肽的组合给予可使所给予的工程改造多肽的降低量为有效量。
可通过口服途径，包括跨细胞、旁细胞(paracellular)或受体介导的途径给药。不希望受任何理论的束缚，本文所述的包含毒蜥外泌肽的工程改造多肽可口服利用，部分是因为它们相对小的尺寸和对肠酶相对稳定。已报道，通过吸收/渗透增强剂打开的肠细胞间的紧密连接为小于20 nm宽。参见例如Chao等, 1998, J. Drug Targeting, 6:37-43。因此，本文所述的足够小(例如小于10 kD或15 kD)的工程改造多肽可穿过肠壁并结合门静脉系统中的白蛋白，由此进入循环。本发明的工程改造多肽的口服递送可以是每天两次、每天一次、隔天一次、每三天一次、每周一次、两周一次、三周一次或者甚至一月一次。可使用适于其他肽的口服递送系统。在一个实施方案中，口服递送系统可具有相对快速的吸收概况，例如1-4小时，在这种情况下，工程改造多肽固有的长作用持续时间提供所需的延长作用持续时间，例如每天一次或每周一次给予。可选择作用持续时间，例如通过选择ABD和其对白蛋白的亲和力。不希望受任何理论的束缚，认为对白蛋白较高的亲和力将得到较长的循环时间，其提供较长的作用持续时间。口服递送可使用已知的体外和体内方法进行测试。例如，可用含有工程改造多肽的溶液(用或不用渗透/吸收增强剂和/或蛋白酶抑制剂配制)经口灌胃小鼠，以测试口服利用度和任何添加的赋形剂的作用。药效学(治疗效果)和药代动力学(药物性质)的任一者或两者可随时间进行测量，例如药物血浆水平、急性或慢性葡萄糖和/或HbA1c下降、胰岛素血浆水平、食物摄取抑制、重量减轻和/或脂质水平。
B. 有效剂量
本文提供的药物组合物包括其中包含治疗有效量(即，有效实现其预期目的的量)的活性成分的组合物。对具体应用有效的实际量将尤其依赖于所治疗的病况。例如，当在治疗糖尿病的方法中给予时，所述组合物将包含有效实现所需结果(例如，降低受试者的禁食血糖)的量的活性成分。当在治疗肥胖的方法中给予时，所述组合物将包含有效实现所需结果(例如，降低体重)的量的活性成分。
给予的化合物的剂量和频率(单次或多次给药)可根据多种因素而不同，包括给药途径；接受者的尺寸、年龄、性别、健康、体重、体重指数和饮食；所治疗的疾病症状的性质和程度(例如，疾病对本文所述化合物的响应；禁食血糖)；其它疾病或其它健康相关问题的存在；同时存在的治疗的类型；和任何疾病或治疗方案的并发症。其它治疗方案或药剂可与本发明的方法和化合物一起使用。
人类使用的治疗有效量可从动物模型确定。例如，可配制人类的剂量以获得已发现在动物中有效的浓度。人类中的剂量可通过监测一个或多个生理学参数(包括但不限于血糖和体重)并上调或下调剂量来进行调整，如上文所述和本领域已知。
剂量可根据患者的需要和所使用的化合物而变化。在本发明的情况下，给予患者的剂量应足以在一定的时间内在患者中产生有益的治疗反应。剂量的大小还将通过任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常，用较小剂量开始治疗，所述剂量小于化合物的最佳剂量。之后，小增量增加剂量，直到达到在各情况下的最佳效果。在本发明的一个实施方案中，剂量范围为0.001%-10% w/v。在另一实施方案中，剂量范围为0.1%-5% w/v。
然而，考虑到本文工程改造多肽延长的半寿期，典型的剂量可包含约1 ug、5 ug、10 ug、50 ug、100 ug到150 ug/天的下限至约50 ug、100 ug、150 ug、200 ug或甚至300 ug药物化合物/周的上限。剂量可以所需的间隔例如每日或每周，以离散单位剂量递送。
剂量和间隔可单独调整，以对所治疗的具体临床适应症提供有效的给予化合物的水平。这提供了一种与个体疾病状态的严重性相称的治疗方案。
利用本文提供的教导，可设计有效的预防性或治疗性治疗方案，其不引起显著毒性而且还完全有效地治疗特定患者显示的临床症状。该设计应包括通过考虑例如化合物效能、相对的生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重性、优选的给药方式和所选药剂的毒性概况等因素而谨慎选择活性化合物。
本发明的工程改造多肽令人惊讶的剂量节省性质，以及它们令人惊讶的长血浆半寿期和药理学作用持续时间，提供了优良的药剂。在含毒蜥外泌肽的工程改造多肽的情况下还令人惊讶的是它们的口服利用度。包括剂量节省的优良性质允许较低剂量(由此较少或较不严重的副作用和改进的制品成本)和/或更成本有效和更简单的每天一次或每周一次给予的制剂，这通过单独的母体化合物目前是无法实现的。
C. 毒性
特定化合物的毒性与治疗效果的比率是其治疗指数，可表示为LD50 (在50%的群体中致死的化合物的量)与ED50 (在50%的群体中有效的化合物的量)的比率。优选显示高治疗指数的化合物。自细胞培养测定和/或动物研究获得的治疗指数数据可用于配制人类中使用的剂量范围。所述化合物的剂量优选在包括几乎没有或没有毒性的ED50的血浆浓度范围内。在该范围内剂量可根据所用剂型和所用给药途径而变化。参见例如Fingl等,In: ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.l, 1975。准确的制剂、给药途径和剂量可由单独的医师根据患者的病况和使用化合物的具体方法来选择。
不希望受任何理论所束缚，认为ABD白蛋白结合结构域与本文所述的激素结构域的融合可提供减少的免疫原性，其通过相对于没有ABD融合的激素结构域在免疫反应上的降低来判断。参见例如，WO 2009/016043，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
示例性的HD1、接头和ABD序列包括：
HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:1)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:2)；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:3)；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:4)；
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO:5)；
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:6)；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO:7)；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:8)；
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO:9)；
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO:10)；
KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO:11)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN (SEQ ID NO:12)；
HHHHHH (SEQ ID NO:49)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:111)；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO:112)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO:113)；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:114)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK (SEQ ID NO:115)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:116)；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO:117)；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO:118)；
GGGG (SEQ ID NO:125)；
GGGGG (SEQ ID NO:126)；
[G]nE (SEQ ID NO:127)，其中n为1-6；
[G]nK (SEQ ID NO:128)，其中n为1-6；
[G]nD (SEQ ID NO:129)，其中n为1-6；
[G]nR (SEQ ID NO:130)，其中n为1-6；
GGGKGGGG(SEQ ID NO:131)；
GGGNGSGG (SEQ ID NO:132)；
GGGCGGGG (SEQ ID NO:133)；
GPNGG (SEQ ID NO:134)；
[GS]n (SEQ ID NO:135)，其中n为1-6；
[GGS]n (SEQ ID NO:136)，其中n为1-6；
[GGGS]n (SEQ ID NO:137)，其中n为1-6；
[GGGGS]n (SEQ ID NO:138)，其中n为1-6；
[GE]n (SEQ ID NO:139)，其中n为1-10；
[GGE]n (SEQ ID NO:140)，其中n为1-10；
[GGGE]n (SEQ ID NO:141)，其中n为1-10；
[GGGGE]n (SEQ ID NO:142)，其中n为1-10；
[GD]n (SEQ ID NO:143)，其中n为1-10；
[GGD]n (SEQ ID NO:144)，其中n为1-10；
[GGGD]n (SEQ ID NO:145)，其中n为1-10；
[GGGGD]n (SEQ ID NO:146)，其中n为1-10；
[GK]n (SEQ ID NO:147)，其中n为1-10；
[GGK]n (SEQ ID NO:148)，其中n为1-10；
[GGGK]n (SEQ ID NO:149)，其中n为1-10；
[GGGGK]n (SEQ ID NO:150)，其中n为1-10；
[GR]n (SEQ ID NO:151)，其中n为1-10；
[GGR]n (SEQ ID NO:152)，其中n为1-10；
[GGGR]n (SEQ ID NO:153)，其中n为1-10；
[GGGGR]n (SEQ ID NO:154)，其中n为1-10；
[EAAAK]n (SEQ ID NO:155)，其中n为1-10；
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)，
其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X14选自A、S、C和K；X10选自A、S和R；X26选自D和E；X39选自D和E；X40选自A和E；X43选自A和K；X44选自A、S和E；第45位的亮氨酸为存在或不存在的；和第46位的脯氨酸为存在或不存在的；
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQID NO: 678)
其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X10选自A、S和R；和X14选自A、S、C和K；第45位的亮氨酸为存在或不存在的；和第46位的脯氨酸为存在或不存在的；和
参见表1、表2、表3和图1。
本文所述的包含毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物或其活性片段的工程改造的多肽、其使用方法和药物组合物的示例性实施方案包括：
实施方案1. 工程改造的多肽，包含：白蛋白结合结构域多肽(ABD)序列和选自毒蜥外泌肽序列、毒蜥外泌肽类似物序列或其活性片段序列的第一肽激素结构域(HD1)序列。
实施方案2. 实施方案1的工程改造的多肽，还包含将所述HD1序列和所述ABD序列共价连接的第一接头(L1)。
3. 实施方案1或2的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含所述ABD序列作为C-端部分和所述HD1序列作为N-端部分
4. 实施方案3的工程改造的多肽，包含结构：HD1-ABD。
5. 实施方案3的工程改造的多肽，包含结构：HD1-L1-ABD。
6. 实施方案1-5中任一项的工程改造的多肽，其中所述HD1序列是所述毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物序列。
7. 实施方案6的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽序列是毒蜥外泌肽-4序列，并且毒蜥外泌肽类似物序列是Leu14毒蜥外泌肽-4序列。
8. 实施方案6的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽片段序列是毒蜥外泌肽-4(1-28)、毒蜥外泌肽-4 (1-29)、毒蜥外泌肽-4 (1-30)、毒蜥外泌肽-4 (1-31)或毒蜥外泌肽-4 (1-32)的序列。
9. 实施方案6的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物序列选自以下序列：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:3)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:4)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:2)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:111)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO:112)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO:113)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:114)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK (SEQ ID NO:115)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:116)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO:117)和HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO:118)。
10. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物包含在对应His1的位置上的修饰，所述修饰选自：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、N-α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙酰基、脱氨基-组氨酰基(咪唑并丙酰基)、β-羟基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-组氨酰基和β-羧基-咪唑并丙酰基。
11. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述类似物包括在对应His1的位置上包含修饰的毒蜥外泌肽-4，并且所述类似物选自(4-咪唑并乙酰基)毒蜥外泌肽-4、(脱氨基-组氨酰基)毒蜥外泌肽-4 (或(咪唑并丙酰基)毒蜥外泌肽-4)、(β-羟基-咪唑并丙酰基)毒蜥外泌肽-4、(N-二甲基-组氨酰基)毒蜥外泌肽-4和(β-羧基-咪唑并丙酰基)毒蜥外泌肽-4。
12. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽类似物序列与毒蜥外泌肽-4、实施方案9的毒蜥外泌肽类似物或实施方案8的毒蜥外泌肽片段具有至少70%的氨基酸序列同一性。
13. 实施方案1-12中任一个的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽类似物与毒蜥外泌肽-4、实施方案9的毒蜥外泌肽类似物或实施方案8的毒蜥外泌肽片段具有至少80%的同一性。
14. 前述实施方案的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽类似物与毒蜥外泌肽-4、实施方案9的毒蜥外泌肽类似物或实施方案8的毒蜥外泌肽片段具有至少90%的同一性。
15. 前述实施方案的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽类似物与毒蜥外泌肽-4、实施方案9的毒蜥外泌肽类似物或实施方案8的毒蜥外泌肽片段具有至少95%的同一性。
16. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽类似物序列具有1-5个氨基酸修饰，所述修饰独立选自插入、缺失、添加和取代中的任何一种或组合。
实施方案17. 前述实施方案中任一项的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：式(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14YGVSDFYKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)，其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X14选自A、S、C和K；X10选自A、S和R；X26选自D和E；X39选自D和E；X40选自A和E；X43选自A和K；X44选自A、S和E；第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和式(ii) 与(i)所定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，条件是X7不是L、E或D；或者备选地，条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A XcXd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQID NO: 679)，其中彼此独立地，Xa选自V和E；Xb选自L、E和D；Xc选自N、L和I；Xd选自R和K；Xe选自D和K；和X5选自Y和F；X8选自N、R和S；X9选自V、I、L、M、F和Y；X11选自N、S、E和D；X12选自R、K和N；X14选自K和R；X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；X23选自K、I和T；X24选自A、S、T、G、H、L和D；和X25选自H、E和D。
18. 实施方案17的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨基酸序列：式(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)，其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X14选自A、S、C和K；X10选自A、S和R；X26选自D和E；X39选自D和E；X40选自A和E；X43选自A和K；X44选自A、S和E；第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯氨酸是存在或不存在的。
19. 实施方案17的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括式(ii)的氨基酸序列，式(ii)与(i)中定义的序列具有至少95%同一性，条件是X7不是L、E或D；或者备选地，条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此独立地，Xa选自V和E；Xb选自L、E和D；Xc选自N、L和I；Xd选自R和K；Xe选自D和K；和X5选自Y和F；X8选自N、R和S；X9选自V、I、L、M、F和Y；X11选自N、S、E和D；X12选自R、K和N；X14选自K和R；X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；X23选自K、I和T；X24选自A、S、T、G、H、L和D；和X25选自H、E和D。
20. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含选自包括以下的氨基酸序列的氨基酸序列：式(iii) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP (SEQ ID NO: 678)，其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X10选自A、S和R；X14选自A、S、C和K；第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和式(iv) 与(iii)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，条件是X7不是L、E或D；或者备选地，条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd ELXe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO:679)，其中彼此独立地，Xa选自V和E；Xb选自L、E和D；Xc选自N、L和I；Xd选自R和K；Xe选自D和K；和X5选自Y和F；X8选自N、R和S；X9选自V、I、L、M、F和Y；X11选自N、S、E和D；X12选自R、K和N；X14选自K和R；X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；X23选自K、I和T；X24选自A、S、T、G、H、L和D；和X25选自H、E和D。
21. 实施方案20的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨基酸序列：式(iii) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP(SEQ ID NO: 678)，其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X10选自A、S和R；X14选自A、S、C和K；第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯氨酸是存在或不存在的。
22. 实施方案20的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨基酸序列：式(iv) 与(iii)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，条件是X7不是L、E或D；或者备选地，条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGVX20 AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此独立地，Xa选自V和E；Xb选自L、E和D；Xc选自N、L和I；Xd选自R和K；Xe选自D和K；和X5选自Y和F；X8选自N、R和S；X9选自V、I、L、M、F和Y；X11选自N、S、E和D；X12选自R、K和N；X14选自K和R；X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；X23选自K、I和T；X24选自A、S、T、G、H、L和D；和X25选自H、E和D。
23. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X6为S。
24. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X6为E。
25. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X3为S。
26. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X3为E。
27. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X3为Q。
28. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X7为A。
29. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X7为S。
30. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X10为A。
31. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X10为S。
32. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X10为R。
33. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X14为S。
34. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X14为C。
35. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X14为K。
36. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X14为A。
37. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X26为D。
38. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X26为E。
39. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X39为D。
40. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X39为E。
41. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X40为A。
42. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X40为E。
43. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X43为A。
44. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X43为K。
45. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X44为A。
46. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X44为S。
47. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X44为E。
48. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中第45位的亮氨酸是存在的。
49. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中第45位的亮氨酸是不存在的。
50. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中第46位的脯氨酸是存在的。
51. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中第46位的脯氨酸是不存在的。
52. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-5 s-1。
53. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-6 s-1。
54. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD序列选自本文所公开的或来自表1的或来自图1的或SEQ ID NO: 301-444的ABD序列中的任一个。
55. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD序列选自以下氨基酸序列：所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:304-305、SEQ ID NO:307-308、SEQ ID NO:310-311、SEQ ID NO:313-314、SEQ ID NO:316-317、SEQ ID NO:319-320、SEQ ID NO:322-323、SEQ ID NO:325-326、SEQ ID NO:328-329、SEQ ID NO:331-332、SEQ ID NO:334-335、SEQID NO:337-338、SEQ ID NO:341-342和SEQ ID NO:349-350中的任一个。
56. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含选自来自表1或图1的序列中任一个的氨基酸序列的序列。
57. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD序列还包含一个或多个另外的氨基酸残基，其位于式(i)或(iii)中定义的序列的N-端和/或C-端。
58. 前述实施方案的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD序列的N-端的丝氨酸残基。
59. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD序列的N-端的甘氨酸残基。
60. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD序列的N-端的谷氨酸残基或半胱氨酸残基。
61. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD序列的N-端的丙氨酸残基。
62. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD序列的C-端的甘氨酸残基。
63. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD序列的C-端的半胱氨酸残基。
64. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含选自SEQ IDNO:445-450和SEQ ID NO:462-463中任一个的氨基酸序列。
65. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含不超过两个半胱氨酸残基。
66. 前述实施方案的工程改造的多肽，其中所述ABD包含不超过一个半胱氨酸残基。
67. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽序列或毒蜥外泌肽类似物序列或其片段与所述ABD序列经由所述多肽的第X14位半胱氨酸残基的硫醇基缀合。
68. 实施方案18的工程改造的多肽，其中所述ABD为GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 463)或GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 700)。
69. 实施方案18的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含选自以下的肽序列中的任一个：来自表1、图1或本文任一个表的序列。
70. 实施方案1-69中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包括与式i)或iii)的ABD、或与表1、图1或本文任一个表的ABD中的任一个具有至少95%同一性的ABD类似物。
71. 实施方案1-70中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1是1-30个氨基酸或少于30个氨基酸的肽。
72. 实施方案1-71中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1选自20个天然存在的氨基酸。
73. 实施方案1-72中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含非天然氨基酸，所述非天然氨基酸通过化学合成、翻译后化学修饰掺入或者通过宿主细胞中的重组表达在体内掺入。
74. 实施方案1-73中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。
75. 实施方案1-74中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1氨基酸为甘氨酸。
76. 实施方案1-74中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含的大多数氨基酸是无空间位阻的。
77. 实施方案1-76中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包括多聚甘氨酸、多聚丙氨酸、多聚(Gly-Ala)或多聚(Gly-Ser)。
78. 实施方案1-77中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包括序列(Gly)3、(Gly)4 (SEQ ID NO: 125)、或(Gly)5 (SEQ ID NO: 126)、(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ IDNO: 131)；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 132)；(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO:133)；GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 134)、GG、GGG、GGS或GGGS (SEQ ID NO: 192)。
79. 实施方案1-74中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ala的组合。
80. 实施方案1-74中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ser的组合。
81. 实施方案1-80中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1选自富含甘氨酸的肽。
82. 实施方案1-81中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含N-端TG二肽。
83. 实施方案1-82中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含C-端AS二肽。
84. 实施方案1-83中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含N-端TG二肽和C-端AS二肽。
85. 实施方案1-84中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1选自TG-(GGGS)1(SEQ ID NO: 848)、TG-(GGGS)2 (SEQ ID NO: 849)、TG-(GGGS)3 (SEQ ID NO: 850)、TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO: 851)、TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 852)、(GGGS)1-AS (SEQ ID NO:853)、(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 854)、(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 855)、(GGGS)4-AS (SEQID NO: 856)、(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 857)、TG-(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 195)、TG-(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 858)、TG-(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 859)、TG-(GGGS)4-AS (SEQID NO: 860)和TG-(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 861)。
86. 实施方案1-85中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1 TG和/或AS是不存在的或被选自T、A、S和G的一对氨基酸置换。
87. 实施方案1-86中任一个的工程改造的多肽，其对血清白蛋白具有小于约10-6mol/L解离常数的亲和力。
88. 实施方案87的工程改造的多肽，其对血清白蛋白具有小于约10-9 mol/L解离常数的亲和力。
89. 实施方案88的工程改造的多肽，其对血清白蛋白具有小于约10-12 mol/L解离常数的亲和力。
90. 实施方案1-89中任一个的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少1天的作用持续时间。
91. 实施方案90的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少3天的作用持续时间。
92. 实施方案91的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少6天的作用持续时间。
93. 实施方案92的工程改造的多肽，其中所述多肽在人受试者中具有至少6天的作用持续时间。
94. 实施方案91的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少7天的作用持续时间。
95. 实施方案92的工程改造的多肽，其中所述多肽在人受试者中具有至少7天的作用持续时间。
96. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽选自本文表2或表3的序列中的任一个。
97. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽选自：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 727)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 728)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 729)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 730)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 731)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 732)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 733)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 734)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 735)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 736)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 737)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 738)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 739)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 740)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 741)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 742)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 743)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 744)和HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 745)。
98. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽选自：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 727)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 728)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 729)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 730)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 731)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 732)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 733)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 734)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 735)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 737)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 738)和HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 739)。
99. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包括Cmpd 5、Cmpd 9或Cmpd 11。
100. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中工程改造的多肽与所述工程改造的多肽具有至少95%的序列同一性。
101. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中工程改造的多肽与所述工程改造的多肽具有至少98%的序列同一性。
102. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，与将毒蜥外泌肽给予哺乳动物后诱发的免疫反应相比，将所述工程改造的多肽给予哺乳动物后不诱发免疫反应或诱发降低的免疫反应，所述毒蜥外泌肽没有连接到所述ABD或者连接到如本文所述在PCT公布申请号WO 2009/016043中所描述的未经修饰以降低免疫原性的ABD。
103. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其用作药物。
104. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有适于每日给予两次的血浆半寿期。
105. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有适于每日给予一次的血浆半寿期。
106. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有适于每周给予两次的血浆半寿期。
107. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有适于每周给予一次的血浆半寿期。
108. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少40小时的血浆半寿期。
109. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少60小时的血浆半寿期。
110. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少72小时的血浆半寿期。
111. 包含前述实施方案中任一个的工程改造的多肽和药学上可接受的赋形剂的组合物。
112. 实施方案111的组合物，其是水性的。
113. 实施方案111的组合物，其是固体。
114. 前述实施方案中任一个的组合物，其用作药物。
115. 前述实施方案中任一个的组合物，其中所述工程改造的多肽是冻干固体。
116. 前述实施方案中任一个的组合物，其还包含人血清白蛋白。
117. 包含前述实施方案中任一个的工程改造的多肽的药物组合物。
118. 实施方案117的药物组合物，其包含所述工程改造的多肽和药学上可接受的赋形剂。
119. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其是水性的。
120. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其是固体。
121. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其用作药物。
122. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述工程改造的多肽是冻干固体。
123. 前述实施方案中任一个的药物组合物，还包含人血清白蛋白。
124. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是用于肌内、静脉内、皮下、皮内、关节内、鞘内、粘膜、口服、鼻、舌下、肺或含服递送的药物组合物。
125. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是用于皮下递送的药物组合物。
126. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是用于通过注射递送的药物组合物。
127. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是用于口服递送的药物组合物。
128. 实施方案127的药物组合物，其中所述药物组合物是用于口服递送的药物组合物，并且包括固体形式。
129. 实施方案128的药物组合物，其中所述药物组合物是用于口服递送的药物组合物，并且包括片剂、颗粒剂、微粒剂或胶囊剂。
130. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是持续释放的或长效的药物组合物。
131. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是每日给予两次的药物组合物。
132. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是每日给予一次的药物组合物。
133. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是每周给予两次的药物组合物。
134. 前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是每周一次的药物组合物。
135. 前述实施方案中任一个的药物组合物，其用于治疗需要所述治疗的受试者的疾病或病症。
136. 实施方案135的药物组合物，其中所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、阿尔茨海默氏病、帕金森病、脂肪肝病、血脂障碍、冠心病、中风、短肠综合征(SBS)、高血脂、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、无症状性低血糖(HU)、包括结节病的限制性肺病或代谢综合征X。
137. 实施方案136的药物组合物，其中所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、SBS或帕金森病。
138. 实施方案137的药物组合物，其中所述糖尿病是I型糖尿病、II型糖尿病、前驱糖尿病、妊娠糖尿病、HIV治疗诱导的糖尿病、类固醇诱导的糖尿病或成人中潜在的自身免疫糖尿病(LADA)。
139. 实施方案1-138中任一个的工程改造的多肽或药物组合物，其中所述工程改造的多肽规定一周给予一次。
140. 用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，包括将前述实施方案中任一个的工程改造的多肽以有效治疗所述疾病或病症的量给予对其有需要的受试者。
141. 实施方案140的方法，其中所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、阿尔茨海默氏病、帕金森病、脂肪肝病、血脂障碍、冠心病、中风、短肠综合征(SBS)、高血脂、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、无症状性低血糖(HU)、包括结节病的限制性肺病或代谢综合征X。
142. 实施方案140的方法，其中所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、阿尔茨海默氏病、脂肪肝病、血脂障碍、冠心病、中风、SBS、高血脂或帕金森病。
143. 实施方案142的方法，其中所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、SBS或帕金森病。
144. 实施方案143的方法，其中所述疾病或病症是I型糖尿病、II型糖尿病或前驱糖尿病。
145. 实施方案142的方法，其中所述疾病或病症是II型糖尿病。
146. 实施方案142的方法，其中所述疾病或病症是血脂障碍或高血脂。
147. 编码前述实施方案中任一个的工程改造的多肽的多核苷酸。
148. 包含实施方案147的多核苷酸的表达载体。
149. 包含实施方案148的表达载体的宿主细胞。
150. 制备前述实施方案中任一个的工程改造的多肽的方法，包括表达编码所述工程改造的多肽的多核苷酸。
151. 使用氨基酸和/或具有受保护反应性侧链的氨基酸衍生物，通过非生物学肽合成制备前述实施方案中任一个的工程改造的多肽的方法，所述非生物学肽合成包括：分步偶联氨基酸和/或氨基酸衍生物，以形成具有受保护反应性侧链的前述实施方案中任一个的多肽，从多肽的反应性侧链上除去保护基，并将得到的多肽在水性溶液中折叠。
152. 制备前述实施方案中任一个的工程改造的多肽的方法，包括：制备毒蜥外泌肽，制备ABD，并将所制备的ABD与所制备的毒蜥外泌肽缀合。
VII. 实施例
提供实施例1-5以尤其阐明本文所述的ABD的优良性质，例如与先前的ABD相比减少免疫原性的性质。
实施例1：白蛋白结合多肽的克隆、表达、纯化和表征。
在该实施例中，克隆、纯化和表征了8种不同的白蛋白结合多肽，PEP07913 (SEQID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968 (即，与PEP07911缀合的DOTA, SEQ ID NO:459)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ IDNO:455)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)，其氨基酸序列列于图1中。
材料与方法
白蛋白结合多肽变体的克隆
用适当的寡核苷酸，使用定向诱变产生G148-GA3的突变，以获得所需的白蛋白结合多肽变体。通过PCR用引物扩增基因片段，在白蛋白结合多肽变体的前面添加特定的内切酶位点以及N-端MGSS序列(SEQ ID NO: 844)。用NdeI和NotI切割片段，纯化并连接至用相同酶限制的克隆载体，质粒pAY02556(含有来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因和用于表达目标基因的T7启动子)。将连接体转化至电感受态大肠杆菌TOP10细胞。将转化细胞铺板于补充有50 μg/ml卡那霉素的TBAB平板(30 g/l胰蛋白胨血琼脂基质)，然后在37℃下孵育过夜。使用PCR筛选菌落，使用生物素化的寡核苷酸和按厂商手册使用的BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)将扩增的片段测序。通过使用Magnatrix 8000 (NorDiag AB)结合到链霉抗生物素包被的磁珠上来纯化测序反应物，并在ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems)上分析。将所有的白蛋白结合多肽变体作为单体进行亚克隆，通过表达载体编码的构建体为MGSS-[PP###](如SEQ ID NO: 844公开的“MGSS”)，其中PP###对应于构成白蛋白结合多肽序列的46个氨基酸残基。
此外，G148-GA3、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313) 和PP037(SEQ ID NO:337)的基因片段通过PCR用引物扩增，在构成白蛋白结合多肽序列的46个氨基酸残基之前添加特定的内切酶位点以及六组氨酸序列(SEQ ID NO: 49)、TEV蛋白酶位点和甘氨酸残基。多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914(SEQ ID NO:458)和PEP07968 (SEQ ID NO:459)对应于添加有甘氨酸残基的白蛋白结合多肽G148-GA3、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)和PP037 (SEQ ID NO:337)。将片段用XbaI和NotI切割，纯化并连接至用相同酶限制的克隆载体，质粒pAY02512(含有pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因和用于表达目标基因的T7启动子。克隆位点前面是编码含有六组氨酸标签(SEQ ID NO: 49)的肽序列，该序列之后是TEV蛋白酶的切割位点)。连接、转化和序列鉴定按上述进行。将4个白蛋白结合多肽变体G148-GA3、PP007、PP013和PP037 作为单体进行亚克隆，通过表达载体编码的构建体为MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###]，其中MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG为SEQ IDNO:600，并且“PP###”表示本文所述的ABD序列。
蛋白质表达
在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达白蛋白结合多肽变体，其具有N-端MGSS-延伸(如SEQ ID NO: 844公开的“MGSS”)或具有N-端His6-标签(SEQ ID NO: 49)，其后是TEV蛋白酶识别位点和甘氨酸残基。每个白蛋白结合多肽变体的菌落用于接种添加有卡那霉素至浓度为50 μg/ml的4 ml TSB+YE培养基。在37℃下生长培养物约5小时。3 ml各培养物用于接种平行的生物反应器(Greta system, Belach Bioteknik AB)中添加有卡那霉素至浓度为50μg/ml的800 ml TSB+YE。以800 ml/分钟通气，搅拌概况为保持溶解氧水平大于30%，将培养在37℃下进行至OD600为2，之后添加IPTG至终浓度为0.5 mM。继续培养5小时，之后将培养物冷却至10℃，停止通气并将搅拌降低至300 rpm。通过离心(15600 × g，4℃，20分钟)收获细胞沉淀，并储存于-20℃直至纯化。
具有His6-标签(SEQ ID NO: 49)和TEV蛋白酶位点的白蛋白结合多肽的纯化。
将包含带可溶性六组氨酸-标签的多肽(“六组氨酸”如SEQ ID NO: 49所公开)PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (SEQ ID NO:459)的冷冻细胞沉淀悬浮于添加有1000 U Benzonase®(1.01654.001, Merck)的35 ml结合缓冲液(20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、20 mM咪唑，pH7.4)中，并通过超声处理破裂。对于各个多肽，通过离心(1 h，37000 × g，4℃)使超声处理的悬浮液澄清，并将上清液装载到His GraviTrapTM柱(11-0033-99, GE Healthcare)上。用10 ml洗涤缓冲液(20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、60 mM咪唑，pH 7.4)洗涤柱，之后用3 ml洗脱缓冲液(20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、0.5 M咪唑，pH 7.4)洗脱多肽。使用PD-10脱盐柱(17-0851-01, GE Healthcare)将缓冲液更换成切割缓冲液(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH8)。通过测量280 nm处的吸光度来确定多肽产物的量，之后加入DTT至终浓度为5 mM。将带His6-标签的TEV蛋白酶(“His6”如SEQ ID NO: 49所公开)以相对于多肽产物为1:10的质量比添加至切割缓冲液中。切割于4℃在缓慢混合下进行过夜。添加咪唑至切割混合物中至浓度为20 mM，之后将混合物装载到His GraviTrapTM柱(11-0033-99, GE Healthcare)，以除去切下来的His6-标签(SEQ ID NO: 49)、带His6-标签的TEV蛋白酶(“His6”如SEQ ID NO:49所公开)和带His6-标签的未切割产物(“His6”如SEQ ID NO: 49所公开)。
对于每个变体，包含白蛋白结合多肽变体的穿流液进一步通过反相色谱(RPC)纯化，如下。将穿流液流分装载到预先用RPC A缓冲液(含0.1% TFA的水)平衡的1 mlResource 15 RPC柱(GE Healthcare)上。用10柱体积(CV)的RPC A缓冲液进行柱洗涤后，用0-50% RPC B缓冲液(含0.1% TFA的乙腈)的线性梯度在10 CV期间洗脱结合的多肽。流速为2 ml/min，监测280 nm处的吸光度。含有白蛋白结合多肽变体的流分通过SDS-PAGE分析鉴定并合并。
RPC纯化的白蛋白结合多肽变体通过填塞在XK16柱(GE Healthcare)中的120 mlSuperdex 75 (GE Healthcare)上的凝胶过滤进一步纯化。运行缓冲液是1xPBS，流速是2ml/min。合并含有纯的白蛋白结合多肽变体的流分并浓缩至约1.3 mg/ml。最终，按照厂商建议，通过使用AffinityPak Detoxi-Gel Endotoxin去除凝胶(Pierce, prod#20344)的1ml柱纯化浓缩物以除去痕量的残余内毒素。
将白蛋白结合多肽变体PEP07911与Mal-DOTA 缀合，之后进行RPC纯化步骤，如下。使用一次性的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)，将IMAC-FT纯化步骤的穿流液流分的缓冲液更换为0.2 M NaAc，pH 5.5。以5倍摩尔过量添加马来酰亚胺-单-酰胺-DOTA(Macrocyclics, 目录号B-272)，并在30℃持续摇动下孵育60分钟。得到的多肽表示为PEP07968。
不含His6-标签(SEQ ID NO: 49)的白蛋白结合多肽变体的纯化。
将包含可溶性白蛋白结合多肽变体PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQID NO:455)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)的冷冻细胞沉淀悬浮于20 mM Tris-HCl，pH 8中，并通过超声处理破裂。对于每个多肽变体，通过离心(30min，32000 × g，4℃)使超声处理的悬浮液澄清，并将上清液装载到HSA-Sepharose柱(GEHealthcare)上。在用TST缓冲液(25 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、200 mM NaCl、0.05% Tween20，pH 8.0)洗涤并接着用5 mM NH4Ac，pH 5.5洗涤后，用0.5 M HAc，pH 3.2洗脱结合的白蛋白结合多肽变体。
通过反相色谱(RPC)进一步纯化白蛋白结合多肽变体，如下。对于每个变体，将HSA-亲和纯化步骤的洗出液装载到预先用RPC A缓冲液(含0.1% TFA的水)平衡的1 mlResource 15 RPC柱(GE Healthcare)上。在用10 CV RPC A缓冲液进行柱洗涤后，用0-50 %RPC B缓冲液(含0.1% TFA的乙腈)的线性梯度在10 CV期间洗脱结合的多肽。流速为2 ml/min，监测280 nm处的吸光度。含有纯的白蛋白结合多肽变体的流分通过SDS-PAGE分析鉴定并合并。最终，使用一次性PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲液更换为1xPBS (2.68 mMKCl、137 mM NaCl、1.47 mM KH2PO4、8.1 mM Na2HPO4，pH 7.4)。
纯化的白蛋白结合多肽变体的表征
使用NanoDrop® ND-1000分光光度计通过测量280 nm处的吸光度估算浓度。用SDS-PAGE和LC-MS进一步分析蛋白质。
对于SDS-PAGE分析，将约10 μg的各个白蛋白结合多肽变体与 NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，在70℃下孵育15分钟，并装载到NuPAGE 4-12 % Bis-Tris凝胶(Invitrogen)。在XCell II SureLock Electrophoresis Cell (Novex)上用NuPAGE MESSDS运行缓冲液(Invitrogen)运行凝胶，使用Sharp Prestained Standard (Invitrogen)作为分子量标记，并使用PhastGel BlueR (GE Healthcare)染色。
为证实白蛋白结合多肽变体的身份，使用装配有API-ESI和单一的四级质量分析仪的Agilent 1100 LC/MSD系统进行LC/MS分析。将约10 μg的各个纯化的白蛋白结合多肽变体以0.5 ml/min的流速装载到Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore柱(2.1 x 150 mm，3.5 µm，Agilent Technologies)上。使用10-70%溶液B的线性梯度以0.5 ml/min洗脱多肽15分钟。分离在30℃下进行。监测离子信号和280 nm及220 nm处的吸光度。通过MS确认纯化的白蛋白结合多肽变体的分子量。
结果
按SDS-PAGE分析估计，白蛋白结合多肽变体的表达水平为10-30 mg产物/g细胞沉淀。
对于所有的变体，按SDS-PAGE分析测定的纯度超过95%，且LC/MS分析证实了正确的分子量。纯化后，对8个白蛋白结合多肽变体中的每一个，获得1-8 mg的纯多肽。
实施例2：白蛋白结合多肽的亲和力测定
在该实施例中，使用Biacore仪器，表征了在实施例1中合成或表达和纯化的PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07844 (SEQ ID NO:461)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (即与PEP07911缀合的DOTA，SEQ ID NO:459)对人血清白蛋白(HSA)的亲和力。PEP07913对应于添加有N-端甘氨酸残基的G148-GA3的氨基酸序列，而PEP07271、PEP07844、PEP07912、PEP07914和PEP07968对应于具有不同N-端氨基酸添加的白蛋白结合多肽PP001(SEQ ID NO:301)、PP043 (SEQ ID NO:343)、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)和PP037 (SEQ ID NO:337)。
材料与方法
使用HSA (Albucult®, Novozyme)在Biacore2000仪器(GE Healthcare)上进行生物传感器分析，按照厂商建议，通过胺偶联将HSA固定到CM-5芯片(研究级；Biacore)表面的羧化葡聚糖层上。将芯片的表面1活化和失活并在注入期间用作参照池(空白表面)，而表面2包含固定至731共振单位(RU)的HSA，表面4包含固定至955 RU的HSA。将纯化的白蛋白结合多肽变体在运行缓冲液HBS-EP (GE Healthcare)中稀释至2.5 nM、10 nM和40 nM，并以50 μl/min的恒定流速注入5分钟，然后注入HBS-EP 60分钟。用一次注入25 μl HCl，10 mM使表面再生。以两组进行亲和力测量；第一组中注入(芯片表面2)HBS-EP、PEP06923、PEP07271、PEP07912、PEP07913、PEP07914 和PEP07968，第二组中注入(芯片表面4)HBS-EP、PEP06923、PEP07844、PEP07912和PEP07914。在每次运行中注入PEP06923两次作为对照。用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)分析结果。从配体表面的曲线扣除空白表面的曲线。
结果
Biacore 2000仪器具有技术上的局限，阻碍了极高亲和力的测量。因此，Biacore研究的目的不是测定白蛋白结合多肽变体对HSA的亲和力的精确动力学参数。然而，结果提供了定量评估这些多肽对白蛋白的相对亲和力。扣除参考表面和缓冲液注入之后，使用具有质量传递修正和具有设置为局部参数的RUmax的BIAevaluation软件，将曲线拟合至1:1(Langmuir)结合模型。曲线显示于图2中。估算了相对KD、ka (kon)和kd (koff)值并显示于下表中。
如表5和表6所示，PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07844 (SEQ ID NO:461)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458) 和PEP07968 (与DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)都似乎对HSA具有大致相同的亲和力，大大超过了母体G148-GA3(PEP07913；SEQ ID NO:453)的亲和力。尽管类似的解离速率，但这些多肽的HSA亲和力略微低于PEP06923 (SEQ ID NO:454)。
实施例3：白蛋白结合多肽的变性温度(Tm)的测定
在该实施例中，将按实施例1中所述表达和纯化的白蛋白结合多肽变体PEP07913(SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07554(SEQ ID NO:456)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968(与DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)，以及白蛋白多肽变体PEP07975 (即，DOTA缀合的PEP07834，SEQ ID NO:460，通过Cys14与马来酰亚胺-单-酰胺-DOTA (Macrocyclics, 目录号B-272)通过CD分析法进行分析。PEP07913对应于具有N-端甘氨酸残基的G148-GA3的序列，PEP06923为先前由Jonsson等(上述)描述的工程改造的高亲和力衍生物，而PEP07271、PEP07554、PEP07912、PEP07914、PEP07968、PEP07844和PEP07975为根据本公开内容具有不同的N-端氨基酸添加的46个氨基酸残基白蛋白结合多肽PP001 (SEQ ID NO:301)、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)、PP037(SEQ ID NO:337)和PP043 (SEQ ID NO:343)的实例。
材料与方法
将纯化的白蛋白结合多肽变体在1xPBS中稀释至终浓度为0.4-0.5 mg/mg。在Jasco J-810分光偏振计上，在具有光学路径长度为1 mm的池内进行圆二色性(CD)分析。在可变温度测量下，从20℃至90℃测量221 nm处的吸光度，温度梯度为5℃/min。
结果
通过测定CD vs.温度曲线中的转换中点来计算不同白蛋白结合多肽变体的解链温度(Tm)。结果总结于下表7中。
表7. 测定所测试的白蛋白结合多肽变体的Tm值
变体 SEQ ID NO:# N-端序列3 Tm (℃)
PEP07913 SEQ ID NO:453 GL 61
PEP06923 SEQ ID NO:454 GSSL 57
PEP07271 SEQ ID NO:455 GSSL 65
PEP07554 SEQ ID NO:456 GSSL 58
PEP07912 SEQ ID NO:457 GL 53
PEP07914 SEQ ID NO:458 GL 59
PEP07968 SEQ ID NO:1591 GL 53
PEP07975 SEQ ID NO:1601, 2 AL 50
PEP07844 SEQ ID NO:461 GSSL 65
1)肽在半胱氨酸处与马来酰亚胺-DOTA缀合
2)肽在C-端被酰胺化
3)亮氨酸(下划线)是如本公开内容的第一方面中定义的白蛋白结合多肽的46个氨基酸序列第1位的残基，表7中的“GSSL”如 SEQ ID NO: 845所公开。
多肽PEP07968与PEP07912相同，除了前者在第14位上具有半胱氨酸残基，其与马来酰亚胺DOTA缀合，而后者为丝氨酸残基。因此，DOTA修饰不应影响解链温度。PEP07975也使用Cys14用DOTA与马来酰亚胺缀合，并且其与PEP07968相同，除了C-端酰胺(产生于肽合成)和具有N-端丙氨酸而不是甘氨酸。此外，将PEP07912与PEP07554进行比较，揭示了N-端丝氨酸比相同位置上的甘氨酸提供更高的解链温度(Tm有5℃差异)。因此，本公开内容的所有白蛋白结合多肽变体显示超过55℃的Tm，除了PEP07912和DOTA缀合的变体。考虑到N-端部分的重要性，所有测试的白蛋白结合多肽优于Jonsson等的衍生物，例如PEP06923。
实施例4：血清反应分析
通过ELISA分析能够结合本文公开的白蛋白结合多肽组的含IgG人血清的百分比。总体上，筛选了对应于127个个体的149份血清样品。
材料与方法
ELISA板(96孔，半面积板(Costar，目录号3690))用50 μl/孔的在包被缓冲液(Sigma，目录号3041)中稀释至8 μl/ml的Albucult® (Novozyme)包被。将板在4℃下包被过夜三天。在分析当天，用自来水洗涤板两次，并用100 μl含0.05%酪蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBSC)封闭2小时。将板倒空，按照预先制造的板布局，加入在PBSC中稀释至2 μg/ml的50 μl/孔的白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968 (DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)。在室温(RT)下孵育2小时后，使用自动ELISA洗涤器在PBSC中洗涤板4次。通过加入24 μl血清至1174 μl PBSC中，将来自129个个体的149份血清样品在PBSC中稀释50倍。按照预先制造的板布局，将50 μl的稀释血清加到每孔中。每份血清样品作为单峰进行测试。在每个板上以及对每种白蛋白结合多肽，包括阳性对照和阴性对照。加入白蛋白结合抗体(内部制备的50 µl，0.5 µl/ml免疫球蛋白溶液，其来自PEP06923免疫的灵长类血清)作为阳性对照，50 μl PBSC用作阴性对照。在RT下将板孵育1小时，随后使用自动ELISA洗涤器在PBSC中洗涤4次。用50 μl/孔的在PBSC中稀释10 000倍的抗人IgG(Southern Biotech，目录号2040-05)检测结合的IgG。使用自动ELISA洗涤器在PBSC中洗涤4次后，加入50 μl/孔的底物(Pierce，目录号34021)。通过加入50 μl H2SO4至每孔10-15分钟后终止反应，随后使用多孔读板器(Victor3, Perkin Elmer)测量吸光度。
结果
对结合白蛋白结合多肽的IgG进行筛选的149份血清中，23份对所有8种多肽是阴性(OD值< 0.1)，即，显示没有IgG结合到多肽。用对一种或多种白蛋白结合多肽为阳性的126份血清进行分析。计算平均吸光度(图3A)和OD值< 0.15 (图3B)或> 1.0 (图3C)的血清百分比。对于PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)和PEP07844 (SEQID NO:461)，获得具有IgG结合的血清的最高平均OD值和最高百分比，而对于PEP07968(DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07954 (SEQ IDNO:456)，发现最低反应性。
因此，最具反应性的白蛋白结合多肽是母体G148-GA3 (PEP07913，SEQ ID NO:453)和先前亲和力改进的衍生物(PEP06923，SEQ ID NO:454)，其具有自G148-GA3上保留的螺旋1。第三个较具反应性的多肽(PEP07844，SEQ ID NO:461)含有螺旋1中第14位上的初始赖氨酸。该残基预期用于缀合，因此在如此使用时不会暴露出来。除了在第14位具有丙氨酸之外相同的白蛋白结合多肽变体(PEP07554，SEQ ID NO:456)是最不具活性的一个。
实施例5：白蛋白结合多肽的免疫原性测试
从52个人类高加索个体(获自CRI-Labo Medische Analyse, Gent, Belgium)中，针对诱导外周血单核细胞(PBMC)的T细胞增殖的能力，筛选PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (即，DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:159)。PEP07913对应于具有N-端甘氨酸残基的G148-GA3的序列，而PEP07912、PEP07914和PEP07968是根据本公开内容具有不同N-端氨基酸添加的46个氨基酸残基白蛋白结合多肽PP007 (SEQ ID NO:7)、PP013 (SEQ ID NO:13)和PP037 (SEQ ID NO:37)的实例。
材料与方法
将按标准细胞生物学方法制备的PBMC以300 000 PBMC/孔的量加入到组织培养物(TC)处理的96孔圆底板(Falcon)中。通过加入100 μl/孔在AIMV培养基(Invitrogen)中的白蛋白结合多肽PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968刺激细胞，所述AIMV培养基另外含有900 μl/ml (3倍摩尔过量)的重组人白蛋白(Albucult®, Novozyme)。这对应于30 µg/ml白蛋白结合多肽的终浓度。一式八份进行刺激，即将相同的白蛋白结合多肽以相同的量和相同的条件下加入到8个孔中。在阳性对照孔中，用30 µg/ml匙孔血蓝蛋白(KLH,Calbiochem)或30 µg/ml破伤风类毒素(TT, Statens Serum Institut)刺激细胞。在阴性对照孔中，仅加入含或不含900 µg/ml白蛋白的AIMV培养基。
培养7天后，使用Alexa Fluor 488 Click-iT EdU流式细胞计数测定试剂盒(Invitrogen)评价细胞增殖。在第6天加入1 μM/孔EdU掺入标记。在第7天，将细胞洗涤，从板上解离，再次洗涤并用抗-CD3-PerCP试剂(Becton Dickinson)和抗-CD4-Alexa647试剂(Becton Dickinson)染色30分钟。染色后，按厂商的方案(Invitrogen)，将细胞洗涤，固定(BD cellfix, BD biosciences)，透化(使用皂苷)和通过加入Click-iT试剂对EdU染色。完成染色后，再次洗涤细胞，并用流式细胞仪(FACSCantoII, BD Biosciences)进行分析。为评价增殖细胞的数量，分析前向每孔加入固定量的fluosphere (Invitrogen)。所有染色程序和洗涤直接在96孔板中进行。
原始FACSCantoII数据对CD3+ CD4+ T细胞进行分级设门，并记录设门细胞的数量以及它们的EdU-Alexa Flour 488掺入标记荧光强度。将增殖细胞的数量的平均值/一式八份的蛋白处理的孔与阳性对照和阴性对照比较，并计算得到的比率，其描述为刺激指数(SI)。基于SI和重复间的差异，刺激和抑制的SI阈值分别设置为2.0和0.5。
结果
使用体外PBMC增殖测定法，在目标人类群体中，在3倍过量重组人白蛋白的存在下，评价白蛋白结合多肽PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968的免疫原性潜力。与白蛋白对照相比，PEP07913诱导52个供体的6个中的CD3+CD4+ T细胞增殖，PEP07912诱导52个供体的5个中的CD3+CD4+ T细胞增殖，PEP07914和PEP07968诱导52个供体的1个中的CD3+CD4+ T细胞增殖(图4A)。
与包含重组人白蛋白的阴性对照相比，对于PEP07914和PEP07968，所有52个供体的平均刺激指数(SI)没有显著差异(分别地，p=0.79和0.48，图4B)。PEP07913的SI显著更高(p=0.002)，而PEP07912的SI较高但不显著(p=0.03，图4B)。
与仅缓冲液相比，反应个体的数量分别为：对PEP07912为10、对PEP07912为7、对PEP07914为2、对PEP07968为1、对重组人白蛋白为2、对两个阳性对照TT和KLH为49和51 (图4C)。按照白蛋白结合多肽的免疫原性，以下列顺序将其分级：PEP07913 > PEP07912 >PEP07914 > PEP07968。PEP07914和PEP07968两者定义为无免疫原性。因此上述结果证实，与阳性对照相比，本公开内容的白蛋白结合多肽的免疫原性潜力低。
实施例6：毒蜥外泌肽类似物-ABD型工程改造多肽的纯化
方法。产生的工程改造多肽具有N-端延伸，其包含本领域已知的His6 (SEQ IDNO:49)“标签”，例如序列MAHHHHHHVGTGSNENLYFQHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 846)，其包含ABD00239而不是本发明的ABD，并产生Cmpd 684，提供了应用于本发明的工程改造多肽的重组合成的实例，其起始于例如类似的表达肽，例如MAHHHHHHVGTGSNENLYFQHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 838)，其产生成熟的工程改造多肽HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO:727) (Cmpd 5)。
细胞提取物的制备。为制备细胞提取物，将来自50 mL细胞培养物的细胞沉淀完全重悬于60 mL裂解缓冲液(50 mM TrisHCl、150 mM NaCl，pH 8.0)中。将重悬的细胞以100PSI通过微流化器(Microfluidics, MA)三次。将细胞提取物以16,000 x g离心30分钟以除去碎片。添加EGTA (150 mM储液)至细胞提取物中至终浓度为3 mM。
Ni-NTA色谱。将10 mL Ni-NTA superflow的50%混悬液填装到15 mL空柱中。用10mL水、50 mL裂解缓冲液和20 mL含3 mM EGTA的裂解缓冲液(50 mM TrisHCl、150 mM NaCl、pH8.0、3 mM EGTA)洗涤柱。将细胞提取物小心加入到Ni-NTA柱的顶端，收集穿流液。用30mL含EGTA的裂解缓冲液(50 mM TrisHCl、150 mM NaCl、pH8.0、3 mM EGTA)洗涤住。将10 mL洗脱缓冲液(25 mM TrisHCl、50 mM NaCl、250 mM咪唑、pH8.0)加到柱顶端，收集洗脱流分(2 mL/流分)。进行SDS-PAGE检查穿流液和各流分。合并含有带His-标签的化合物的流分。
TEV蛋白酶消化。将带His6-标签的化合物(“His6”如SEQ ID NO: 49所公开)用25mM TrisHCl、50 mM NaCl、pH8.0稀释3倍。加入β-巯基乙醇(0.1%)和2%的Turbo TEV蛋白酶(2 mg/mL，10,000单位/mg，Accelagen)，将所得物混合并在RT下孵育2小时，并在4℃下孵育过夜。
用Ni-NTA除去切下的His-标签和Turbo TEV。将6 mL Ni-NTA superflow的50%混悬液填装到15 mL空柱上。用20 mL水和20 mL 50 mM TrisHCl、100 mM NaCl、45 mM咪唑、pH8.0洗涤柱。将TEV消化反应物用50 mM TrisHCl、150 mM NaCl、pH8.0稀释2倍。将稀释的消化反应物小心添加到Ni-NTA柱的顶端，收集穿流液。将10 mL 50 mM TrisHCl、100 mMNaCl、45 mM咪唑、pH8.0加到柱上，以洗脱任何未结合的蛋白。收集穿流液并合并。
第一分子排阻色谱法(SEC)。用0.2 μm过滤器过滤Ni-NTA穿流液。用390 mL PBS预平衡Superdex 75 HiLoad 26/60柱。将过滤的穿流液用样品泵注入到HiLoad 26/60柱上。用1.5 CV PBS洗脱蛋白，合并单体峰。
第二分子排阻色谱法。将第一SEC合并物用0.2 μm过滤器过滤。用390 mL PBS预平衡Superdex 75 HiLoad 26/60柱。将过滤的穿流液用样品泵注入到柱HiLoad 26/60上。用1.5 CV PBS洗脱蛋白，合并单体峰。
第三分子排阻色谱法。将第二SEC合并物用0.2 μm过滤器过滤。用390 mL PBS预平衡Superdex 75 HiLoad 26/60柱。将过滤的穿流液用样品泵注入到柱HiLoad 26/60上。用1.5 CV PBS洗脱蛋白，合并单体峰。
用EndoTrap Red除去残余的内毒素。第三SEC合并物仍含有约20 EU/mg的内毒素，通过使用EndoTrap Red将其除去。简言之，0.5 mL凝胶浆液通过添加1 mL再生缓冲液到浆液中并通过轻轻摇动管约5秒钟来活化。离心并吸出上清液。重复该步骤另外两次。加入1mL平衡缓冲液，通过轻轻摇动管子约5秒钟进行混合。离心并吸出上清液。重复该步骤另外两次。添加蛋白质样品(5.5 mL)至树脂中，在RT下孵育90分钟，孵育时同时轻轻摇动或旋转管。将所得物以1200 x g离心5分钟，将上清液转移到干净的管中。
结果。在所用的条件下，最终纯化的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上迁移为约6 kD蛋白。LC-MS显示正确分子量为9827道尔顿。蛋白产量为3.3 mg (自50 mL细胞培养物)。
实施例7：毒蜥外泌肽-ABD工程改造多肽的活性
本发明的毒蜥外泌肽-ABD工程改造多肽在体外细胞活化测定中保留有足够的毒蜥外泌肽活性。此外，当以单一剂量给予哺乳动物时，与毒蜥外泌肽-4比较，工程改造的多肽对血糖降低和体重减轻提供显著改进的作用持续时间。令人惊讶的是，在啮齿动物模型中，作用持续时间可延长至至少1天、甚至至少4天、甚至至少7天或更长，这可转化为在人类受试者中至少1周的作用持续时间，因此适于每天2次、每天1次、每周3次、每周2次或甚至每周1次给予。
实施例8：白蛋白结合
可通过多种方法对工程改造多肽化合物与白蛋白的结合进行表征，包括本文所述的Biacore。在该实施例中，在25℃下使用GLC传感器芯片，用BioRad ProteOn XPR36系统(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA; ProteOn XPR36 Protein InteractionArray System，目录号176-0100)进行结合测量。对于胺偶联，使用自如下所示的水中原始储液稀释30倍的sulfo-NHS/EDC的1:1混合物活化GLC芯片5分钟。将每种白蛋白样品在10mM乙酸钠pH 5.0中稀释至25 μg/ml，并注入到各个传感器表面上5分钟。然后用1 M乙醇胺pH 8.5封闭每个表面。每种白蛋白以2000-5000共振单位的密度偶联。使用5 nM作为最高浓度以3倍稀释系列检测工程改造多肽的结合。运行缓冲液含有10 mM HEPES pH 7.4、150 mMNaCl、3 mM EDTA和0.005% tween-20。使用3倍稀释系列检测所有样品。每个浓度系列重复检测两次。监测最高浓度的离解相达3小时。
工程改造多肽所测量的相对KD显示于下表8中。结果显示，白蛋白结合多肽与白蛋白以高亲和力结合。括弧中的数字表示最后一位有效数字的标准偏差。如下表所见，甚至与未缀合的ABD PEP07986自身相比，与白蛋白结合结构域ABD00239 (产生多肽Cmpd 684或Cmpd 088)或本发明的ABD (产生本发明的工程改造多肽，例如Cmpd 5)融合的毒蜥外泌肽多肽保留了对各个物种的血清白蛋白极高的亲和力，特别是对人血清白蛋白。甚至与融合先前的ABD00239(代替新的PEP7986)的相同毒蜥外泌肽类似物-接头构建体相比，工程改造多肽保留了高亲和力(比较Cmpd 684和Cmpd 5)。
表8
Cmpd 人SA 狗SA 猴SA 小鼠SA 大鼠SA
ABD00239 16.1(4)pM 201(2)pM 123(1)pM 1.24(1)nM 18.3(5)pM
PEP07986 9.5(2)pM 126(2)pM 84.0(8)pM 160(2)pM 5.7(2)pM
Cmpd 088 84.7(9)pM 397(2)pM 77.5(6)pM 1.332(6)nM 16(1)pM
Cmpd 684 68(1)pM 513(3)pM 90.9(9)pM 1.253(8)nM 200(200)pM
Cmpd 5 160(1)pM 606(4)pM 140(1)pM 300.2(5)pM 12.5(2)pM
Cmpd 11 251 pM 2450 pM 431 pM 1029 pM 51 pM
实施例9：GLP-1受体功能性测定中化合物的活性
可使用表达GLP-1受体的细胞系测定化合物的功能活性。参见例如美国专利申请公布US20110097751A1，对于测定方法通过引用结合。在该实施例中，使用内源性表达GLP-1R的细胞测定功能活性，并且检测cAMP诱导作为毒蜥外泌肽活性的测量。使用HTRF测定试剂盒(Cisbio International (Bedford, Mass.)。该生物测定法在基于细胞的测定中使用了大鼠甲状腺癌6-23 (克隆6)细胞，其利用获自Cisbio目录号62AM4PEB的HTRF® cAMPdynamic 2 1,000测定试剂盒。HTRF®标准品和校准品按试剂盒的说明书制备。使用HTRF(CisBio)基于细胞的cAMP测定试剂盒以384孔模式，在化合物处理30分钟后测量cAMP的积聚。相对于用10 μM毛喉素(腺苷酸环化酶的组成型激活剂)的细胞处理，测定肽的功效，并使用拟合至4参数模型的非线性回归分析，通过分析浓度-反应曲线来测定肽的效能(EC50)。对于效能(EC50)，GLP-1受体功能活性(cAMP诱导)的结果提供于下表9中。
表9 GLP-1R功能活性
描述 GLP-1R功能活性(EC50)/nM
毒蜥外泌肽-4 0.004
[Leu14,Gln28]毒蜥外泌肽-4(1-32)-fGLP-1)33-37)(SEQ IDNO: 4) 0.016
毒蜥外泌肽-4 (1-28)酰胺 0.011
Cmpd 088 0.131
Cmpd 5 0.486
Cmpd 6 0.560
Cmpd 7 0.904
Cmpd 8 0.612
Cmpd 9 3.21
Cmpd 10 0.575
Cmpd 11 1.28
在血清白蛋白的存在下证实了工程改造多肽化合物的体外活性特征。可在白蛋白、特别是人血清白蛋白存在和缺失下进行测定。在约0.1%牛血清白蛋白(BSA)的存在下确定以上数据。下表10显示上述受体活化(cAMP诱导)测定法的功能活性，但是在各个物种的血清白蛋白存在下并以增加的量进行。如可见，令人惊讶的是，甚至当Cmpd 11与血清白蛋白(例如人血清白蛋白)结合时，尽管存在ABD和大的血清白蛋白(其具有空间位阻和因白蛋白结合造成的化合物表观Stoke半径变化的可能性)，工程改造多肽仍保留了GLP-1受体激动剂活性。鉴于ABD和工程改造多肽对某些种类的血清白蛋白(例如人血清白蛋白)的皮摩尔亲和力，认为工程改造多肽有效地与测定中存在的白蛋白充分结合(并因此还在循环血液中体内充分结合)。因为化合物与白蛋白结合的极高亲和力和血液中存在高浓度的血清白蛋白，预期化合物将在体内基本上以结合状态存在，并令人惊讶地提供足够的毒蜥外泌肽功能(如本文所证实)。
表10 不同量的血清白蛋白中的GLP-1R功能活性
实施例10：OGTT DOA (口服葡萄糖耐量试验作用持续时间)体内活性
用指定化合物以25 nmol/Kg剂量给药后1天，研究在口服灌胃(1.5 k/kg葡萄糖)之前和灌胃之后30分钟时降低血糖的效果，结果显示于下表中。将药物给予禁食4小时的NIH/Swiss小鼠。给药后24小时，进行OGTT以评价化合物活性的持续时间。用OneTouch®Ultra® (LifeScan, Inc., a Johnson & Johnson Company, Milpitas, CA)测量血糖。*p<0.05 vs.溶媒对照；ANOVA, Dunnett's检验。在灌胃后30分钟，提供按与溶媒相比百分比降低的葡萄糖降低(负值表示葡萄糖降低)。OGTT DOA显示，给予药物后，药物活性存在至少24小时(给予OGTT之前的一段时间)。结果显示于表11中。毒蜥外泌肽-4 (未与ABD缀合)、Leu14毒蜥外泌肽-4 (未与ABD缀合)和未缀合的ABD EP07986在该测定中当在t-24小时给予时无活性，即使当以更高剂量提供时亦如此。当恰在OGTT之前以30 nmol/kg给予未缀合的毒蜥外泌肽化合物时，毒蜥外泌肽-4和Leu14毒蜥外泌肽-4两者提供自基础-41%的葡萄糖变化。具有通过相对短的接头与ABD融合的C-端截短的毒蜥外泌肽-4 (1-28)的Cmpd 12(HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP；SEQ ID NO:847)在体外对GLP-1受体具有活性，但在该持续时间测定中未显示24小时的持续时间。在该情况下，在该测定中预期增加接头长度将导致所需的24小时或更长持续时间。该作用持续时间测定以及本文所示的其它体内测定证实，改进的工程改造多肽对人血清和人细胞膜蛋白酶非常稳定。
表11 OGTT DOA
描述 相对于溶媒的百分比葡萄糖降低
Cmpd 5 -19, -22
Cmpd 6 -22
Cmpd 7 -16
Cmpd 8 -18, -17
Cmpd 9 -12
Cmpd 10 -12
Cmpd 11 -23
实施例11：毒蜥外泌肽-白蛋白结合结构域多肽在糖尿病ob/ob小鼠中的作用
为证实慢性暴露于与第一代白蛋白结合结构域多肽融合的毒蜥外泌肽(如PCT公布申请号WO 2009/016043所公开)对葡萄糖降低(例如HbA1c)和体重减轻的影响，用在其C-端与命名为ABD00239的白蛋白结合结构域型多肽(先前公开于PCT公布申请号WO 2009/016043的ABD，并且并非本发明的ABD)融合的毒蜥外泌肽治疗ob/ob小鼠(糖尿病的)，但这提供了本发明改进的工程改造多肽(使用本文公开的新改进的ABD)的活性的实例，例如PEP7986。给药后研究了测试化合物对ob/ob小鼠中体重、葡萄糖降低和HbA1c降低的影响的时程，且4周时的数值显示于图5A-5C。如图5C所述，用25和250 nmol/kg化合物IP每周两次持续28天治疗伴随有显著的体重降低。图5A和5B描述葡萄糖(%治疗前) (图5B)和HbA1c(%治疗前)(图5A)的变化。各点表示平均值±s.d.(标准偏差)。在第0天在非禁食雄性ob/ob小鼠中收集基线样品之后立即sc注射测试化合物。除非另外说明，否则本文所述的血糖测量使用OneTouch® Ultra®装置(LifeScan, Inc. Miliptas)。25 nmol/kg biw (每周两次)给药观察到的作用与通过持续输注(CSI)以约7.2 nmol/kg/d给予毒蜥外泌肽-4所观察到的作用相似。因此，以可比较的剂量，毒蜥外泌肽-4-GGS-ABD00239化合物(Cmpd 088)与毒蜥外泌肽-4的最大有效剂量的血糖和体重降低相匹配。以250 nmol/kg，Cmpd 88的有效性是毒蜥外泌肽-4的最大有效剂量的两倍。此外，令人惊讶的是，以等摩尔给药，对于血糖降低、HbA1c降低和体重降低，Cmpd 088比利拉鲁肽[N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰基))-Lys26,Arg34]-GLP-1-(7-37)-酸(一种白蛋白结合GLP-1衍生物)更有效(数据未显示)。
令人惊讶的是，尽管如上文所观测，与未缀合的毒蜥外泌肽-4相比体外效能降低，但在最大功效方面本文公开的与白蛋白结合多肽融合的毒蜥外泌肽的急性(6小时内)体内活性与未缀合的毒蜥外泌肽类似，而在效能(例如ED50)方面仅略微降低(几倍)，例如当通过小鼠食物摄取减少所测量(数据未显示)。甚至更令人惊讶的是，本文公开的与白蛋白结合多肽融合的毒蜥外泌肽的慢性暴露的效果几乎与毒蜥外泌肽-4 (持续输注)一样有效，但能够提供更大的最大效果。此外，根据对小鼠或大鼠白蛋白的极高亲和力和低解离速率，所有工程改造的化合物在体内测定中(以及在体外测定中)与白蛋白有效结合。因此，改进的工程改造多肽保留GLP-1R功能活性，甚至当与白蛋白结合时。这出乎意料，部分是因为白蛋白化合物(例如利拉鲁肽)已报道为仅当从白蛋白解离时才具有显著活性。他人已报道，为获得GLP-1受体功能，有必要经蛋白水解将GLP-1或毒蜥外泌肽从与其缀合的白蛋白结合肽上去除。因此，本申请全文所述的改进的工程改造多肽的体内活性甚至更令人惊叹。
实施例12：工程改造多肽在体内的长作用持续时间
为进一步证实本文所述的工程改造多肽的长半寿期和长活性持续时间，使用大鼠测定药代动力学(PK)和药效学(PD)性质。呈现了皮下给予正常Harlan Sprague-Dawley(HSD)大鼠的示例性工程改造多肽的药代动力学概况和生物学活性。将重组的工程改造化合物Cmpd 11 (在其C-端具有经甘氨酸接头与PEP07986融合的Leu14毒蜥外泌肽-4)和Cmpd9在t=0时以25 nmol/kg注射到正常HSD大鼠。在t=1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、72小时、96小时和168小时时，从饲喂的HSD雄性大鼠经尾部放血收集血液。每天测量食物和体重。图6A (Cmpd 11)和7A (Cmpd 9)描述化合物对减少食物摄取的影响。图6B (Cmpd 11)和7B (Cmpd 9)描述化合物对降低体重的影响。图6C (Cmpd 11)和7C (Cmpd 9)描述单次给药后的化合物PK概况。各点表示平均值±sd。在图中，溶媒为实心正方形，Cmpd 11为空心倒三角形，Cmpd 9为实心三角形。图6C中的血浆最大浓度等于约25,000皮摩尔。
观察到这些实例性工程改造多肽多达7天的暴露，在通过该给药途径的大鼠中，Cmpd 11的半寿期为42小时，Cmpd 9的半寿期为46小时。通过异速生长比例并考虑到工程改造多肽对人白蛋白的强亲和力，预期在人受试者中物理和生物学活性持续时间至少相同，甚至更长。因此，特别是在人受试者中，化合物具有至少每天给药、每周两次给药和甚至每周给药的用法。
实施例13：工程改造多肽在体内的长作用持续时间和绝对血浆半寿期
呈现了静脉内给予正常Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠的实例性工程改造多肽的药代动力学概况和生物学活性，从中可计算出绝对血浆半寿期。将重组的工程改造化合物Cmpd 11在t=0时以2 nmol/kg静脉内注射到正常HSD大鼠。将未缀合的毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-4类似物Leu14毒蜥外泌肽-4以2 nmol/kg静脉内注射。从饲喂的HSD雄性大鼠在t=1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、72小时、96小时和168小时经尾部放血收集血液。每天测量食物和体重。图8A描述Cmpd 11对减少食物摄取的影响。图8B描述Cmpd 11对降低体重的影响。图8C描述在单次IV给药后Cmpd 11的PK概况。如所期望，未缀合的毒蜥外泌肽的半寿期为小于15分钟。示例性工程改造多肽Cmpd 11的绝对半寿期估计为约至少12.3小时。各点表示平均值± sd。
通过该给药途径，甚至以这些相对低的剂量，观察到该示例性工程改造多肽多达4天的暴露。通过异速生长比例并考虑到工程改造多肽对人白蛋白的强亲和力，预期在人受试者中物理和生物学活性持续时间至少相同，甚至更长。因此，特别是在人受试者中，化合物具有至少每天两次(例如早上和晚上)给药、至少每天给药、每周两次给药和甚至每周一次给药的用法。
实施例14：亚慢性给药提供重叠和毒蜥外泌肽样的药理学
为证实示例性工程改造多肽在体内的亚慢性暴露的作用，将Cmpd 11每周两次或每日皮下给予，持续14天。每天测定食物摄取抑制、体重降低和Cmpd 11血浆水平。正常瘦的HSD大鼠用25 nmol/kg Cmpd 11经14天皮下处理，如图9A-9F所示，如向下箭头所示的每周两次(BIW；空心倒三角形)或每天(QD；空心正方形)。与溶媒(实心圆)相比，BIW和QD给药均抑制每天的食物摄取，如图9A累积食物摄取、图9B每天食物摄取百分比变化和图9C累积食物摄取百分比变化所示。与溶媒相比，BIW和QD给药均导致体重降低(如图9D总体重降低所示)和图9E更大的体重百分比负变化。图9F描述BIW或QD给予的Cmpd 11的PK概况。各点表示平均值± s.d (标准偏差)，每点4-6个动物。在第0天，紧接基线样品收集后皮下注射测试化合物。
如可见，两种给药模式提供重叠的效果，在每次后续给药后产生较高的化合物血浆水平，直到获得稳定的状态。通过仅仅11天的治疗，BIW (每周两次)给药所观察到的功效开始接近于通过持续输注(CSI)以约7.2 nmol/kg/d给予的Leu14毒蜥外泌肽-4所观察到的功效—在稳定状态水平下比溶媒校正体重低约7%。QD给药提供较平滑的概况，然而当转化为较大的动物和具有更长的固有白蛋白血浆半寿期的那些时，对于BIW、每周三次和甚至每周给予该化合物和本文所述的任何工程改造多肽，预期接近于在大鼠中所观察的QD模式的较平滑的血浆水平。在短治疗期间，用该工程改造多肽的QD给药获得或超过未缀合的输注毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物的功效，因此预期对本文所述的每种工程改造多肽都是这种情况。
实施例15：缺少空泡形成
用某些药物，例如某些聚乙二醇化蛋白，可在沿近侧曲小管排列的上皮细胞的细胞质中形成不合需要的空泡，这是一种不合需要毒性的度量。本申请的工程改造的白蛋白结合化合物不形成肾空泡。每天在光照结束之前3小时将C57BL6雌性小鼠(n=2笼，3小鼠/笼)称重。在第0-6天，紧接称重后，用测试化合物皮下注射小鼠。在第7天处死小鼠，取出肾脏用于组织病理学。肾皮质小管上皮细胞的细胞质空泡的严重性评分按下进行：分值1=最小(8-15%)；2=轻微(16-35%)；3=中等(36-60%)；4=显著(>60%)。引起空泡形成的已知阳性对照化合物得分为3。ABD多肽PEP07986本身得分为0。工程改造多肽Cmpd 5得分为0。
实施例16：口服递送实现全身分布
使用Cmpd 088研究肠吸收的口服递送。口服(经口灌胃)给予糖尿病db/db小鼠240nmol/kg的下列化合物，毒蜥外泌肽类似物[Leu14, Gln28]毒蜥外泌肽-4-(1-32)-fGLP-1-(33-37)酸和Cmpd 088。数据证实，工程改造的肽可口服生物利用，甚至在缺少可增强递送和吸收的其它特定赋形剂的PBS/丙二醇(50:50)制剂中。与毒蜥外泌肽类似物相比，超过毒蜥外泌肽类似物分子量两倍的Cmpd 088 (两者都以1 mg/kg剂量)在相同制剂中同样可口服生物利用。该结果表明，当口服给予时，两种化合物是有活性的，并且在测试条件下至120分钟时同等有效。结果显示于图10中。各点表示平均值+/-sd。获取基线样品后立即在t=0时，经口通过灌胃给予肽。小鼠为禁食2小时的db/db小鼠。因此，特别在人受试者中，本文所示的改进的工程改造多肽化合物具有至少每天两次(例如早上和晚上)给药、至少每天给药、每周三次给药、每周两次给药和甚至每周一次口服给药的用法。

Claims (22)

1.工程改造的多肽，包含：白蛋白结合结构域多肽(ABD)和包含毒蜥外泌肽序列、毒蜥外泌肽类似物序列或其活性片段序列的第一肽激素结构域(HD1)，其中所述ABD的氨基酸序列选自：SEQ ID NO: 453、SEQ ID NO: 454、SEQ ID NO: 455、SEQ ID NO: 456、SEQ ID NO:457、SEQ ID NO: 458、SEQ ID NO: 459、SEQ ID NO: 461、SEQ ID NO: 463 和SEQ ID NO:700。
2.权利要求1的工程改造的多肽，还包含将所述HD1和所述ABD共价连接的第一接头(L1)。
3.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽序列是毒蜥外泌肽-4序列，并且毒蜥外泌肽类似物序列是SEQ ID NO: 3所示的Leu14毒蜥外泌肽-4序列。
4.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO: 980所示的毒蜥外泌肽-4(1-28)、SEQ ID NO: 981所示的毒蜥外泌肽-4 (1-29)、SEQ ID NO: 680所示的毒蜥外泌肽-4 (1-30) 、SEQ ID NO: 982所示的毒蜥外泌肽-4 (1-31)或SEQ ID NO: 983所示的毒蜥外泌肽-4 (1-32)的序列。
5.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述HD1的氨基酸序列选自：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:2)、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:3)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:4)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:2)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:111)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO:112)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO:113)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:114)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK (SEQ ID NO:115)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:116)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO:117)和HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO:118)。
6.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-5 s-1。
7.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-6 s-1。
8.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述ABD为GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 463)。
9.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述接头L1包括多聚甘氨酸、多聚丙氨酸、多聚(Gly-Ala)或多聚(Gly-Ser)。
10.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含N-端TG二肽。
11.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含C-端AS二肽。
12.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述接头L1选自TG-(GGGS)1 (SEQ ID NO:848)、TG-(GGGS)2 (SEQ ID NO: 849)、TG-(GGGS)3 (SEQ ID NO: 850)、TG-(GGGS)4 (SEQID NO: 851)、TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 852)、(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 853)、(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 854)、(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 855)、(GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 856)、(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 857)、TG-(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 195)、TG-(GGGS)2-AS (SEQID NO: 858)、TG-(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 859)、TG-(GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 860)和TG-(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 861)。
13.权利要求1的工程改造的多肽，其对血清白蛋白具有小于10-6 mol/L解离常数的亲和力。
14.权利要求中1的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽的氨基酸序列选自：
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 727)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 728)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 729)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 730)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 731)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 732)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 733)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 734)、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 735)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 737)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 738)；和HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 739)。
15.权利要求1-14中任一项的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少40小时的血浆半寿期。
16.包含权利要求1-14中任一项的工程改造的多肽和药学上可接受的赋形剂的组合物。
17.权利要求1-14中任一项的工程改造的多肽在制备用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述药物包含有效治疗所述疾病或病症的量的多肽。
18.权利要求17的用途，其中所述疾病或病症是糖尿病、超重、肥胖、阿尔茨海默氏病、帕金森病、脂肪肝病、血脂障碍、冠心病、中风、短肠综合征(SBS)、高血脂、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、无症状性低血糖(HU)、包括结节病的限制性肺病或代谢综合征X。
19.编码权利要求1-14中任一项的工程改造的多肽的多核苷酸。
20.包含权利要求19的多核苷酸的表达载体。
21.包含权利要求20的表达载体的宿主细胞。
22.制备权利要求1-14中任一项的工程改造的多肽的方法，所述方法包括表达编码所述工程改造的多肽的多核苷酸或通过非生物学肽合成而合成多肽。
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