CN104152372B - 防治植物病害的生防菌株g68及其菌剂制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了防治植物病害的生防菌及其菌剂制备方法和应用。该生防菌命名为Bacillus subtilisG68，保藏号CGMCC NO.8978；该生防菌菌剂的制备方法为将活化后的菌株G68接种于NYBE培养液培养22～26h获得种子液，将种子液接种于含0.08～0.12 mM MnSO₄的NYBE发酵培养基培养70～74 h获得发酵液，即为生防菌菌剂；含菌株G68的生防菌剂可促进植物种子萌发，加速植物生长，且对番茄立枯病和早疫病病害防效分别达53.8%和60.1%；菌株G68具有抗菌谱广，效果稳定，制备成本低，应用方法简单，环境友好，无毒害等特点，在植物病害防治方面具有很好的应用前景。

Description

防治植物病害的生防菌株G68及其菌剂制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及防治植物病害的生防菌及其菌剂制备方法和应用。

背景技术

我国作为一个农业大国，农作物的病害防治问题在农业种植中相当重要。据报道，我国粮食作物每年因病害问题造成的损失至少有10%~15%。农作物病害的发生往往使国家经济和人民生活遭受严重损失。植物病害防治的方法有植物检疫、抗病育种、农业防治、化学防治、物理和机械防治和生物防治等。

选育和利用抗病育种的方法是防治病害发生的有效途径。然而，抗病品种在大面积推广后容易在几年内失去其抗病性而成为感染品种。化学防治因其生产简便、价格便宜、特别是见效快等优点，在植物病害的防治中一直占有主要地位，而被广泛应用。但使用不当，则会引起植物药害，杀害有益微生物，导致病原菌产生抗药性，高浓度的农药残留还会发生人、畜中毒，环境污染等问题。生物防治的研究从20世纪30年代开始。生物防治具有许多优于化学防治的特点，其只针对病原微生物，不会杀死有益微生物，而且对人、畜安全，不会造成环境污染。因此，生物防治正成为植物病害防治的重要方法，国内外对生物防治的研究越来越多，该防治方法具有广阔的应用前景。

芽孢杆菌(Bacillus)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。用芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。然而不同菌株的抑菌谱、抑菌作用、抑菌机理以及抑菌效果的稳定性等亦有较大差异。因此，筛选高效、广谱、效果稳定的芽孢杆菌仍是生物防治的一个研究热点。

发明内容

为了解决上述问题，针对目前农业生产植物病害防治中大量使用化学杀菌剂，造成农药残留、环境污染等问题，本发明提供了一种高效、广谱、效果稳定及环境友好的植物病害生防菌菌株G68。

本发明的目的在于提供一株新菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）G68。

本发明的另一个目的在于提供上述菌株在植物病害防治过程中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种含有Bacillus subtilis G68的植物病害防治剂。

本发明的再一个目的在于提供生防菌株Bacillus subtilis G68菌剂的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种植物病害生防菌株G68，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2014年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.8978，建议的分类命名为Bacillus subtilis，已于2014年3月28日鉴定保藏的菌株是存活的。

上述生防菌株Bacillus subtilis G68在植物病害防治过程中的应用。

进一步的，上述的植物病害为植物细菌或真菌病害。

一种植物病害防治剂，其含有上述植物病害生防菌株Bacillus subtilis G68。

生防菌株Bacillus subtilis G68菌剂的制备方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的生防菌株G68接种于LB平板在29～31℃条件下活化，将活化后的生防菌株G68接种于NYBE培养液，29～31℃，105～115 r/min条件下培养22～26h，获得种子液；将种子液按2.5～3.5%的接种量接种于含0.08～0.12 mM MnSO₄的NYBE发酵培养基，36～38℃，190 ～210r/min条件下培养70～74 h，获得发酵液，即生防菌株Bacillus subtilis G68菌剂。

本发明的有益效果是：

1）本发明的生防菌剂制备过程简单，成本较低，可替代或减少对化学农药的应用，减少农药残留，降低农民农业生产成本。该菌剂为生物产品，无毒害，无环境污染，有利于无公害作物的生产及农业的可持续发展。

2）本发明的生防菌株G68在试验室平板拮抗试验中表明：生防菌株G68可对番茄立枯病、番茄早疫病、小麦赤霉病、玉米炭疽病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黄萎病、油菜菌核病等多种植物真菌和番茄青枯病等植物细菌病原菌均表现出良好的抑制效果，具有较广的抗菌谱。并且经多次传代培养，该菌株抗病效果稳定。

3）本发明的生防菌株G68在温室试验结果中表明：含本发明所述生防菌株G68的生防菌剂可以促进种子萌发及作物生长，且该生防菌剂有效抑制了病原菌的生长，对于番茄立枯病（Rhizoctonia solani）和早疫病（Alternaria tomatophila）病害均表现出显著的防治效果，防效分别可达53.8%和60.1%。

附图说明

图1为生防菌株G68抑制番茄立枯病病原菌（Rhizoctonia solani）平板拮抗试验；

图2为生防菌株G68抑制番茄早疫病病原菌（Alternaria tomatophila）平板拮抗试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

一、生防菌株G68的分离、筛选和鉴定

一种植物病害生防菌株G68，命名为Bacillus subtilis G68，由广东省农业科学院农业资源与环境研究所有机固体废弃物处理基地的堆肥中分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下：

（1）生防菌株G68的分离

称取10.0 g混合均匀的堆肥样品，加入90 ml无菌水，30℃，180r/min，振荡30min，将菌液依次稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍，吸取适当的稀释菌悬液（稀释10^-5、10^-6、10^-7 倍的菌液）100 µl均匀涂布在营养琼脂平板上，每个稀释度重复三次，于30℃恒温培养箱中培养1~2d。按照细菌形状、大小、色泽等生理性状的不同，挑取单菌落再涂平板直到获得单一形态的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态，确为单一形态即为纯化，纯化后4 ℃冷藏备用。

（2）生防菌株G68的筛选

采用平板拮抗试验方法进行生防菌株的筛选，吸取浓度为1×10⁵CFU/ml的病原菌菌液100 µl分别放入LB培养基（细菌）或PDA培养基（真菌）平板中涂布均匀，利用无菌打孔器在平板上打4个孔，每孔中分别注入在30℃培养24h的不同分离菌株的培养液、发酵上清液（6000 r/min离心30min去除菌体）、无菌水及1mM的放线菌酮80 µl，每个处理重复三次。30℃恒温培养箱中培养3~5 d后，观察有无抑菌圈，计算抑菌活性。

抑菌活性用抑菌圈直径表示: 抑菌圈直径=透明圈直径-孔径(8 mm)。

将具有抑菌活性的菌株在LB平板上连续转接培养10次(每隔7d一次)，测定每次传代培养菌株的拮抗稳定性。

根据对植物病原菌番茄立枯病、番茄早疫病、番茄青枯病、小麦赤霉病、玉米炭疽病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黄萎病、油菜菌核病等的抑菌活性以及传代后抑菌活性的稳定性，筛选出一株高效、广谱、效果稳定的抗植物真菌和细菌病原菌的菌株，将菌株纯化后，用50%的甘油保存于~70℃超低温冰箱。

生防菌株G68的鉴定

经形态、染色、生理生化反应及分子生物学鉴定为Bacillus subtilis。

a.生防菌株G68的菌落形态及菌体特征

在LB固体培养基上菌落形态较小、边缘不整齐、表面无凸起、较湿润、不透明，呈乳白色。菌体细胞呈短杆状、染色均匀，革兰氏阳性菌、中生芽孢、周生鞭毛。

b. 本发明生防菌株G68的生理生化特征

生防菌株G68的生理生化特征为：需氧性，葡萄糖发酵型，接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、酪朊水解、明胶水解、糖醇类发酵、M.R.和V-P试验结果为阳性；柠檬酸盐水解、纤维素分解和酪氨酸水解试验结果为阴性（如表1所示）。

表 1 生防菌株G68的生理生化特征

注：“+”阳性，“-”阴性。

c. 生防菌株G68的分子生物学鉴定

采用Fast DNA kit 提取细菌基因组DNA，利用16srRNA的通用引物进行测序。所用引物序列为：8F(5'-AGAGTTTGA TCATGG CTCAG-3')和907R(5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT -3')从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物委托TaKaRa公司测序，测序结果提交到GenBank数据库获得登录号KJ123643，利用Blast程序搜索同源序列，结果与登录号为 的NR104873 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain BGSC 3A28同源性为99%，因此，结合菌落形态和生理生化特征，生防菌株G68鉴定为Bacillus subtilis。

二、生防菌株G68菌剂的制备

将保存于LB斜面培养基的生防菌株G68，接种于LB平板活化（30℃），将活化后的生防菌株G68接种于NYBE（8 g营养肉汤，7 g酵母粉，1L H₂O）培养液，30℃，110 r/min条件下培养24h，获得种子液。将种子液按3%的接种量接种于NYBE.Mn（NBYE+0.1 mM MnSO₄·H₂O）发酵培养基（8 g营养肉汤，7 g酵母粉，0.1mM MnSO₄·H₂O ，1L H₂O），37℃，200 r/min条件下培养72 h，获得发酵液（生防菌液），即生防菌株G68菌剂，其中生防菌株G68活菌数为10⁹～10¹⁰CFU/ml。

三、生防菌株G68对植物病原菌的抑制作用

（1）平板拮抗试验

吸取浓度为1×10⁵CFU/ml的植物病原菌（如表2所示）菌液100 µl分别放入LB（细菌）或PDA（真菌）平板中涂布均匀，利用无菌打孔器在每个平板上打4个孔，分别注入80 µl的无菌水、1mM的放线菌酮、生防菌株G68菌剂和生防菌株G68菌剂的发酵上清液，每个处理重复三次，30℃恒温培养箱中培养3～5 天后，观察有无抑菌圈，并测定抑菌圈活性，抑菌活性用抑菌圈直径（mm）表示：抑菌圈直径=透明圈直径－孔径(8 mm)。

抑菌圈活性的测定结果如下表2所示，从中可以看出本发明菌株G68及其发酵上清液对常见的植物病原菌番茄立枯病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、玉米炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、甘蔗黑腐病菌、甘蔗黑腐病菌、棉花黄萎病菌、油菜菌核病菌和番茄青枯病菌均具有明显的抑菌效果，其抑菌效果明显优于放线菌酮的抑菌效果。说明本发明的生防菌株G68对多种植物真菌和细菌病原菌均表现出良好的抑制效果，具有较广的抗菌谱。

其中菌株G68及其发酵上清液对番茄立枯病病原菌、番茄早疫病病原菌的抑菌图分别如图1和图2所示，从中可以看出菌株G68及其发酵上清液对这两种植物病原菌产生了明显的抑菌圈，尤其是菌株G68的抑菌圈明显大于放线菌酮的抑菌圈。

综上所述，本发明的生防菌株G68对常见植物病原菌具有很的抑制作用。

表2 生防菌株G68对植物病原菌的抑菌圈直径（mm）

（2）温室试验测定生防菌株G68菌剂在抗番茄立枯病中的应用效果

取上述“二”中制备的生防菌株G68菌剂，生防菌株G68活菌数为1×10⁹CFU/ml；番茄立枯病病原菌接种于PDA培养基，培养7d，用无菌水冲洗，调整孢子浓度为1×10⁵CFU/ml。一共设置5个处理：

处理组1：用生防菌株G68菌剂浸泡番茄种子24 h，播种后接种5ml番茄立枯病病原菌和5ml无菌水；

处理组2：将种子播种后分别接种5ml生防菌株G68菌剂和番茄立枯病病原菌；

处理组3（对照组）：将种子播种后接种5ml番茄立枯病病原菌和5ml无菌水；

处理组4：将种子播种后接种5ml生防菌株G68菌剂和5ml无菌水；

处理组5（常规组）：将种子播种后接种10ml无菌水。

每盆装有150 g土壤，播种10颗种子；每个处理6个重复，将上述番茄种子播种于土壤中，将番茄放置于温度为28℃，光照为16h/8h条件下培养，观察种子发芽情况以及病害防效。并统计发病率，并将发病级别分为0、1、2、3共四个等级：

0级：不发病；

1级：幼苗茎基部产生椭圆形暗褐色病斑；

2级：病斑逐渐凹陷，扩大后绕茎1周；

3级：茎基部呈溃疡状，萎蔫，以至死亡；

病害指数=［∑（各级病株数×相应发病级别值）／调查总株数×最高发病级别值］×100%；

防效＝［（对照组病害指数－处理组的病害指数）／对照组病害指数］×100％。

表3 各处理的病害指数和防效情

结果显示，处理组4种子早于其他处理组一天萌发，幼苗生长速度快。处理组1和处理组2均起到了较好的病害防治作用，两种处理方法的防治效果分别为51.3%和53.8%，并无显著差异。

上述试验结果说明，本发明生防菌株G68对植物具有很好的病害防治作用。

（3）温室试验测定生防菌株G68菌剂在抗番茄早疫病中的应用效果

取上述“二”中制备的生防菌株G68菌剂，生防菌株G68活菌数为1×10¹⁰CFU/ml；番茄早疫病病原菌接种于PDA培养基，培养7 d，用无菌水冲洗，调整孢子浓度了1×10⁶CFU/ml。番茄先进行育苗，带长到4叶期进行移栽。设置4个处理：

处理组1：将幼苗移栽后浇灌50ml生防菌剂，3 天后浇灌30ml番茄早疫病病原菌；

处理组2（对照组）：移栽后浇灌50ml无菌水，3d后浇灌30ml番茄早疫病病原菌；

处理组3：将幼苗移栽后浇灌50ml生防菌剂，3d后浇灌30ml无菌水；

处理组4（常规组）：移栽后浇灌50ml无菌水，3d后再浇灌30ml无菌水。

每盆3颗种子，每个处理5个重复，将番茄放置于温度为28℃，光照为16h/8h条件下培养，观察番茄植株生长情况以及病害防效。并统计发病率：分为0、1、2、3、4、5、6共七个发病等级：

0级：不发病；

1级：1片叶片发病，病叶上有零星病斑，病斑占叶面面积的10%以下；

2级：2~4片叶片发病，病叶上有少量病斑，病斑占叶面面积的11%~25%以下；

3级：5~7片叶片发病，病叶上病斑数量中等，病斑占叶面面积的26%~50%以下；

4级：大量叶片发病，病叶上病斑数量较多，病斑占叶面面积的51%~75%以下；

5级：大量叶片发病，整个叶片枯萎；

6级：植株死亡。

病害指数=［∑（各级病株数×相应发病级别值）／调查总株数×最高发病级别值］×100%；

防效＝［（对照组病害指数－处理组的病害指数）／对照组病害指数］×100％。

结果显示：生防菌株G68对番茄有促生作用，移栽25 d后处理3番茄生长植株较处理4高10cm，茎粗较处理4宽0.2mm。同时，生防菌株G68菌剂对番茄早疫病表现出较好的防治效果，防效达60.1%。

表4 各处理组的病害指数和防效情况

上述试验结果说明，本发明生防菌株G68对植物具有很好的病害防治作用。

Claims (4)

1.一种防治植物病害的生防菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）G68，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO.8978。

2.权利要求1所述的生防菌株枯草芽孢杆菌G68在植物病害防治过程中的应用；

所述的植物病害为植物细菌或真菌病害；

所述植物真菌病害为番茄立枯病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、玉米炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、甘蔗黑腐病菌、棉花黄萎病菌、油菜菌核病菌，所述植物细菌病害为番茄青枯病菌。

3.一种植物病害防治剂，其特征在于：所述防治剂中含有权利要求1所述的生防菌株枯草芽孢杆菌G68。

4.权利要求1所述的生防菌株枯草芽孢杆菌G68的菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求1所述的生防菌株枯草芽孢杆菌G68接种于LB平板在29～31℃条件下活化，将活化后的生防菌株G68接种于NYBE培养液，29～31℃，105～115 r/min条件下培养22～26h，获得种子液；将种子液按2.5～3.5%的接种量接种于含0.08～0.12 mM MnSO₄的NYBE发酵培养基，36～38℃，190～210r/min条件下培养70～74 h，获得发酵液，即生防菌株枯草芽孢杆菌G68的菌剂；

所述的NYBE培养液由8g营养肉汤、7g酵母粉和1L H₂O组成；

所述NYBE发酵培养基由8g营养肉汤、7g酵母粉、0.08～0.12 mM MnSO₄和1L H₂O组成。