CN104073428A - 一种细胞分离微结构系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物及医学体外检测技术领域，公开了一种细胞分离微结构系统，其包括微流芯片，微流芯片包括：样品入口、样品出口、细胞捕获区、侧冲入口，回收出口，清洗入口；细胞捕获区内部为数个微柱，形成微柱阵列；微柱阵列呈梯度分布，表现为微柱间距梯度变化和微柱尺寸梯度变化；所述微柱阵列各层从顶层至底层逐渐分散的正梯形分布；各微柱的水平横截面形状分为上部和下部，接近样品入口的上部为近似正等腰三角形，等腰的两边为对称的内凹圆弧状，接近样品出口的下部为倒等腰三角形。本发明用于CTC或UETC的分离富集、计数与回收，检测效率超过90％，并且降低了流体冲击挤压被捕获细胞时微柱阵列对被捕获细胞的破坏。

Description

一种细胞分离微结构系统

技术领域

本发明涉及生物及医学体外检测技术领域，尤其涉及一种能用于从生物流体中分离富集稀有细胞的微结构系统，该系统可用于人体血液中循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)和尿液中的尿脱落癌细胞(Urine ExfoliatedTumor Cell,UETC)的分离富集、计数与回收。

背景技术

稀有细胞是指生物样本中存在的数量稀少的确具有重要生物学功能的或临床检测意义的细胞。如人体外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的细胞，实体肿瘤血管中的肿瘤干细胞，人体淋巴液中的脱落肿瘤细胞，人体尿液中的尿脱落肿瘤细胞等。

一、CTC分离富集及后续检测技术。

人体血液中循环肿瘤细胞是一类具有代表性的稀有细胞。它是指因自发或诊断、手术、放化疗操作等外部因素引起的由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可以发展成为新的肿瘤转移灶(Racila E,Euhus D,Weiss AJ,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,4589-4594；PantelK,Brakenhoff RH,Nat.Res.Cancer2004,4,448-456)。肿瘤转移是癌症患者致死的主要原因，调查显示超过90％的癌症患者死于肿瘤转移(Mehlen P,Puisieux A,Nat.Rev.Cancer2003,3,453-458)。临床研究表明，患者血液中CTC的浓度与肿瘤转移情况及患者存活率密切相关(Massimo Cristofanilli,M.D.,G.Thomas Budd,M.D.,Matthew J.Ellis,M.B.,Ph.D.,Alison Stopeck,M.D.,Jeri Matera,B.S.,R.Ph.,M.Craig Miller,B.S.,James M.Reuben,Ph.D.,Gerald V.Doyle,D.D.S.,W.JeffreyAllard,Ph.D.,Leon W.M.M.Terstappen,M.D.,Ph.D.,and Daniel F.Hayes,M.D.NEngl J Med2004；351:781-791)。因此，循环肿瘤细胞是一种具有重大生物学意义和临床价值的稀有细胞，从血液中分离富集和回收循环肿瘤细胞的医学和后续研究意义越来越受到人们的重视。但是，循环肿瘤细胞在外周血中的含量极少，每10ML血液可能仅含有几个到几百个不等的循环肿瘤细胞，却有高达约1亿个白细胞和约5亿个红细胞(Zhe XN,Cher ML,Bonfil RD,Am.J.CancerRes.2011,1,7409-751)。因此在大量其他细胞干扰下无法对循环肿瘤细胞进行直接检测，这些检测包括数量、基因突变、表面标志物、细胞活性、分泌蛋白谱、力学性质等，所以利用简单有效的办法将循环肿瘤细胞从外周血中分离出来对后续的检测具有决定性的意义。

目前，血液样品中CTC的检测技术主要包括：免疫细胞化学技术、差减富集技术、细胞物理性质差异化分选技术。

1.免疫细胞化学技术(Immunocytochemistry,ICC)是指以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗体抗原反应和细胞化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性和定量测定的技术。目前ICC技术检测的肿瘤标记物主要包括上皮细胞角蛋白(CK)、上皮细胞膜特异性抗体(如黏蛋白类)以及肿瘤相关糖蛋白(TAG)者3类。ICC技术可对CTC进行细胞表面和形态学分析，但许多分化差的肿瘤细胞不能表达目标抗原，因此ICC检测技术的特异性并不高。

ICC技术最具代表性的应用是由美国Veridex公司(强生子公司)开发的CellSearch系统，但由于CellSearch系统高度依赖所选择的上皮细胞特异性抗体EpCAM，因此它现阶段仅适用于乳腺癌等少数几种肿瘤细胞的检测。

免疫细胞化学技术高度依赖所选择的特异性抗体，可富集的肿瘤细胞种类少，检测成本高，且回收的肿瘤细胞表面粘满免疫磁珠，表面形态改变、活性缺失，无法进行后续检测。

2.差向分离富集技术(Subtraction Enrichment Technology,SET)(http://www.cytointelligen.com/technology.html)，其主要作用原理是通过逐步去除血液中绝大多数的血源性白细胞、红细胞及血浆蛋白的方法，从而达到富集非血源性肿瘤细胞的目的。

差向分离富集技术可以保持CTC的活性和完整形态，但缺点是步骤繁多，成本高，且分离稀有细胞的准确率低。步骤繁多：非低渗溶法去除红细胞，免疫磁珠法去除白细胞，非血源性介质差速离心法分离稀有细胞，iFISH多重染色，显微识别；成本高：所用体外试剂繁多，分离富集过程长达4小时，物料及人工成本高企；准确率低，利用差速离心法将稀有细胞与其他体液成分分层，再用吸管吸取稀有细胞层液体，该层液体中所含其他杂志细胞数量多，因此富集准确率低。

3.细胞物理性质差异化分选技术根据肿瘤细胞与正常细胞物理性质(尺寸、密度、介电性质等)不同来分离肿瘤细胞。例如尺寸差异化分选技术根据肿瘤细胞与正常细胞的尺寸、变形能力不同来分离肿瘤细胞。微流道内设置特定间隔的筛状结构，该结构允许其他柔韧性较好、体积较小的血细胞(如红细胞、白细胞)通过，同时捕获柔韧性较差、体积较大CTC细胞。这种通过物理方法分离的细胞未经抗体处理，基本可以保持形态完整。

基于细胞物理性质差异化分选原理的产品有：新加坡Clearbridge Biomedics公司的Clearcell System。该技术利用CTC与正常细胞的尺寸和变形能力的差异，通过半月形微柱结构来隔离CTC。该技术源自新加坡国立大学LIM ChweeTeck课题组，核心是流道中特定间距的半月形微柱阵列，此间距可以让尺寸较小、变形能力较强的血细胞通过，而阻拦下尺寸较大、变形能力较弱的CTC，该技术检测准确率约为80％。

但现有的物理性质差异化分选技术的缺点是检测效率及检测准确率不高(均为80％左右)，单位时间处理样本流量小，容易破坏细胞表面结构，且基于微结构捕获的过程中极易出现凝血想象，影响有效富集。

二、UETC分离富集及后续检测技术。

膀胱癌肿瘤细胞从原发部位脱离，直接进入膀胱尿液的成为尿脱落肿瘤细胞(UETC)。尿液生理环境复杂，其中含有大量的干扰细胞——正常的尿脱落上皮细胞。此外，尿液中还有丰富的无机盐、葡萄糖、尿素、尿酸以及结晶和蛋白杂质。

UETC检测的特异性是目前膀胱癌无创诊断措施中最高的，而且也得到了NCCN(美国国立综合癌症网络)指南作为无创诊断指标的唯一推荐。研发敏感、客观的新型UETC检测技术具有重大的临床价值。

现今临床上主要应用的UETC检测技术为尿脱落细胞学检测(ConventionalCytology，CC)。尿脱落细胞学检测是通过将尿液离心，获得尿沉渣后涂片染色，病理科医生对已染色样本中细胞的染色体倍增情况进行主观观察，判断尿脱落癌细胞是否存在以及其数量级。尿脱落细胞学检测目前被认为是确诊膀胱癌无创性检测方法的“金标准”，虽然特异性较高(近100％)，对高级别的膀胱癌诊断敏感性较高，但对低级别的或早期的膀胱癌诊断的敏感性则较低(仅30～50％)，并且尿细胞学检测的准确性也依赖于病理科医师的经验，主观性较大，而且膀胱内化学药物的灌注也可能造成检测的假阳性。

目前基于UETC的分离富集及后续检测于一体的技术尚未问世。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：捕获并且富集生物流体中的稀有细胞，尤其是针对血液中的循环肿瘤细胞(CTC)、尿液中的脱落肿瘤细胞(UETC)进行准确、高效的分离富集、计数与回收。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种细胞分离微结构系统，其包括微流芯片，所述微流芯片包括：样品入口、样品出口和细胞捕获区，生物样本从样本入口进入，经过细胞捕获区后，从样本出口流出，完成稀有细胞捕获，所述细胞捕获区内部为数个微柱，排列为数层，接近样品入口的为顶层，接近样品出口的为底层，形成微柱阵列；

所述微柱阵列呈梯度分布，表现为微柱间距梯度变化和微柱尺寸梯度变化；

所述微柱间距梯度变化是指每一层的各微柱间的间距相等，但底层各微柱间的间距到顶层各微柱的间距逐步增大；

所述微柱尺寸梯度变化是指每一层的各微柱的宽度相等，但底层各微柱的宽度到顶层各微柱的宽度逐步增大。

优选的，所述微柱阵列各层从顶层至底层逐渐分散的正梯形分布。

优选的，每一层的各微柱间的间距从底层各微柱间的4至8微米间距增大到顶层各微柱间的10至14微米间距；每一层的各微柱的宽度从底层各微柱的6至10微米宽度增大到顶层各微柱的10至14微米宽度。

进一步优选的，所述微柱阵列为8层，每一层的各微柱间的间距从底层各微柱间的6微米间距增大到顶层各微柱间的12微米间距；每一层的各微柱的宽度从底层各微柱的8微米宽度增大到顶层各微柱的12微米宽度，微柱层间距离40微米。

优选的，各微柱的水平横截面形状分为上部和下部，接近样品入口的为上部，接近样品出口的为下部；上部为近似正等腰三角形，等腰的两边为对称的内凹圆弧状；下部为倒等腰三角形。

进一步优选的，上部两段对称的内凹圆弧的曲率半径为各微柱宽度的一半，上部顶角倒角为曲率半径1至3微米的圆角；下部等腰三角形顶角度数为45至60度，顶角倒角为曲率半径1至3微米的圆角。

优选的，所述微流芯片还包括细胞预过滤区，生物样本从样本入口进入，先流经细胞预过滤区后进入细胞捕获区，所述细胞预过滤区包括一个数个微柱组成的微柱阵列，各微柱的水平横截面形状为圆形，各微柱半径为60至80微米，各微柱间的间隔为100至140微米。

优选的，所述微流芯片还包括侧冲入口、回收出口、侧冲回收流道；冲洗细胞的缓冲液从左侧的侧冲入口经过一个左侧侧冲回收流道进入细胞捕获区，冲出细胞后经过右侧侧冲回收流道由右侧的回收出口流出，各侧冲回收流道由数条直线流道构成；其中，直线流道的设计参数为：宽度40至80微米；长度1000至3000微米。

优选的，所述微流芯片还包括清洗入口，清洗入口用于对所述微流芯片内部表面采用如下方式之一进行抗凝血改性的工作，清洗后的废液从样本出口流出：

(1)表面活性剂处理法：预先用等离子处理所述微流芯片内表面，再通过清洗入口通入亲水性表面活性剂溶液与所述微流芯片内表面发生作用，使得所述微流芯片内表面的亲水性提高，最终达到抗凝血目的；

(2)血液抗凝剂处理法：预先用等离子处理所述微流芯片内表面，再通过清洗入口通入血液抗凝剂溶液与所述微流芯片内表面发生作用，使得所述微流芯片内表面的生物相容性提高，最终达到抗凝血目的；

(3)亲水性LBL法：预先用等离子处理所述微流芯片内表面，依次通过清洗入口通入PAH、PSS溶液，达到在所述微流芯片内表面涂覆上PSS亲水层目的，进而降低蛋白吸附，从而抑制凝血效应；

(4)生物抗凝血法：通过清洗入口通入肝素溶液于所述微流芯片内表面涂覆一层肝素分子，使得所述微流芯片的抗凝血性能大大增强。

优选的，至少细胞捕获区为2个以上，形成多通道并联处理的微流芯片结构。

本发明技术方案带来的有益效果是：

1.与现有的CTC免疫细胞化学技术、差向分离富集技术比较：本发明不依赖任何磁珠和特异性抗体，仅通过细胞尺寸和变形能力的物理差异即可对样本中的CTC进行直接、简单、快速的分离富集，分离富集CTC准确率>90％(杂质细胞含量低于10％)，大大降低检测成本(没有因应用大量生物标记抗体和生物磁珠等体外试剂带来的附加成本)且不会破坏所检测的CTC的结构完整性和生物活性。

2.与现有的CTC细胞物理性质差异化分选技术—新加坡ClearbridgeBiomedics公司的Clearcell System相比，本发明不仅从微结构设计上提高了CTC富集的准确率(新加坡Clearcell System技术检测准确率约为80％，本发明检测准确率>90％)，又对芯片结构进行优化设计，增加了侧冲回收被富集的活性CTC的功能，这不仅使得本发明可以应用于血液样本中的CTC浓度监测、也可以回收活性CTC进行后续的一系列基于CTC的研究和产品开发工作(单细胞研究、免疫研究、基因研究、开发针对CTC的抗癌药物等)。

3.本发明可以对尿液中的UETC进行直接而准确的分离富集和后续染色全流程原位操作，医生可以根据芯片上的富集和染色结果直接进行客观判断，检测敏感度高，结果客观性强，且大大降低因尿沉渣、制片、染色等多步骤人工操作带来的人力成本和物料成本，且不会破坏所检测的UETC的结构完整性和生物活性。

附图说明

图1本发明实施例一的平面结构示意图。

图2本发明实施例一的细胞捕获区内部结构示意图。

图3本发明实施例一的微柱形状示意图。

图4本发明实施例一的细胞预过滤区内部结构示意图。

图5本发明实施例二的平面结构示意图。

其中：1样品入口，2样品出口，3回收出口，4侧冲入口，5细胞捕获区，6细胞预过滤区，7侧冲回收流道，8清洗入口，9微柱，10稀有细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明的工作原理是：根据血液样本中CTC与普通血细胞(红细胞和白细胞)，尿液样本中UETC与尿脱落上皮细胞等常见的尿脱落细胞在细胞尺寸和变形能力方面的差异，利用梯度分布的微柱阵列对血液样本中的CTC和尿液样本中的UETC进行准确、高效的分离富集，并可通过后续的细胞染色在芯片原位或回收后再体外检测对样本进行分离富集操作后得到的目标细胞(CTC\UETC)的数量指标，也可利用回收富集到的活性CTC或UETC进行后续的检测和研究。

如图1所示，本发明一种细胞分离微结构系统实施例一的平面结构示意图。该细胞分离微结构系统包括微流芯片，所述微流芯片包括：样品入口1、样品出口2、侧冲入口4、回收出口3、细胞捕获区5、细胞预过滤区6、侧冲回收流道7、清洗入口8。

所述微流芯片的生物样本处理过程为：

(1)生物样本从样本入口1进入，经过细胞预过滤区6和细胞捕获区5后，从样本出口2流出，完成稀有细胞捕获。

(2)缓冲液从侧冲入口4进入，经过侧冲回收流道7和细胞捕获区5后，从回收出口3流出，完成对所捕获稀有细胞的回收。

细胞捕获区5

细胞捕获区5是捕获稀有细胞的核心区域。CTC、UETC等稀有细胞由于其较大的尺寸及较弱的变形能力而被隔离在这个区域。细胞捕获区5内部细节示意图如图2所示。

(1)微柱阵列梯度分布设计

细胞捕获区5内部为数个微柱，排列为数层，接近样品入口1的为顶层，接近样品出口2的为底层，形成微柱阵列；所述微柱阵列呈梯度分布，表现为微柱间距梯度变化和微柱尺寸梯度变化；所述微柱间距梯度变化是指每一层的各微柱间的间距相等，但底层各微柱间的间距到顶层各微柱的间距逐步增大；所述微柱尺寸梯度变化是指每一层的各微柱的宽度相等，但底层各微柱的宽度到顶层各微柱的宽度逐步增大。该微柱阵列呈梯度分布的最大优点为：易于加工，成品率高，对细胞损害最小，不同尺寸的目标细胞可在不同微柱层被捕获，极大提升了微柱结构的利用效率，同时降低了底层微柱提前饱和从而导致芯片失效的风险。

优选的，每一层的各微柱间的间距从底层各微柱间的4至8微米间距逐步增大到顶层各微柱间的10至14微米间距；每一层的各微柱的宽度从底层各微柱的6至10微米宽度逐步增大到顶层各微柱的10至14微米宽度。这种微柱空间上梯度排列，在用于隔离和捕获CTC同时能允许主要的血液组分通过。多数肿瘤细胞的大小范围从20微米到6微米，因此可以想见，他们在流经芯片细胞捕获区的时候，能够被挡在微柱之间；另一方面，白细胞平均大小8微米、红细胞平均大小6微米，也具有高度可塑性，因此，他们可以很容易的通过微柱之间而不被挡住。

如图2所示，本发明实施例一中细胞捕获区5的微柱阵列为8层，该微柱阵列优化的梯度分布规律是，每一层的各微柱间的间距从底层各微柱间的6微米间距增大到顶层各微柱间的12微米间距；每一层的各微柱的宽度从底层各微柱的8微米宽度增大到顶层各微柱的12微米宽度，微柱层间距离40微米。

另外，如图2所示，本发明实施例一中细胞捕获区5的微柱阵列各层从顶层至底层逐渐分散的正梯形分布也是经过特殊设计的。计算结果表明，流道内部的微柱在该正梯形分布排列之下，可保证各处流体流量守恒，最大限度降低流体剪切应力，进而缓解凝血效应的发生。

(2)微柱形状设计

如图3所示，本发明实施例一的细胞捕获区中的微柱形状是经过特殊设计处理的，各微柱9的水平横截面形状分为上部和下部，接近样品入口1的为上部，接近样品出口2的为下部；上部为近似正等腰三角形，等腰的两边为对称的内凹圆弧状，这种上部的圆弧形状设计使得被捕获的细胞(如稀有细胞10)在微柱间受力均匀，从而得以最大限度地保持细胞活性，降低细胞在流场下因剪切作用而破损的可能性；下部为倒等腰三角形，这种下部的倒三角设计使得微柱之间的流体得以顺利通过，最大限度地降低流体在此处的流动阻力，防止微柱尾部出现扰流，有利于保持整体流动稳定，进而抑制凝血现象。

本发明实施例一各微柱设计参数为：上部两段对称的内凹圆弧的曲率半径为各微柱宽度的一半，上部顶角倒角为曲率半径1至3微米的圆角；下部等腰三角形顶角度数为45至60度，顶角倒角为曲率半径1至3微米的圆角。

细胞预过滤区6

细胞预过滤区6处在微流体系上游，生物样本先流经此区域，如图4所示该区域由较大间隔的微柱阵列构成，各微柱的水平横截面形状为圆形；该区域的微柱设计参数为：微柱半径为60至80微米；间隔(左右、上下)100至140微米。

细胞预过滤区可提前过滤掉血液、尿液样品中尺寸较大的杂质(如纤维蛋白等)，从而避免后续小尺寸的微流道的阻塞。细胞预过滤区也对进入的生物流体产生缓冲作用，降低生物流体对下游小尺寸微柱的冲击，从而避免破坏下游微结构。

侧冲回收流道7

如图1所示，细胞捕获区5完成对生物样本的处理之后，侧冲回收流道7可用来回收被捕获的目标细胞。冲洗细胞的缓冲液从左侧的侧冲入口4经过一个左侧侧冲回收流道进入细胞捕获区5，冲出细胞后经过右侧侧冲回收流道由右侧的回收出口3流出，各侧冲回收流道7由数条直线流道构成。其中，直线流道的设计参数为：宽度40至80微米；长度1000至3000微米。

清洗入口8

如图1所示，清洗入口8用于在微流芯片通血之前从清洗入口8通入EDTA溶液或pluronic溶液或LBL改性液等等进行微流芯片内部结构表面的预处理，达到降低后续凝血的目的，清洗后的废液从样本出口流出。

生物样本，尤其是血液样本的流入，非常容易造成微流芯片内部微流道堵塞。因此，在微流芯片内部可以进行内表面抗凝血改性的工作。该抗凝血改性方法主要分为两种：化学抗凝血法和生物抗凝血法。

化学抗凝血法包含三种实现方案：

(1)表面活性剂处理法：预先用等离子处理微流芯片内表面，再通过清洗入口8通入亲水性表面活性剂Pluronic等溶液与芯片内表面发生作用，使得内表面的亲水性提高，最终达到抗凝血目的(Pluronic是一种表面活性剂，化学成分为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物。它的加入可使微流芯片内表面活化，间接地提高表面亲水性能。而血液中大部分蛋白为油性物质，因此，亲水表面可以降低各类蛋白的吸附，从而抑制凝血效应)。

(2)血液抗凝剂处理法：预先用等离子处理微流芯片内表面，再通过清洗入口8通入血液抗凝剂如EDTA(乙二胺四乙酸)、草酸钠、肝素或枸橼酸钠等溶液与芯片内表面发生作用，使得内表面的生物相容性提高，最终达到抗凝血目的(EDTA化学名为乙二胺四乙酸，是一种常用的抗凝血试剂。钙离子是血液发生凝固反应的基础，EDTA能与血液中的钙离子形成稳定的螯合物，使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固反应)。

(3)亲水性LBL法：预先用等离子处理微流芯片内表面，依此通过清洗入口8通入PAH(聚烯丙胺盐酸盐，Poly(allylamine)Hcl)、PSS(聚苯乙烯磺酸盐，Polystyrene sulfonate)溶液，达到在芯片内表面涂覆上PSS亲水层目的，进而降低蛋白吸附，从而抑制凝血效应(亲水性LBL法，即层层自组装表面抗凝血改性技术，层层自组装(layer-by-layer self-assembly，LBL)是上世纪90年代快速发展起来的一种简易、多功能的表面修饰方法。LBL最初利用带电基板(substrate)在带相反电荷中的交替沉积制备聚电解质自组装多层膜(polyelectrolyte self-assembled mulilayers)，本发明采用该方法的最终目的是在微流芯片内表面涂覆上一层亲水性物质PSS亲水层。然而PSS亲水层无法直接与微流芯片内表面结合，因此，需要引入中间层PAH。其中，PAH、PSS均为带电荷高聚物，两者通过静电作用而相互结合)。

生物抗凝血法：

预先从清洗入口8通入一定浓度的肝素溶液，使得肝素大分子吸附在微流芯片内表面，继而降低后续通血时的凝血程度。

多通道设计

为达到高通量处理目的，在细胞捕获区单一处理模块的基础上，可以采取并联处理的方式。即多个流道可同时处理生物样本，优选的，如图5所示本明实施例二的二通道并行组织架构。事实上，由于微流芯片加工简单快速，设计自由度大，为了适合不同血液样本量的处理，芯片有效结构可做任意多通道设计(>2)。

操作流程

使用本发明的细胞分离微结构系统与恒流注射泵(或其他泵)、注射器、导管等部件连接，可以构建一种微流分离富集装置；恒流注射泵连接注射器，注射器通过导管连接到细胞分离微结构系统的微流芯片的样品入口，通过注射器使得生物样本得以进入微流芯片，通过注射泵可精确控制微流芯片内部的流体流速，恒定流速下持续使生物样本通过微流芯片，从而捕获CTC或UETC。

使用本发明技术方案的一个具体实施流程可包括以下几步骤：

1.生物样本前期处理

(1)血液样本

从肝癌患者的手臂采集血液样品，并将血液样品进行红细胞裂解(红细胞裂解是一种去除红细胞最简便易行的方法，该步骤可大大减少血液样本体积，从而提高后期荧光标记的成功率)。此时将获得少量的CTC(该案例中为肝癌细胞)和白细胞。为了鉴定CTC及白细胞，需要将CTC和白细胞分别进行荧光标记。①肝癌细胞抗CD45阴性，抗CK18阳性，抗EpCAM阳性，所以被标记的肝癌细胞会发出绿色荧光(该案例中CK18和EpCAM抗体的荧光颜色)。②白细胞是抗CD45阳性，抗CK18阴性，抗EpCAM阴性，所以被标记的WBCs会带红色荧光(该案例中CD45抗体的荧光颜色)。③同时，两类细胞均为有核细胞，其对于DAPI(荧光颜色为蓝色)均成阳性。

(2)尿液样本

取膀胱癌患者的晨尿。将尿液样本以1000rpm的转速离心5min。弃上层废液。提取底部沉淀以供后续步骤使用。

2.微流芯片处理生物样本

用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将第一步所得的细胞样本稀释到1ml，并收集于1ml注射器中。将注射器安装于恒流注射泵，该注射泵可精确控制微流芯片内部的流体流速(在此案例中，流速为500ul/h至2ml/h不等)。通过导管将注射器与微流芯片样本入口相连，生物样本得以进入微流芯片。在上述恒定流速下持续使生物样本通过微流芯片，从而捕获CTC。

3.所捕获细胞的计数

根据步骤1所述的荧光标记原理，在样本处理完毕之后，将微流芯片置于倒置荧光显微镜下观察，根据不同的荧光颜色来鉴定不同的细胞，完成CTC的计数工作。

利用本发明的细胞分离微结构系统，在所选取的10位肝癌患者的血液样品中全部都检测出了CTC的存在，其中癌细胞浓度超过2个/3ml的患者有9位，占所有被试者的90％。

表：临床实验数据

捕获的CTC数目(3ml血液样本)	对应患者数
		1-2	1
3-10	3
		11-20	4
>20	2

4.回收被捕获细胞

取磷酸盐缓冲液(PBS)溶液至1ml注射器，将注射器安装于恒流注射泵，使用导管将注射器与微流芯片的回收入口相连，同时另一根导管将96孔板与微流芯片的回收出口相连(96孔板为所回收细胞的收纳装置)，以恒定流速缓慢通入PBS溶液，以达到回收细胞的目的。本发明的细胞分离微结构系统的一大优势为：回收的细胞依旧具备生物活性，是CTC/UETC后期研究的基础。

本发明技术方案的优点是：

首先，与目前使用最广泛，认可度最高的CellSearch系统对比来看，本发明基于癌细胞特殊的物理性质，即癌细胞的大小和变形能力较其他血细胞有所不同，而将血液中的循环肿瘤细胞分离出来，避免了受特异性抗体性能的影响，而具有更加广泛的适用范围，敏感性高，也避免了一些未表达或少表达靶向抗原的肿瘤细胞的遗漏，且对于细胞的活性与功能没有损害，有利于更进一步的研究分析；

其次，与目前最有设计前景的基于物理性质的检测差异化方法对比来看，本发明设计采用了间隙在空间上梯度变化的微柱阵列，微流芯片设计简单，合成方便，不需外加任何电场或磁场，对细胞的损害降到最小；利用最简单最直观的检测方法，能够对于细胞进行富集并直观的检测和计数，在检测效果上也表现出了优异的性能，检测效率高达90％以上，检测准确度接近90％，通过优化微柱结构设计后，大大提高检测准确率(>90％)，并且降低了微柱阵列对细胞表面结构的破坏。并且对微流芯片内表面的改性(亲疏水与肝素化)和细胞捕获区的多结构并联解决了样本处理过程中的凝血问题和单位时间处理流量偏小问题；

再者，与差减分离富集法相比，本发明分离富集流程简单、所用物料及人力成本低，富集准确率高(>90％)；

最后，与尿脱落细胞学检测方法相比，本发明可以对尿液中的UETC进行直接而准确的分离富集和后续染色全流程原位操作，医生可以根据芯片上的富集和染色结果直接进行客观判断，检测敏感度高，结果客观性强，且大大降低因尿沉渣、制片、染色等多步骤人工操作带来的人力成本和物料成本。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种细胞分离微结构系统，其包括微流芯片，所述微流芯片包括：样品入口、样品出口和细胞捕获区，生物样本从样本入口进入，经过细胞捕获区后，从样本出口流出，完成稀有细胞捕获，其特征在于，所述细胞捕获区内部为数个微柱，排列为数层，接近样品入口的为顶层，接近样品出口的为底层，形成微柱阵列；

所述微柱阵列呈梯度分布，表现为微柱间距梯度变化和微柱尺寸梯度变化；

所述微柱间距梯度变化是指每一层的各微柱间的间距相等，但底层各微柱间的间距到顶层各微柱的间距逐步增大；

所述微柱尺寸梯度变化是指每一层的各微柱的宽度相等，但底层各微柱的宽度到顶层各微柱的宽度逐步增大。

2.如权利要求1所述细胞分离微结构系统，其特征在于，所述微柱阵列各层从顶层至底层逐渐分散的正梯形分布。

3.如权利要求1或2所述细胞分离微结构系统，其特征在于，每一层的各微柱间的间距从底层各微柱间的4至8微米间距增大到顶层各微柱间的10至14微米间距；每一层的各微柱的宽度从底层各微柱的6至10微米宽度增大到顶层各微柱的10至14微米宽度。

4.如权利要求3所述细胞分离微结构系统，其特征在于，所述微柱阵列为8层，每一层的各微柱间的间距从底层各微柱间的6微米间距增大到顶层各微柱间的12微米间距；每一层的各微柱的宽度从底层各微柱的8微米宽度增大到顶层各微柱的12微米宽度，微柱层间距离40微米。

5.如权利要求1或2所述细胞分离微结构系统，其特征在于，各微柱的水平横截面形状分为上部和下部，接近样品入口的为上部，接近样品出口的为下部；上部为近似正等腰三角形，等腰的两边为对称的内凹圆弧状；下部为倒等腰三角形。

6.如权利要求5所述细胞分离微结构系统，其特征在于，上部两段对称的内凹圆弧的曲率半径为各微柱宽度的一半，上部顶角倒角为曲率半径1至3微米的圆角；下部等腰三角形顶角度数为45至60度，顶角倒角为曲率半径1至3微米的圆角。

7.如权利要求1或2所述细胞分离微结构系统，其特征在于，所述微流芯片还包括细胞预过滤区，生物样本从样本入口进入，先流经细胞预过滤区后进入细胞捕获区，所述细胞预过滤区包括一个数个微柱组成的微柱阵列，各微柱的水平横截面形状为圆形，各微柱半径为60至80微米，各微柱间的间隔为100至140微米。

8.如权利要求1或2所述细胞分离微结构系统，其特征在于，所述微流芯片还包括侧冲入口、回收出口、侧冲回收流道；冲洗细胞的缓冲液从左侧的侧冲入口经过一个左侧侧冲回收流道进入细胞捕获区，冲出细胞后经过右侧侧冲回收流道由右侧的回收出口流出，各侧冲回收流道由数条直线流道构成；其中，直线流道的设计参数为：宽度40至80微米；长度1000至3000微米。

9.如权利要求1或2所述细胞分离微结构系统，其特征在于，所述微流芯片还包括清洗入口，清洗入口用于对所述微流芯片内部表面采用如下方式之一进行抗凝血改性的工作，清洗后的废液从样本出口流出：

(1)表面活性剂处理法：预先用等离子处理所述微流芯片内表面，再通过清洗入口通入亲水性表面活性剂溶液与所述微流芯片内表面发生作用，使得所述微流芯片内表面的亲水性提高，最终达到抗凝血目的；

(2)血液抗凝剂处理法：预先用等离子处理所述微流芯片内表面，再通过清洗入口通入血液抗凝剂溶液与所述微流芯片内表面发生作用，使得所述微流芯片内表面的生物相容性提高，最终达到抗凝血目的；

(3)亲水性LBL法：预先用等离子处理所述微流芯片内表面，依次通过清洗入口通入PAH、PSS溶液，达到在所述微流芯片内表面涂覆上PSS亲水层目的，进而降低蛋白吸附，从而抑制凝血效应；

(4)生物抗凝血法：通过清洗入口通入肝素溶液于所述微流芯片内表面涂覆一层肝素分子，使得所述微流芯片的抗凝血性能大大增强。

10.如权利要求1或2所述细胞分离微结构系统，其特征在于，至少细胞捕获区为2个以上，形成多通道并联处理的微流芯片结构。