CN104204767A - 有数字全息显微镜的流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

当前发明涉及用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的流式细胞术系统和方法，其包括数字全息显微镜(DHM)和至少一个流体系统，其中，所述DHM包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置，其中，所述流体系统能够引导所述对象通过所述DHM的照明装置的照明光束，其中，所述流体系统包括用于引起通过所述流体系统的液体样品流的机构，其中，优选地，所述流体系统包括用于在所述流体系统内控制液体样品流的横向尺寸的流大小控制设备，优选地，所述流大小控制设备能够在所述液体样品流中将对象逐个地或一次多个地排开。

Description

有数字全息显微镜的流式细胞仪

技术领域

本发明属于使用数字全息显微镜(DHM)在液体样品中观察、测量、分析和/或分离对象的技术领域，所述对象包括生物有机体和非生物对象、杂质、污染物，或其任意组合，所述生物有机体诸如细胞、细菌、酵母、微生物、线虫。更特别地，公开了一种系统，其中所述对象流动通过在流式细胞术设置中的DHM反应器的照明光束，其中对象可以被观察、测量、分析、分类和可能地根据其由DHM所观察到的特性而分离。

背景技术

流式细胞术(Flow cytometry)是通过将它们悬浮在流体的流中并将它们通过电子探测装置而用于计数和检查微观粒子的技术，所述微观粒子诸如细胞和染色体。它允许高达每秒数千颗粒的物理和/或化学特性的同时多参数分析。流式细胞术经常地用在特别是血癌的健康失调的诊断中，但在研究和临床实践中都有许多其它应用。常见的变化是基于它们的性质而物理地分选粒子，以便纯化所关注的群体。

荧光活性细胞分选是一种特殊类型的流式细胞术。基于每个细胞的特定光散射和荧光特性，它提供了用于一次一个细胞地分选生物细胞的异质混合物到两个或更多的容器中的方法。因为它提供了来自单个细胞的荧光信号的客观和定量的记录以及特别感兴趣的细胞的物理分离，它是有用的科学仪器。细胞悬浮液被夹带在窄的、快速流动的液体流的中心中。所述流动被布置成使得在细胞之间相对于其直径有较大的间隔。振动结构导致细胞流断裂成单个液滴。所述系统被调整，使得每滴有多于一个细胞的概率很低。就在所述流断裂成液滴之前，所述流动通过每个感兴趣细胞的荧光性质被测量的荧光测量站。电充电环刚好放置在所述流断裂成液滴的点上。电荷基于所述即刻前的荧光强度测量而被放置在所述环上，并且由于液滴从流断裂，相反的电荷被截留在所述液滴上。所述带电液滴然后掉落通过静电偏转系统，所述系统基于它们的电荷转移液滴到容器内。在某些系统中，电荷被直接地施加到流，并且断裂的液滴保留与流符号相同的电荷。所述流然后在液滴断裂之后返回到中性。

流式细胞术由此可用于在液体样品中分析对象和将对象从其它分离。其中，一般通过使用对象的低密度悬浮液和在窄流中或在小液滴中对象液体被允许向下掉落的液滴形喷嘴，对象悬浮在液体中并且逐个排开。所述窄流在照明装置前通过，所述照明装置一般是激光束或荧光激活光。所述激光束可以从对象散射，或者如果这些对象已经标有荧光标记物，照明装置能够在对象中诱导荧光。基于观察到的散射和/或荧光响应的光，可以得到关于单独地扫描的对象的信息。此信息可以进一步用于从所述束中分离此对象。至此，电荷可以被诱导在对象或其中所述对象悬浮的液滴上，并且然后可以通过施加静电场将对象从所述流中移除。由于测量装置通常能够一次一个地获得关于对象的信息，在现有的流式细胞术中重要的是，当它们通过测量装置时，诸如对象的微观粒子在液体流中逐个排开。

美国专利7463366公开了一种用三维显微技术获得样品的方法和设备，特别是厚的生物样品和由样品发出的荧光场。一个实施例包括获得试样的干涉信号，获取从试样发出的荧光信号，记录这些信号，和处理这些信号，以便重建试样的和由试样发出的荧光场的在给定时间的三维图像。另一实施例包括数字全息显微镜、照射样品的荧光激发源，其中所述显微镜和荧光激发源结合以获得试样的干涉信号并且获得由试样发出的荧光信号，用于记录所述干涉信号和荧光信号的装置，以及用于处理所述干涉信号和荧光信号以便重建试样的和从试样发出的荧光场的在给定时间的三维图像。

专利申请WO2004102111公开了一种紧凑的显微镜，所述显微镜能够以数字全息的方式工作用于获得样品的高质量3D图像，所述样品包括荧光样品和相对较厚的样品，如生物样品，所述显微镜包括用于照射要研究的样品的至少部分地空间相干的照明装置，和用于从所述样品在电子成像设备的传感器上产生干涉光束的差分干涉仪，所述干涉仪包括用于以限定的角度相对于其他的倾斜一个干涉光束的即倾斜装置(namely tilting means)，所述倾斜导致所述干涉光束在电子成像装置的传感器上的限定偏移，所述偏移比各光束的空间相干宽度小，所述显微镜能够被准完全地独立与样品地预先调整，使得需要用于获得样品的可靠3D图像的额外调整最小化。

流体动力聚焦是被例如微生物学家使用以从流式细胞仪或库尔特计数器(Coulter counters)提供更准确的结果用于例如确定细菌或细胞的大小的技术。随着它们被迫通过小的隧道，引起激光束或电流中的中断，细胞被计数。这些中断由仪器进行分析。由于直径必须在微米的量级，而隧道的长度应超过几个毫米，难以使用普通的制造工艺创建用于此目的的足够窄的通道。利用流体动力学的效应，流体动力聚焦通过用流体建立隧道的壁解决了这个问题。利用由玻璃或塑料制成的宽的(几百微米的直径)管，通过所述管泵送被称为鞘流(sheath flow)的流体的“壁”。样品被注入到鞘流的中间。如果两种流体在其速度或密度上足够不同，它们不会混合：它们形成两层稳定的流动。所述稳定性对悬浮对象的更好的测定质量是必需的。

WO2011/068764公开了一种流式细胞仪，其包括具有样品通道的毛细管、至少一个联接到所述毛细管的振动产生换能器(vibration producingtransducer)，所述至少一个振动产生换能器被构造为在样品通道内产生引起声辐射压的声信号，以声学地浓缩在样品通道中的流体样品流内流动的颗粒；和具有紫色激光和蓝色激光的扫描源(interrogation source)，紫色和蓝色激光被构造为至少与一些声学地浓缩的颗粒相互作用以产生输出信号。如在WO2011/068764中的系统是有声学聚焦的流式细胞仪的例子，并且更具体地是有声学聚焦的毛细管流式细胞仪的例子。

WO1998/057152公开了一种方法并且描述了用于探测标记到微粒的荧光物质的装置。所述设备包括用于输送微粒通过选定位置的单一的毛细管流动载体系统，用于照射标记到微粒的物质的电磁辐射源，和用于测量物质在选定位置发射的荧光的探测系统。所述方法包括输送微粒到选定位置，照射标记到微粒的荧光物质，并测定荧光物质在选定位置发射的荧光。如在WO1998/057152或WO2011/068764中的系统是毛细管流式细胞仪的一个例子。

现有技术的流式细胞仪具有许多缺点。一个缺点是从散射光得到的关于对象的信息是有限的。因为来自流式细胞分析的数据处于集合的水平，观察和测量单个对象的行为是不容易的。现有技术的流式细胞仪的另一个主要缺点仪是其低对象吞吐率。即使对于高速流式细胞仪和分选机，这仍然少于每秒几千个对象。吞吐速率与流动速度有关，并且被测量装置限制，所述测量装置需要能够在移动粒子上提供质量足够的测量。一般，当流动速度增加时，测量的质量下降，反之亦然。更快的测量技术，即在更小的周期内做质量足够的测量的技术，由此允许更高的吞吐率。许多实验需要非常大量的对象。这意味着，即使是如在现有技术中可用的高速流式细胞仪和分选机也需要运行较长的时间，这不仅是昂贵的建议，也可能会造成质量问题，因为从这样的长期运行中分选的对象在科学实验中可能不再是可用的。当分选的对象必须是无菌的时，这个问题可能进一步加重。

虽然高速流式细胞仪可以得到无菌对象，但是这使操作变得复杂，并进一步降低了吞吐量。大多数现有的流式细胞术系统不获取对象的图像，所述图像可能是期望的，例如为在以后进行检查或为更新图像数据库。在确实获得对象的图像的系统中，所述图像用传统显微镜拍摄，这需要将所述对象在显微镜的焦点中排队，所述对象包括生物有机体和非生物对象、杂质、污染物，或其任意组合，所述生物有机体诸如细胞、细菌、酵母、微生物、线虫，所述显微镜例如是荧光的或投影的。来自排到焦点外的对象的测量结果通常被抛弃，这导致在效率上和在信息上的显著损失。

此外，流式细胞术拥有非常复杂的仪器，因而只有熟练的和训练有素的操作员才能够运行它，并从这样的装置得到任何可接受水平的性能。

此外，流式细胞仪是购买和维护昂贵的仪器。激光流式细胞仪，其只能分析而不能分选，可以是非常昂贵的，尤其是对于小的实验室，而基于弧光灯的流式细胞仪仅稍微便宜一些。有附加分选功能的流式细胞仪可以花费其更便宜版本的将近两倍。此外，操作高速分选是每次运行通常大量花费的另一经常性开支。

用现有技术的流式细胞仪的分析或测量装置所获取的数据可能是不足够准确的，它可能不能足够快地获取，所述装置可能是太昂贵的，它可能只产生二维和/或模拟的图像。现有技术的流式细胞仪可能使用传统的光学技术以获得对象的图像，其中，所述对象需要在光学系统的焦点中。这有两个主要缺点：(i)人们可能不能够从对象获得良好的图像，因为将对象放置在焦点可能并不是简单的，尤其是如果它是如在流式细胞仪中的移动的对象，和(ii)人们每次只能获得一个对象的图像，因为每次只有一个对象可以被放置在焦点。此外，所收集的样品可能需要在分析之前处理，这可以是耗时耗力的过程。当同一装置被用来监视或分析不同的样品时，污染可能是一个问题。

DHM可以提供有关样品的图像和/或直接地数字化的信息，这均优于其它成像或分析技术获得的图像和信息。使用DHM作为流式细胞术系统的测量装置或附加到流式细胞仪允许用户获得悬浮在液体中的对象的三维图像。这种照片是基于由DHM记录的干涉信息。DHM可以获取此信息而没有将对象在显微镜的焦点中逐个排开的必要性。事实上，由DHM记录的干涉图案允许采集后聚焦，导致从数字化干涉图案提取对象的清晰3D图像的可能性，所述采集后聚焦优选地通过在分析计算机上的采集后软件，并且这不需要定位对象在显微镜的焦点上或调整显微镜的焦点到该对象的位置。此外，由于记录的干涉图案可以包含大量对象的3D信息，所述对象不需要被排成单行。在DHM用于流式细胞术系统或与流式细胞术系统结合使用时，这导致更高的吞吐率。此外，DHM仍然可以与荧光染料或标记物结合使用，其组合导致了在单次运行中的大量悬浮对象的扩展的可观察参数集合和数量。

在本领域中仍然有对具有改进的测量、观察、分析和/或分离特性的流式细胞仪的需要。使用数字全息显微镜作为流式细胞仪的测量装置比现有技术的流式细胞仪将允许获得关于扫描对象的更好的信息，特别是由于其在成像过程中省去聚焦装置或聚焦步骤的采集后聚焦功能。由于它需要很少的时间以获得对象的干涉或全息图像，DHM还很好地适合于提供有关运动对象的高品质信息。全息图像比流式细胞术系统中的现有技术测量所能提供的包含关于对象的多得多的信息，所述测量通常基于散射光和荧光。

在本领域中仍然有对具有改进的吞吐率的流式细胞仪的需要。DHM的快速采集时间允许高的吞吐率，比现有技术的流式细胞仪更高，特别是比提供被扫描对象的类似数量和质量的信息的现有技术流式细胞仪更高。特别是由于它的采集后聚焦能力，DHM还能够在一个记录步骤中收集许多对象的信息。因此，没有必要将对象逐个地呈现在显微镜的焦点中，而是可以得到许多对象的全息图。

在本领域中仍然有对对被扫描的对象是非侵入性的流式细胞仪的需要。这包括需要引入荧光或其它标记物到被扫描的对象的流式细胞仪，所述对象包括生物有机体和非生物对象、杂质、污染物或其任意组合，所述生物有机体诸如细胞、细菌、酵母、微生物、线虫。这样的标记可以是昂贵的、耗时的并且对对象是侵入的，因而所述对象可能不能够在进一步的实验中使用了。由于DHM提供了获得关于对象的高质量信息的一种非侵入性并且成本和时间效益的方法，采用有DHM的流式细胞仪解决了这个问题。对于相同的或改进的测量质量，不需要染料或标记物。然而，在本领域中仍然有对流式细胞仪的需要，所述流式细胞仪能够在单次运行中获得关于悬浮对象的组合信息，如通过DHM和荧光技术可获得的。

在本领域中仍然有对易于操作的流式细胞仪的需要。由于其提供能够被电子存储和/或简单地传输以供进一步使用的数字化的信息，DHM可被制成易于操作的，并且还完美地适合于自动化。

在本领域中仍然有对更便宜地制造和操作的流式细胞仪的需要。有DHM的流式细胞仪不需要染料或标记物，这导致更低的操作成本。此外，DHM可包括部分地相干的光源，如LED(发光二极管)，OLED(有机发光二极管)，OLET(有机发光晶体管)或类似的，而不是例如激光的高度相干光源，因此大大降低了制造成本。

因此，本发明的目的是提供一种包括数字全息显微镜的流式细胞仪用于在液体流中的对象的观测。

DHM可以提供有关样品的图像和/或直接地数字化的信息，这优于其它的成像或分析技术。因为人们可以在记录的干涉图案上执行采集后聚集技术，DHM不需要聚集系统。因此，人们可以无需聚焦而得到对象的高质量图像，并且由于这些图像可以在采集后步骤中获取，人们可以一次获得多个对象的图像。此外，使用现有技术，所收集的样品可能需要在分析之前处理，这可以是耗时耗力的过程。当同一装置被用来监视或分析不同的反应器，或者几次在不同位置的同一反应器时，污染可能是一个问题。现有技术可能并不总是提供返回样品到反应器或另一个反应器中的可能性，或者是实时监测并提供及时的反馈用于调整反应器中的环境参数的可能性。

发明内容

本发明提供但不限于用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的流式细胞术系统，所述系统包括数字全息显微镜(DHM)和至少一个流体系统，

-其中，DHM包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置；

-其中，流体系统能够引导所述对象通过所述DHM的照明装置的照明光束。

-其中，对象优选地是生物有机体、细胞、细胞色素、DNA和RNA链、染色体、蛋白质、微生物、细菌、病毒、酵母、线虫、酶、细胞质、细胞膜、原生动物等和非生物对象、杂质、污染物的列表中的任一项或其任意组合；

-其中，优选地，所述流体系统包括用于引起通过所述流体系统的液体样品流的一种机构，优选地，所述机构包括泵；

-其中，所述流体系统优选地包括用于在所述流体系统内控制液体样品流的横向尺寸的流大小控制设备，优选地所述流大小控制设备在所述液体样品流中能够将对象逐个地或一次多个地排开。

在一个优选的实施例中，所述DHM的照明装置包括部分地相干的光。

在一个优选的实施例中，所述DHM是差分DHM、彩色或彩色敏感的DHM，或其组合。

在一个优选的实施例中，所述系统包括用于观测对象的荧光的一个或多个荧光探测器。

在一个优选的实施例中，所述流体系统包括用于毛细管流式细胞术的毛细管。

在一个优选的实施例中，所述流体系统包括用于通过鞘流提供窄的隧道的流体动力学聚焦系统，带有对象的液体样品能够流动通过所述隧道。

在一个优选的实施例中，所述流体系统包括用于声学地集中在所述液体样品流中流动的对象的声学聚焦系统。

在一个优选的实施例中，所述流式细胞术系统包括用于根据可被所述DHM测量的性质分离对象的对象分选系统。

在一个优选的实施例中，所述对象是细胞。在一个更加优选的实施例中，所述细胞可以根据表明所述细胞是异常的性质而分离，所述性质如被人乳头瘤病毒(HPV)感染。

在一个优选的实施例中，本发明提供了如上所描述的流式细胞术系统，其包括至少一个泵送系统，所述泵送系统连接到所述一个或多个流体系统并且能够在所述流体系统中引起流体流动。

在一个优选的实施例中，本发明提供了如上所描述的流式细胞术系统，其中，至少一个流体系统形成在样品储存器和所述DHM之间的并且返回到所述储存器和/或一个或多个其他储存器的回路。

在一个优选的实施例中，本发明提供了如上所描述的流式细胞术系统，其中，至少一个流体系统包括储存器附接系统，其用于容易地附接所述流体系统到储存器和/或从储存器拆卸所述流体系统，据此防止流体泄漏。

在一个优选的实施例中，本发明提供如上所描述的流式细胞术系统，其中，至少一个流体系统包括流体密封的柔性的、可移动的和/或可弯曲的部件，当被压缩、拉动和/或推动时，所述部件导致在所述流体系统中的流体流动。

在一个优选的实施例中，本发明提供了如上所描述的流式细胞术系统，其包括有连接到所述流体系统的泵的泵送系统，所述泵送系统能够压缩、拉动和/或推动所述流体密封的柔性的、可移动的和/或可弯曲的部分，从而在所述流体系统中引起流体流动。

在一个优选的实施例中，本发明提供了如上所描述的流式细胞术系统，其中，至少一个泵送系统包括，优选地是连续的，诸如蠕动泵的泵，其能够在所述泵连接到的流体系统中引起优选地是连续的流体流动。

在另一方面中，本发明提供了用于如上所描述的流式细胞术系统的流体系统的管。

在一个优选的实施例中，所述管是可高压加热的。

在一个优选的实施例中，本发明提供了如上所描述的管，其中，所述部件包括用于使通过所述管的液体样品流变窄的毛细管部件。

在另一方面中，本发明提供了用于如上所描述的流式细胞术系统的流体系统，其包括至少是部分地透明的一个或多个部件，其用于所述流式细胞术系统的DHM的照明装置，所述部件诸如至少部分地透明的管、储存器，鞘流体，或如在管中的透明中断或开口。

在不同的方面中，本发明提供了用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的一种流式细胞术方法，其步骤包括：

-提供包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置的DHM；

-提供一种流体系统，所述流体系统优选地包括引起液体样品通过流体系统的液体样品流的机构；

-引起通过所述流体系统的液体样品流；

-引导所述的对象，逐个地或一次多个地排开，通过所述DHM的照明装置的照明光束；

-借助于所述DHM观察和/或分析所述对象；

-优选地按照所述对象的观察到的性质将所述对象从所述液体样品流分开，

其中，优选地，所述对象是生物有机体和非生物对象、杂质、污染物，或其任意组合，所述生物有机体诸如细胞、细菌、酵母、微生物、线虫，其中，优选地，所述对象通过毛细作用、毛细流动、声学聚焦和/或流体聚焦而被排开。

附图说明

图1是说明根据本发明的流式细胞术系统的流程图。

图2示出了来自储存器的液体样品(202)如何流动到在现有技术中已知的流式细胞仪(212)，并随后地流动到DHM。

图3示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中，液体样品流被引导到DHM并随后被引导到现有技术的流式细胞仪。

图4示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中，在液体样品流中的对象根据由DHM获取的信息而被分选，并且随后一部分的对象被引导到现有技术的流式细胞仪用于获得额外信息。

图5示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中在液体样品流中的对象根据由现有技术的流式细胞仪和DHM获取的组合信息而被分选。

图6示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中在液体样品流中的对象根据由现有技术的流式细胞仪采集的信息而被分选，并且随后对象的分选后的一部分被引导到DHM以获得额外的信息。

具体实施方式

本发明涉及一种用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的流式细胞术系统和方法。本发明还涉及这样的流式细胞术系统的流体系统和用于这种流体系统的管。

除非另有定义，在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有如本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指导，术语定义被包括以更好地理解本发明的教导。

如本文所使用的，下列术语具有以下含义：

除非上下文另有明确规定，如本文所用的“一(a)”、“一(an)”，和“该(the)”是指单数和复数形式两者。通过举例的方式，“隔室”是指一个或一个以上的隔室。

如本文所使用的指可测量的值如参数、量、持续时间等的“大约(about)”旨在包含特定值的和从特定值的+/-20％或更少的变化，优选的是包含+/-10％或更少的变化，更优选的是包含+/-5％或更少的变化，甚至更优选地包含+/-1％或更小的变化，并且还更加优选地包含+/-0.1％或更少的变化，在所公开的发明中迄今这样的变化对执行是适当的。然而，应理解的是，修饰语“大约”所指的值本身也是特别地公开的。

如本文中使用的“包含(comprise)”、“包含(comprising)”和“包含(comprises)”和“包含的(comprised of)”等同于“包括(include)”、“包括(including)”、“包括(includes)”或“包含(contain)”、“包含(containing)”，“包含(contains)”是包含性的或开放性的术语，其说明如部件的随后事物的存在，而不除去或排除本领域已知的或其中公开的额外的、非列举的部件、特征、元件、构件、步骤的存在。

通过端点的数值范围的表述包括范围内所包含的所有数字和分数，以及所引用的端点。

表述“重量％(％by weight)”(重量百分比)，在这里和整个说明中除非另有定义，是指基于该制剂的总重量的各组分的相对重量。

在第一方面中，本发明提供了用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的流式细胞术系统，所述系统包括数字全息显微镜(DHM)和至少一个流体系统。

-其中，所述DHM包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置；

-其中，流体系统能够引导所述对象通过所述DHM的照明装置的照明光束。

-其中，优选地，对象是生物有机体、细胞、细胞色素、DNA和RNA链、染色体、蛋白质、微生物、细菌、病毒、酵母、线虫、酶、细胞质、细胞膜、原生动物等和非生物对象、杂质、污染物的列表中的任一项或其任意组合；

-其中，优选地，所述流体系统包括用于引起通过所述流体系统的液体样品流的一种机构，优选地，所述机构包括泵；

-其中，优选地，所述流体系统包括用于在所述流体系统内控制液体样品流的横向尺寸的流大小控制设备，优选地所述流大小控制设备在所述液体样品流中能够将对象逐个地或一次多个地排开。

使用DHM测量和/或分析对象具有许多优于其他技术的优点，这是本文档通篇所解释的，所述对象诸如生物有机体、细胞、细胞色素、DNA和RNA链、染色体、蛋白质、微生物、细菌、病毒、酵母、线虫、酶、细胞质、细胞膜、原生动物等和非生物对象、杂质、污染物，或其任意组合，所述其他技术特别是其他的显微技术。所述优点包括采集后聚焦的可能性，其允许人们无需光学聚焦步骤而获取多个对象的信息。结合DHM与在液体中的对象流或流动允许获得在样品中的单个对象的详细分析，其中，在它们将被DHM测量或观察时，所述对象排成单行或一次出现多个对象，与现有技术的流式细胞术系统相比，所述分析具有改进的质量。此外，这允许大量对象通过DHM的快速、详细并且个性化的扫描或者分析，比现有技术DHM分析相同数量的对象更快。

相比于其他分析/监测技术，在流式细胞术系统中使用DHM提供了许多优点，诸如

-内联3D/4D四维监控代替(2D/3D)显微系统上的在特定时刻和从特定反应器收集或手工收集样品的劳动密集的方法和后续的分析的可能性，所述显微系统诸如传统显微镜、相衬显微镜和共聚焦显微镜；

-相比其他显微技术，在更短时间期间内收集的更大量的关于样品的信息；

-自动数字化和甚至样品的自动化鉴定和定量等的可能性。

DHM提供直接地数字化的相位信息，其允许3D成像。这比诸如CT扫描的其他3D成像技术更快，所述其他3D成像技术先获得大量的2D图像，从所述2D图像重建3D图像，可能在额外的数字化步骤之后。因此，本发明通过使用DHM作为观察、分析和/或监控装置或机构导致了反应器的更快速、更准确并且更可靠的分析和/或监测。因为它比例如CT技术更快、更准确，DHM也比其他显微系统更易于用于分析流体样品，更优选地是液体样品，特别是用于获得3D信息。

数字全息显微术是允许3D样品或对象的记录而没有逐层扫描样品的需要的技术。在这方面，DHM是比共聚焦显微术更优越的技术。在DHM中，全息表示由诸如CCD(电荷耦合器件)或CMOS(互补金属氧化物半导体)摄像头的数码相机记录，其随后可以在计算机上存储或处理。

为了获得全息表示，或者全息图，传统地诸如激光光源的高相干光源被用于照射样品。在最基本的设置中，来自光源的光被分成两个光束，物体光束和参考光束。所述物体光束经由光学系统发送到样品并与它相互作用，从而取决于物体的光学性质和3D形状而改变光的相位和振幅。然后使已被反射或透射过样品的物体光束(例如，通过一组反射镜和/或分束器)与参考光束干涉，产生数字化记录的干涉图案。由于当物体光束和参考光束具有可比拟的振幅时全息图是更准确的，在参考光束中可引入吸收元件，所述吸收元件可以减小它的振幅到物体光束的水平，而不改变参考光束的相位或最多全局地改变相位，即不依赖于参考光束在何处和如何通过吸收元件。所记录的干涉图案包含依赖于对象的光学性质和3D形状的相位和振幅变化上的信息。

制作全息图的另一种方式是通过使用直列全息技术。直列DHM类似于更传统的DHM，但不分裂光束，至少不通过分束器或其他外部光学元件分裂光束。直列DHM最优选地用于看在流体中的不太浓密的粒子溶液，所述粒子例如细胞。因此，至少部分地相干的光的某些部分将穿过样品而不与粒子(参考光束)相互作用，并且与已与粒子相互作用的光(物体光束)干涉，产生数字化记录和处理的干涉图案。直列DHM在透射模式中使用，它需要具有相对较大的相干长度的光，并且如果样品太厚或太稠密，就不能使用。

称为差分DHM(DDHM)的另一种DHM技术公开在欧洲专利EP1 631788中。DDHM与其它技术不同在于它没有真正使用参考光束和物体光束。在DDHM的优选设置中，所述样品由照明装置照射，所述装置由在反射或透射模式中的至少部分地相干的光组成。反射的或透射的样品光束可以通过物镜发送，随后被分束器分为两个，并沿不同路径在差分干涉仪中发送，所述干涉仪例如迈克尔逊和马赫-曾德尔型(the Michelson or Mach-Zehndertype)。在所述路径的一个中，插入光束弯曲元件或倾斜装置，例如透明的楔形件。然后使两个光束在聚焦透镜的焦平面上相互干涉，在此焦平面中的干涉图案由例如连接到电脑的CCD摄像头数字地记录和存储。因此，由于光束弯曲元件，所述两个光束以受控的方式略微偏移，并且所述干涉图案取决于偏移的量。然后，光束弯曲元件被转动，由此改变偏移的量。新的干涉图案也被记录。这可以做N次，并且从这些N个干涉图案，在所述聚焦透镜的焦平面中的相位的梯度(或空间导数)可以被近似地计算。这被称为相位步进方法，但得到相位梯度的其他方法也是已知的，诸如傅立叶变换数据处理技术。相位的梯度可以被积分，得到作为位置的函数的相位。作为位置的函数的光的振幅能够从所述N个记录的干涉图案的可能地但不一定必须地加权平均的振幅来计算。因为相位和振幅由此是已知的，与在直接全息方法中(利用参考和物体光束)相同的信息被获得，并可以执行所述对象的后续3D重构。差分DHM具有一定的超越其他类型的DHM的优势，其中之一是降低的生产和操作成本。此外，利用差分DHM，人们不需要在干涉部件之间引入样品，这导致获得的全息图的更好质量以及更强大和更耐冲击的DHM。因此，在优选的实施例中，DHM是差分DHM。

在诊断设置中使用DHM具有许多优点，这使它成为在诸如当前发明的设置中实施的理想技术。除了明场图像，也创建了相移图像。相移图像是DHM独有的并给出了关于光程的可量化信息。在反射DHM中，相移图像形成对象的形貌图像。

透明对象，如活的生物细胞，传统上是在相衬显微镜或差分干涉相衬显微镜中观察。这些方法通过用相移信息扭曲亮场图像而可视化相移透明对象。替代扭曲的亮场图像，透射DHM产生示出对象光学厚度的单独的相移图像。数字全息显微术由此使得可视化和量化透明对象成为可能，因此也被称为量化相衬显微术。此外，DHM允许三维亚细胞结构成像。

对象图像在给定的焦距计算。然而，由于所记录的全息图包含所有必需的对象波前信息，能够通过在重建算法中改变焦距参数而计算在任何焦平面的对象。事实上，所述全息图包含计算完整的图像堆栈所需的所有信息。在所述对象的波前从多个角度记录的DHM系统中，能够充分表征对象的光学特性并创建对象的断层图像。

此外，由于DHM系统不具有成像透镜，传统的光学像差并不适用于DHM。光学像差通过重建算法的设计而被“校正”。真实地模拟光学装置的重建算法不会受光学像差影响。在光学显微系统中，光学像差传统上是通过将透镜组合成复杂和昂贵的成像显微镜物镜而校正。此外，在高放大倍率处的狭窄焦点深度需要精密机械。最后，用于DHM系统的所需部件是廉价的光学和半导体部件，诸如激光二极管和图像传感器。低部件成本与DHM的自动聚焦能力结合，使得以非常低的成本制造DHM系统成为可能。

在优选的实施例中，DHM是差分DHM、彩色或彩色敏感DHM、或它们的组合。一般，如果流式细胞术系统的成本要被保持较低，可以使用差分DHM。彩色或彩色敏感DHM允许人们获得对象的更详细的和/或彩色的图像，所述彩色或彩色敏感DHM包括处于或接近不同波长的一个以上的，例如三个，照明装置。

在优选的实施例中，所述系统包括一个或多个用于观察对象荧光的荧光探测器，或者用于测量对象阻抗的阻抗探测器。本发明的流式细胞术系统可以包括在现有技术的流式细胞术系统中使用的测量部件，诸如阻抗(或电导)测量系统和得到光信号的光学系统，所述光学系统例如灯(汞，氙)；高功率水冷激光器(氩、氪、染料激光器)；低功率风冷激光器(氩(488纳米)、红-氦氖(633纳米)、绿-氦氖、氦镉(深紫外UV))；二极管激光器(蓝，绿，红，紫)。DHM由此可联接到现有的流式细胞术系统，其中，相比没有DHM的现有系统增加在一次运行中获得的信息。

在优选的实施例中，流体系统包括用于毛细管流式细胞术的毛细管。以这种方式，液体样品中的对象，例如细胞，可以在毛细管中排成单行或一次多个对象地排开，例如无需鞘流体或其他机构。通过选择毛细管的宽度，也能够控制同时地暴露到DHM的照明装置的对象的数量。

在优选的实施例中，流体系统包括用于通过鞘流提供狭窄隧道的流体动力学聚焦系统，通过所述隧道带有对象的液体样品可以流动。流体动力聚焦是定位颗粒用于分析的非常有效的方法。

在一个优选的实施例中，所述流体系统包括用于声学地浓缩在所述液体样品流中流动的对象的声学聚焦系统。有声学聚焦系统的流式细胞仪利用声学激励以既聚焦又浓缩样品颗粒到扫描区域，所述声学激励沿例如毛细管的整个结构产生。因为声学方法既聚焦又浓缩颗粒，所以能够既保持传统的颗粒分析速率又保持长的通过时间，同时使用没有声学聚焦系统的流式细胞仪的动力和耗材的一小部分。更长的集成时间允许常规粒子分析使用更便宜、更小、并且需要更少功率的数据采集系统，而且仍然进行高灵敏度的测量。然而，声学聚焦流式细胞术的好处不仅仅局限于鞘液的可能消除。声学浓缩也使得能够以合理的分析速率进行极稀样品的分析，所述极稀样品在每升几个细胞或颗粒的量级上，如在水监控应用中可能见到的。由于没有鞘，也能够反复地重新分析感兴趣的颗粒用于可靠的稀有事件分析。

在优选的实施例中，流式细胞术系统包括用于根据由所述DHM可测量的性质分离对象的对象分选系统。在更优选的实施例中，所述分选系统包括振动机构，它导致对象流断裂成单个液滴。所述系统被调整，使得每个液滴有多个对象的概率较低。就在所述流断裂成液滴之前，所述流通过DHM的照明装置，在其中预定的对象属性可以被测量或观察。电学充电环就放置在所述流断裂成液滴的点上。基于即刻前的DHM测量，电荷被放置在所述环上，并且由于液滴从流断裂，相反的电荷被截留在所述液滴上。所述带电液滴然后掉落通过静电偏转系统，所述系统基于它们的电荷转移液滴到容器内。在另一实施例中，电荷被直接地施加到流，并且断裂的液滴保留与所述流符号相同的电荷。所述流然后在液滴分解之后返回到中性。

在一个优选的实施例中，至少一些所述对象是细胞。细胞是用DHM能够很详细地研究的对象。

在一个优选的实施例中，至少一些所述对象是杂质或污染物，其优选地包括比DHM的探测极限更大的尺寸。DHM的探测极限一般是照明光束的波长的量级，但也可以进一步减少到约此波长的一半，例如通过使用暗场显微技术。

在一个优选的实施例中，所述流式细胞术系统包括荧光测量系统，其用于测量对象对所述DHM的照明装置的荧光响应。因此，流式细胞术系统可以从DHM和从荧光分析得到组合的信息。对于荧光分析，用至少一个标记物和/或染料处理样品或在样品中的对象可能是必要的。从来自DHM和荧光测量系统的组合数据，人们还可以寻找在如由DHM得到的细胞特征与指示病毒、蛋白质、DNA或RNA序列等存在的标记物的荧光信号之间的相关性。

样品中对象的荧光响应可以是自发的，或者其可以是被DHM的照明装置所诱导的，和/或在优选的实施例中，所述流式细胞术系统包括用于诱导所述对象的荧光响应的荧光照明装置。这些照明装置可包括有能够用于诱导对象的荧光的频谱、强度和/或其它性质的光源，所述对象可以用标记物和/或染料处理过。

在一个更加优选的实施例中，所述细胞能够根据一个或多个特性而被分离，优选地表明所述细胞是异常的特性，例如感染人乳头瘤病毒(HPV)。这些特性可包括由所述DHM可测量的特性，诸如细胞大小、细胞高度、细胞光学高度、细胞类型、核大小、核高度、核光学高度、透镜效应等，或其任意组合。这些特性也可以通过对象对照明装置的荧光响应是可测量的，其中，对象优选地用至少一个例如用于标记异常存在的标记物和/或染料处理过，所述异常诸如HPV。透镜效应的特性指的是细胞的聚焦或散焦特性，其取决于对象的曲率以及如细胞质的细胞成分和细胞液体的折射系数。这样的特性可以用于确定细胞是活的还是死的。

在另一方面，本发明提供了用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的一种流式细胞术方法，其步骤包括：

-提供包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置的DHM；

-提供一种流体系统，所述流体系统优选地包括引起液体样品通过流体系统的液体样品流的机构；

-引起通过所述流体系统的液体样品流；

-引导所述的对象，逐个地或一次多个地排开，通过所述DHM的照明装置的照明光束；

-借助于所述DHM观察和/或分析所述对象；

-优选地按照所述对象的观察到的性质将所述对象从所述液体样品流分离，

其中，优选地，所述对象是生物有机体和非生物对象、杂质、污染物，或其任意组合，所述生物有机体诸如细胞、细菌、酵母、微生物、线虫，其中，优选地，所述对象通过毛细作用、毛细流动、声学聚焦和/或流体聚焦而被排开。

相比于在本文中描述的流式细胞术系统的数字全息显微术，其他显微技术对监控在反应器和回路系统中的过程未必是足够快速或精确的。这样的其他显微技术可能不会被内联应用，而是需要拿取样品，可能地施加模具或着色，将样品施加到载玻片上，并用显微镜观察载玻片上的样本。此过程是耗时并且劳动密集的，因此不适合于自动化。其他显微镜技术可以得到模拟图像，其然后可以通过例如附加的扫描步骤而数字化存储。利用DHM，所述信息被数字化地获取并且能够数字化地直接处理，即人们不需要额外的数字化过程。此外，因为如果需要可将样品返回到反应器中，DHM不会导致样品的损失。由于例如着色、载玻片、添加必需的标记物等的使用，其他显微技术可能不具有那种优势。然而，荧光标记物和染料或其他现有技术仍然可以与DHM结合使用，因此增加在单次运行中可以从悬浮的对象获得的信息量。

一般地，DHM包括照明装置、干涉仪、以及数字记录装置。所述照明装置装置包括相干光源或至少部分地相干的光源，诸如激光或LED，所述干涉仪可包括一组反射镜和/或分束器，所述数字记录装置诸如CCD或CMOS相机和连接到它用于长时间储存的如闪存卡或磁存储装置。DHM也可以包含其它光学元件，诸如透镜、反射镜、棱镜、衰减器等。可能地，DHM还可以包含或可以连接到处理装置，诸如大型机、PC，如PLC的逻辑器件等。优选地根据要被观察的样品的性质，DHM可以工作在透射和/或反射模式中。如在本发明的系统中使用的DHM可以是传统DHM、直列DHM、差分DHM、彩色或彩色敏感DHM，或另一类型的DHM。因此，在优选的实施例中，所述流式细胞术的DHM的照明装置包括部分地相干的光。部分地相干的光源一般比相干光源便宜。

在所述流式细胞术系统的一个实施例中，至少一个流体系统包括一个或多个可能会与来自所述反应器的流体处于直接接触的管。优选地，所述管包括可弯曲的材料，所述材料仍然抵抗可能的扭结。在流体系统中使用管以引导流体的优点在于，它们可以被便宜地制造，并且可以被制成对手头应用足够长，或者可以被组合到较长的流体引导通道。在更加优选的实施例中，仅管，更加优选地容易地可更换的管，可能与反应器的流体处于直接接触。因此，流体系统的其它部件可以被重新使用，而没有可能昂贵的清洁或去污步骤的必要性。

在一个优选的实施例中，所述至少一个流体系统包括对所述DHM的照明装置至少部分地透明的部件，用于获得所述流体样品的相位信息。

为了用根据本发明的流式细胞术系统内联监测和/或分析液体样品储存器的内容物，在DHM与储存器的内容物的至少一个样品之间的光学接触是必要的，优选地没有明确地从储存器移除那个样品的需要。因此，所述流体系统可以至少包括提供与DHM的光学接触的部件，优选地所述部分的性质对DHM的规格是最优化的。此外，在一个优选的实施例中，所述流体系统包括一个或多个管，所述管用于从储存器引导样品到DHM并返回储存器和/或一个或多个其他储存器。在这样的实施例中，可能地取决于由DHM所获得的信息，流体系统可引导流体从一个储存器到DHM然后或者返回相同的储存器，或者到另一个。由于DHM能够快速和准确地获取关于液体样品的信息，它可以实时地使用这个信息来决定需要对所观察的样品的内容物做什么。另外，在一个优选的实施例中，流体系统可包括优选地是电子操纵的一个或多个阀和决策单元，所述决策单元可操作地连接到所述阀和DHM，并且在取决于由DHM所获取的信息的时间决定打开和/或关闭哪个阀。

为了避免从一个储存器取出的样品被例如来自另一储存器的残余物污染，可能会与来自储存器的流体处于直接接触的流体系统回路的部件应该是很容易地可替换的。以这种方式，不与来自储存器的流体接触的部件可以被重新使用。这有许多优点：可替换的部件可以至少部分地由廉价材料制成，只有应该提供与DHM或流大小控制设备的最佳光学接触的部件可能需要是昂贵的，所述部件例如收窄液体的下降流到微米尺寸的喷嘴，因为它们需要持续更长的时间，可重复使用的部件可以是更昂贵的和质量更好的。如果可重复使用的部件是廉价制造的，这也是好的。更特别地，本发明的系统的制造商有如何制造可重复使用部件的选择，所述可重复使用部件可根据系统的具体用途进行优化。所述系统的可更换部件不需要被净化或被消毒，或者可以在被连接到流体系统之前灭菌，例如高压加热，因此赢得时间并节省成本，尤其是如果许多不同类型的样品需要用同一流式细胞仪分析。这样的可更换部件可以大量生产，导致降低的成本。因此，在优选的实施例中，所述流体系统包括容易地可更换的和/或廉价制造的管。

在一个优选的实施例中，本发明的系统包括连接到DHM或DHM的部件的中央单元，其能够调节DHM，特别是DHM的工作参数。

由于诸如对流、传导或辐射的自然现象，流体流动可以出现，所述自然现象由例如通过发生在反应器中的反应或热梯度引起的密度或压力差异、由通过高度差异引起的重力等。如果流体流动是所期望的，但没有自发地发生或者如果所述流动需要被控制，可将一个或多个泵送系统连接到流体系统，以便在所述系统中引起流动。因此，在优选的实施例中，本发明的流式细胞术系统包括至少一个泵送系统，所述泵送系统连接到流体系统，并能够在所述流体系统中引起流体流动。

在一个优选的实施例中，根据本发明的流式细胞术系统包括至少一个流体系统，其包括储存器附接系统用于容易地附接所述流体系统到储存器和/或从储存器拆卸所述流体系统，由此防止流体泄漏。在一个更加优选的实施例中，所述储存器附接系统包括安装在外表面上的螺纹，其能够拧入并拧出在所述储存器的侧面或盖子的开口中的相应螺纹，以此密封所述开口，即防止流体从所述储存器和所述流体系统创建的容积逸出，其中，所述储存器附接系统包括用于流体流入和流体流出的至少两个通道，以此允许流体经由所述流体系统从所述储存器到所述DHM的输送。储存器附接系统可以是这样的，即流体系统可以从顶部、侧部、底部或其组合连接到储存器。

在一个优选的实施例中，所述至少一个流体系统包括流体密封的柔性的、可移动的和/或可弯曲的部件，当压缩、拉动和/或推动时，所述部件的导致在所述的流体系统中的流体流动。因此，可以在流体系统中引起流体流动，而没有高的泄漏风险，并且没有所述流的致动器的污染。在一个更加优选的实施例中，本发明的流体显微镜系统包括连接到所述流体系统的泵送系统，其能够压缩、拉动和/或推动所述流体密封的柔性的、可移动的和/或可弯曲的部件，从而在所述流体系统中引起流体流动。

在另一个方面，本发明提供了一种如在本文档中公开的流式细胞术系统组件，其经由流体系统连接到一个或多个储存器。这种储存器可包括悬浮在液体中的对象的样品，其中，所述对象可以由所述流式细胞术系统观察、测量、分析、分类和/或分选。

本发明通过下面的非限制性例子进一步描述，所述例子进一步说明本发明，而没有意图也不应被解释为限制本发明的范围。

例子

图1是说明根据本发明的一种流式细胞术系统的流程图。液体样品，即在悬浮液中的对象的样品，从储存器(206)被引入流体系统。流由泵送系统(201)被引入到液体样品，并且液体样品经由流体系统的管(202)导向到流体系统的流大小控制设备(203)。液体样品的流可以被所述设备(203)收窄(204)并被发送到流式细胞术系统的DHM(205)。这可以通过任何技术完成，诸如在本文档中描述的那些：流体动力学聚焦、声学聚焦、毛细作用等，并且液体样品可以简单地落下穿过DHM的照明装置的照明光束，或者它可以在透明管中被引导穿过照明光束，所述透明管诸如透明毛细管等。收窄的流(204)的横截面直径可以预先设置，或者其可以根据正被分析的特定液体样品或流式细胞术系统操作者的具体要求而调整。对于高通量，所述直径可以选择大的，使得许多对象一次出现在照明光束并被DHM观察。如果所述对象要根据其测量到的性质进行分类时，导致对象逐个排开的小直径，可以是优选的。关于在液体样品流中的对象的信息被DHM(205)记录，并优选地经由链接(208)发送给控制、计算和数据库系统(207)。此系统(207)可以解释如由DHM获得的信息，并且可以例如执行采集后聚焦用于放大到单个对象，并使用成像或图像解释软件获取关于这些对象的信息。所述控制系统(207)还可以能够存储或选择性地存储所获得的关于对象的信息，并且其还可以通过链接(211)操纵分选装置(210)，以便根据一组预先确定的标准分选在所述流中的对象。分选的对象然后可引导到一个或多个储存器(209)。

在分选的情况下，流式细胞术系统还可以包括振动机构，其使液体样品流断裂成单个液滴。该系统然后可以被调整，使得每个液滴有多于一个对象的概率较低。电学充电环就放置在所述流断裂成液滴的点上。基于即刻前测量的特性，电荷被放置在所述环上，并且由于其从流断裂，相反的电荷被截留在所述液滴上。所述带电液滴然后掉落通过静电偏转系统，所述系统基于它们的电荷转移液滴到容器内。在一些系统中，电荷被直接地施加到所述流，并且断裂的液滴保留与所述流符号相同的电荷。所述流然后在液滴分解之后返回到中性。

图2至6示出了根据本发明的流式细胞术系统的其它实施例，其中，现有技术的流式细胞仪与DHM结合。

在图2中，来自储存器(206)的液体样品(202)流动到在现有技术中已知的流式细胞仪(212)，例如，基于荧光或散射激光的流式细胞仪。在图2中的现有技术的流式细胞仪(212)包括流大小控制设备，其将样品中的对象逐个排开，并且从现有技术的流式细胞仪(212)中流出的液体样品流可以是窄的样品流(204)，其中所述对象逐个排开，所述流被引导或掉落穿过DHM(205)的照明光束。可选地，所述流可在被提交到DHM(205)的照明光束之前被加宽。所述DHM可获取有关对象的附加信息，包括如2D、3D或4D图像。然后，液体样品流可以返回到储存器。

图3示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中，液体样品流被引导到DHM并随后被引导到现有技术的流式细胞仪。所述液体样品取自储存器(206)，并经由流体系统(202)被引导到DHM(205)，在所述DHM(205)中一次多个对象被DHM(205)观察。液体样品流然后被流体系统引导到现有技术的流式细胞仪(212)，其中它被收窄以将在流中的对象逐个排开。所述窄的流(204)被流体系统收集并引导到储存器(209)。在这样的设置中，人们可以例如使用由DHM(205)获取的信息，以实时地调整现有技术的流式细胞仪(212)的设置，例如通过自动化控制系统(214)。

图4示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中，在液体样品流中的对象根据由DHM获取的信息而被分选，并且随后地，对象的一部分被引导到现有技术的流式细胞仪中以获得更多的信息。在图4中示出的系统类似于图1中示出的那个，只是沿分选后的液体样品流的一个(215)添加了现有技术的流式细胞仪(212)。在此设置中，由于分选后的液体样品流(215)已经只包含感兴趣的对象，现有技术流式细胞仪(212)可以独立于控制系统(207)而工作。可选地，流式细胞仪(212)可以连接到同一控制系统(207)，所述控制系统然后可以作为集中的控制、计算和/或数据系统。

图5示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中，在液体样品流中的对象根据由现有技术流式细胞仪和DHM获得的组合信息而被分选。在图5中示出的系统类似于图1中示出的那个，只是在液体样品流(202)中添加了有流大小控制设备的现有技术流式细胞仪(212)。现有技术细胞仪通过链接(213)提供信息到控制系统(207)，所述信息如荧光强度或通过观察到的激光的散射获得的对象尺寸。流出现有技术流式细胞仪(212)的流可以保持较窄(204)，即对象仍然可以逐个排开。所述对象然后被引导通过DHM的照明装置的照明光束，并且关于对象的信息被获得并经由链接(208)发送到控制系统(207)。所述控制系统(207)然后可以实时地结合来自现有技术流式细胞仪和DHM的信息，以便操纵分选装置(210)，其中所述对象可根据其测量到的特性而分选。分选后的液体样品流可以返回到一个或多个储存器(209)。

图6示出了根据本发明的流式细胞术系统的一个实施例，其中，在液体样品流中的对象根据由现有技术流式细胞仪获取的信息而被分选，并且随后地对象的分选后的一部分被引导到DHM以获取额外的信息。在液体样品流中的悬浮对象取自储存器(206)，并经由流体系统(202)被引导到现有技术流式细胞仪(212)，其将对象逐个排开。由现有技术流式细胞仪(212)获得的信息被用来控制分选对象(210)，所述控制例如通过现有技术的控制系统(220)。分选后的液体样品流的一个被引导通过DHM的照明光束，并且DHM获得关于分选后的对象的额外信息，所述液体样品流仍然可以保持较窄(204)，即对象可以保持逐个排开。在经由链路(208)的控制系统(207)上，所述信息可以被分析和/或存储。分选后的液体样品流可以被引导到一个或多个储存器(209)。

应假定的是，本发明并不限于任何前面描述的实现形式，并且在不脱离所附权利要求呈现示例的范围内可以添加一些修改。

Claims (15)

1.用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的流式细胞术系统，所述系统包括数字全息显微镜(DHM)和至少一个流体系统，其中，所述DHM包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置，其中，所述流体系统能够引导所述对象通过所述DHM的照明装置的照明光束，其中，所述流体系统包括用于引起通过所述流体系统的液体样品流的机构，其中，优选地，所述流体系统包括用于在所述流体系统内控制液体样品流的横向尺寸的流大小控制设备，优选地，所述流大小控制设备在所述液体样品流中能够将对象逐个地或一次多个地排开。

2.根据权利要求1所述的流式细胞术系统，其中，所述对象优选地是在生物有机体、细胞、细胞色素、DNA和RNA链、染色体、蛋白质、微生物、细菌、病毒、酵母、线虫、酶、细胞质、细胞膜、原生动物等和非生物对象、杂质、污染物的列表中的任一项或其任意组合。

3.根据权利要求1到2的任一项所述的流式细胞术系统，其中，用于引起液体样品流的所述机构包括泵。

4.根据权利要求1到3的任一项所述的流式细胞术系统，其中，所述DHM的照明装置包括部分地相干的光。

5.根据权利要求1到4的任一项所述的流式细胞术系统，其中，所述DHM是差分DHM或彩色DHM。

6.根据权利要求1到5的任一项所述的流式细胞术系统，其中，所述流体系统包括用于毛细流式细胞术的毛细管。

7.根据权利要求1到6的任一项所述的流式细胞术系统，其中，所述流体系统包括用于通过鞘流提供窄的隧道的流体动力学聚焦系统，带有对象的液体样品能够流动通过所述隧道。

8.根据权利要求1到7的任一项所述的流式细胞术系统，其中，所述流体系统包括用于声学地浓缩在所述液体样品流中流动的对象的声学聚焦系统。

9.根据权利要求1到8的任一项所述的流式细胞术系统，所述系统包括用于测量对象对所述DHM的照明装置的荧光响应的荧光测量系统。

10.根据权利要求9所述的流式细胞术系统，所述系统包括引起所述对象的荧光响应的荧光照明装置。

11.根据权利要求1到10的任一项所述的流式细胞术系统，所述系统包括用于根据通过所述流式细胞术系统可测量的性质分离对象的对象分选系统。

12.用于在液体样品中观察、分析和/或分离对象的流式细胞术方法，其步骤包括：

-提供DHM，其包括照明装置、干涉仪系统和数字记录装置；

-提供一种流体系统，所述流体系统优选地包括引起液体样品通过流体系统的液体样品流的机构；

-引起通过所述流体系统的液体样品流；

-引导所述对象通过所述DHM的照明装置的照明光束，其中，所述对象逐个地或一次多个地排开；

-借助于所述DHM观察和/或分析所述对象。

13.根据权利要求12所述的方法，其步骤包括：

-根据所述对象的观察到的性质将所述对象从所述液体样品流分离。

14.根据权利要求12到13的任一项所述的方法，其中，所述对象是生物有机体、细胞、细胞色素、DNA和RNA链、染色体、蛋白质、微生物、细菌、病毒、酵母、线虫、酶、细胞质、细胞膜、原生动物、非生物对象、杂质、污染物，或其任意组合。

15.根据权利要求12到14的任一项所述的方法，其中，所述对象通过毛细作用、毛细流动、声学聚焦和/或流体动力聚焦而排开。