CN104232532B - 一种植物内生短小芽孢杆菌及其菌剂、制法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物内生的短小芽孢杆菌及其菌剂、制法与应用。该植物内生的短小芽孢杆菌J14‑1（Bacillus pumilus J14‑1），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9601。菌株J14‑1及其菌剂在提高作物耐盐能力中应用，菌株可以定殖到作物体内，显著提高玉米等作物的耐盐能力，从而可以显著提高玉米等作物的发芽率和生物量，解决了在盐碱化土壤中玉米等普通作物耐盐能力较差而导致的粮食减产等问题。

Description

一种植物内生短小芽孢杆菌及其菌剂、制法与应用

技术领域

本发明涉及一种植物内生的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，还涉及利用该芽孢杆菌生产的微生物菌剂，以及所述植物内生短小芽孢杆菌与菌剂在提高作物耐盐能力中的应用。

背景技术

盐碱土是指土壤含盐量太高(超过0.3％)的土壤，土壤的盐碱化会增加农业生产成本，甚至导致土地荒废。据统计，我国的盐碱地资源面积约5.27亿亩，其中盐碱耕地0.88亿亩，主要分布在华北、西北和东北地区。土壤盐碱化使我国每年造成大量的粮食减产，农田土壤盐碱化导致的粮食减产不但造成了严重的经济损失，还对国家的粮食安全构成了严重威胁。

治理盐碱地改良措施有物理、化学和生物以及农业耕作措施等，包括水利改良措施(灌溉、排水、放淤、种稻、防渗等)；农业改良措施(平整土地、改良耕作、施客土、施肥、播种、轮作、间种套种等)；生物改良措施(种植耐盐植物和牧草、绿肥、植树造林等)；化学改良措施(施用改良物质，如石膏、磷石膏、亚硫酸钙等)，以及利用从土壤中筛选的微生物菌株形成的肥料来改善土壤性质等。

在自然界的植物体内存在大量的内生细菌、真菌和放线菌，这些菌株不但不会引起宿主植物的疾病，反而可以通过与植物的相互作用，提高宿主植物自身抗逆境条件的能力。开发这些植物内生微生物资源对工农业生产具有重要的现实意义。

发明内容

本发明主要从具有较强盐碱耐受能力的植物体内，筛选自身耐盐能力强并可以提高作物耐盐碱能力的细菌，以期提高普通作物的耐盐能力。与改良土壤实现盐碱地改良的微生物肥料相比，植物内生细菌可以进入作物根或茎内，与植物形成互利共生关系，通过改变植物的生理状态，提高作物自身的耐盐能力，本发明的植物内生细菌及其菌剂的使用操作简便、成本低。

本发明解决的第一技术问题是克服土壤盐碱化的不良影响，提供一种植物内生芽孢杆菌，能提高作物自身耐盐能力，改善在盐碱化土壤中玉米等普通作物耐盐能力较差而导致的粮食减产。

本发明解决的第二技术问题是提供一种含有上述植物内生芽孢杆菌的微生物菌剂，可以在盐碱土壤中使用，提高普通作物的耐盐能力及作物在盐碱土壤中的生长。本发明提供的菌株和菌剂可以作为微生物肥料在盐碱化农田中使用，提高作物在中的发芽率、生物量或粮食产量。

本发明解决的第三技术问题是植物内生短小芽孢杆属细菌和菌剂在提高作物耐盐能力的应用。

具体来说，本发明提出了如下技术方案。

本发明的第一方面，提供了一种植物内生的短小芽孢杆菌J14-1(Bacilluspumilus J14-1；以下简称菌株J14-1)，菌株的保藏编号为CGMCC No.9601。本发明提供的菌株J14-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9601，保藏日期为2014年8月26日。

菌株J14-1在提高作物耐盐能力中应用。优选的，所述J14-1菌株应用于盐碱土壤，所述盐碱土壤是指含可溶性盐浓度为0～2.0％的土壤。所述短小芽孢杆菌菌株J14-1能够定殖到作物体内。优选的，所述作物是玉米。

本发明的又一方面，一种微生物菌剂，其利用上述菌株J14-1生产得到，其活性成分为上述植物内生短小芽孢杆菌菌株J14-1。

该微生物菌剂在提高作物耐盐能力中应用。优选的，所述微生物菌剂应用于盐碱土壤，所述盐碱土壤是指含可溶性盐浓度为0～2.0％的土壤。

本发明的又一方面，该微生物菌剂通过包括下述步骤的制备方法得到：

1)斜面种培养：将权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌株J14-1活化后接种于试管斜面上；

2)摇瓶种培养：步骤1)的得到的试管菌种接种于肉汤培养基中，恒温震荡培养至对数生长期；

3)种子罐接种培养：将步骤2)得到的摇瓶菌种按照10％接种量(体积比)接种于种子罐中培养至对数生长期；

4)生产罐培养：将步骤3)得到的种子罐菌种按10％接种量(体积比)接种于生产罐中，温度控制在30～35℃进行培养，得到菌剂。

本发明提供的植物内生短小芽孢杆菌J14-1及其菌剂可以应用于含可溶性盐浓度为0～2.0％的土壤(盐碱土壤)，菌株可以定殖到作物体内，显著提高玉米等作物的耐盐能力，从而可以显著提高玉米等作物发芽率，并明显提高作物的生物量。使用本发明植物内生芽孢杆菌J14-1及其菌剂可以扩大玉米的种植范围，提高作物的种植面积。

具体实施方式

本发明主要从具有较强盐碱耐受能力的植物体内，筛选自身耐盐能力强并可以提高作物耐盐碱能力的细菌，以期提高普通作物的耐盐能力。本发明提供的植物内生短小芽孢杆菌J14-1及其菌剂本身能在含盐(NaCl)量为16％的LB培养基等培养基中生长，在含0.5％、1.0％和2.0％的盐(NaCl)浓度的水溶液中，可以显著提高玉米种子发芽率。将种子放到本发明菌剂中浸泡4小时后，种植到含盐量为1.0％的土壤中，可以显著提高玉米等作物发芽率，并明显提高作物的生物量。在含2.0％可溶盐的土壤中使用菌株J14-1，可以提高玉米等作物的成活率。

保藏信息

本发明提供的植物内生的芽孢杆菌属(Bacillus)短小芽孢杆菌菌株J14-1(Bacillus pumilus J14-1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCC No.9601，保藏日期为2014年8月26日。

本发明的J14-1菌株具有如下性质：

1.形态特征：菌体为杆状。

2.生理生化特征：革兰氏染色反应阳性，硝酸盐还原阴性、精氨酸水解阴性；接触酶、氧化酶、酯酶阳性；不产生H₂S、吲哚，利用阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，不利用鼠李糖、棉子糖；在LB培养基培养3天后，形成直径0.5mm、白色、不透明、表面干燥、边缘不规则的菌落。

3.16S rDNA序列鉴定

采用如下引物：8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，进行PCR扩增，从菌株J14-1中扩增到16S rDNA基因片段，将所获得16S rDNA克隆到pGEM T-easy载体后送北京博艾远上生物科技有限公司测序。16S rDNA的部分序列见序列表SEQ ID No：1所示的碱基序列，与GenBank中的序列比对发现，J14-1菌株的16S rDNA序列与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株序列的同源性最高，达99％以上。

具体步骤：

取翅碱蓬植株一株，将翅碱蓬根系剪为数段，然后对植物表面消毒(优选采用次氯酸钠和70％乙醇)，用无菌水冲洗干净，并收集冲洗水涂布于LB培养基平板上，经检测表面无菌后，用无菌研钵碾碎，收集植物组织残渣，用无菌水稀释后在含2％盐浓度的LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 20g/L，琼脂粉20g/L，用水定容至1L，pH 7.0左右)平板上涂布，培养7天后，挑取单菌落划线纯化后保存。

本发明还公开了利用上述J14-1菌株生产的微生物菌剂，其活性成分为J14-1菌体。

所述微生物菌剂的制备方法如下所述：

生产菌剂的工艺为：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。

在一个优选的实施方式中，所述菌剂的制备具体可采用如下步骤：

(1)斜面种培养：将菌株J14-1(原种)在高盐LB培养基(成分如下：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 160g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0～7.2)平板上培养，备用。

(2)摇瓶种培养：将试管种接种于200ml肉汤培养基(牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，其他为水，pH 7.0～7.2)中，恒温振荡培养至对数生长期，准备接种种子罐。

(3)种子罐接种培养：配制发酵培养基，其组分及重量百分比为：葡萄糖0.8％、(NH₄)₂SO₄1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.01％、CaCO₃0.3％、酵母粉0.02％，其余为水，pH值7.2～7.5，将400L发酵培养基加入500L种子罐，121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将将步骤2)得到的摇瓶菌种按10％(体积百分含量)的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1：0.8(空气和培养液的体积比)。

(4)生产罐培养：生产罐(生产罐容量5吨)所用培养基成分与发酵培养基相同(投料量4.5吨)，投料后的生产罐在1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用；将到达对数期的种子液按10％(体积百分含量)的接种量接入生产罐，接种后的生产罐温度控制在30～35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：(0.6～1.2)(空气和培养液的体积比)，搅拌速度为180～240转/分(可优选为240转/分)，整个工艺流程培养时间为48～60小时；发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

(5)发酵完成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

内生菌与宿主之间存在选择性，一种特定的内生菌基因型需要找到正确的宿主基因型才能成功建立共生关系。目前有关于巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌提高作物的耐盐能力的报道，然而适用作物仅限于小麦，并不能应用于玉米。另外，目前并没有报道短小芽孢杆菌能提高作物耐盐能力，特别的，没有报道短小芽孢杆菌能提高玉米的耐盐能力。

本发明能提高作物耐盐能力的植物内生芽孢杆菌J14-1和微生物菌剂具有生产使用成本低、使用方便的优点，可以显著提高玉米等作物的耐盐能力。本发明提供的菌株和菌剂可以作为微生物肥料在盐碱化农田中使用，提高作物在盐碱土壤中的发芽率、生物量或粮食产量。使用该菌剂可以扩大玉米的种植范围，提高作物的种植面积。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，具体如表1所示，所用玉米种子为常规玉米种子。以下实验均设置三次重复，结果取平均值。以下实施例中所指的含盐量，如无特殊说明，均为质量百分含量，所指的盐为NaCl。

表1 各试剂的商购来源信息表

实施例1：Bacillus pumilus J14-1的获得及鉴定

一、Bacillus pumilus J14-1的获得

取2013年6月从内蒙古乌梁素海周边翅碱蓬植株一株，将翅碱蓬根系剪为数段后，用次氯酸钠、70％乙醇做表面消毒，用无菌水冲洗干净，并收集冲洗水涂布于LB培养基平板上，经检测表面无菌后，用无菌研钵碾碎，收集植物组织残渣，用无菌水稀释后在含2％盐浓度的LB培养基平板上涂布，培养7天后，挑取单菌落划线纯化后保存。

含2％盐浓度的LB培养基成分：酵母粉5.0g、蛋白胨10.0g和NaCl 20g，琼脂粉20g，用水定容至1L，pH 7.0左右。

二、Bacillus pumilus J14-1的鉴定

(1)形态特征：菌体为杆状。

(2)生理生化特征：革兰氏染色反应阳性，硝酸盐还原阴性、精氨酸水解阴性；接触酶、氧化酶、酯酶阳性；不产生H₂S、吲哚，利用阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，不利用鼠李糖、棉子糖；在LB培养基培养3天后，形成直径0.5mm、白色、不透明、表面干燥、边缘不规则的菌落。

(3)16S rDNA序列鉴定

采用如下引物：8F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)，1492R(5′-TAC CTTGTT ACG ACT T-3′)，进行PCR扩增，从菌株J14-1中扩增到16S rDNA片段，将所获得16SrDNA克隆到pGEM T-easy载体后送北京博艾远上生物科技有限公司测序。16S rDNA的部分序列见序列表的SEQ ID No：1所示的碱基序列，与GenBank中的序列比对发现，菌株J14-1的16S rDNA序列与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)同源性最高，生理、生化指标与短小芽孢杆菌的标准菌株的一致，将菌株J14-1鉴定为短小芽孢杆菌。

三、菌株J14-1的保藏

通过以上鉴定结果，确认上述菌株为短小芽孢杆菌的一个新菌株，将其命名为Bacillus pumilus J14-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9601。

实施例2：菌株J14-1提高玉米种子在不同盐浓度的水溶液的发芽率

挑取菌株J14-1单菌落于3ml LB液体培养基中，30℃、165转/分振荡培养24小时，获得新鲜菌液。按2％(体积比)的接种量接种到200mL发酵培养基(其组分及重量百分比为：葡萄糖0.8％、(NH₄)₂SO₄1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.01％、CaCO₃0.3％、酵母粉0.02％，其余为水，pH值7.2-7.5)中扩大培养，120r/min、30℃培养48h。

将大小均匀的玉米种子分为两组，一组置于菌液中接种浸泡4小时，另一组用培养基浸泡4小时。自然晾干后将浸泡后的玉米种子分别置于含0.5％、1.0％、2.0％盐水的滤纸上，然后将种子分别放于28℃的培养箱中避光静置培养，7天时观察其发芽情况。

玉米的发芽率＝(发芽玉米种子数量/实验种子数量)×100％。

结果(表2)表明，菌株浸泡后的玉米种子在0.5～2.0％盐(NaCl)浓度的水溶液中能快速发芽，其发芽率明显高于未接种芽孢杆菌J14-1的玉米种子。

表2 J14-1菌株对玉米在不同浓度的盐溶液中的发芽率的影响

实施例3：菌株J14-1提高玉米在含盐土壤中的生物量、成活率

挑取菌株J14-1单菌落于3ml LB液体培养基中，30℃、165转/分振荡培养24小时，获得新鲜菌液。按2％(体积比)的接种量接种到200mL发酵培养基(其组分及重量百分比为：葡萄糖0.8％、(NH₄)₂SO₄1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.01％、CaCO₃0.3％、酵母粉0.02％，其余为水，pH值7.2-7.5)中扩大培养，120r/min、30℃培养48h。

选取大小一致的玉米种子，放到菌株J14-1的新鲜菌液中浸泡4小时，对照种子在LB培养基中浸泡4小时。然后将种子分别播种到在可溶性盐浓度为0.5％、1.0％、2.0％的土壤中。将盆钵放到阳光下培养，定时浇水维持土壤含水量在20％。10天时观察玉米的生长情况。同时取部分玉米根剪为数段后，用次氯酸钠、70％乙醇做表面消毒，用无菌水冲洗干净，并收集冲洗水涂布在LB培养基平板上，以确认消毒情况；用无菌研钵碾碎，收集植物组织残渣，用无菌水稀释后在含2％盐浓度的LB培养基平板上涂布，培养7天后，观察菌株J14-1在玉米根内的定殖情况。

结果见表3，结果表明，菌株浸泡后的玉米种子在1.0～2.0％盐(NaCl)浓度的含盐土壤中的生长速度明显快于未接种芽孢杆菌的玉米种子；在2％的盐浓度的土壤中，不接种菌株的土壤中玉米不能生长，而浸种后玉米可以生长。同时实验结果表明这些细菌在玉米的根内成功定殖。

表3 接种菌株对土壤种植玉米的影响

实施例4利用上述短小芽孢杆菌J14-1生产微生物菌剂

1、将菌株J14-1(原种)在高盐LB培养基(成分如下：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 160g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0～7.2)平板上培养，备用。

2、挑取高盐LB培养基平板上的单菌落接种于100ml肉汤培养基(牛肉膏0.3克，蛋白胨1.0克，NaCl 0.5克，其余为水，pH值7.0～7.2)中，恒温振荡培养至对数生长期，准备接种种子罐。

3、配制发酵培养基，其组分及重量百分比为：葡萄糖0.8％、(NH₄)₂SO₄1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.01％、CaCO₃0.3％、酵母粉0.02％，其余为水，pH值7.2～7.5，将400L发酵培养基加入500L种子罐，121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将摇瓶菌种按10％(体积百分含量)的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1：0.8(空气和培养液的体积比)。

4、生产罐(生产罐容量5吨)所用培养基成分与发酵培养基相同(投料量4.5吨)，投料后的生产罐在1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用；将到达对数期的种子液按10％(体积百分含量)的接种量接入生产罐，接种后的生产罐温度控制在30～35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：1.0(空气和培养液的体积比)，搅拌速度为180～240转/分(可优选为240转/分)，整个工艺流程培养时间为60小时；发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml。

5、发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

由上实施例可见，本发明提供的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1及其菌剂可以提高玉米等农作物在含盐条件下的发芽率、生长速度或玉米的成活率。本发明成功地解决了在玉米等普通作物在含盐量较高的土壤中不能生长或长势较差的现状，显著降低生产和使用过程中的工作量，生产和使用成本低，拓展适宜种植玉米等普通粮食作物的土壤类型和面积，对确保粮食供应、维护国家粮食安全等具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明权利要求的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种植物内生的短小芽孢杆菌J14-1(Bacilluspumilus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9601，所述短小芽孢杆菌J14-1能定殖到作物体内，所述作物为玉米。

2.权利要求1所述的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1在提高玉米耐盐能力中的应用。

3.根据权利要求2所述的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1在提高玉米耐盐能力中的应用，其特征在于，所述植物内生的短小芽孢杆菌J14-1应用于盐碱土壤，所述盐碱土壤是指含可溶性盐浓度为0～2.0％的土壤。

4.根据权利要求2或3所述的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1在提高玉米耐盐能力中的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌J14-1定殖到玉米体内。

5.一种微生物菌剂，其特征在于，其利用权利要求1所述的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1生产得到，其活性成分为权利要求1所述的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1；所述短小芽孢杆菌J14-1为10亿个/ml以上。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，该菌剂利用权利要求1所述的植物内生的短小芽孢杆菌J14-1和发酵培养基生产得到，所述发酵培养基以质量计含有如下组分：葡萄糖0.7～1.0％、(NH₄)₂SO₄0.8～1.2％、K₂HPO₄0.1～0.3％、MgSO₄0.03～0.07％、NaCl 0.005～0.015％、CaCO₃0.2～0.4％、酵母粉0.01～0.03％，其余为水，pH值7.2～7.5。

7.权利要求5或6所述的微生物菌剂在提高玉米耐盐能力中的应用。

8.权利要求7所述的微生物菌剂在提高玉米的耐盐能力中的应用，其特征在于，所述微生物菌剂应用于盐碱土壤，所述盐碱土壤是指含可溶性盐浓度为0～2.0％的土壤。

9.根据权利要求7或8所述的微生物菌剂在提高玉米的耐盐能力中的应用，其特征在于，所述活性成分短小芽孢杆菌J14-1定殖到玉米体内。

10.权利要求5或6所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，其通过包括下述步骤的制备方法得到：

1)斜面种培养：将权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌株J14-1活化后接种于试管斜面上；

2)摇瓶种培养：步骤1)的得到的试管菌种接种于肉汤培养基中，恒温震荡培养至对数生长期；

3)种子罐接种培养：将步骤2)得到的摇瓶菌种按照10体积比％的接种量接种于种子罐中培养至对数生长期；

4)生产罐培养：将步骤3)得到的种子罐菌种按10体积比％的接种量接种于生产罐中，温度控制在30～35℃进行培养，得到菌剂。