CN104211814A

CN104211814A - 用于消耗靶膜蛋白的组合物

Info

Publication number: CN104211814A
Application number: CN201410234917.8A
Authority: CN
Inventors: 郑光镐; 李承炫; 赵美英; 高荣晙; 林柏玮; C.李; 黄载雄
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2014-12-17
Also published as: EP2808035B1; US20140356366A1; EP2808035A1; US9388243B2

Abstract

一种消耗靶膜蛋白的组合物，其包含结合驱动物膜蛋白的第一结合域和结合靶膜蛋白的第二结合域，其中所述驱动物膜蛋白和靶膜蛋白与靶膜蛋白所在的细胞膜部位结合，且当该二元结合分子的第一结合域结合驱动物膜蛋白时内在化到细胞中并降解；以及相关的方法和用途。

Description

用于消耗靶膜蛋白的组合物

发明背景

1.发明领域

本发明提供了一种用于消耗靶膜蛋白的组合物以及相关方法和用途，所述组合物包含与驱动物膜蛋白结合的第一结合域和与靶膜蛋白结合的第二结合域，其中当二元结合分子的第一结合域结合驱动物膜蛋白时，所述驱动物膜蛋白和靶膜蛋白与靶膜蛋白所在的细胞膜结合，内化到细胞中并降解。

2.相关技术的描述

膜蛋白与细胞或细胞器的膜结合或与其关联，并根据其定位展现它们自身的特征性功能。对膜蛋白功能的研究主要依赖于用siRNA去干扰感兴趣蛋白的表达。然而，通过用siRNA干扰蛋白表达来研究膜蛋白的功能是有局限的。

一种鉴别膜蛋白功能的更有利途径是蛋白在膜中正常表达和定位后将其除去。例如，作为癌细胞相关膜蛋白已知的58种不同的受体酪氨酸激酶(RTKs)共享一种非常常见的结构。这些RTK蛋白根据其与配体的结合而形成同二聚体或异二聚体，并通过与各种膜蛋白或细胞内蛋白的相互作用参与信号传导通路，从而导致包括细胞增殖、分化、迁移、存活、附着和代谢在内的各种作用。也就是说，膜蛋白展现其自身的功能，例如，仅仅当其在膜中正常表达和定位后才从细胞外基质向细胞质转导信号。

如上所述，膜蛋白的功能主要通过使用siRNA来进行研究，但其具有加诸其上的限制，且由于膜蛋白的特征性功能大大受制于其在细胞中的定位，优选并需要膜蛋白在膜中正常表达和定位后将其消耗掉。具体地，消耗靶膜蛋白的方法如果能消耗质膜上的靶特异性蛋白，就可以象siRNA技术一样被普遍采用。

因此，需要用于消耗正常表达和定位的膜蛋白包括RTK的技术，其将用于膜蛋白精确功能的分析和膜蛋白的有效调节。

发明内容

本申请提供了一种消耗靶膜蛋白的组合物，所述组合物包含二元结合分子，所述二元结合分子包含与驱动物膜蛋白结合的第一结合域和与靶膜蛋白结合的第二结合域，其中当二元结合分子的第一结合域结合驱动物膜蛋白时，所述驱动物膜蛋白和靶膜蛋白与细胞膜上靶膜蛋白所在的部位结合，内化到细胞中并降解。

本申请还提供了用于治疗或预防癌症的包含二元结合分子的组合物。在相关的方面，本申请提供了二元结合分子以及包含所述二元结合分子的药物组合物。

附图简述

图1是说明靶膜蛋白消耗机制的示意图。

图2是说明质膜中靶膜蛋白消耗的示意图。

图3是说明膜蛋白消耗系统中用到的组分(双特异性抗体:BsAb)的示意图。

图4是说明抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体对MKN45胃癌细胞中降解的c-Met的活性的曲线图(Y-轴:c-Met相对于对照(培养基)的相对水平；X-轴:L3-1Y IgG2:抗-c-Met抗体,ME-01和ME-03:抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体,MH2-01:抗-c-Met/抗-HER2双特异性抗体).

图5是显示抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体诱导的MKN45胃癌细胞中EGFR降解的荧光图像(黄色:抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体；红色:抗-c-Met抗体；绿色:抗-EGFR抗体)。

图6是比较用抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体处理的MKN45胃癌细胞和用抗-EGFR抗体单独或与抗-c-Met抗体组合处理的细胞之间的EGFR的细胞内化或降解的荧光图像(黄色:抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体；红色:抗-c-Met抗体；绿色:抗-EGFR抗体)。

图7是比较用抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体处理的MKN45胃癌细胞和用抗-c-Met抗体单独或与抗-EGFR抗体(抗EGFR ab或Erbitux(爱必妥))组合处理的细胞之间的EGFR的细胞内化或降解的荧光图像(黄色:抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体；红色:抗-c-Met抗体；绿色:抗-EGFR抗体)。

图8是比较用抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体处理的MKN45胃癌细胞和用抗-c-Met抗体或抗-EGFR抗体(抗EGFR ab)单独或其组合处理的细胞之间的EGFR的细胞内化或降解的荧光图像(黄色:抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体；红色:抗-c-Met抗体；绿色:抗-EGFR抗体)。

图9显示用抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体处理后经Western印迹测量的MKN45胃癌细胞(上图)和EBC-1肺癌细胞(下图)中EGFR的总水平和EGFR活性。

图10显示用抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体处理后经Western印迹测量的具有低表达水平c-Met的A431癌细胞中EGFR的总水平和EGFR活性。

图11显示经Western印迹测量的野生型HCC827肺癌细胞和HCC827耐厄洛替尼细胞(HCC827ER)中c-Met对EGFR降解的影响。

图12显示经Western印迹测量的MKN45胃癌细胞中抗-c-Met/抗-Her2双特异性抗体所致的HER2-特异性降解。

图13的荧光图像显示，在低水平表达c-Met的A549癌细胞中，当过表达c-Met后，c-Met对于抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体诱导的EGFR降解的影响。

图14的荧光图像显示，在低水平表达c-Met的HeLa细胞中，当过表达c-Met后，c-Met对于抗-c-Met/抗-EGFR双特异性抗体诱导的EGFR降解的影响。

图15包括多个显示huAbF46抗体表位作图的ELISA结果的曲线图。

图16是huAbF46抗体的示意图，显示了该抗体SEMA域上的表位位置。

具体实施方式

本申请的一个实施方案提供了用于靶特异性细胞膜蛋白消耗的组合物，其包含与驱动物膜蛋白结合的第一结合域和与靶膜蛋白结合的第二结合域。

二元结合分子通过其第一和第二结合域同时结合驱动物膜蛋白和靶膜蛋白。一旦与二元结合分子结合，驱动物膜蛋白被触发而发生胞吞，随后结合的靶膜蛋白向细胞内迁移，这些蛋白最终在细胞内部被降解(参见图1和2)。

图1的示意图举例说明了根据一个实施方案的膜蛋白消耗技术。在图1中，当将能够识别靶膜蛋白并同时结合驱动物膜蛋白的二元结合分子应用到在其膜中含有靶物(target)和驱动物(driver)的那些细胞时，二元结合分子的结合作为触发因素而启动胞吞和降解。

图2的示意图举例说明根据一个实施方案以靶特异性方式消耗靶膜蛋白的机制。虽然质膜中存在各种蛋白，但二元结合分子对靶是特异性的而无需与其它膜蛋白相互作用，由此触发仅是靶蛋白和驱动蛋白的内化和降解。

本申请中所用的术语“驱动物膜蛋白”是指用于通过与二元结合分子的相互作用将靶膜蛋白运输至细胞内的蛋白。

驱动物膜蛋白可以是通过与配体、抗体或其它蛋白或肽的相互作用(例如，结合)而经受内化的任何蛋白。类似地，靶膜蛋白可以是位于细胞膜上的、当通过二元结合分子与驱动物蛋白连接时可被内化的任何蛋白。驱动蛋白和靶蛋白可独立地选自受体、通道蛋白、膜酶、脂蛋白、整联蛋白(integrins)、细胞表面上的各种标志物等。例如，驱动物膜蛋白和靶膜蛋白可独立地选自受体酪氨酸激酶(例如，c-Met蛋白、c-Met蛋白突变体、EGFR、HER2、HER3、VEGFR、PDGFR、IGF1R、ephrin受体、FGFR等)、整联蛋白、NMDA受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)、运铁蛋白受体、低密度脂蛋白(LDL)受体、分化抗原簇或指定簇(clusters of designation)(CDs)(例如，CD11a、CD20、CD3、CD33、CD44、CD59、CD73、CD152(CTLA4)等)、NTRK2(神经营养性酪氨酸激酶)、外周膜蛋白、四穿膜区蛋白(tetraspanins)(例如，CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B等)和可通过抗体结合而被内化的用于抗体药物偶联物(ADC)的膜靶标(参考文献:2013NatureReviews Drug Discovery12:330,将其引入本申请作为参考)(例如，CD22、CD79b、CD22、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、叶酸受体1、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAP1、CD70、SLC44A4、柄蛋白(Nectin)4、AGS-16、鸟苷酰环化酶C、粘蛋白1、EGFRvIII、间皮素等)。

在一个实施方案中，驱动物膜蛋白可以是当其细胞外域与配体或抗体结合时可被内化至细胞中的任何蛋白。可替换地，驱动物膜蛋白可以是经过改造而能在与配体或抗体相互作用后被胞吞而野生型则不能的突变体。

在另一个实施方案中，驱动物膜蛋白可以是位于或被引入细胞膜上靶膜蛋白所处部位的蛋白。驱动物膜蛋白因二元结合分子的第一结合域与其结合而被触动，从而被内化至细胞中并被降解。根据一个实施方案，驱动物膜蛋白可以是选自以下的至少一种：

1)通过与配体、抗体、非抗体蛋白相互作用能被诱导经受内化的受体酪氨酸激酶(RTKs)(例如，c-Met蛋白、c-Met蛋白突变体、表皮生长因子受体(EGFR；ErbB1)、HER2(人类表皮生长因子受体2蛋白；ErbB2)、HER3(人类表皮生长因子受体3蛋白；ErbB3)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子(VEGFR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、ephrin受体、成纤维细胞生长因子受体(FGFR))；

2)通过与配体、抗体、非抗体蛋白相互作用被诱导经受内化的受体(例如，运铁蛋白受体、低密度脂蛋白(LDL)受体、分化抗原簇或指定簇(CD)(例如，CD11a、CD20、CD3、CD33、CD44、CD59、CD73、CD152(CTLA4))、NTRK2(神经营养性酪氨酸激酶))；

3)四穿膜区蛋白(例如，CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B)；和

4)可通过抗体结合而被内化的用于抗体药物偶联物(ADC)的膜靶标(参考文献:2013Nature Reviews Drug Discovery12:330)(例如，CD22、CD79b、CD22、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、叶酸受体1、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAP1、CD70、SLC44A4、柄蛋白4、AGS-16、鸟苷酰环化酶C、粘蛋白1、EGFRvIII、间皮素等)。

不考虑类型、性质和功能，靶膜蛋白可以是任何型式的膜蛋白。此外，不能自身触发而被内化至细胞中的膜蛋白可在靶标的范围之内。

在一个实施方案中，驱动物膜蛋白可以是c-Met蛋白，而与驱动物膜蛋白结合的二元结合分子第一结合域可与c-Met蛋白SEMA域(SEQ ID NO:79)中从第143位至第147位的氨基酸序列SEQ ID NO:73(EEPSQ)结合。

例如，靶膜蛋白可以是受体介导的与异常细胞(例如在肿瘤发生中)有关的细胞信号，或是通道蛋白。在一个实施方案中，靶膜蛋白可以是异常细胞相关性疾病如癌症的治疗靶标。

如上所述，靶膜蛋白可以是任何膜蛋白，其包括整合蛋白(integralprotein)如G-蛋白偶联受体(GPCRs)、受体酪氨酸激酶等，以及外周膜蛋白。具体地，其可以选自微丝结合蛋白(microfilament-associated proteins)、细胞粘附分子、膜酶、膜受体、载体蛋白、通道蛋白、转运蛋白、指向细胞外的脂质锚定蛋白及其组合。任何整合蛋白如果通过如上所述与配体或抗体的相互作用而被内化，均可用作靶膜蛋白而与驱动物膜蛋白偶联。在一个实施方案中，整合蛋白可选自受体酪氨酸激酶(RTKs)、G-蛋白偶联受体(GPCR)和各种受体(运铁蛋白受体、低密度脂蛋白(LDL)受体、分化抗原簇(指定簇；CD))以及它们的组合。靶膜蛋白可以是在细胞功能中发挥重要作用的蛋白中的一种，并且尤其选自表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、HER2蛋白(人类表皮生长因子受体2蛋白)、HER3蛋白(人类表皮生长因子受体32蛋白)和血小板源性生长因子受体(PDGFR)。

如本申请中所用，术语“c-Met蛋白”表示与肝细胞生长因子配体结合的受体酪氨酸激酶。所述c-Met蛋白可来源于任何物种，例如，灵长类物种，如人类c-Met(例如，NP_000236)和恒河猴c-Met(例如，Macaca mulatta,NP_001162100)，或者啮齿类物种，如鼠c-Met(例如，NP_032617.2)和大鼠c-Met(例如，NP_113705.1)。所述蛋白可包括例如由GenBank登录号NM_000245的核苷酸序列编码的多肽，或者由GenBank登录号NP_000236的氨基酸序列编码的蛋白，或者所述多肽或蛋白加上它们的细胞外域。所述c-Met蛋白已知是一种受体酪氨酸激酶，其涉及包括肿瘤发生、癌症转移、癌细胞的迁移和浸润、及血管发生在内的多种活动。

表皮生长因子受体(EGFR)、HER2(人类表皮生长因子受体2蛋白)和HER3(人类表皮生长因子受体3蛋白)是HER家族的成员，该家族包括四种质膜结合型受体酪氨酸激酶(RTKs)，EGFR(HER1)、HER2、HER3和HER4。

当它们的细胞外域与配体结合时，EGFR、HER2和HER3被四种ErbB受体中的任一种诱导成同二聚体或异二聚体，从而导致受体胞质域内酪氨酸残基的自磷酸化作用。EGFR自磷酸化作用导致包括MAPK和PI3K/Akt的下游信号传导网络活化，其依次诱导细胞增殖、血管发生和转移。EGFR、HER2和/或HER3的过表达或基因扩增、突变或重排往往在多种不同的人类恶性肿瘤中被发现，且与癌症治疗的预后不佳和临床结果有关。由于该原因，EGFR、HER2和/或HER3是用于抗癌疗法的重要靶标。

EGFR、HER2或HER3可来源于哺乳动物如灵长类(例如，人类、猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。例如，EGFR是包括由如下GenBank登录号的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽JQ739160、JQ739161、JQ739162、JQ739163、JQ739164、JQ739165、JQ739166、JQ739167、NM_005228.3、NM_201284.1、NM_201282.1或NM_201283.1。在一个实施方案中，HER2可以是由GenBank登录号X03363.1的核苷酸序列(mRNA)编码的多肽，而HER3则可以是由GenBank登录号NM_001982的核苷酸序列(mRNA)编码的多肽。

血管内皮生长因子受体(VEGFRs)存在于癌细胞以及正常细胞的质膜中并介导VEGF诱导的血管发生的信号传导，其对于癌细胞的营养供应是必要的。VEGFR的过表达是多种疾病的病因尤其是肿瘤生成的原因，并涉及不佳的治疗预后，如侵入、转移等。相应地，VEGFR是用于抗癌疗法的一种重要靶标。VEGFR可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，VEGFR可以是包括由GenBank登录号AF063657.2的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽。

血小板源性生长因子受体(PDGFRs)是细胞表面酪氨酸激酶受体并涉及细胞增殖、分化和生长及包括癌症在内的多种疾病发作的调节机制。PDGFR可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，PDGFR可以是包括由GenBank登录号NM_006206.4(PDGFR-A)、NM_002609.3(PDGFR-B)或NM_016205.2(PDGFR-C)的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽。

胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，属于一大类酪氨酸激酶受体，其为由胰岛素样生长因子1(IGF-1)活化的跨膜受体。IGF1R可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，IGF1R可以是包括由GenBank登录号NM_000875.3的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽。

Ephrin受体是细胞表面受体酪氨酸激酶并介导涉及胚胎发育过程调节的ephrin信号传导，所述胚胎发育过程包括轴突指导(axon guidance)、组织边界的形成、细胞迁移、和分节(segmentation)。Ephrin受体可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，ephrin受体可以是包括由GenBank登录号NM_004440.3、NM_004438.3、NM_004431.3、NM_004442.6、NM_017449.3、NM_004093.3、NM_004441.4、NM_182472.2、NM_005232.4、NM_005233.5、NM_173641.2、NM_001099439.1、NM_001080448.2、NM_001080448.2、NM_004443.3、NM_182689.1、NM_004428.2、NM_004439.5、NM_001962.2、NM_004429.4、NM_182644.2、NM_004952.4、NM_173655.2、NM_182690.2、NM_020526.3、NM_001406.3、NM_005227.2和NM_182685.1的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽。

成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是与成纤维细胞生长因子家族的成员结合的受体。这些受体中的一些涉及病理情况(pathological condition)。例如，FGFR3中的点突变可导致软骨发育不全。已经在脊椎动物中鉴定出五种不同的FGFR并且它们都属于酪氨酸激酶超家族(FGFR1至FGFR4和FGFR6)。FGFR1可包括由GenBank登录号NM_001174063或NM_001079908的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，FGFR2可包括由GenBank登录号NM_000141或NM_010207的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，FGFR3可包括由GenBank登录号NM_000142或NM_001163215的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，且FGFR4可包括由GenBank登录号NM_002011或NM_008011的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列。

运铁蛋白受体是运铁蛋白的载体蛋白。它通过经受体介导的胞吞(内化)将运铁蛋白-铁络合物内化而将铁输入到细胞中，它随细胞内铁浓度而被调节。运铁蛋白受体可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，运铁蛋白受体可以是包括由GenBank登录号NM_001128148.1、NM_003234.2、NM_001206855.1、NM_003227.3、BC001188.1或M11507.1的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽。

低密度脂蛋白(LDL)受体是识别埋入LDL颗粒的磷脂外层中的载脂蛋白B100的细胞表面受体。它介导富含胆固醇的LDL的胞吞。LDL受体可来源于哺乳动物和啮齿类。例如，LDL受体可以是包括由GenBank登录号NM_000527.4、NM_001195802.1、NM_001195799.1、NM_001195803.1、NM_001195800.1或NM_001195798.1的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列的多肽。

分化抗原簇(指定簇；CD)分子可作为涉及包括细胞信号传导和细胞粘附的多种细胞过程的受体或配体起作用，且对于人类其最近总计高达350种。CD分子可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，CD分子可来自任何来源，具体地可以是CD44、CD47或它们的突变体。在实施方案中，CD分子可以是由包括由GenBank登录号(NM_000610.3、NM_001728.3、X55150.1)的核苷酸序列(mRNA)分别编码的氨基酸序列的多肽。

G-蛋白偶联受体(GPCRs)是活化信号转导通路和细胞应答的跨膜受体并涉及多种疾病。基于序列同源性和序列相似性，GPCR可分为6类：A类或1类(视紫红质样受体)；B类或2类(胰泌素受体家族)；C类或3类(代谢型谷氨酸/信息素)；D类或4类(真菌交配信息素受体)；E类或5类(环AMP受体)；以及F类或6类(卷曲的/平滑的)。GPCR可来源于哺乳动物，其包括灵长类如人类和猴，以及啮齿类如小鼠和大鼠。例如，GPCR可以是癌症转移相关的趋化因子受体(视紫红质样受体亚家族)，例如，CXC趋化因子受体、CC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体等。在一个实施方案中，GPCR可以是包括由GenBank登录号NM_001123041.2、NM_005508.4、NM_005201.3和NM_016602.2的核苷酸序列(mRNA)分别编码的氨基酸序列的多肽。

四穿膜区蛋白(例如，CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B等)是一个具有33个哺乳动物成员的跨膜蛋白的家族，其在几乎所有细胞和组织类型中的质膜上以及多种细胞内细胞器和颗粒中不定期被发现。与许多其他细胞表面蛋白相比，四穿膜区蛋白不具有明显的受体功能。四穿膜区蛋白在内体系统和溶酶体相关细胞器中被发现。这些包括血小板中的致密颗粒和α颗粒、黑色素细胞中的黑色素体、T细胞中的细胞毒性颗粒、内皮细胞中的Weibel-Palade体和树突细胞中的主要组织相容性复合物II(MHCII)隔室。此外，在许多细胞类型中，晚期内体/MVB(多泡体)可被触发从而与细胞表面融合并释放功能上与癌症进展和转移有关的外体。这些暗示着四穿膜区蛋白可被用作膜消耗的驱动物或靶物。CD9可包括由GenBank登录号NM_001769或NM_007657的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，CD81可包括由GenBank登录号NM_004356或NM_133655的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，CD151可包括由GenBank登录号NM_001039490或NM_001111049的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，CD63可包括由GenBank登录号NM_001040034或NM_001042580的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，CD37可包括由GenBank登录号NM_001040031或NM_007645的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，CD53可包括由GenBank登录号NM_000560或NM_007651的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，NET1可包括由GenBank登录号NM_001047160或NM_001047159的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，NET2可包括由GenBank登录号NM_012338或NM_173007的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，NET6可包括由GenBank登录号NM_014399或NM_025359的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，TM4SF6可包括由GenBank登录号NM_001278743、NM_001278742、NM_001278741、NM_001278740、NM_003270或NM_019656的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，Tspan2可包括由GenBank登录号NM_005725、NM_001243132或NM_027533的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，Tspan3可包括由GenBank登录号NM_001168412、NM_198902、NM_005724或NM_019793的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列，且TM4B(TSPAN16)可包括由GenBank登录号NM_001282510、NM_001282509或NM_012466的核苷酸序列(mRNA)编码的氨基酸序列。

消耗靶膜蛋白的组合物不是简单地通过结合来抑制一些靶膜蛋白的活性，所述靶膜蛋白介导与异常细胞状态有关的细胞信号或参与包括癌症在内的疾病的病因学，而是通过触发胞吞(内化)和降解起作用从而消耗靶膜蛋白。

为了消耗靶膜蛋白的组合物能有效工作，驱动膜蛋白驱动物膜蛋白和靶膜蛋白都必须存在于相同的细胞(例如，相同的细胞膜)上。考虑到质膜的柔性和流动性以及质膜中靶膜蛋白的水平(例如，在异常细胞中的表达水平)，对相同细胞膜上驱动膜蛋白驱动物膜蛋白和靶膜蛋白之间的距离没有具体的限定。

消耗靶膜蛋白的组合物中所含的双重结合分子中的第一结合域和第二结合域可各自独立地选自针对驱动膜蛋白驱动物膜蛋白或靶膜蛋白的抗体、它们的抗体片段(例如，抗原结合片段)，以及抗体模拟物(mimics)(也称作抗体模仿物(mimetics))。第一和第二结合域的具体实例包括，例如抗体(例如，完整免疫球蛋白形式)、scFv抗体、噬菌体抗体、域抗体、DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白(Designed Ankyrin Repeat Proteins))、纤连蛋白域、kringle域、纳体(nanobodies)、肽体(peptibodies)、肽或aptides或它们的组合。

例如，第一结合域可源自对抗驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，而第二结合域可源自对抗靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段。因此，二元结合分子可以是驱动物膜蛋白和靶膜蛋白的双特异性(二元结合)抗体，其包括各自与驱动物膜蛋白和靶膜蛋白的结合域。

在一个实施方案中，双特异性抗体可包括：

对抗驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段；和

对抗靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，

其中对抗靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段与对抗驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段的C末端或N末端连接。

在这方面，双特异性抗体可具有垂直不对称性，其中双特异性抗体的N末端部分(例如，来自Fc区域的N末端部分)和C末端部分(例如，来自Fc区域的C末端部分)在结构上不同(例如，它们彼此不同并独立地选自scFv片段、(scFv)₂、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段和抗体模拟物如DARPin，以及，和/或在功能上彼此不同(例如，N末端和C末端特异性识别不同的蛋白和/或与不同的蛋白结合))。可替换地，具有垂直不对称性的双特异性抗体可包含完整形式的抗体(例如，IgG形式)和与抗体的C末端或N末端连接的抗体片段(例如，scFv片段、(scFv)₂、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段或抗体模拟物如DARPin)，其中所述抗体和抗体片段可识别彼此相同或不同的抗原。

在另一个实施方案中，双特异性抗体可包括：

针对驱动物膜蛋白的单链抗体(scFvFc)或其抗原结合片段(scFv)；和

针对靶膜蛋白的单链抗体(scFvFc)或其抗原结合片段(scFv)，

其中对抗驱动物膜蛋白的单链抗体或其抗原结合片段与对抗靶膜蛋白的单链抗体或其抗原结合片段接合，从而形成双侧不对称。

因此，双特异性抗体可以是双侧不对称的，其中两个单链抗体与彼此不同的蛋白特异性地结合。

在消耗靶膜蛋白的组合物或在双特异性抗体中，对于抗驱动物膜蛋白的抗体而言重要的是，起到介导细胞内化和降解两方面的作用。为了展现其功能，对抗驱动物膜蛋白的抗体可具有完整抗体形式(例如，全免疫球蛋白形式)。另一方面，因为对于抗靶膜蛋白的抗体而言重要的是，特异性识别靶膜蛋白并与其结合，故这种抗体可以是抗原结合片段或完整抗体的形式。在一个实施方案中，因此，双特异性抗体可包括对抗驱动物膜蛋白的完整抗体和对抗靶膜蛋白的抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段与对抗驱动物膜蛋白的完整抗体的C末端连接。

为了说明驱动物膜蛋白和靶膜蛋白之间的距离，二元结合分子中驱动物膜蛋白的第一结合域可与靶膜蛋白的第二结合域分开足够的距离，从而促进靶膜蛋白和驱动物膜蛋白结合。因此，二元结合分子可具有一种结构，其中第一结合域可通过柔性连接体与第二结合域连接。

在双特异性抗体中，对抗驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段可与对抗靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段直接连接或通过肽连接体连接。肽连接体可由1至100个氨基酸、2至50个氨基酸或5至20个氨基酸组成。对于肽连接体中所使用的氨基酸种类没有设置限定。例如，肽连接体可包括至少一个选自Gly、Asn和Ser的残基，或者可包括中性氨基酸如Thr和/或Ala。适合用于肽连接体的氨基酸可以是本领域已知的。肽连接体还可以是任何长度，条件是其不使双特异性抗体的功能无效。

在一个实施方案中，对抗靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段可选自抗-EGFR抗体、抗-HER2抗体、抗-HER3抗体、抗-VEGFR抗体、抗-PDGFR抗体、抗-IGF-1R抗体和它们的抗原结合片段。抗-EGFR抗体可选自西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥(Erbitux))、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、MM-151(一种寡克隆治疗物，其由设计为与EGFR的非重叠表位结合的三种全长人单克隆抗体的混合物组成)、包括含有SEQID NO:109或113所示氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:110或114所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体。抗-HER2抗体可选自曲妥珠单抗(trastuzumab，赫塞汀(Herceptin))或帕妥珠单抗(pertuzumab)。抗-HER3抗体可以是RG-7597(人源化IgG1单克隆抗体)。例如，抗-VEGFR2(KDR)抗体和抗-PDGFR抗体可以分别是雷莫芦单抗(ramucirumab)和奥拉图单抗(olaratumab,IMC-3G3)。西旭木单抗(Cixutumumab，IMC-A12)可适合用作抗-IGF-1R抗体。

如上所述，对抗靶膜蛋白的抗体可以以双特异性抗体的完整形式或抗原结合片段形式存在。

对抗驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段可以是抗-c-Met抗体或能够有效地将对抗靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段内化的抗体。对抗驱动物膜蛋白的抗体可为完整抗体或抗原结合片段的形式。

如本申请所用，术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白上与抗原结合的片段。例如，抗原结合片段可以是scFv片段、(scFv)₂、Fab片段、Fab'片段或F(ab')₂片段，但不限于这些。

Fab片段包含来自轻链的一个可变域和一个恒定域及来自重链的一个可变域和一个恒定域(C_H1)，其保留一个抗原结合位点。

Fab'片段与Fab的不同之处在于：Fab’还包括铰链区，包括位于重链C_H1域C末端的至少一个半胱氨酸残基。当两个Fab'片段通过铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键连接时，形成F(ab')₂片段。

Fv片段是仅含重链和轻链的可变域的最小抗体片段。生产Fv的重组技术是本领域已知的。在双链Fv片段中，重链可变区通过非共价键与轻链可变区相连。单链Fv具有如下结构，其中重链可变域和轻链可变域直接在C末端彼此共价连接，且两个单链Fv片段可像在双链Fv片段中那样形成二聚体。肽连接体可包括1至100个氨基酸残基、2至50个氨基酸残基或5至20个氨基酸残基，对于氨基酸残基的种类没有设置限定。例如，肽连接体可包括至少一个选自Gly、Asn和Ser的残基，且还可包括中性氨基酸如Thr和/或Ala。适合用于肽连接体的氨基酸可以是本领域公知的那些。只要其对抗原结合片段的功能没有负面影响，肽连接体的长度可被适当调整。

抗原结合片段可以用蛋白酶来制备(例如，完整抗体用木瓜蛋白酶消化将裂解成两个Fab片段，而用胃蛋白酶将产生F(ab')₂片段)。可替换地，基因重组技术可用于生产抗原结合片段。

在一个实施方案中，双特异性抗体可包括抗-c-Met抗体和对抗靶膜蛋白的抗体(例如，抗-EGFR抗体、抗-HER2抗体、抗-HER3抗体、抗-VEGFR抗体或抗-PDGFR抗体)的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'或F(ab')₂片段，其中所述片段与抗-c-Met抗体的C末端连接，优选scFv。例如，抗-EGFR抗体的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'或F(ab')₂片段包括包含如SEQ ID NO:109或113所规定的氨基酸序列的重链可变域和包含如SEQ ID NO:110或114所规定的氨基酸序列的轻链可变域。在一个实施方案中，因此双特异性抗体包括抗-c-Met抗体、还包括抗-EGFR抗体的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'或F(ab')₂片段，其中所述片段与抗-c-Met抗体的C末端连接，且包括包含如SEQ IDNO:109或113所规定的氨基酸序列的轻链可变域和包含如SEQ ID NO:110或114所规定的氨基酸序列的重链可变域。

抗c-Met抗体可以是对c-Met起作用从而诱导c-Met向细胞内内化并被降解的任何抗体或抗原结合片段。抗c-Met抗体或其抗原结合片段可识别c-Met的特异性区域，例如，SEMA域中的特异性区域，如表位。

c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的受体，可分为三个部分：细胞外、跨膜和细胞内部分。细胞外部分由通过二硫键彼此连接的α亚基和β亚基组成，并含有负责结合HGF的SEMA域、PSI域(丛状蛋白-导向蛋白(semaphorins)-整联蛋白同一性/同源性域)和IPT域(由丛状蛋白和转录因子域共享的免疫球蛋白样折叠)。c-Met蛋白的SEMA域可包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列，且是起与HGF结合的作用的细胞外域。SEMA域的特异性区域，即包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列的区域，其对应于SEMA域(SEQID NO:79)的氨基酸序列的第106至124位氨基酸残基，是SEMA域的表位中第二和第三螺旋之间的环区。该区域可作为抗c-Met抗体的表位起作用。

如本申请所用，术语“表位”是指抗原决定簇，是抗体所识别的抗原的一部分。在一个实施方案中，表位可以是包括c-Met蛋白的SEMA域(SEQID NO:79)中5个或更多相连的(连续的或非连续的)氨基酸残基的区域，例如，SEQ ID NO:71的5至19个连续的氨基酸残基。例如，表位可以是包括选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分组合的5至19个相连氨基酸的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:73(EEPSQ)的氨基酸序列作为表位的必要要素。SEQ ID NO:73的氨基酸序列从c-Met蛋白的SEMA域(SEQ IDNO:79)的第143位至147位。例如，表位可以是包括SEQ ID NO:71、SEQID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列，或基本上由所述序列组成，或者只是由所述序列组成的多肽。

包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列的表位对应于c-Met蛋白的SEMA域中第二和第三螺旋之间的环的最外面部分。包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位是根据一个实施方案的抗体或抗原结合片段最特异性结合的位点。

因此，抗c-Met抗体可特异性结合具有选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分组合的5至19个连续的或非连续的氨基酸的表位，其包括SEQID NO:73作为必要要素。例如，抗c-Met抗体可特异性结合包括SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位。

在一项实施方案中，所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段可包括：

至少一种重链互补决定区(CDR)，选自(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO:2的8-19个连续氨基酸(包括SEQ ID NO:2的第3至第10位)的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6、SEQID NO:85的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO:85的6-13个连续氨基酸(包括SEQ ID NO:85的第1至第6位)，或者包含包括所述至少一个重链互补决定区的重链可变区；

至少一个轻链互补决定区(CDR)，选自(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:86的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO:89的9-17个连续氨基酸(包括SEQ ID NO:89的第1至第9位)的氨基酸序列，或者包含包括所述至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；

所述至少一个重链互补决定区和所述至少一个轻链互补决定区的组合；或

所述重链可变区和所述轻链可变区的组合。

本文中，SEQ ID NOS:4–9的氨基酸序列分别由下式I-VI表示：

式I

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4)，

其中Xaa₁不存在或为Pro或Ser，且Xaa₂为Glu或Asp；

式II

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr(SEQ ID NO:5)，

其中Xaa₃为Asn或Lys，Xaa₄为Ala或Val，且Xaa₅为Asn或Thr，

式III

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr(SEQ ID NO:6)，

其中Xaa₆为Ser或Thr，

式IV

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)

其中Xaa₇为His、Arg、Gln或Lys，Xaa₈为Ser或Trp，Xaa₉为His或Gln，且Xaa₁₀为Lys或Asn，

式V

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃(SEQ ID NO:8)

其中Xaa₁₁为Ala或Gly，Xaa₁₂为Thr或Lys，且Xaa₁₃为Ser或Pro，和

式VI

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr(SEQ ID NO:9)

其中Xaa₁₄为Gly、Ala或Gln，Xaa₁₅为Arg、His、Ser、Ala、Gly或Lys，且Xaa₁₆为Leu、Tyr、Phe或Met。

在一项实施方案中，所述CDR-H1可包括选自SEQ ID NOS:1、22、23和24的氨基酸序列。所述CDR-H2可包括选自SEQ ID NOS:2、25和26的氨基酸序列。所述CDR-H3可包括选自SEQ ID NOS:3、27、28和85的氨基酸序列。

所述CDR-L1可包括选自SEQ ID NOS:10、29、30、31、32、33和106的氨基酸序列。所述CDR-L2可包括选自SEQ ID NOS:11、34、35和36的氨基酸序列。所述CDR-L3可包括选自SEQ ID NOS:12、13、14、15、16、37、86和89的氨基酸序列。

在另一项实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可包括重链可变区，其包括包含选自SEQ ID NOS:1、22、23和24的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)、包含选自SEQ ID NOS:2、25和26的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，和包含选自SEQ ID NOS:3、27、28和85的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)；和轻链可变区，其包括包含选自SEQ ID NOS:10、29、30、31、32、33和106的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)、包含选自SEQ ID NOS:11、34、35和36的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和包含选自SEQ ID NOS12、13、14、15、16、37、86和89的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。

当注射于人用于医学治疗目的时，通过使用所需的抗原免疫无免疫性的动物产生的动物来源的抗体通常会引起免疫原性，因此已研发嵌合抗体以抑制此类免疫原性。通过基因工程使用人抗体的恒定区替换引起抗同工型应答的动物来源的抗体的恒定区来制备嵌合抗体。与动物来源的抗体相比，嵌合抗体极大地改善了抗同工型应答，但是动物来源的氨基酸仍具有可变区，以至于嵌合抗体对潜在的抗个体基因型应答有副作用。已研发人源化抗体以减少此类副作用。人源化抗体通过将在嵌合抗体的可变区的抗原结合中起重要作用的互补决定区(CDR)移植至人抗体框架中而产生。

在CDR移植产生人源化抗体中最重要的事情是为接受动物来源的抗体的CDR选择优化的人抗体。使用了抗体数据库、晶体结构分析和分子模型技术。然而，即使当所述动物来源的抗体的CDR被移植至最优化的人抗体框架时，位于动物来源的CDR的框架中的氨基酸对抗原结合影响仍然存在。因此，在很多情况中，抗原结合亲和力不能被维持，因而需要恢复所述抗原亲和力的其它抗体工程技术的应用。

所述抗c-Met抗体可以是小鼠来源的抗体、小鼠-人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述抗体或其抗原结合片段可以自活体分离。

完整的抗体包括两个全长轻链和两个全长重链，其中每个轻链通过二硫键连接至重链。所述抗体具有重链恒定区和轻链恒定区。所述重链恒定区为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)型，其可进一步分为gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)或alpha2(α2)。所述轻链恒定区为kappa(κ)或lambda(λ)型。

如本文所用，术语“重链”指的是全长重链和其片段，其包括包含足以提供对抗原特异性的氨基酸序列的可变区V_H，和三个恒定区，C_H1、C_H2和C_H3，以及铰链。术语“轻链”指的是全长轻链和其片段，其包括包含足以提供对抗原特异性的氨基酸序列的可变区V_L，和恒定区C_L。

术语“互补决定区(CDR)”指的是存在于免疫球蛋白的重链或轻链的高变区中的氨基酸序列。所述重链和轻链可分别包含三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3；和CDRL1、CDRL2和CDRL3)。所述CDR可提供在抗体与抗原或表位的结合中起重要作用的接触残基。术语“特异性结合”和“特异性识别”是本领域普通技术人员所公知的，且表示抗体和抗原彼此特异性接触以产生免疫活性。

在一项抗c-Met抗体或抗原结合片段的实施方案中，所述重链的可变域包括SEQ ID NO:17、74、87、90、91、92、93或94的氨基酸序列且所述轻链的可变域包括SEQ ID NO:18、19、20、21、75、88、95、96、97、98、99或107的氨基酸序列。

在一项实施方案中，所述抗c-Met抗体可以是单克隆抗体。所述单克隆抗体可由保藏号为KCLRF-BP-00220的杂交瘤细胞系产生，其特异性地结合c-Met蛋白的胞外区(参考韩国专利公开2011-0047698，其公开内容在此全部引入作为参考)。所述抗c-Met抗体可包括韩国专利公开2011-0047698中所定义的所有抗体。

在所述抗c-Met抗体中，所述轻链和所述重链除如上所定义的CDR、轻链可变区和重链可变区外的其余部分为轻链恒定区和重链恒定区，可以是免疫球蛋白的任一亚型(例如IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、等)的那些。

作为进一步实例，所述抗c-Met抗体或所述抗体片段可包括：

包含选自以下的氨基酸序列的重链：SEQ ID NO:62的氨基酸序列(其中所述氨基酸序列从第1至第17位的氨基酸残基为信号肽)，或SEQ ID NO:62从第18至第462位的氨基酸序列、SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其中从第1至第17位的氨基酸序列为信号肽)、SEQ ID NO:64从第18至第461位的氨基酸序列、SEQ ID NO:的氨基酸序列(其中从第1至第17位的氨基酸序列为信号肽)和SEQ ID NO:66从第18至第460位的氨基酸序列；和

包含选自以下的氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO:68的氨基酸序列(其中从第1至第20位的氨基酸序列为信号肽)、SEQ ID NO:68从第21至第240位的氨基酸序列、SEQ ID NO:70的氨基酸序列(其中从第1至第20位的氨基酸序列为信号肽)、SEQ ID NO:70从第21至第240位的氨基酸序列和SEQ ID NO:108的氨基酸序列。

例如，所述抗c-Met抗体可选自：

包含含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62从第18至第462位氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68从第21至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64从第18至第461位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68从第21至第240的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66从第18至第460位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68从第21至第240的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62从第18至第462位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70从第21至第240的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64从第18至第461位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70从第21至第240的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66从第18至第460位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70从第21至第240的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62从第18至第462位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链的抗体；

包含含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64从第18至第461位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链的抗体；和

包含含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66从第18至第460位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链的抗体。

根据一项实施方案，所述抗c-Met抗体可包含含SEQ ID NO:66从第18至第460位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:68从第21至第240位的氨基酸序列的轻链，或含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:66从第18至第460位的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链。

SEQ ID NO:70的多肽为含人kappa(κ)恒定区的轻链，而具有SEQ IDNO:68氨基酸序列的多肽是通过使用酪氨酸替换具有SEQ ID NO:70氨基酸序列的多肽的62位的组氨酸(根据kabat编号法对应于SEQ ID NO:68的36位)而获得的多肽。可通过替换增加所述抗体的产率。具有SEQ ID NO:108氨基酸序列的多肽是通过色氨酸替换32位的丝氨酸(根据kabat编号法在SEQ IDNO:68的氨基酸残基21-240的27e位，位于CDR-L1内)而获得的多肽。通过此类替换，包括这些序列的抗体和抗体片段展现出增加的活性，如c-Met结合亲和力、c-Met降解活性和Akt磷酸化抑制。

在另一项实施方案中，所述抗c-Met抗体可包括含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链互补决定区、含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区或含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链。

另一项实施方案提供消耗靶膜蛋白的方法，其包括使用消耗靶膜蛋白的组合物或使用包含于该组合物中的二元结合分子(或双特异性抗体)处理细胞，或者向需要消耗靶膜蛋白的患者给予消耗靶膜蛋白的组合物或包含于该组合物中的二元结合分子(或双特异性抗体)。所述消耗靶膜蛋白的方法可进一步包括在给予步骤前鉴别需要消耗靶膜蛋白的患者的步骤。

根据另一方面，提供了所述组合物或所述二元结合分子(或特异性抗体)在靶膜蛋白消耗中的用途。

所述细胞可以是任何源自哺乳动物包括灵长类如人和猴、或啮齿类如小鼠和大鼠的任何有活力的细胞。在一项实施方案中，所述细胞可以是癌细胞并表达驱动物膜蛋白，例如质膜中的c-Met蛋白。所述细胞可存在于机体中或可以是自机体分离的细胞。所述患者可以是哺乳动物，包括灵长类如人和猴，或啮齿类如小鼠和大鼠，且可以是患有与靶膜蛋白相关的疾病例如癌症的个体。

已知c-Met与RTK包括EGFR在癌细胞中共表达，并且由于所述癌细胞对抗癌剂的耐受性，在c-Met和其它RTK之间存在串扰。因此，抑制c-Met和RTK如EGFR或HER2两者为研发克服对常规抗癌剂的耐受性和常规抗癌剂所具有的问题的新抗癌剂提供了设想。

另一项实施方案提供了预防和/或治疗癌症的药物组合物，其包括消耗靶膜蛋白的组合物或二元结合分子(或特异性抗体)作为活性成分、并包括载体、稀释剂或赋形剂。

另一项实施方案提供了预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括向需要预防和/或治疗癌症的患者给予药学有效量的消耗靶膜蛋白的组合物或该组合物中所用的二元结合分子(例如双特异性抗体)。所述预防和/或治疗癌症的方法包括在给予步骤前鉴别需要预防和/或治疗癌症的患者的步骤。

另一项实施方案提供了消耗靶膜蛋白的组合物或二元结合分子(或双特异性抗体)在预防和/或治疗癌症中的用途。

所述方法可用于治疗或预防任何类型的癌症。可基于待治疗的癌症类型选择靶膜蛋白。癌症的实例包括但不限于鳞状细胞癌、小细胞肺癌、费小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、直肠癌、肛周癌、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性白血病、肝癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌或头部或颈部癌。所述癌症可以是原发癌或转移癌。具体地，所属癌症可以是对常规抗癌剂耐药的癌症，例如对所述靶膜蛋白的拮抗剂耐药的癌症。

除消耗靶膜蛋白的组合物或该组合物中所用的二元结合分子(或双特异性抗体)外，所述药物组合物可包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

只要通常可用于抗体的药物制剂，任何药学上可接受的载体可包含于该药物组合物中。所述可用于该药物组合物的药学上可接受的载体的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或其任意组合，但不限于此。除这些组分外，所述药物组合物可进一步包含选自以下的典型的添加剂：稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味增强剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂和其组合。

所述药物组合物可经口服或胃肠外给予。对于胃肠外给予，该给予可经由静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、局部、鼻内、肺内和直肠内途径进行，但不限于此。然而，对于口服给予，所述药物组合物可被包被或调配以保护活性成分在胃中免遭降解，因为蛋白质和肽可被胃蛋白酶分解。此外，该给予可在适于将所述药物组合物递送至靶细胞的仪器的辅助下进行。

取决于多种因素，包括制剂的类型、患者的年龄、体重和性别、所治疗病症的严重程度、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率和敏感度，有效量是可变的。例如，对于成人，所述组合物可以单剂0.001mg至100mg/kg给予。如本文所用，术语“药学有效量”指的是有效预防或治疗癌症所使用的量。

根据本领域的技术人员所公知的方法，所述药物组合物可与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起被调配成单位剂型，或者包含于多剂量包装中。在本文中，所述药物组合物可被调配成油或水性介质中的溶液、混悬剂、糖浆剂、乳剂、酏剂、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，且可进一步包含崩解剂或稳定剂。

所述药物组合物可被单独给予或与其它治疗剂组合给予。在此情况中，它们被与常规治疗剂序贯给予或同时给予。

包含二元结合分子(例如双特异性抗体)的药物组合物可被调配成免疫脂质体。包含抗体的脂质体可可使用本领域公知的方法制备。所述免疫脂质体可通过反相蒸发从包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG化的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物产生。例如，Fab'可通过二硫化物再形成而偶联至脂质体。所述脂质体可进一步含有抗癌剂如多柔比星。

被给予该药物组合物或者需要预防和/或治疗癌症的患者可包括哺乳动物，其包括灵长类如人或猴，和啮齿类如大鼠和小鼠，或衍生(分离)自上述动物的细胞或组织，但不仅限于此，并且可以是，例如，对所述靶膜蛋白的拮抗剂有抗性的癌症患者。

如上文所解释，靶膜蛋白和驱动蛋白(其负责使相同质膜中的靶膜蛋白内化至细胞中和降解)的共存是靶膜蛋白消耗的先决条件。在此条件下，所述二元结合分子(触发物)与所述靶蛋白的驱动物偶联，从而触发所述驱动子和所述靶内化至细胞中并降解。所述驱动子和靶蛋白必须在相同的质膜中共存，并且可内化至细胞中并在细胞内降解。所述二元结合分子(触发物)是一种能够高亲和力地结合靶膜蛋白和驱动物的分子，并且触发所述驱动子内化至细胞中并降解，从而将所述靶拉进细胞质并导致所述靶的降解。

图3的示意图解释了一项实施方案的驱动物蛋白和触发物(二元结合抗体)。EGFR，一种已知的作为抗癌靶点的膜蛋白，当经其相应的抗体处理时，其被抑制，但是却未被从有活力细胞的质膜中耗尽。在一项实施方案中，所述驱动物为含表位的c-Met蛋白，且所述二元结合抗体为对该表位和该驱动物均展现出高亲和力的双特异性抗体，允许c-Met有效地内化至细胞中并降解而不引起副作用(激动作用)。

事实上在应用至临床样品后，预期靶膜蛋白消耗技术会引起以下作用：

1.为细胞生物学领域提供一种研究膜蛋白功能的新时代的工具和方法，其可象siRNA技术一样被商业化。

2.扩展双特异性抗体的产品线：生产抗c-Met和第二靶点的双特异性抗体(其中当所述第二靶点与c-Met被共抑制时，预期所述第二靶点有协同效果)，并且由于其消耗所述抗癌靶点的能力其可用作抗癌剂，从而扩展了抗癌剂的产品线。

3.增加对抗癌疗法相关的主要靶点如EGFR、HER2等的功效：该技术允许这些靶点的所有同二聚体和异二聚体的降解，从而抑制这些靶点的原癌基因的功能。

4.克服c-Met相关的耐药性并生产具有增强的c-Met抗癌活性的抗体试剂。

通过以下实施例可获得对本发明更好的理解，这些实施例意在解释说明本发明，而不应理解为限制本发明。

实施例

参考例1:抗c-Met抗体的构建

1.1.生产“AbF46”，一种针对c-Met的小鼠抗体

1.1.1.小鼠的免疫

为获得生成杂交瘤细胞系所需的免疫小鼠，5只4-6周龄的BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)各自经腹膜内注射100μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&DSystems)和1倍体积的完全弗氏佐剂的混合物。注射的两周后，对相同小鼠第二次腹膜内注射50μg人c-Met/Fc蛋白和1倍体积不完全弗氏佐剂的混合物。在第二次免疫的一周后，免疫应答被末次加强。三天后，从小鼠尾部取血并将血清以1/1000稀释于PBS中并用于通过ELISA检查抗体对c-Met的效价。选择有足够抗体效价的小鼠用于细胞融合过程。

1.1.2.细胞融合和杂交瘤的生成

在细胞融合的三天前，BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)经腹膜内注射50μg人c-Met/Fc融合蛋白和1倍体积PBS的混合物而免疫。将免疫小鼠麻醉，然后将脾脏从左侧身体切除。将脾脏过筛以分离脾细胞，然后将脾细胞悬浮于培养基(DMEM,GIBCO,Invitrogen)中。离心该细胞悬浮液以回收细胞层。将所获得的脾细胞(1x10⁸细胞)与骨髓瘤细胞(Sp2/0)(1x10⁸细胞)混合，然后自旋以得到细胞沉淀(pellet)。将该细胞沉淀缓慢地悬浮，用含45％聚乙二醇(PEG)(1mL)的DMEM在37℃处理1分钟，补加1mL DMEM。在10分钟内向这些细胞中添加10mL DMEM，然后在37℃水浴中温育5分钟。将细胞体积调整至50mL，然后离心。将所形成的细胞沉淀以密度为1～2×10⁵细胞/mL再悬浮于选择培养基(HAT培养基)中，给96孔板的每个孔分配0.1mL细胞悬浮液，随后在37℃在CO₂培养箱中温育，以建立杂交瘤细胞群。

1.1.3.选择产生针对c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞

用人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白作为抗原，通过ELISA，从参考例1.1.2所建立的杂交瘤细胞群中筛选对c-Met显示特异性应答的杂交瘤细胞。

将人c-Met/Fc融合蛋白以50μL(2μg/mL)/孔的量接种于微量滴定板，使其附着于每个孔的表面。通过洗涤除去仍未结合的抗体。为了用于选择不结合c-Met但识别Fc的抗体，以相同的方式将人Fc蛋白附着于微滴板表面。

将参考例1.1.2所获得的杂交瘤细胞培养物以50μL的量添加至所述板的各孔中并培养1小时。使用足量的Tris缓冲盐水和吐温20(TBST)洗出仍未反应的细胞。将山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)添加至所述板并在室温培养1小时。使用足量的TBST洗涤所述板，随后将过氧化物酶与底物(OPD)反应。在ELISA读数器上测量450nm处的吸光度。

重复地选择出分泌特异性地并强烈地结合人c-Met但不结合人Fc的抗体的杂交瘤细胞系。在经重复选择获得的杂交瘤细胞系中，通过有限稀释最终分离出产生单克隆抗体的单个克隆。根据布达佩斯条约，所述产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单个克隆于2009年10月9日保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line Research Foundation)，一家位于Yungun-Dong,Jongno-Gu,Seoul,Korea的国际保藏单位，保藏号为KCLRF-BP-00220(参考韩国专利公开(Laid-Open Publication)2011-0047698)。

1.1.4.单克隆抗体的产生和纯化

将参考例1.1.3中获得的杂交瘤细胞系培养于无血清培养基中，并从该细胞培养物中产生和纯化单克隆抗体(AbF46)。

首先，将于补充有10％(v/v)FBS的50ml培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心，细胞沉淀用20ml PBS洗涤两次或更多次以从中除去FBS。然后将细胞再悬浮于50mL DMEM中，37℃在CO₂培养箱中培养3天。

通过离心除去细胞后，上清液在4℃保存备用或者立即用于抗体的分离和纯化。使用配备有亲和柱(G蛋白琼脂糖柱；Pharmacia，USA)的AKTAsystem(GE Healthcare)从50-300mL上清液中纯化抗体，然后使用过滤器(Amicon)浓缩。将抗体的PBS溶液贮存好，以备下述实施例所用。

1.2.构建chAbF46，一种针对c-Met的嵌合抗体

小鼠抗体易于在人中激发免疫原性。为了解决该问题，用人IgG1抗体的氨基酸序列替换恒定区而不是对抗体特异性负责的可变区，从而从参考例1.1.4所产生的小鼠抗体AbF46构建嵌合抗体chAbF46。

为此，将基因设计成包括重链核苷酸序列“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-TGA-XhoI”(SEQ ID NO:38)和轻链核苷酸序列“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI”(SEQ ID NO:39)，并合成。然后，具有重链核苷酸序列(SEQ ID NO:38)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:39)的DNA片段被EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，然后被分别克隆至OptiCHO^TM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVEC^TM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆至pcDNA^TM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中。

所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用Freestyle^TM MAX293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。293F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyle^TM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x10⁵细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x10⁶细胞/ml时，进行瞬时表达。通过脂质体试剂法使用Freestyle^TM MAX试剂(invitrogen)进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiPro^TM SFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)Freestyle^TM MAX试剂和2ml OptiPro^TM SFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在结束转染后，将细胞在37℃、80％湿度和8％CO₂的条件下在130rpm培养箱中培养5天。

然后将细胞在37℃在5％CO₂条件下在补充有10％(v/v)FBS的DMEM中培养5小时，然后在37℃在5％CO₂条件下在无FBS的DMEM中培养48小时。

离心后，将上清液应用于AKTA prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样至配备有蛋白A柱的AKTAPrime(GE healthcare,17-0405-03)，随后用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)进行洗脱。将所述缓冲液与PBS交换，以纯化嵌合抗体AbF46(以下称为“chAbF46”)。

1.3.从嵌合抗体chAbF46构建人源化抗体huAbF46

1.3.1.重链的人源化

为设计两个域H1-重链和H3-重链，分析了与参考例1.2中纯化的小鼠抗体AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。一项Ig BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)结果显示，VH3-71在氨基酸水平具有83％的同一性/同源性。小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat编号法定义。设计将小鼠抗体AbF46的CDR引入VH3-71的框架中。于是，在位置30(S→T)、48(V→L)、73(D→N)和78(T→L)处进行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。然后，H1进一步在位置83(R→K)和84(A→T)处突变，以最终建立H1-重链(SEQ ID NO:40)和H3-重链(SEQ ID NO:41)。

为了设计H4-重链，通过BLAST搜索分析多个人抗体框架。结果显示，已知的最稳定的VH3亚型在框架和序列方面与小鼠抗体AbF45非常相似。小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat编号法定义并被引入至VH3亚型以构建H4-重链(SEQ ID NO:42)。

1.3.2.轻链的人源化

为了设计两个域H1-轻链(SEQ ID NO:43)和H2-轻链(SEQ ID NO:44)，分析了与小鼠抗体AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。Ig BLAST搜索结果显示，VK4-1在氨基酸水平具有75％的同一性/同源性。小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义。设计将小鼠抗体AbF46的CDR引入VK4-1的框架中。于是，在位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。仅在H2-轻链的位置49(Y→I)处进行一个回复突变。

为了设计H3-轻(SEQ ID NO:45)，通过BLAST搜索分析了多个与小鼠抗体AbF46的VL基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。结果，选择了VK2-40。发现小鼠抗体AbF46的VL与VK2-40在氨基酸水平具有61％的同一性/同源性。所述小鼠抗体的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义并被引入至VK2-40的框架中。在H3-轻的位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行回复突变。

为了用于设计H4-轻链(SEQ ID NO:46)，分析了多个人抗体框架。BLAST搜索显示，已知的最稳定的Vk1亚型在框架和序列方面与小鼠抗体AbF46非常相似。小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义并被引入至Vk1亚型中。于是，在H4-轻链的位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行回复突变。

此后，具有重链核苷酸序列(H1-重链:SEQ ID NO:47，H3-重链:SEQ IDNO:48，H4-重链:SEQ ID NO:49)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(H1-light:SEQ ID NO:50,H2-light:SEQ ID NO:51,H3-light:SEQ ID NO:52,H4-light:SEQ ID NO:53)的DNA片段经EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，然后被分别克隆至OptiCHO^TM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVEC^TM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆至pcDNA^TM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中，从而构建多个重组载体以表达人源化抗体。

离心后，将上清液应用于AKTA prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样至配备有蛋白A柱的AKTAPrime(GE healthcare,17-0405-03)，随后用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)进行洗脱。将所述缓冲液与PBS交换，以纯化人源化抗体AbF46(以下称为“huAbF46”)。以下实施例中所用的人源化抗体huAbF46包括H4-重链(SEQ ID NO:42)和H4-轻链(SEQ ID NO:46)的组合。

1.4.构建huAbF46抗体的scFV文库

为了用于从huAbF46抗体的重链和轻链可变区构建huAbF46抗体的scFV，将一个基因设计成对于每个重链和轻链可变区具有“VH-连接子-VL”的结构，该连接子具有氨基酸序列“GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS”(SEQ ID NO:54)。在Bioneer中合成编码所设计的huAbF46的scFV的多核苷酸序列(SEQ ID NO:55)并且该多核苷酸的表达载体具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列。

在表达后，发现产物对c-Met展现出特异性。

1.5.用于亲和力成熟的文库基因的构建

1.5.1.靶CDR的选择和引物的合成

在以下步骤中实现huAbF46的亲和力成熟。首先，6个互补决定区(CDR)根据Kabat编号法定义。在下表1中给出所述CDR。

表1

CDR	氨基酸序列
		CDR-H1	DYYMS(SEQ ID NO:1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:2)
		CDR-H3	DNWFAY(SEQ ID NO:3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:10)
		CDR-L2	WASTRVS(SEQ ID NO:11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(SEQ ID NO:12)

为了将随机序列引入抗体的CDR中，如下设计引物。常规地，使用N密码子以相同的比例(25％A,25％G,25％C,25％T)将碱基引入所需的突变位点。在本实验中，以如下方式将随机碱基引入至huAbF46的CDR中：在编码每个CDR的野生型多核苷酸中，对于每个密码子的三个核苷酸而言，第一和第二核苷酸在整个序列的85％中是保守的，而另外三个核苷酸以相同的百分数(各为5％)引入，并且向该第三个核苷酸赋予了相同的可能性(33％G、33％C、33％T)。

1.5.2.huAbF46抗体文库的构建和对c-Met的亲和力

使用以与参考例1.5.1相同的方式合成的引物通过引入随机序列进行抗体基因文库的构建。使用覆盖huAbF46scFV的多核苷酸作为模板，获得两种PCR产物，对它们实施重叠延伸PCR，以得到huAbF46抗体(其中仅所需的CDR是突变的)的多个scFV文库基因。对于从所述scFV文库基因制备的6个CDR，构建靶向它们中的每一个的文库。

每个文库对c-Met的亲和力与野生型的亲和力相比较。与野生型相比，大多数文库对c-Met的亲和力较低。在一些突变体中对c-Met的亲和力得到保留。

1.6.从文库选择具有改善的亲和力的抗体

在对构建的文库进行了c-Met亲和力成熟后，分析来自每个克隆的scFv的核苷酸序列。如此获得的核苷酸序列汇总于表2，并且将其转化成IgG形式。在随后的实验中使用分别从克隆L3-1、L3-2、L3-3、和L3-5生成的4种抗体。

表2

克隆	构建的文库	CDR序列
			H11-4	CDR-H1	PEYYMS(SEQ ID NO:22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(SEQ ID NO:23)
			YC193	CDR-H1	SDYYMS(SEQ ID NO:24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(SEQ ID NO:25)
			YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(SEQ ID NO:26)

YC354	CDR-H3	DNWLSY(SEQ ID NO:27)
			YC374	CDR-H3	DNWLTY(SEQ ID NO:28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:29)
			L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(SEQ ID NO:30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:31)
			L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:33)
			L2-9	CDR-L2	WASKRVS(SEQ ID NO:34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(SEQ ID NO:35)
			L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(SEQ ID NO:36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(SEQ ID NO:13)
			L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(SEQ ID NO:14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(SEQ ID NO:15)
			L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(SEQ ID NO:16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(SEQ ID NO:37)

1.7.将选择的抗体转化成IgG

编码4种选择的抗体的重链的相应多核苷酸设计为具有“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-XhoI”(SEQ ID NO:38)的结构。这些huAbF46抗体的重链照原样使用，因为它们的氨基酸在亲和力成熟期间没有变化。然而，在铰链区的情况中，采用U6-HC7铰链(SEQ ID NO:57)代替人IgG1的铰链。轻链基因设计为具有“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-XhoI”的结构。编码经过亲和力成熟而选出的4种抗体的轻链可变区多肽在Bioneer中合成。然而，将具有重链核苷酸序列的DNA片段(SEQ ID NO:38)和一组具有轻链核苷酸序列的DNA片段(包含L3-1衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:58的DNA片段，包含L3-2衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:59的DNA片段，包含L3-3衍生的CDR-L3：SEQID NO:60的DNA片段，和包含L3-5衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:61的DNA片段)用EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，之后分别克隆到OptiCHO^TM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVEC^TM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆到pcDNA^TM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建用于表达亲和力成熟的抗体的重组载体。

所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用Freestyle^TM MAX293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。293F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyle^TM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x10⁵细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x10⁶细胞/ml时，进行瞬时表达。使用Freestyle^TM MAX试剂(invitrogen)通过脂质体试剂法进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiPro^TM SFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)Freestyle^TM MAX试剂和2ml OptiPro^TM SFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃、80％湿度和8％CO₂的条件下温育5天。

离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTA Prime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。用PBS更换缓冲液以纯化4种亲和力成熟的抗体(下文分别称为“huAbF46-H4-A1(L3-1起源)、huAbF46-H4-A2(L3-2起源)、huAbF46-H4-A3(L3-3起源)、和huAbF46-H4-A5(L3-5起源)”)。

1.8.构建取代了恒定区和/或取代了铰链区的huAbF46-H4-A1

在参考例1.7中选出的4种抗体中，发现huAbF46-H4-A1对c-Met的亲和力最高而Akt磷酸化和c-Met降解程度最低。在该抗体中，替换铰链区，或替换恒定区加铰链区。

抗体huAbF46-H4-A1(U6-HC7)由重链和轻链组成，所述重链包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链、和人IgG1恒定区的恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)由重链和轻链组成，所述重链包含重链可变区、人IgG2铰链区、和人IgG1恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)由huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区及轻链组成，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻可变区和人kappa恒定区。因此，在所有三种抗体中将轻链的人kappa恒定区上第36位的组氨酸残基改变成酪氨酸，以增加抗体生成。

为了用于构建三种抗体，在Bioneer合成多核苷酸(SEQ ID NO:63)、多核苷酸(SEQ ID NO:65)、多核苷酸(SEQ ID NO:67)、以及多核苷酸(SEQ ID NO:69)，其中，多核苷酸(SEQ ID NO:63)编码多肽(SEQ ID NO:62，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:65)编码多肽(SEQ ID NO:64，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:67)编码多肽(SEQ ID NO:66，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:69)编码多肽(SEQ ID NO:68，其包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区(其中位置36处的组氨酸被酪氨酸替换)和人kappa恒定区)。然后，将具有重链核苷酸序列的那些DNA片段插入OptiCHO^TM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVEC^TM-TOPO TA克隆试剂盒中，而将具有轻链核苷酸序列的那些DNA片段插入pcDNA^TM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建表达这些抗体的载体。

离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTA Prime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。用PBS更换缓冲液以最终纯化3种抗体(huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)、和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc))。在三种抗体中，代表性选择huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)用于下列实施例，并且将其称为L3-1Y-IgG2(uAbF46-H4-A1(IgG2Fc))。

1.9：huAbF46的表位分析

(1)表位作图

1)制备用于huAbF46表位作图的肽

543种包含c-Met SEMA域的氨基酸序列及其结构呈现于PDB(蛋白质数据库)ID：1UZY，基于这543种氨基酸序列，用支架化学连接肽(ChemicallyLinked Peptides on Scaffolds，CLIPS)技术(Timmerman等,2007Functionalreconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS^TMtechnology.J.Mol.Recognit.20:283-00)，设计并合成另外6,063种能够生成构象性表位和不连续表位的序列。肽阵列制作详述如下。采用由PepScan开发的CLIPS技术制备具有称作CLIPS的内在结构的肽，而不是经已知典型方法制备的具有约15个氨基酸的长度的线性肽。用这些线性肽和CLIPS肽测量huAbF46的结合亲和力。在这些CLIPS肽中，制得多个T2CLIPS肽，使得两个半胱氨酸连接在一起形成环，从而这些肽具有人工结构，还制得多个T3CLIPS肽，使得三个半胱氨酸连接在一起形成环，从而这些肽具有人工结构。另外，可以制备结合型肽，诸如T2T3或T2T2CLIPS肽。

总共制得6,063种肽用于表位作图(将肽阵列设计应用于PepScan)。为此，制得第1种到第529种肽，都是典型的线性肽，使得这些肽具有15个氨基酸的长度并在某些区域之间有重叠区。将第1种到第529种肽引入T2CLIPS肽，制得第530种到第1,058种肽。将两种各具有15个氨基酸的肽与T3CLIPS肽连接，制得第1,059种到第2,014种肽，即总共956种肽。再制得第2,015种到第6,063种肽，即总共4,048种肽，将它们用于通过具有8至35个氨基酸残基的肽组别之间的结合，搜寻具有构象性和不连续性结构的表位。

例如，如下制备包含T2CLIPS肽的肽阵列。将0.5mM包含T2CLIPS肽的1,3-二(溴甲基)苯溶液溶于碳酸氢铵(20mM,pH7.9)/乙腈(1:1(v/v))中，将所得的溶液添加至肽阵列。将T2CLIPS肽作为模板与肽阵列(具有3ul孔的455孔板)中固相结合肽上的两个半胱氨酸侧链结合。将肽阵列在所述溶液中缓慢摇动30至60分钟。最后，将肽阵列用大量的水充分清洗，在含有1％SDS/0.1％β-巯基乙醇和PBS(pH7.2)的裂解物缓冲液中，于70℃进行30分钟的超声片段化，然后在水中进行45分钟的超声片段化。使用与上述相同的方法制备T3CLIPS肽，不同的是将T3CLIPS肽作为模板与三个半胱氨酸侧链连接。

作为用上述肽通过ELISA进行表位作图的结果，确认huAbF46的一种核心表位是EEPSQ(SEQ ID NO:73)肽，其由c-Met蛋白的第168到第171位氨基酸组成。

2)用于huAbF46的表位作图的ELISA

为进行表位作图，用总共529种线性肽和CLIPS肽实施基于PEPSCAN的ELISA。将这些肽用5％封闭溶液(4％卵清蛋白、5％马血清、和1％Tween80)于室温维持30分钟。然后，将1至100ug/ml huAbF46抗体在含有1％Tween80的PBS中于4℃维持过夜，再与上述肽反应，然后清洗所得的产物。此后，将所得的产物用兔抗绵羊抗体(SIGMA)处理，用PBS清洗，然后将清洗过的产物用附接有过氧化物酶的猪抗兔抗体(SIGMA)处理，用PBS清洗。然后，将所得物用3％H₂O₂中的2ul/ml过氧化物酶2,2’-叠氮-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸(ABTS)(SIGMA)处理，1小时后测颜色反应。

结果如图15中显示的，这些线性肽和CLIPS肽中，都是只有包含EEPSQ(SEQ ID NO:3)的肽展现出特异性ELISA阳性反应，因此确认huAbF46抗体识别c-Met的线性表位和构象性表位。

另外，在多个含有EEPSQ(SEQ ID NO:73)的肽的表位中，用多个带有E168D突变的多肽以与上述相同的方式实施ELISA，所述E168D突变是已知可见于一些肺癌或卵巢癌患者中的代表性c-Met SEMA域突变。下文表3中显示了结果。

<表3>

上述结果表明，huAbF46抗体不能够结合c-Met中具有E168D突变的SEMA域。这指示这些抗体可以用于提供癌症进展信息的诊断方法中。

3)对huAbF46的表位作图结果的分析

从上文显示的结果看，确认了huAbF46抗体特异性结合包含第168至171位氨基酸EEPSQ的线性肽和CLIPS肽两者，无非特异性反应。这指示huAbF46抗体结合c-Met蛋白的线性表位和构象性表位两者。就分子结构(PyMOL1.4.1(www.pymol.org),Cn3D4.1(NCBI))而言，如图16中显示的，确认了huAbF46的表位位于SEMA域。另外，确认了HGF的结合位点是在与直接结合位点附近的环对应的位置。

(2)对全部位置扫描结果的分析

将EEPSQ序列的每个氨基酸用除了初始氨基酸以外的20种氨基酸取代，对于每种肽与huAbF46抗体之间结合亲和力的任何变化，经由7个肽阵列进行分析。

上述分析确认了EEPSQ序列上哪个氨基酸在与抗体的结合中发挥关键的作用。特别是确认了EEPSQ中的EEP序列在与抗体的结合中发挥非常关键的作用。

1.10通过SEMA域突变分析huAbF46抗体的结合亲和力

将EEPSQ序列(SEQ ID NO:73)的每个氨基酸或总共5个氨基酸用丙氨酸而不是初始氨基酸取代，并用Biacore(GE healthcare)测量每种肽(“AAAAA”、“AEPSQ”、“EAPSQ”、“EEASQ”、“EEPSQ”、“EEPSA”，SEQ ID NO:132到SEQ ID NO:137)与huAbF46抗体之间的结合亲和力。将约80至110个反应单位(RU)的huAbF46抗体固定在CM5芯片上，并将具有氨基酸序列SEQ ID NO:132到137的肽，以30ul/min的速率和100nM至0.39nM之间的9种不同浓度，注入所述芯片，由此获得k_结合和k_解离数值见下表4，从中计算K_D值。结果确认了huAbF46抗体不能结合具有氨基酸取代的肽。此结果证实，EEPSQ序列确实是这些huAbF46抗体的必需表位。

<表4>

参考例2：抗EGFR scFv的制备

将(G₄S)₃接头肽插入抗EGFR抗体scFv序列的重链可变域和轻链可变域之间，制得抗EGFR的抗体。简言之，以如下的方式使用自动化基因合成仪合成编码抗EGFR抗体的scFv的DNA(委托给Bioneer Corporation)，使得编码(GGGGS)₃接头肽的DNA序列添加在分别编码人源化抗EGFR抗体的重链可变域(SEQ ID NO:109)和轻链可变域(SEQ ID NO:111)的DNA序列(SEQ IDNO:110和112)之间。

另外以与所述scFv相同的方式构建抗EGFR scFv的一级突变体，不同的是，在重链可变域(SEQ ID NO:109)上第51位用I取代F并且第62位用S取代Q，以及在轻链可变域(SEQ ID NO:111)上第46位用L取代R并且第83位用E取代F。这些突变改善所得抗体的热稳定性。此外，通过用C取代重链可变域上第44位和轻链可变域上第100位的氨基酸，构建抗EGFR scFv的二级突变体。详细地，以与上述相同的方式制备抗EGFR scFv的二级突变体(重链可变域：SEQ ID NO:113；轻链可变域：SEQ ID NO:114)，不同的是，在重链可变域(SEQ ID NO:109)上第51位用I取代F，第44位用C取代G，第62位用S取代Q，并且在轻链可变域(SEQ ID NO:111)上第46位用L取代R，第83位用E取代F，第100位用C取代G。这些突变容许在所述片段中引入稳定的二硫键，如此改善所得的抗体片段的体内药动学。依照Kabat编号系统对抗体中的氨基酸位置编号。

所得的产物，抗EGFR scFv、抗EGFR scFv分子的一级突变体和抗EGFRscFv分子的二级突变体用于构建以下双特异性抗体。

参考例3：抗Her2scFv的制备

将(G₄S)₃接头肽插入曲妥单抗(herceptin(何塞汀))scFv序列的重链可变域和轻链可变域之间插入，制得结合Her2的scFv片段。简言之，以如下的方式使用自动化基因合成仪合成编码抗Her2抗体的scFv的DNA(委托给BioneerCorporation)，使得编码(GGGGS)₃接头肽的DNA序列添加在分别编码抗Her2抗体(Herceptin)的重链可变域(SEQ ID NO:115)和轻链可变域(SEQ ID NO:117)的DNA序列(SEQ ID NO:116和118)之间。

<抗Her2抗体的重链可变域的氨基酸序列>(SEQ ID NO:115)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS

<编码抗Her2抗体的重链可变域的DNA序列>(SEQ ID NO:116)

gaagttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcg

<抗Her2抗体的轻链可变域的氨基酸序列>(SEQ ID NO:117)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR

<编码抗Her2抗体的轻链可变域的DNA序列>(SEQ ID NO:118)

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttctcgcttctctggttccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacga

使用所得的抗Her2scFv构建下列双特异性抗体。

实施例1：双特异性抗体的构建

1.1.抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体的构建

将参考例1中制得的抗c-Met抗体L3-1Y IgG2，与参考例2中制得的抗EGFR scFv、或抗EGFR scFv的一级突变体、或抗EGFR scFv的二级突变体，在Fc的C端融合。融合过程如下进行。

将具有与参考例1所得抗c-Met抗体L3-1Y-IgG2重链对应的核苷酸序列的DNA片段，插入OptiCHO^TM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pcDNA^TM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)的EcoRI和XhoI限制性位点中，而将与所述轻链对应的DNA片段插入pOptiVEC^TM-TOPO TA克隆试剂盒中。随后，将参考例2中制备的抗EGFRscFv，与插入pcDNA^TM3.3中的L3-1Y-IgG2的Fc的C端，经由由(G4S)2组成的10聚体接头肽融合，以构建用于表达双特异抗体的载体。

此重组载体用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用Freestyle^TM MAX293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。该瞬时表达在293F细胞这进行，所述细胞以悬浮培养方式在FreeStyle^TM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x10⁵细胞/ml的密度接种细胞，当细胞生长24小时后达到1x10⁶细胞/ml的密度时，进行瞬时表达。这些细胞用所述DNA制剂转染，是用Freestyle^TM MAX试剂(invitrogen)通过脂质体试剂法进行转染。简言之，将一个15ml管中重链DNA:轻链DNA＝1:1的DNA混合物添加2mlOptiPro^TM SFM(invitrogen)(A管)，而100μl(微升)Freestyle^TM MAX试剂和2mlOptiPro^TM SFM在另一15ml管中混合(B管)。待A管和B管混合后，保温15分钟，再缓慢地添加到前一天制备的细胞中。此后，将细胞在30rpm培养箱中在37℃、80％湿度和8％CO₂的条件下培养5天。

在细胞离心后，使用AKTA Prime(GE Healthcare)纯化100ml每种上清液。为此，将上清液以5ml/min的流速在AKTA Prime中安装的蛋白A柱(GEhealthcare,17-0405-03)上加载，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。PBS缓冲液更换产生纯化的抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体。

抗EGFR scFv、抗EGFR scFv的一级突变体、或抗EGFR scFv的二级突变体分别与抗c-Met抗体L3-1Y-IgG2的C端融合，所得的抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体分别称作ME-01、ME-03、和ME-03S。

使用Biacore T100仪(GE)分析抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体对两种抗原(c-Met/EGFR)的亲和力。依照制造商的说明书，将人Fab捕捉物(GE Healthcare)固定到CM5芯片(#BR-1005-30,GE)上。在捕获约90～120个RU的ME03S后，记录注射不同浓度的c-Met-Fc(#358-MT/CF,R&D Systems)或EGFR-Fc(#344-ER,R&D Systems)溶液后的感应图。芯片表面通过注射10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.5)来再生。为评估亲和力，使用BIAevaluation软件(GEHealthcare,Biacore T100评估软件)拟合数据。

下文表5中汇总了结果。

表5

如表5中显示的，实施例1中制备的所有抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体结合这两种抗原。

1.2.抗c-Met/抗Her2双特异性抗体的构建

将参考例1中制备的抗c-Met抗体L3-1Y IgG2(uAbF46-H4-A1(IgG2Fc))在Fc的C端与参照实施例3中制备的抗Her2scFv融合。融合过程如下进行。

将具有与参考例1中制备的抗c-Met抗体L3-1Y-IgG2的重链对应的核苷酸序列(SEQ ID NO:66)的DNA片段，插入OptiCHO^TM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pcDNA^TM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)的EcoRI和XhoI限制性位点中，而将包含与轻链对应的核苷酸序列(SEQ ID NO:68)的DNA片段插入pOptiVEC^TM-TOPO TA克隆试剂盒中。随后，经由(GGGGS)2接头肽，将编码参考例3中制备的抗Her2scFv的DNA与插入pcDNA^TM3.3中的L3-1Y-IgG2的Fc的C端融合，以构建表达双特异抗体的载体。

使用Qiagen Maxiprep试剂盒(产品目录编号12662)扩增此重组载体，并借助于Freestyle^TM MAX293表达系统(invitrogen)瞬时表达。在293F细胞中进行瞬时表达，所述293F细胞在FreeStyle^TM293表达培养基中悬浮培养。瞬时表达前1天，将细胞以5x10⁵个细胞/ml的密度接种。在将细胞培养24小时至1x10⁶个细胞/ml的密度时，实现瞬时表达。将它们用Freestyle^TM MAX试剂(Invitrogen)通过脂质体试剂方法用DNA制备物转染。简言之，将15ml管中的重链DNA:轻链DNA＝3:2的DNA混合物添加至2ml OptiPro^TM SFM(Invtrogen)(管A)，而将100μl Freestyle^TM MAX试剂和2ml OptiPro^TM SFM在另一个15ml管(管B)中混合。在将管A与管B混合后，将混合物温育15分钟，并缓慢添加至1天前制备的细胞中。此后，将细胞于37℃和80％湿度在8％CO₂气氛下在30rpm培养箱中培养5天。

在细胞离心后，使用AKTA Prime(GE Healthcare)纯化100ml每种上清液。为此，将上清液以5ml/min的流速在AKTA Prime中安装的蛋白A柱(GEhealthcare,17-0405-03)上加载，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。PBS缓冲液更换产生纯化的抗c-Met/抗Her2双特异性抗体。

抗Her2scFv与抗c-Met抗体L3-1Y-IgG2的C端融合而成的抗c-Met/抗Her2双特异性抗体称作MH2-01。

使用Biacore T100仪(GE)分析抗c-Met/抗Her2双特异性抗体对两种抗原(c-Met/Her2)的亲和力。依照制造商的说明书，将人Fab捕捉物(GE Healthcare)固定到CM5芯片(#BR-1005-30,GE)上。在捕获约90～120个RU的MH2-01后，记录注射不同浓度的c-Met-Fc(#358-MT/CF,R&D Systems)或Her2-Fc(1129-ER,R&D Systems)溶液后的感应图。芯片表面通过注射10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.5)来再生。为评估亲和力，使用BIAevaluation软件(GEHealthcare,Biacore T100评估软件)拟合数据。

下文表6中汇总了结果。

表6

如表6中显示的，依照一个实施方案的在实施例1中制备的所有抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体结合这两种抗原。

实施例2：双特异性抗体诱导的c-Met降解

对分别在实施例1.1和1.2中制备的抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体和抗c-Met/抗Her2双特异性抗体测定在胃癌细胞系MKN45中针对癌细胞生长的抑制活性。

将所有细胞系在补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素的RPMI1640(#11875-093,Gibco)中于37℃在5％CO₂气氛中培养。

通过测量c-Met的相对总量，评估实施例1.1和1.2中制备的双特异性抗体对c-Met蛋白降解的影响。c-Met的相对总量反映出由于抗体触发c-Met被细胞内化并降解所致的c-Met总量变化，如此评估抗体的功效。

胃癌细胞系MKN45(日本癌症研究库(Japanese Cencer Research Bank，JCRB),东京,日本)以2×10⁵个细胞/ml的密度，与每种抗体(5μg/ml)一起，接种到96孔板，并温育24小时。经抗体处理的细胞发生裂解后，使用人总HGFR/c-Met ELISA试剂盒(R&D systems,DYC358)测量c-Met总量的变化。

图4中描绘了结果。观察到抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-01和ME-03在过表达c-Met的MKN45胃癌细胞系中分别将c-Met降解了86.8％和88.4％。在用抗c-Met/抗Her双特异性抗体MH2-01处理时，c-Met降解了约80％。与抗c-Met抗体L3-1Y或L3-1Y IgG2相比，这些双特异性抗体在c-Met降解活性方面显著改善。总之，这些数据提示，抗c-Met抗体与抗EGFR或抗Her2抗体(scFv)融合在一起时，以协同地方式降解c-Met。

实施例3：抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体诱导的EGFR内在化和降解。

将MKN45细胞(日本癌症研究库(JCRB),东京,日本)以2x10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中，单独或与L3-1Y-IgG2(参考例1)、抗EGFR抗体(见下文)、和抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03(实施例1.1)一起于37℃温育4小时。无论单独或组合，每种抗体以5μg/ml/孔的密度使用。作为对照，细胞仅用PBS处理。通过用4％(v/v)甲醛处理15分钟将细胞固定到板上，用PBS清洗三次，然后用封闭缓冲液(0.5％triton x-100和5％驴血清)于室温封闭1小时。对每孔添加100μl1:100稀释的抗c-Met一抗(FAB3582A,R&D systems)和抗EGFR一抗(#5616,Cell signaling)，并于4℃温育15小时。将细胞用PBS再清洗三次，并于室温与100μl1:2000稀释的二抗(A21433,Invitrogen)一起温育1小时。在用PBS清洗三次后，将细胞用含有DAPI的封固介质(H-1200,VectorLab)复染色，并通过共焦显微术(Zeiss,LSM710)检查。

抗EGFR抗体是一种识别EGFR的scFv-Fc抗体，通过将SEQ ID NO:109的重链可变域和SEQ ID NO:111的轻链可变域(两种在参考例2中显示)与IgG2Fc的N端融合而构建。

图5中显示了结果。如可以在图5的共焦显微图像中看到的，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体引起靶膜蛋白EGFR经历细胞内化，并且在那些于质膜上过表达c-Met的细胞中降解(右侧小图)。比较而言，在仅存在抗c-Met抗体的情况中没有观察到EGFR的内在化。同样地，用抗EGFR抗体的处理根本没有引起EGFR的降解。这些结果指示，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体可以触发定位于质膜上的EGFR的细胞内化和降解。

在双特异性抗体和单特异性抗体组合之间进行降解效率的比较。将抗EGFR抗体(抗EGFR ab)、L3-1Y-IgG2(参考例1)、和抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03(实施例1.1)以5μg/ml的密度单独或组合(在此情况中，也各为5μg/ml)应用于每孔，并且实施与获得图5结果的实验相同的实验。

图6中给出了结果。如图6中显示的，抗c-Met/抗EGFR抗体双特异性抗体(ME-03)可以触发EGFR的细胞内化和降解，而单独的抗c-Met和抗EGFR抗体的组合不能。这些结果指示了EGFR的细胞内化和降解是通过膜蛋白消耗系统的操作造成的，其中抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03)触发c-Met充当驱动物，同时保持EGFR。在组合使用单独的抗体时在细胞中的EGFR位置中没有检出变化。观察到抗c-Met抗体(L3-1Y-IgG2)仅引起c-Met被内在化到细胞并被降解。

在用单独或组合的各种抗c-Met抗体和抗EGFR抗体，或用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体处理MKN45胃癌细胞时，监测细胞中膜蛋白(EGFR和c-Met)的位置。

简言之，将抗EGFR抗体(抗EGFR ab)、L3-1Y-IgG2(参考例1)、Erbitux(#ET509081213,Merck)和抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03S(实施例1.1)以5μg/ml的密度单独或组合(在此情况中，也各为5μg/ml)应用于每孔，并且实施与获得图5结果的实验相同的实验。

图7中给出了结果。如图7中显示的，EGFR的内在化既不被抗癌剂Erbitux也不被scFV-Fc抗体抗EGFR ab(两者都识别EGFR)诱导，但是可以被抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03S)诱导。

在另一种不同癌细胞系，例如EBC-1肺癌细胞系(JCRB，日本研究生物资源中心(Japanese Collection of Research Bioresources))中检查抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体诱导的EGFR的细胞内化和降解。

简言之，将抗EGFR抗体(抗EGFR ab)、L3-1Y-IgG2(参考例1)、Herceptin(Roche)、抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03S(实施例1.1)、和抗c-Met/抗Her2双特异性抗体MH2-01(实施例1.2)以5μg/ml的密度单独或组合(在此情况中，也各为5μg/ml)应用于每孔，并且实施与获得图5结果的实验相同的实验。

图8中给出了结果。如图8中显示的，与胃癌细胞系一样，肺癌细胞系仅容许经抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03S)处理后有EGFR内在化。尽管MH2-01是一种双特异性抗体，其对EGFR没有影响，而是仅诱导靶Her2经历内在化/降解。这些结果指示了，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03S)的EGFR特异性消耗。

此外，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体诱导的EGFR的特异性细胞内化和降解，通过在用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03)处理后测量EGFR的总量和EGFR活性变化来评估。为此，用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03)处理MKN45胃癌细胞系和EBC-1肺癌细胞系24小时后，通过Western印迹分析(用磷酸化的-EGFR)检查EGFR的总水平和EGFR活性变化。

简言之，将MKN45细胞(日本癌症研究库(JCRB),东京,日本)和EBC-1细胞(JCRB日本研究生物资源中心)一式三份在96孔板(每孔5000～10,000个细胞)中培养，并且与1μM geftinib(吉非替尼，#S1025,Selleckchem)，5μg/mlErbitux(#ET509081213,Merck)，5μg/ml L3-1Y-IgG2(参考例1)，或5μg/ml抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03(实施例1.1)一起温育24小时。在细胞裂解前30分钟，添加100ng/ml的EGF。

图9中给出了Western印迹结果。如从图9的数据看明显的，MKN45和EBC-1细胞两者的EGFR活性都降低，但是在它们仅用EGFR抑制剂Gefitinib或抗EGFR抗体Erbitux单独处理时没有展现出EGFR总水平的变化。比较而言，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03)引起两种癌细胞系在EGFR活性和EGFR总水平两者上显著降低，这导致处理24小时后EGFR的完全降解。

实施例4：在低水平表达c-Met的细胞中抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体诱导的EGFR消耗的测定法

检查抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体即使在作为驱动物的c-Met以低水平表达的细胞中是否也可以消耗膜蛋白EGFR。为此，将表达低水平的c-Met的A431细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)CRL-1555)与实施例1.1中制备的抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03)一起温育，用Western印迹分析EGFR的消耗。A431细胞以非常高的水平表达EGFR，但是以非常低的水平表达c-Met，它广泛用于研究EGFR功能。如此，所述细胞的EGFR比充当驱动物的c-Met多得多。

简言之，MKN45和EBC-1细胞一式三份(2x10⁵个细胞/ml)在96孔板中培养，然后与5μg/ml Erbitux(#ET509081213,Merck)、5μg/ml L3-1Y-IgG2(参考例1；图10中的L3-1Y)、和5μg/ml抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03(实施例1.1)单独或组合(在此情况中，也各为5μg/ml)一起温育24小时。在细胞裂解前30分钟添加100ng/ml的EGF。随后，将用抗体处理的细胞裂解，用人总HGF R/c-MET ELISA试剂盒(R&D systems,DYC358)和磷-EGFR来测量c-Met总量和EGFR磷酸化的变化。

图10中给出了结果。如从图10的数据看明显的，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03)由于靶向EGFR的抗EFGR scFv组分而抑制EGFR的磷酸化，但是不能降低EGFR的总量。这些结果暗示了双特异性抗体在充当驱动物的c-Met水平不足时不能诱导靶膜蛋白的降解。因此，驱动物蛋白的某种水平是双特异性抗体诱导膜蛋白的降解需要的。

实施例5：c-Met表达细胞中抗c-Met/抗-EGFR双特异性抗体诱导的EGFR消耗的测定法

评估c-Met的表达水平对于抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体诱导的EGFR降解的影响。

在用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03S)处理HCC827肺癌细胞后，通过Western印迹分析测量靶膜蛋白EGFR的降解。关于实验过程，参见实施例4。将野生型HCC827肺癌细胞(HCC827WT细胞；美国典型培养物保藏中心(ATCC)CRL-2868)和Erlotinib(厄洛替尼)抗性HCC827肺癌细胞(HCC827ER#15细胞；而HCC827WT细胞(美国典型培养物保藏中心,ATCC CRL-2868)在有5nM至2μM不等的浓度的厄洛替尼(#S1023,Selleckchem)的情况中培养，选出对厄洛替尼有抗性的细胞。它们之中，选出具有升高的c-Met表达水平的克隆备用。按图11所示使用每种抗体(在图11中，L3-1Y代表L3-1Y-IgG2(参考例1))。

图11中给出了结果。HCC827WT细胞以非常高的水平表达EGFR，但是以非常低的水平表达c-Met，并且广泛用于研究EGFR抑制剂厄洛替尼的功能。如此，这些细胞的EGFR远远多于充当驱动物的c-Met。在HCC827WT细胞中，如图11中看到的，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03S)降低EGFR的磷酸化，但是没有降低EGFR的总量。

HCC827ER#15细胞对厄洛替尼有抗性，c-Met的表达水平和活性都升高。在HCC827ER#15细胞中，如从图11中了解的，抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03S)抑制EGFR的磷酸化，并且降低EGFR的总量，充当驱动物的c-Met的表达水平升高。这些数据指示了双特异性抗体诱导的靶膜蛋白降解依赖于质膜中的驱动物(c-Met)水平。

实施例6：c-Met/Her2双特异性抗体诱导的HER2的特异性降解

本系统消耗靶膜蛋白的活性针对一种不同的靶物：MKN45胃癌细胞中的HER2。为此，在本系统中采用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME-03；实施例1.1)和抗c-Met/抗Her2双特异性抗体(MH2-01；实施例1.2)。

将MKN45细胞用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03或抗c-Met/抗Her2双特异性抗体MH2-01处理，并通过Western印迹分析测量HER2水平。

简言之，将MKN45和EBC-1细胞一式三份地生长于96孔板中(2x10⁵个细胞/ml)，然后与Erbitux(#ET509081213，Merck)、Herceptin(Roche)、L3-1Y-IgG2(参考例1)、抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03(实施例1.1)或抗c-Met/抗Her2双特异性抗体MH2-01(实施例1.2)各5μg/ml温育24小时。在细胞裂解前30分钟以100ng/ml的密度添加EGF。随后，使经抗体处理的细胞裂解，用人总HGF R/c-MET ELISA试剂盒(R&D systems,DYC358)和磷-EGFR(phosphor-EGFR)测量c-Met总量变化和EGFR磷酸化。

结果在图12给出。如从图12的数据明显的，在MKN45胃癌细胞(其中充当驱动物的c-Met过表达)中，当用抗c-Met/抗HER2双特异性抗体(MH2-01)处理时观察到靶膜蛋白HER内在化和降解，而当用抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03处理细胞时没有检测到HER2表达水平的变化。由于如图8中显示的MH2-01对EGFR没有影响，因此该抗体被视为触发仅仅HER2特异性的细胞内化和降解。因此，这些数据指示用于膜蛋白消耗的系统(双特异性抗体)特异性地靶向感兴趣的蛋白质。

实施例7：c-Met过表达后抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体诱导的EGFR的降解

检查依照一个实施方案的靶膜蛋白消耗系统的技术适用性。为此，在将c-Met于A549肺癌细胞(pleniMet转染的细胞)中人工过表达后，将用于膜蛋白消耗的系统(抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03S)应用于这些细胞，然后通过荧光显微术来监测EGFR降解。

简言之，将A549细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)CRL-185)以2x10⁴个细胞/孔的密度，连同Fugene6转染试剂(Invitrogen Lipofectamine^TM2000)和plentic-Met载体(SMC,Samsung Medical Center)的混合物一起接种到孔板中，接着温育24小时以经由逆转录来转染(依照制造商说明书使用Opti-MEM中0.1-3.0μg/μl DNA实施)。然后，将细胞在37℃用L3-1Y-IgG2(参考例1)、抗EGFR ab(实施例3)和抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME03S(实施例1.1)单独或组合地处理4小时(每种，1μg/ml/孔，甚至在组合时也是)。将细胞通过用4％(v/v)甲醛处理15分钟而固定于板上，用PBS清洗3次，然后用封闭缓冲液(0.5％triton x-100和5％驴血清)于室温封闭1小时。向每个孔加入100μl经1:100稀释的抗c-Met一抗(37-0100,Invitrogen)和抗EGFR一抗(#5616,Cell signaling)，并在4℃温育15小时。将细胞用PBS再清洗3次，并在室温与100μl1:1000稀释的二抗(A21433,Invitrogen)一起温育1小时。在用PBS清洗3次后，将细胞用含DAPI的封固剂(H-1200,Vector Lab)复染色，并通过共聚焦显微术(Zeiss,LSM710)检查。

结果显示于图13。图13的最后一幅是经MEO3S处理的细胞的单独绿色图以使EGFR内在化清楚可见，因为细胞的共聚焦图像红色太强而难以分辨绿色信号模式。如可从图13看到的，当人工允许细胞在质膜中过表达驱动物(c-Met)时，发现抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03S诱导EGFR向细胞中内化并被降解。这些数据指示，用于膜蛋白消耗的系统能根据触发物的种类特异性地消耗靶膜蛋白。

参见图13数据的实验规程，将用于膜蛋白消耗的系统[抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体ME-03S(实施例1.1)或抗c-Met/抗HER2双特异性抗体MH2-01(实施例1.2)]应用于HeLa细胞(CCL-2,ATCC)，其中c-Met已人工过表达(plenti::c-Met转染的细胞)，然后通过荧光显微术来监测EGFR降解。

结果在图14给出，其中‘低水平暴露’和‘高水平暴露’代表不同的信号强度，且分别为在低增进值和高增进值处的荧光图像。高增进值能帮助使c-Met信号(红色)可见，甚至在低度荧光的细胞中也是。如可从图14看到的，发现抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体(ME03S)触发EGFR在人工过表达驱动物(c-Met)的细胞中进行细胞内化和降解。相对而言，抗c-Met/抗HER2双特异性抗体MH2-01不能触发EGFR向细胞中内化和降解，因为它是膜蛋白HER2的触发物。总之，这些数据指示依照本发明的用于膜蛋白消耗的系统能根据触发物的类型特异性靶向和降解感兴趣的膜蛋白。

本文中引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利均通过提述并入本文，其程度如同每个参考文献均分别且特定地指示为通过提述纳入且在本文中完整列出的。

除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，术语“一个/一种”和“该”和“至少一个/一种”及类似指代物在描述本发明的背景中(尤其在所附权利要求的背景中)的使用应理解为涵盖单数和复数。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，术语“至少一个/一种”后接一项或多项的列的使用(例如“至少一个/一种的A和B”或“A和B的至少一个/一种”)应理解为意指选自所列项的一项(A或B)，或两项或更多所列项的任意组合(A和B)。除非另外记载，术语“包含/包括”、“具有”和“含有”应理解为开放端术语(即意指“包括但不限于”)。除非另外指示，本文中值的范围的记载仅意图作为分别提述落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独的值均纳入说明书中，如其在本文中分别记载的。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，本文中描述的所有方法可以任何适宜的次序进行。除非另外主张，本文中提供的任何和所有例子或例示性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地说明本发明，而不对本发明的范围施加限制。说明书的任何语言均不应理解为指示任何未主张的要素为对本发明实践必要的。

在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明最佳的模式。在阅读前述说明后，那些优选实施方案的变体对于本领域普通技术人员可能是明显的。发明人预期熟练的技术人员如适宜地采用这类变体，且发明人意图本发明以本文中具体描述的以外的方式实践。因此，本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物，如适用法律所允许的。而且，除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，上述要素在其所有可能变体中的任意组合均涵盖在本发明中。

Claims

1.一种消耗靶膜蛋白的组合物，其包含一种二元结合分子，其中：

所述二元结合分子包含结合驱动物膜蛋白的第一结合域和结合靶膜蛋白的第二结合域，且

所述驱动物膜蛋白与细胞膜上有靶蛋白的部位结合，且当所述二元结合分子的第一结合域结合所述驱动物膜蛋白时，所述驱动物膜蛋白被内在化到细胞中并被降解。

2.依照权利要求1的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述驱动物蛋白和所述靶膜蛋白各自独立地选自下组：受体、通道蛋白、膜酶、脂蛋白、整联蛋白、以及细胞表面标志物，且所述驱动物膜蛋白通过与配体、抗体、非抗体蛋白质或肽的相互作用而被内在化。

3.依照权利要求2的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述驱动物蛋白和所述靶膜蛋白各自独立地选自下组：受体酪氨酸激酶(RTK)、G蛋白偶联受体(GPCR)、运铁蛋白受体、低密度脂蛋白(LDL)受体和分化抗原簇(cluster ofdifferentiation，CD)、四穿膜区蛋白(tetraspanin)、以及抗体药物偶联物(ADC)的膜靶物。

4.依照权利要求3的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述靶膜蛋白选自下组：表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、HER2蛋白(人表皮生长因子受体2蛋白)、HER3蛋白(人表皮生长因子受体3蛋白)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B、CD22、CD79b、CD22、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、CD74、TACSTD2、CEA、叶酸受体1、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAP1、CD70、SLC44A4、柄蛋白4(Nectin4)、AGS-16、鸟苷酰环化酶C、粘蛋白1、EGFRvIII、和间皮素(Mesothelin)。

5.依照权利要求3的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述驱动物膜蛋白选自下组：c-Met蛋白、c-Met蛋白突变体、表皮生长因子受体、HER2、HER3、血小板来源的生长因子受体、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1受体、ephrin受体、运铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体、CD11a、CD20、CD3、CD33、CD44、CD59、CD73、CD152(CTLA4)、NTRK2(神经营养性酪氨酸激酶)、CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B、CD22、CD79b、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、叶酸受体1、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAP1、CD70、SLC44A4、柄蛋白4、AGS-16、鸟苷酰环化酶C、粘蛋白1、EGFRvIII、和间皮素。

6.依照权利要求1的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述二元结合分子是包含第一和第二结合域的双特异性抗体，且

所述第一结合域是针对所述驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，且

所述第二结合域是针对所述靶膜蛋白的抗体或其抗原结合片段。

7.依照权利要求6的消耗靶膜蛋白的组合物，

其中针对所述驱动物膜蛋白的抗体或其抗原结合片段是抗c-Met抗体或其抗原结合片段。

8.依照权利要求7的消耗靶膜蛋白的组合物，

其中所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段与包含c-Met蛋白SEMA域(SEQID NO:79)内的5个或更多个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列(EEPSQ)的表位特异性结合。

9.依照权利要求8的消耗靶膜蛋白的组合物，

其中所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:71的5至19个连续氨基酸且包含SEQ ID ON:73所示氨基酸序列的表位特异性结合。

10.依照权利要求8的消耗靶膜蛋白的组合物，

其中所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段包含：

至少一个选自下组的重链互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，包含SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:2的包括第3至第10位在内的8-19个连续氨基酸的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，包含SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:85的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:85的包括第1至第6位在内的6-13个连续氨基酸的氨基酸序列，或含有所述至少一个重链互补决定区的重链可变区；

至少一个选自下组的轻链互补决定区：(a)CDR-L1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(b)CDR-L2，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，包含SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:86的氨基酸序列，或包含SEQID NO:89的包括第1至第9位在内的9-17个连续氨基酸的氨基酸序列，或含有所述至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；

所述至少一个重链互补决定区与所述至少一个轻链互补决定区的组合；或

所述重链可变区与所述轻链可变区的组合。

11.依照权利要求1的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述第一结合域是结合所述驱动物膜蛋白的抗体，而所述第二结合域是与结合所述驱动物膜蛋白的所述抗体的c端相连的、结合所述靶膜蛋白的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体模拟物。

12.依照权利要求11的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述第一结合域是抗c-Met抗体。

13.依照权利要求1的消耗靶膜蛋白的组合物，其中所述第一结合域是抗c-Met抗体而所述第二结合域是抗EGFR抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗VEGFR抗体、抗PDGFR抗体、抗IGF-1R抗体、或其抗原结合片段。

14.依照权利要求13的消耗靶膜蛋白的组合物，其中，

所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、MM-151，或包含以下的抗体：包含SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:112的氨基酸序列的轻链可变区，

所述抗HER2抗体是曲司珠单抗(trastuzumab)或帕妥珠单抗(pertuzumab)，

所述抗HER3抗体是RG-7597，

所述抗VEGFR抗体是雷莫芦单抗(ramucirumab)，

所述抗PDGFR抗体是奥拉图单抗(olaratumab)，和

所述抗IGF-1R抗体是西旭木单抗(cixutumumab)。

15.一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包含依照权利要求1至13中任一项的消耗靶膜蛋白的组合物。

16.一种包含连接至第二结合域的第一结合域的二元结合分子，其中所述第一结合域是结合c-Met蛋白的抗体或抗原结合片段，而所述第二结合域是结合以下的抗体或抗原结合片段：表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、HER2蛋白(人表皮生长因子受体2蛋白)、HER3蛋白(人表皮生长因子受体3蛋白)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B、CD22、CD79b、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、叶酸受体1、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAP1、CD70、SLC44A4、柄蛋白4、AGS-16、鸟苷酰环化酶C、粘蛋白1、EGFRvIII或间皮素。