CN104232685B - 一种可活体成像监测肝脏中NF‑κB活性的小鼠模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可活体成像监测肝脏中NF‑κB活性的小鼠模型及其构建方法。本发明通过构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFκB基因以及萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的重组载体，用水动力法将其导入小鼠体内，得到受NFκB基因调控表达的萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因整合于小鼠肝脏的小鼠模型。用本发明的小鼠模型可以评价不同因素在体内对NF‑κB活性的调节作用，也可作为天然免疫中干扰素或炎性因子调节药物、分子和病毒的评价模型，可广泛应用于各个门类的生物医学动物实验当中。

Description

一种可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型及其构建 方法

本发明为申请日2011年12月26日，申请号201110441969.9，发明名称“一种可活体成像监测肝脏中IFN-β或NF-κB活性的小鼠模型及其构建方法”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物学领域中的动物模型及其构建方法，特别是涉及一种可活体成像监测有NF-κB活性的小鼠模型及其构建方法。

背景技术

I型干扰素(Interferon，IFN)在天然免疫反应中有着重要作用，其主要成员是IFN-α和IFN-β，肝脏是蛋白合成和许多天然免疫成分活化的一个重要场所，许多免疫相关分子能够被肝细胞来源的信号活化，肝脏的天然免疫系统在肝炎病毒感染及其免疫致病中发挥何种效应，已经成为学者们研究的热点。IFN在细胞水平的研究无法反映出其在复杂完整免疫体系中的真实情况，目前尚无合适的动物模型，用来探讨IFN在活体动物肝脏中的活性。

核因子-κB是1986年由Sen和Baltimore在小鼠B淋巴细胞中发现的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子B位点特异结合的核蛋白因子，并将其命名为Nuclear Factor-κB(NF-κB)。核因子-κB是一个具有广泛生物活性的转录因子，调控多种信号传导途径。作为细胞内信号传递的一个枢纽，核因子-κB在免疫、炎症、肿瘤等众多疾病的发生发展过程中都起到重要作用，其表达的异常通常会导致机体的多种病理、生理学改变。然而，现今大多数关于NF-κB的研究都是基于细胞水平进行的，真正动物整体水平的调控机制研究相对较少、较为困难，其主要原因就是缺乏实时、动态、易于建模、方便使用的动物模型。

活体成像技术和生物发光技术由于其实用性，是近年来在生物医学研究领域应用较为广泛的报告基因监测手段。活体成像系统可以使研究人员直接实时的观察活体动物体内的细胞生长和基因表达情况，大大提高了生物学实验的可视性和可操作性，但成本相对较高，结合生物发光技术则可以有效控制由活体成像系统产生的高额成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型。

本发明所提供的可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型，是肝脏转染有报告基因及NF-κB基因的小鼠模型，所述NF-κB基因调控报告基因的表达，所述报告基因用于指示NF-κB的表达水平。

在上述小鼠模型中，所述报告基因可为各种荧光素酶或碱性磷酸酶报告基因，优选为萤火虫荧光素酶(Fluc)基因。

本发明的第二个目的是提供一种上述活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型的构建方法。

本发明所提供的上述活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型的构建方法，可包括以下步骤：

1)载体构建：构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFκB基因以及萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的重组载体，所述噬菌体整合酶识别位点attB基因与NFκB基因位于Fluc报告基因的上游；

2)将步骤1)构建的重组载体及噬菌体整合酶质粒用尾静脉高压注射的方法(水动力法)导入小鼠体内，得到受NFκB基因调控表达的萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因整合于小鼠肝脏的小鼠模型。

在上述小鼠模型的构建方法中，所述步骤1)中用于构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFκB基因以及Fluc报告基因的重组载体的出发载体为pNFκB-Luc，以pNFκB-Luc为出发载体构建的携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NF-κB基因以及萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的重组载体pattB-NFκB-Fluc。

所述步骤2)中的噬菌体整合酶质粒为PhiC31o，所述将步骤1)构建的重组载体及噬菌体整合酶质粒用尾静脉高压注射的方法(水动力法)导入小鼠体内的方法具体为：取4-6周龄的雄性小鼠，称重，将重组质粒10μg和噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o20μg混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在3秒钟以内通过尾静脉快速转染至小鼠肝脏。

本发明提供了一种可活体成像监测有NF-κB活性的小鼠模型及其构建方法。本发明的小鼠模型是通过构建含有噬菌体整合酶识别位点attB基因、由NFκB基因调控萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因表达的重组载体，再通过水动力注射法将该重组载体转染至小鼠肝脏，并可通过活体成像技术检测NF-κB活性。本发明的小鼠模型可用于评价NF-κB抑制剂PDTC抑制NF-κB激活的药效作用。用本发明的小鼠模型可以评价不同因素在体内对NF-κB活性的调节作用，也可作为天然免疫中干扰素或炎性因子调节药物、分子和病毒的评价模型，可广泛应用于各个门类的生物医学动物实验当中。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为载体pGL3-Basic的物理图谱

图2A为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶(Fluc)活性的活体成像检测结果

图2B为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶(Fluc)表达水平的Western blot检测结果

图2C为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型稳定性的活体成像检测结果

图2D为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型稳定性的巢式PCR检测结果

图3A为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子活化的活体成像检测结果

图3B为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其血清中IFN-β含量的检测结果

图4A为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子被HCVNS3/4A蛋白酶抑制的活体成像检测结果

图4B为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子被HCVNS3/4A蛋白酶抑制的血清中IFN-βELISA检测结果

图4C为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子被HCVNS3/4A蛋白酶抑制的Western blot检测结果

图5为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型来评价真实病毒对IFN-β启动子作用的活体成像检测结果

图6A为重组载体pattB-NFκB-Fluc的结构示意图

图6B为可活体成像监测肝脏中NFκB活性的小鼠模型肝脏Fluc表达情况的活体荧光成像监测结果

图7A为pattB-NFκB-Fluc质粒在小鼠肝脏长效整合激活再表达情况的检测结果

图7B为nest-PCR对可活体成像监测肝脏中NFκB活性的小鼠模型整合位点的鉴定结果

图8为利用可活体成像监测肝脏中NFκB活性的小鼠模型对NF-κB抑制剂PDTC的作用评价结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、构建可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型

用本发明的方法构建可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型，具体方法包括以下步骤：

一、构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、IFN-β启动子以及萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的重组载体pGL3-attB-IFNβ

以HepG2细胞基因组为模板，在上游引物IFNBpf：

AGATCTAATTCTCAGGTCGTTTGCTT和下游引物IFNBpr：

AAGCTTAAAGGTTGCAGTTAGAATGT的引导下，利用高保真PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶，PCR扩增人的IFN-β启动子序列(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化300bp的IFN-β启动子序列，然后将IFN-β启动子序列经BglII和HindIII双酶切处理后，与经过相同酶(BglII和HindIII)酶切的载体pGL3-Basic(其物理图谱如图1所示)进行连接，得到携带萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因和IFN-β启动子的重组载体pGL3-IFN-β，再以pTA-attB(GROTH A C,OLIVARES E C,THYAGARAJAN B,CALOS M P.A phage integrase directs efficient site-specificintegration in human cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97(11):5995-6000.由M.P.Calos博士提供)为模板，在上游引物attBf：

CTCGAGGCAGGTACCGTCGACGATG和下游引物attBr：

AGATCTGGCTGTCGACATGCCC的引导下，PCR扩增attB基因(其核苷酸序列如序列表中序列2所示)，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化297bp的attB基因，然后将attB基因经XhoI和BglII双酶切处理后，与经过相同酶(XhoI和BglII)酶切的载体pGL3-Basic进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有噬菌体整合酶识别位点attB基因、IFN-β启动子引导萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因表达的重组载体，命名为pGL3-attB-IFNβ。

二、获得活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型

1、获得活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型

将步骤一构建的重组载体pGL3-attB-IFNβ及噬菌体整合酶质粒PhiC31o利用尾静脉高压注射的方法(水动力法)导入小鼠体内，得到受IFN-β启动子调控表达的萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因整合于小鼠肝脏的活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型，具体方法为：先将步骤一得到的重组质粒pGL3-attB-IFNβ用无内毒素质粒大量纯化试剂盒进行质粒纯化(按照QIA，GEN公司、Protocol for EndoFree Plasmid Maxi Kit进行)，然后选4-6周龄的雄性BALB/c小鼠(购于军事医学科学院实验动物中心)20只，将pGL3-attB-IFNβ10μg和噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o(购自Addgene公司)20μg混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在3秒钟以内通过尾静脉快速转染至小鼠肝脏。

三、活体荧光成像仪监测小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶(Fluc)的活性

分别在转染后的不同时间点(0、8、36、60小时)注射Fluc的作用底物—D-Luciferin至步骤二中的小鼠腹腔，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体荧光成像仪进行检测。

结果如图2A所示，荧光素酶活性在第8个小时就已经达到了高峰，随着时间延长，荧光素酶活性逐渐降低，到了60小时基本上检测不到。

四、Western blot验证小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶(Fluc)的表达水平

在相应时间点(8、36、60小时)处死步骤二获得的模型小鼠，取肝脏蛋白用Westernblot法检测肝脏中萤火虫荧光素酶(Fluc)的表达水平，一抗为anti-luciferase mAb(购自Promega公司)，二抗为辣根酶标记的羊抗鼠抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，以β-actin为内参。

结果如图2B所示，可以看出，小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶(Fluc)的表达水平随着时间的延长，发光减弱，蛋白表达量也减少。

五、小鼠模型的稳定性评价

为了验证噬菌体整合酶的整合效率，构建了两组小鼠模型，一组是只转染pGL3-attB-IFNβ质粒，第二组是共转染pGL3-attB-IFNβ和PhiC31o质粒，转染后第5天和第30天分别用水动力方法注射10μg poly(I:C)(聚肌胞苷酸，聚肌苷酸-聚胞苷酸)，8小时后活体成像检测荧光素酶的表达水平。结果如图2C所示，可以看出，在第5天荧光素酶都能够被poly(I:C)激活，两组之间没有明显差别，而在第30天，第一组已经不能被poly(I:C)激活，而第二组由于同时转染了噬菌体整合酶，仍然能够被poly(I:C)激活。

再取两组小鼠的肝脏基因组DNA作为模板，进行巢式PCR扩增，引物序列如下：

mspL1(forward)：5′-GTGGCACATTCCTTAATCCC-3′，

mspL1(reverse)：5′-TGAGGAGGAGCCTTAGCAAC-3′；

attB-1：5′-GTAGGTCACGGTCTCGAAGC-3′，

attB-2：5′-CGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCA-3′。

扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2D所示，可以看出，第二组3只小鼠attL和attR都能见到250bp左右特异性的条带。将PCR扩增产物回收连接到T载体上进行克隆测序，测序结果如下：

测序序列attL arm sequence report:

attB arm core mpsL1 arm

Mouse‐1:CGCGGTGCGGGTGCCAGG**GT*CCCTT*ac*cccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐2:CGCGGTGCGGGTGCCAG*G*GT**CCTTgac*cccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*T*C*CTT**c**ccaaaggccctattaatttagggagcct

attR arm sequence report:

attB arm core mpsL1 arm

Mouse‐1:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGCG*GCCCTTg**ccccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐2:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*TGC*CTTgaca*ccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC***C*CTTgacacccaaaggccctattaatttagggagcct

对测序结果进行BLAST比对分析，结果发现，表达载体attB位点和小鼠第2号染色体的mpsL1位点发生整合，整合铰链区(core area)为TTG，有3-7个碱基丢失。

实施例2、用可活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型评价IFN-β启动子的活化

为了验证实施例1构建的活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型能否用来评价IFN-β在小鼠肝脏的活化，选用IFN-β产生的信号途径中一种病原相关分子模式poly(I:C)来作为诱导剂。将poly(I:C)加至相当于小鼠体重10％的生理盐水，利用水动力转染方法快速注射(5-8 sec)入小鼠体内，分别检测小鼠肝脏荧光素酶的表达及血清中IFN-β的水平，具体为：将poly(I:C)10μg靶向送入3只小鼠肝脏(实验组)，并在4、8、12、24、48、60小时活体成像监测小鼠肝脏的荧光活性，同时设3只对照组小鼠水动力注射生理盐水。

活体成像检测结果如图3A所示，仅仅注射生理盐水的小鼠没有检测到光子，而注射poly(I:C)的小鼠4小时就能够看到明显的发光，在8小时发光值达到顶峰，然后随着时间延长，发光越来越弱，60小时就完全检测不到。

在上述时间点活体成像完成后，随即通过眼眶后静脉丛采血，取血清测量血清中IFN-β的含量。结果如图3B所示，实验组血清IFN-β在4-8小时达到高峰，然后逐渐下降，24小时后基本达到基础水平，而对照组血清中的IFN-β并没有明显变化。

实施例3、用可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型评价IFN-β启动子的抑制

HCV NS3/4A蛋白酶是已知的IFN-β活化信号通路中的抑制剂，在细胞水平的研究已经证明HCV NS3/4A蛋白酶能够通过剪切人类的细胞中MAVS来阻断IFN-β活化信号的传导。用实施例1构建的活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型来评价HCV NS3/4A蛋白酶对IFN-β抑制作用。将pCI-neo(对照组，购自Promega公司)和pCI-HCV NS3/4A(实验组，将HCV NS3/4A插入pCI-neo载体中构建)两组质粒分别用水动力的方法转染至实施例1构建的活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型的肝脏中，24小时后用poly(I:C)10μg(或生理盐水)刺激IFN-β活化，8小时后通过活体荧光成像监测荧光素酶的表达，在活体成像后随即采血收集血清，然后处死部分小鼠取肝脏冻存。通过ELISA检测血清中IFN-β的表达水平(MouseInterferon beta ELISA kit，购自PBL公司)，用Western blot检测肝脏中HCV NS3/4A蛋白的表达水平，一抗为anti-NS3 mAb(购自Santa Cruz公司)，二抗为辣根酶标记的鼠抗羊抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

活体荧光成像监测荧光素酶表达水平的检测结果如图4A所示，用poly(I:C)刺激后，对照组对比实验组的荧光素酶表达水平有显著性差异(P＝0.018)，对照组荧光值比实验组高约6倍；血清中IFN-β表达水平的ELISA检测结果如图4B所示，对照组血清中IFN-β的表达水平平均为实验组的4倍；血清中IFN-β表达水平的Western blot检测结果如图4C所示(Intact MAVS表示完整的MAVS，Cleaved MAVS表示切割的MAVS)，能够检测到实验组小鼠肝脏中的HCV NS3/4A的表达及MAVS的切割，从而证实IFN-β活化信号能够被HCV NS3/4A蛋白酶阻断。

实施例4、用可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型来评价真实病毒对IFN-β启动子的作用

病毒为鼠肝炎病毒MHV-3，病毒滴度为100PFU，将100μl的该病毒通过腹腔注射来感染实施例1构建的可活体成像监测有IFN-β活性的模型小鼠，分别在4、8、12、24、28小时进行活体成像观察小鼠肝脏的荧光素酶表达。

观察结果如图5所示，在病毒接种后4小时就能够见到肝脏荧光素酶的表达，在8小时达到峰值，表明本发明的小鼠模型可以用来评价病毒感染引起的天然免疫中IFN-β活化。

实施例5、构建可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型

用本发明的方法构建可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型，具体方法包括以下步骤：

一、构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NF-κB基因以及萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的重组载体pattB-NFκB-Fluc

使用KpnI单酶切，对pNFκB-Fluc(购自Promega)进行单酶切，其单酶切体系如下：pNFκB-Fluc 7μl、KpnI 5μl、10×Buffer 5μl、ddH₂O 33μl，总体积50μl。37℃酶切8h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳后切取5kb大小片段的条带进行产物回收(按试剂盒说明书操作)将回收获得的pNFκB-Fluc载体与attB片段(297bp)进行连接，构建目的质粒pattB-NFκB-Fluc，酶切产物连接反应体系：pattB-NFκB-Fluc载体质粒1μl、attB片段5μl、10×T4 DNALigase Buffer 1μl、T4 DNA Ligase 1μl、ddH₂O 2μl，共10μl，4℃过夜连接。载体的结构示意图如图6A所示。

二、获得可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型

水动力转染法将步骤一构建的重组载体pattB-NFκB-Fluc分别转染小鼠，具体方法为：取6-8周龄的雄性BALB/c小鼠(H-2^d)(购于军事医学科学院实验动物中心)10只，将10μg重组质粒pattB-NFκB-Fluc和20μg噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o(购自Addgene公司)混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在五秒钟以内通过尾静脉快速转染至小鼠肝脏。

三、活体荧光成像监测模型小鼠肝脏Fluc的表达

分别在转染后的第1、3、6天，通过小动物活体成像系统监测NF-κB的激活过程，方法为：首先，注射D-Luciferin(Fluc作用底物)至转染pattB-NFκB-Fluc小鼠腹腔，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体荧光成像仪进行检测。

结果如图6B所示，可以看出，转染pattB-NFκB-Fluc的小鼠肝脏中Fluc表达时间约为5-6天，且第一天的表达最为强烈，与水动力造成的肝损伤的过程相近。

实施例6、pattB-NFκB-Fluc质粒在小鼠肝脏中长效整合激活再表达及药效评价

一、pattB-NFκB-Fluc质粒长效整合激活再表达

分别于水动力转染pattB-NFκB-Fluc后的11天、30天、60天、80天通过10μg/只的脂多糖(LPS)腹腔注射造成小鼠(实施例5构建的小鼠模型)急性肝损伤，激发小鼠肝脏NF-κB的表达，LPS注射后12小时进行活体成像。

结果如图7A所示，可以看出，每次激活NFκB后，肝脏均有10⁶-10⁷的荧光光子数可以被检出，而LPS注射前荧光光子数为零，说明本发明的小鼠模型可以灵敏的反应肝脏组织中NF-κB的活性情况。

二、nest-PCR对小鼠模型整合位点的鉴定

使用Invitrogen公司的DNA Zol提取实施例5构建的转染pattB-NFκB-Fluc质粒的模型小鼠的肝脏基因组DNA，进行巢式PCR扩增，引物序列如下：

mspL1(forward)：5′-GTGGCACATTCCTTAATCCC-3′，

mspL1(reverse)：5′-TGAGGAGGAGCCTTAGCAAC-3′；

attB-1：5′-GTAGGTCACGGTCTCGAAGC-3′，

attB-2：5′-CGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCA-3′。

扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7B所示，可以看出，3只小鼠attL和attR都能见到250bp左右特异性的条带。将PCR扩增产物回收连接到T载体上进行克隆测序，测序结果如下：

测序序列attL arm sequence report:

attB arm core mpsL1 arm

Mouse‐1:CGCGGTGCGGGTGCCAGG**GT*CCCTT*ac*cccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐2:CGCGGTGCGGGTGCCAG*G*GT**CCTTgac*cccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*T*C*CTT**c**ccaaaggccctattaatttagggagcct

attR arm sequence report:

attB arm core mpsL1 arm

Mouse‐1:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGCG*GCCCTTg**ccccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐2:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*TGC*CTTgaca*ccaaaggccctattaatttagggagcct

Mouse‐3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC***C*CTTgacacccaaaggccctattaatttagggagcct

对测序结果进行BLAST比对分析，结果发现，表达载体attB位点和小鼠第2号染色体的mpsL1位点发生整合，整合铰链区(core area)为TTG，有3-7个碱基丢失。

三、利用可活体成像监测肝脏中NFκB活性的小鼠模型对NF-κB抑制剂PDTC的作用评价

首先向小鼠腹腔注射120mg/kg的PDTC(NF-κB抑制剂/抗氧化剂)，半小时后在腹腔注射10μg/只的LPS，在腹腔注射LPS之后开始计时，分别于2、4、12运用活体成像技术检测NF-κB的激活情况和被PDTC的抑制情况。

利用可活体成像监测肝脏中NFκB活性的小鼠模型活体成像结果如图8所示，LPS激活两小时后PDTC对NF-κB有明显的抑制作用。

Claims (2)

1.一种可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

1)载体构建：构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFκB基因以及萤火虫荧光素酶即Fluc报告基因的重组载体，出发载体为pNFκB-Luc，以pNFκB-Luc为出发载体构建的重组载体命名为pattB-NFκB-Fluc，载体结构如图6A所示，所述噬菌体整合酶识别位点attB基因与NFκB基因位于Fluc报告基因的上游；

2)将步骤1)构建的重组载体pattB-NFκB-Fluc及噬菌体整合酶质粒PhiC31o利用尾静脉高压注射的方法导入小鼠体内，得到受NFκB基因调控表达的Fluc报告基因整合于小鼠肝脏的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中导入的方法具体为：取4-6周龄的雄性小鼠，称重，将重组质粒10μg和噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o20μg混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在3秒钟以内通过尾静脉转染至小鼠肝脏。