CN104059941A - 一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种融合基因真核表达构建体，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。本发明还提供一种融合基因基因工程疫苗及其制备方法。本发明的融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。因此本发明能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，本发明的真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著性提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种真核表达构建体及其基因工程疫苗。
背景技术
霍乱毒素（Cholera toxin，CT）作为一种公认的粘膜免疫佐剂，已经广泛应用于疫苗开发和应用研究。天然的CT分子是由一个A亚单位（CTA）和五个相同的形成环状的B亚单位（CTB）结成的六聚体。A亚单位易被外源性蛋白水解酶切断其二硫键，产生由单一的二硫键连结的Al和A2片段。A1片段具有ADP-核糖基化转移酶活性，能够催化某些哺乳动物蛋白的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性ADP核糖基化，尤其是三聚体GTP结合蛋白Gs的调节亚单位(调节腺苷酸环化酶的活性)，此作用导致环腺苷酸（cAMP）的细胞内浓度增高和蛋白激酶A的活化以及肠细胞内的主要氯化物通道的磷酸化和开放。A2片段是一种衔接分子，其主要功能是与B亚单位相结合。B亚单位能与大多数哺乳动物小肠粘膜上皮细胞上的GMI神经节苷脂受体 结合，介导A亚单位进入细胞，而GM1几乎分布于体内所有细胞类型中，如T细胞、B细胞、抗原呈递细胞以及上皮细胞等，因而也利于抗原进入细胞。
多年来对CT免疫原性和佐剂活性的研究认为，作为一种黏膜免疫佐剂，CT是直接作用于免疫系统，提高整体的反应强度，使针对于抗原的免疫反应增强。
现有的关于CT佐剂的研究中，多是将其作为蛋白疫苗的佐剂经口途径投递，以刺激活化肠黏膜免疫。这是由于一直以来的观点均认为CT佐剂活性主要依赖粘膜途径，是一种有效的粘膜疫苗佐剂，一般以蛋白疫苗的形式进行投递，理论上难以将其直接通过系统途径投递而产生佐剂效果。
然而实际上CT发挥佐剂作用的机制有多种可能性，这是由它的分子特性决定的。但虽然已经过多年的研究，CT佐剂活性的分子机理却一直没有被真正阐明，人们对有关的信号传导途径知之甚少，从而妨碍了对它的应用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种融合基因表达构建体，提供了另一种实现CTA、CTB佐剂效果的技术手段，拓宽了对于CT佐剂的应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种融合基因真核表达构建体，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO:3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有90%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有90%同源。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有95%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有95%同源。
优选的，所述目的抗原基因来源于病原微生物和/或动物细胞的抗原。所述目的抗原基因可以来源于病毒、细菌等病原微生物，也可以来源于动物细胞，例如肿瘤抗原。所述病原微生物包括但不限于HIV、HBV、流感病毒、肠道病毒等。
优选的，所述真核表达构建体为质粒DNA载体、重组病毒载体、慢病毒载体。
优选的，所述真核表达构建体为质粒DNA载体。所述质粒DNA载体包括可商购的pVAX1（英杰（invitrogen））载体、pDRVISV1.0载体（本文为叙述方便起见，以下简称为pSV1.0）（参见中国国家发明专利200410028280.3权利要求1）等。在本发明的一实施方式中，所述质粒DNA载体是pSV1.0载体。在本发明另一实施方式中，所述质粒DNA载体是pVAX1。
优选的，所述真核表达构建体是包括TRIVN-CTA或TRIVN-CTB融合基因的真核表达构建体。
优选的，所述真核表达构建体是包括VP1-CTA或VP1-CTB融合基因的真核表达构建体。
优选的，所述真核表达构建体是包括HA-CTA或HA-CTB融合基因的真核表达构建体。
优选的，所述真核表达构建体是包括OVA-CTA融合基因的真核表达构建体。
优选的，所述疫苗是目的抗原基因可以在受体内表达的任意疫苗形式，如可以是DNA疫苗，重组病毒载体疫苗；优选DNA疫苗。
优选的，所述的目的抗原基因是HIV病毒的抗原基因。
优选地，所述的目的抗原基因是Tat、Rev、Int、Vif、Nef或其融合基因。
优选的，所述目的抗原基因是肠道病毒抗原基因。
优选的，所述目的抗原基因是源于肠道病毒71型（EV71）的衣壳蛋白编码基因VP1。
优选的，所述目的抗原基因是流感病毒抗原基因。
优选的，所述目的抗原基因是流感病毒血凝素（HA）基因。
本发明提供了一种含有融合基因的真核表达构建体载体，所述融合基因真核表达构建体是由真核表达构建体与包含CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码基因核苷酸序列与目的抗原基因编码核苷酸序列相连的融合基因通过可操作连接而成，且所述融合基因位于所述真核表达构建体的真核启动子元件与终止子元件之间，使得所述融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。此外，所述融合基因真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平，因而，所述融合基因真核表达构建体可以用于基因工程疫苗。
所述融合基因的融合方式可以是目的抗原编码核苷酸序列在上游，CTA和/或CTB编码核苷酸序列在下游，也可以是目的抗原编码核苷酸序列在下游，CTA和/或CTB编码核苷酸序列在上游。目的抗原编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸序列之间可以有几个氨基酸编码核苷酸序列组成的连接序列，比如经常用于融合基因的4个甘氨酸编码核苷酸序列组成的连接序列。目的抗原编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸序列之间也可以没有所述连接序列，而是直接首位相连。基因融合的方法均为本领域熟知，包括重叠PCR、IIS型限制性内切酶、重组酶重组等。
本发明还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原编码核苷酸序列相连的融合基因的真核表达构建体表达，该融合蛋白可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1； 所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO:3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有90%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有90%同源。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有95%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有95%同源。
本发明还提供一种宿主细胞，含有所述包含CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原核苷酸序列相连的融合基因的真核表达构建体，且能表达所述CTA和/或CTB与目的抗原相连的融合蛋白。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO:3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有90%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有90%同源。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有95%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有95%同源。
本发明还提供一种基因工程疫苗，所述基因工程疫苗包括含有 CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原编码核苷酸序列融合表达的真核表达构建体。本发明提供的基因工程疫苗可单独施用，也可以与其它形式的疫苗组合施用。尽管本发明没有记载所述基因工程疫苗与重组蛋白疫苗组合施用，但本领域技术人员可利用本领域熟知的初免-加强的策略组合施用本发明的基因工程疫苗与重组蛋白疫苗，以提供免疫应答效果。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO:3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有90%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有90%同源。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有95%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有95%同源。
优选的，所述基因工程疫苗是DNA疫苗，投递方式包括肌肉内接种、皮下接种、静脉注射、鼻内接种、电穿孔、电转化、与载体共投递，优选肌肉内接种和皮下接种。本发明关于DNA疫苗的投递方式还包括电穿孔，电转化，以及与载体的共投递，诸如壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）等。
本发明还提供一种制备基因工程疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将目的抗原基因编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸相连成融合基因，并克隆至真核表达构建体的步骤。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO:3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有90%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有90%同源。
优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1有95%同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有95%同源。
本发明所称“融合基因”，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。
本发明所称的“真核表达构建体”，是指将可在真核细胞或真核生物中表达目的基因的载体，包括真核表达启动子，终止子或增强子等一系列真核表达调控原件。例如，真核表达构建体可以是质粒DNA载体，重组病毒载体、慢病毒载体等。
本发明所称的“基因工程疫苗”，是指使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞表达构建体或宿主中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。例如重组DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、亚单位疫苗。
本发明所称的“佐剂效果”，是指提高目的抗原免疫应答的效果，包括提高体液免疫应答（即抗体应答）或细胞免疫应答的效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，CT或其亚单位是细菌的表达产物，尚未有关于其与目的抗原融合的真核表达构建体的研究报道，本发明填补了这一方面的空白。
附图说明
图1是实施例1中的DNA疫苗或真核表达构建体pSV1.0-TRIVN的表达验证结果。
图2是实施例1中的DNA疫苗或真核表达构建体pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB的表达验证结果。
图3是实施例1中的ELISPOT技术评价细胞免疫原性的结果；其中图3A是总反应强度，即将Tat，Rev，Int，Vif和Nef共五个肽库的斑点数叠加后的结果；图3B是针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。
图4是实施例2中的细胞免疫原性评价的结果；其中图4A是总反应强度；图4B是针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。
图5是实施例2中的多色流式细胞分析中的划门示意图。
图6是实施例2中的多色流式细胞分析的结果；其中图6A是各免疫组小鼠的中心记忆CD8T细胞的细胞因子表达水平；图6B是各免疫组小鼠的效应记忆CD8T细胞的细胞因子表达水平。
图7是实施例2中的对Nef的结合抗体检测结果。
图8是实施例2中的在NIH 3T3细胞模型上的体外刺激活性检测结果。
图9是实施例3中的DNA疫苗或真核表达构建体pVAX1-VP1、pVAX1-VP1-CTA、pVAX1-VP1-CTB的表达验证结果。
图10是实施例3的细胞免疫原性的检测结果。
图11是实施例3中的对重组蛋白VP1的结合抗体检测结果。
图12是实施例4中的细胞免疫原性的检测结果。
图13是实施例4中的中和抗体检测结果。
图14是实施例5中的特异性T细胞应答水平检测结果。
图15是实施例6中的对疫苗免疫小鼠进行痘苗病毒攻击后的保护性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。
实施例1,与目的基因TRIVN的融合
一、TRIVN基因的获取及其DNA疫苗的构建
从Los Alamos HIV Database中调取AE重组亚型AE2F毒株 （Genbank登录号AY008714）的Tat、Rev、Int、Vif和Nef蛋白的氨基酸序列，经过必要的突变修饰之后，将上述基因按Tat-Rev-Int-Vif-Nef的顺序串联起来，在相邻的蛋白之间加入4个甘氨酸作为柔性连接子。然后将其按哺乳动物细胞的密码子偏好逆向翻译成DNA序列，并送上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成后的融合基因命名为TRIVN（核酸序列SEQ ID:5）。用分子生物学方法将所述融合基因分别克隆至pDRVISV1.0载体的多克隆位点（以下简称pSV1.0）上，构建成含融合基因的DNA疫苗pSV1.0-TRIVN。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。
二、pSV1.0-TRIVN的表达验证
为了检测含融合基因TRIVN质粒DNA疫苗pSV1.0-TRIVN在哺乳动物细胞中的表达情况，我们将上述质粒和空载体pSV1.0为阴性对照分别转染了HEK 293T细胞，然后分别收集转然后细胞裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图1是DNA疫苗pSV1.0-TRIVN的表达验证。将所述DNA疫苗以及载体pSV1.0转染293T细胞后，裂解转染细胞制成样品，然后用免疫杂交印迹方法检测，一抗是抗HIV-1人血清。如图1所示，在90kD位置，相对于Mock对照（即pSV1.0载体转染对照），所述DNA疫苗有特异性条带，与预期的分子量位置吻合，而细胞对照及空载体转染对照的泳道上未见相应分子量位置的条带，表明DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原TRIVN。
三、CTA、CTB基因的获取及其与TRIVN基因的融合构建
根据基因文库所提供的霍乱弧菌O395的CTA、CTB基因序列,用JCAT在线优化软件（http://www.jcat.de/）将其优化成哺乳动物密码子 偏好的核酸序列CTA（SEQ ID:3）、CTB（SEQ ID:4），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。运用重叠PCR技术分别将CTA、CTB基因序列与上述目的基因TRIVN基因序列融合形成融合基因基因序列TRIVN-CTA（SEQ ID:6）、TRIVN-CTB（SEQ ID:7），并将所得的融合基因分别克隆至DNA疫苗载体pSV1.0的多克隆位点，得到两种包含所述融合基因的DNA疫苗，分别命名为pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。
四、pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB的表达验证
为了检测分别含融合基因TRIVN-CTA和TRIVN-CTB的质粒DNA疫苗pSV1.0-TRIVN-CTA和pSV1.0-TRIVN-CTB在哺乳动物细胞中的表达情况，我们将上述质粒和空载体pSV1.0为阴性对照分别转染了HEK293T细胞，然后分别收集转染后的细胞裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图2为DNA疫苗pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB的表达验证结果。方法同图1。如图2所示，在95KD的分子量左右有特异性条带，与预期的分子量位置吻合，而细胞对照及空载体转染对照的泳道上未见相应分子量位置的条带，表明DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原。
五、pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB的免疫原性评价
用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗pSV1.0-TRIVN，pSV1.0-TRIVN-CTA，pSV1.0-TRIVN-CTB和载体质粒pSV1.0，所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中(pH7.2)，调整浓度为1mg/mL。
体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验 动物中心。BALB/c小鼠随机分为A、B、C三组，每组5只。其中，对照组A小鼠免疫pSV1.0-TRIVN，实验组小鼠分别接种pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌注射100μg质粒DNA疫苗，在第7周时用含TRIVN的重组痘苗载体疫苗（上海市公共卫生临床中心提供）加强，于第9周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表1。
表1.实施例1的动物免疫分组及免疫规划
用常规分离方法分离脾细胞，简要叙述如下：
(1)摘眼球取血后，颈椎脱臼处死免疫小鼠，小鼠眼眶取的血放入灭菌的1.5mL离心管中，室温放置至凝血后3000g离心15分钟，小心吸取上层血清转移至新的1.5mL无菌离心管中，56℃灭活30分钟，存于-80℃冰箱；
(2)75%乙醇浸泡消毒，在超净台内取脾，放入已加入5mL RPMI 1640培养基（含2%胎牛血清，1%PS，1%谷氨酰胺）的平皿中，纱布研磨；
(3)用吸管将研磨的脾淋巴细胞转移至15mL离心管中，以1200转/分，离心8分钟，弃去上清；
(4)每管加入3mL冰预冷的红细胞裂解液，室温放置3分钟，加入2mL RPMI 1640培养基（2%含胎牛血清，1%PS，1%谷氨酰胺）， 以1200转/分，离心8分钟，弃上清；
(5)每管加入5mL RPMI 1640完全培养基（10%含胎牛血清，1%PS，1%谷氨酰胺）重悬，吸取100μL用PBS稀释10倍后进行白细胞计数，以1200转/分，离心8分钟，弃去上清；
(6)用RPMI 1640完全培养基将细胞稀释至合适浓度备用。
小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（Cat No.551083），按照试剂盒说明书进行。其中，刺激用的肽为源自Tat、Rev、Int、Vif和Nef的肽库，刺激终浓度为5μg/mL，实验结束后，用免疫斑点读板仪获取并分析数据（ChampspotⅢ，北京赛智）。
统计学方法：数据均以均值±标准差表示，两组间均值的统计比较使用非配对t检验，以p<0.05作为差异有显著性的标准。
免疫结束后第3周无菌分离采集小鼠脾细胞，采用HIV-1共享AE肽库刺激后，用ELISPOT方法进行特异性细胞免疫反应检测。图3显示了实施例1中的ELISPOT技术评价细胞免疫原性的结果。显示的结果为去除本底（未加肽刺激孔的斑点数）后的每百万个脾淋巴细胞的斑点形成单位（SFCs）。其中图3A显示的是总反应强度，即将Tat，Rev，Int，Vif和Nef共五个肽库的斑点数叠加后的结果。从总T细胞反应强度来看，pSV1.0-TRIVN-CTB活化的T细胞免疫反应强度为1548±330 SFCs/106脾细胞，显著高于pSV1.0-TRIVN活化的710.2±310 SFCs/106脾细胞（p<0.05）,并且pSV1.0-TRIVN-CTA所活化的T细胞免疫反应强度为1642±514 SFCs/106脾细胞，相较于pSV1.0-TRIVN组也具有统计学意义（p<0.05）（图3A）。图3B显 示了针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。将总T细胞反应按肽库分解后，我们发现特异性T细胞反应在各不同抗原间的分配更趋向均匀，以Int和Vif最强，Rev次之，针对Tat和Nef的反应得到改善，尤其是TRIVN-CTB组，tat的反应有了很大改善（图3B）。总之，包含目的抗原基因TRIVN和CTA、CTB相连的融合基因的DNA疫苗能显著提高所述目的抗原基因的免疫应答。
实施例2，与目的基因TRIVN的融合
一、在实施例1的基础上，我们再重复进行了一组动物实验。疫苗制备如实施例1中所述。
在实施例2中，增加了载体对照组。体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为四组，每组5只。其中，载体对照组Mock小鼠免疫pSV1.0、实验组小鼠分别接种pSV1.0-TRIVN、pSV1.0-TRIVN-CTA、pSV1.0-TRIVN-CTB。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌注射100μg质粒DNA疫苗，于第9周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表2。
表2.实施例2的动物免疫分组及免疫规划
脾细胞分离方法与ELISPOT法检测脾细胞对特异性多肽的T细胞免疫应答如实施例1中所述。图4显示了实施例2中的细胞免疫原 性评价的结果。显示的结果为去除本底（未加肽刺激孔的斑点数）后的每百万个脾淋巴细胞的斑点形成单位（SFCs）。其中图4A显示的是总反应强度；每只小鼠的总反应强度是将Tat，Rev，Int，Vif和Nef共五个肽库的斑点数叠加后的结果。从总T细胞反应强度来看，pSV1.0-TRIVN活化的T细胞免疫反应强度为642±178 SFCs/106脾细胞，显著低于pSV1.0-TRIVN-CTB活化的T细胞频数（1253±489 SFCs/106脾细胞，p<0.05）和pSV1.0-TRIVN-CTA所活化的T细胞频数（979±245 SFCs/106脾细胞，p<0.05）。图4B显示了针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。同样，与实施例1结果相一致的是，pSV1.0-TRIVN-CTB和pSV1.0-TRIVN-CTA疫苗所活化的特异性T细胞反应在各不同抗原间的分配更趋向均匀，以Int和Vif最强，Rev次之。上述结果表明，CTA和/或CTB与免疫原TRIVN融合后能显著性提高细胞免疫水平。
二、多色流式细胞仪染色分析
1×106新鲜分离的小鼠脾细胞接种在圆底96孔培养板上，50μL/孔。然后，分别加入50μL的Tat、Rev、Int、Vif和Nef肽库刺激脾细胞。每条单肽的终浓度为5μg/mL。在37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育1小时后，每孔加入阻断高尔基体的蛋白转运抑制剂布雷非德菌素A（Brefeldin A，BFA）（eBioscience，货号：00-4506-51，美国）和莫能菌素（Monesin，eBioscience，货号：00-4505-51，美国），终浓度分别为1μg/ml和1μM。然后，再在37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育6小时。孵育后，首先用荧光标记的抗CD3-PerCP（BD Pharmingen，美国)、抗CD8a-PB（Biolegend，货号：100725，美国）、抗CD44-FITC（eBioscience，货号：11-0441，美国）和抗 CD62L-APC efluor780（eBioscience,货号：47-0621-82，美国）对细胞表面染色。然后，在固定/穿膜缓冲液（BD生物科学，货号：554715）中固定细胞并穿膜。之后洗涤细胞，用抗IFN-γ/PE（Biolegend，货号：505808，美国）、抗TNF-α/PE-Cy7（BD Pharmingen，货号：557644）和抗IL-2/APC（BD Pharmingen，货号：554429，美国）进行细胞内因子染色。染色后，用含2%胎牛血清（英杰）的PBS洗涤两遍，然后用流式细胞仪（BD FACS Aria Ⅰ）分析。所得数据用FlowJo7.6.1（Tree Star公司，美国）软件分析。
图5显示了实施例2中的多色流式细胞分析中的划门示意图，图中SSC-A表示侧向角，FSC-H表示前向角。依据图5划门获取细胞，依次获取淋巴细胞群，CD3+T细胞群，CD8+T细胞群，CD44highCD62Lhigh中心记忆细胞群和CD44highCD62Llow效应记忆细胞群，并分析其IFN-γ、IL-2、TNF-α的表达。其中，CD8+T细胞群依据CD44表达水平和CD62L表达水平划分为中心记忆细胞和效应记忆细胞，中心记忆细胞定义为CD44高表达和CD62L高表达（即CD44highCD62Lhigh），效应记忆细胞定义为CD44高表达但CD62L低表达（即CD44highCD62Lhigh）。
图6显示了实施例2中的多色流式细胞分析的结果，其中纵坐标表示阳性细胞在整个中心/效应记忆CD8 T细胞中所占比例。“+”表示对应的细胞因子表达阳性，“-”表示对应的细胞因子表达阴性。图6A表明了各免疫组小鼠的中心记忆CD8 T细胞的细胞因子表达水平，图6B表明了各免疫组小鼠的效应记忆CD8 T细胞的细胞因子表达水平。在中心记忆CD8 T细胞中，各免疫组单均能活化产生较高比例的IL-2单阳性中心记忆CD8 T细胞，其中TRIVN组最高，但对于涉及细胞 杀伤功能的IFN-γ和TNF-α双阳性，TRIVN-CTA和TRIVN-CTB活化产生的比例显然高于TRIVN组，而且对于三功能阳性（IL-2、IFN-γ和TNF-α）细胞群，也是TRIVN-CTA和TRIVN-CTB活化产生的比例显然高于TRIVN组。上述结果表明，TRIVN-CTA和TRIVN-CTB能活化产生更高水平的多功能中心记忆CD8 T细胞，特别是涉及杀伤功能活性的IFN-γ和TNF-α双阳性的中心记忆CD8 T细胞。在效应记忆CD8 T细胞中，结果有所不同，对于三功能阳性（IL-2、IFN-γ和TNF-α）细胞群，TRIVN-CTA组高于TRIVN组，高于TRIVN-CTB组，对于双功能阳性（IFN-γ和TNF-α双阳性），却是TRIVN-CTB最高，其次为TRIVN-CTA。结合图6A和图6B，表明了TRIVN与CTA、CTB融合后，诱导产生的特异性T细胞亚群有所不同，融合DNA疫苗更能活化与杀伤功能相关的中心记忆T细胞，有利于细胞免疫的长期记忆。
三、针对Nef的结合抗体检测
免疫动物血清中的结合抗体水平通过本领域技术人员熟知的ELISA方法检测确定。简言之，纯化的HIV-1A亚型，B亚型或C亚型的Nef蛋白（上海科肽）在0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH9.6）中，以1μg/mL的浓度包被在96孔酶联免疫吸附板上（康宁，美国），4℃过夜孵育。然后用PBS洗涤3遍，并用含5%脱脂奶的PBS在37℃下封闭1小时。然后，用PBST（含0.05%吐温20的PBS）洗涤3遍，加入倍比稀释的小鼠血清。37℃孵育1小时后，再用PBST洗涤5遍，加入1:2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz生物科技，sc-2005，美国）。37℃孵育1小时后，PBST洗涤5遍，加入OPD底物（Thermo,#34006）。室温15分钟后，加入2N H2SO4终止反应， 50μL/孔。然后用多功能酶标仪（赛默飞，美国）在492nm处读取每孔的吸光度（A）值。大于阴性对照A值2.1倍判断为阳性，阳性值中的最高稀释度的倒数定义为血清抗体滴度。
图7显示了实施例2中的对Nef的结合抗体检测结果。纵坐标为各免疫小鼠的结合抗体滴度的对数值。结果如图7所示，对于A亚型和B亚型的Nef蛋白，各免疫组小鼠血清均有高滴度的结合抗体IgG，从趋势上看，免疫组TRIVN-CTA和TRIVN-CTB比TRIVN结合抗体滴度更高。而对于C亚型Nef蛋白，TRIVN免疫未能活化有效的结合抗体应答，而融合有CTA和/或CTB的疫苗免疫小鼠能显著性地活化产生高滴度的结合抗体应答，充分表明CTA和/或CTB与目的基因TRIVN融合后能显著性提高抗体应答水平。
四、体外刺激活性
为进一步研究CTA与目的基因融合后的佐剂效果，我们设计了一组刺激细胞因子分泌的体外活性实验。本实验中，使用了常用的研究体外佐剂刺激效果的细胞刺激模型。我们将前述的pSV1.0（作为载体对照）、pSV1.0-TRIVN、pSV1.0-TRIVN-CTA分别以1μg的剂量加入5×105NIH 3T3细胞中，刺激24小时后分别获取上清和细胞，刺激后的细胞经过常规的RNA技术提取总RNA。然后用ELISA试剂盒（购自达科为生物科技有限公司，上海）定量检测细胞上清中的细胞因子IL-1β和IL-6分泌水平，检测方法根据试剂盒说明书。图8显示了实施例2中的在NIH 3T3细胞模型上的体外刺激活性检测结果。纵坐标表示刺激后，细胞上清中的细胞因子分泌水平（pg/mL)。结果如图8所示，pSV1.0-TRIVN-CTA刺激NIH 3T3细胞分泌显著性水平的IL-6，表明了CTA与目的基因融合后有体外的刺激活性，提示这可能 与如实施例1和实施例2中所述的体内的佐剂效果有关。
实施例3，与目的基因VP1的融合
一、真核表达构建体的构建
VP1为肠道病毒71型（EV71）的衣壳蛋白VP1。本发明所用的VP1编码核苷酸序列是将来自EV71 C4亚型的中国分离株VP1的氨基酸序列经哺乳动物密码子优化后并送上海捷瑞生物工程有限公司进行全基因合成所得，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:8。将所述的哺乳动物密码子优化的VP1编码核苷酸序列通过本领域技术人员熟知的方法插入pVAX1载体（货号V260-20，英杰）的多克隆位点中，构建成VP1的真核表达构建体表达构建体或DNA疫苗pVAX1-VP1。然后将实施例1中所述的哺乳动物密码子优化的CTA、CTB基因编码序列编码核苷酸序列分别插入pVAX1-VP1载体的VP1下游，分别构建成表达融合蛋白VP1-CTA和VP-CTB的真核表达构建体或DNA疫苗pVAX1-VP1-CTA和pVAX1-VP1-CTB。其中，VP1-CTA融合基因编码序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO:9，VP1-CTB融合基因编码序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO:10。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。
二、真核表达鉴定
为了检测分别含融合基因VP1-CTA和VP1-CTB的质粒DNA疫苗pVAX1-VP1-CTA和pVAX1-VP1-CTB在哺乳动物细胞中的表达情况，我们将上述质粒和空载体pVAX1为阴性对照分别转染了HEK 293T细胞，然后分别收集转染后细胞裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图9显示了实施例3中的DNA疫苗或真核表达构建体pVAX1-VP1、pVAX1-VP1-CTA、pVAX1-VP1-CTB的表 达验证结果。方法同图1中所述。实验结果如图9所示，在相应分子量左右有特异性条带，与预期的分子量位置吻合，而细胞对照未见相应分子量位置的条带，表明所构建的DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原。
三、动物实验
用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗pVAX1-VP1，pVAX1-VP1-CTA，pVAX1-VP1-CTB和载体质粒pVAX1。所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中(pH7.2)，调整浓度为1mg/mL。
体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为四组，每组5只。其中，载体对照组A小鼠免疫pVAX1，实验组小鼠分别接种pVAX1-VP1、pVAX1-VP1-CTA、pVAX1-VP1-CTB。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌注射100μg质粒DNA疫苗，于第6周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表3。
表3.实施例3的动物免疫分组及免疫规划
用如实施例1和2中的方法采集小鼠脾细胞和血清。
小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司 （Cat No.551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN-γ的肽序列如下：
VP1-5:RPMRNQNYL；
VP1-6:YMRMKHVRAWIPRPM。
上述肽由上海科肽生物科技有限公司合成，刺激浓度为10μg/mL，阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA）和离子霉素（inomysin）均购自美国Sigma公司，刺激浓度分别为50ng/μL，1μg/μL。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞应答水平的特异性T细胞频数表述为斑点形成单位（Spots formulation units，SFCs）/106脾细胞。图10显示了实施例3的细胞免疫原性的检测结果。整体上看，VP1-5特异性细胞免疫应答强于VP1-6，与之前的研究一致，对于VP1-5表位而言，B组活化的T细胞免疫反应强度分别为872±106 SFCs/106脾细胞，显著低于pVAX1-VP1-CTA（C组）活化的T细胞频数（1742±258 SFCs/106脾细胞，p<0.05）和pVAX1-VP1-CTB（D组）所活化的T细胞频数（1222±220 SFCs/106脾细胞，p<0.05）。同样对于VP1-6表位，B组活化的T细胞免疫反应强度分别为260±116 SFCs/106脾细胞，显著低于pVAX1-VP1-CTA（C组）活化的T细胞频数（490±121 SFCs/106脾细胞，p<0.05）和pVAX1-VP1-CTB（D组）所活化的T细胞频数（398±59 SFCs/106脾细胞，p<0.05）。上述结果表明，CTA和/或CTB与免疫原VP1融合后能显著性提高细胞免疫水平。
将前述步骤中得到的各组小鼠血清用于酶联免疫吸附试验（ELISA），以检测特异性抗体应答。96孔酶标板购自江海玻璃仪器 总厂（江苏海门），重组VP1蛋白可购自苏州工业园区唯可达生物科技有限公司。用0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH9.6）将重组VP1蛋白包被在96孔酶标板上，包被浓度为10μg/mL，100μL/孔，4℃过夜。0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）37℃封闭半小时，然后用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤5遍，室温孵育小鼠血清1小时，孵育结束后用PBST洗涤5遍，用1:5000的羊抗鼠IgG-HRP抗体（美国santa cruz公司）37℃孵育半小时，PBST洗涤5遍后按100μL/孔，加入含0.01%3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）底物显色液，37℃显色10分钟，按50μL/孔加入2M硫酸终止，然后在450nm波长下读取吸光度（A）值。大于阴性对照A值2.1倍判断为阳性，阳性值中的最高稀释度的倒数定义为血清抗体滴度。
检测结果如图11，纵坐标表示针对重组VP1蛋白的结合抗体滴度的对数值，从图中所知，各免疫组均能活化产生抗VP1的血清抗体，但非融合DNA疫苗免疫（B组）活化产生的血清结合抗体水平（滴度的对数值为2.84±0.25）显著低于pVAX1-VP1-CTA（C组）活化的抗体水平（滴度的对数值为4.11±0.21）和pVAX1-VP1-CTB（D组）所活化的抗体水平（滴度的对数值为3.93±0.34，p<0.05）。上述结果表明，CTA和/或CTB与免疫原VP1融合后能显著性提高结合抗体应答水平。
统计学方法：数据均以均值±标准差表示，两组间均值的统计比较使用非配对t检验，以p<0.05作为差异有显著性的标准。
实施例4，与目的基因HA的融合
一、真核表达构建体的构建
HA为流感病毒的血凝素抗原。本发明所用的HA基因编码序列 编码核苷酸序列是将来自2009年甲型H1N1流感毒株A/Texas/05/2009(H1N1)血凝素HA的氨基酸序列经哺乳动物密码子优化后并送上海捷瑞生物工程有限公司进行全基因合成所得，其基因编码序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO:11。将所述的哺乳动物密码子优化的HA基因编码序列编码核苷酸序列通过本领域技术人员熟知的方法插入pVAX1载体（货号V260-20，英杰）中的多克隆位点，构建成HA的真核表达构建体或DNA疫苗pVAX1-HA。
然后将实施例1中所述的哺乳动物密码子优化的CTA、CTB编码核苷酸序列分别插入pVAX1-HA载体的HA下游，分别构建成表达融合蛋白HA-CTA和VP-CTB的真核表达构建体或DNA疫苗pVAX1-HA-CTA和pVAX1-HA-CTB。其中，HA-CTA融合编码核苷酸序列如SEQ ID NO:12，HA-CTB融合编码核苷酸序列如SEQ ID NO:13。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。
二、动物实验
用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗pVAX1-HA，pVAX1-HA-CTA，pVAX1-HA-CTB和载体质粒pVAX1。所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中(pH7.2)，调整浓度为1mg/mL。
体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为四组，每组5只。其中，载体对照组A小鼠免疫pVAX1，实验组小鼠分别接种pVAX1-HA、pVAX1-HA-CTA、pVAX1-HA-CTB。分别于第0、4、8周在小鼠右侧胫前肌注射100μg质粒DNA疫苗，于第10周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表4。
表4.实施例4的动物免疫分组及免疫规划
用如实施例1和2中的方法采集小鼠脾细胞和血清。
小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（Cat No.551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN-γ的肽为本领域熟知的HA533表位肽（由上海科肽合成）。上述肽刺激浓度为10μg/mL，阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA）和离子霉素（inomysin）均购自美国Sigma公司，刺激浓度分别为50ng/μL，1μg/μL。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞应答水平的特异性T细胞频数表述为SFCs/106脾细胞。检测结果见图12中，各免疫组小鼠均能活化产生高水平的细胞免疫应答，其中，B组活化的T细胞免疫反应强度分别为247±76 SFCs/106脾细胞，显著低于pVAX1-HA-CTA（C组）活化的T细胞频数（549±144 SFCs/106脾细胞，p<0.05）和pVAX1-HA-CTB（D组）所活化的T细胞频数（407±107 SFCs/106脾细胞，p<0.05）。上述结果表明，CTA和/或CTB与免疫原HA融合后能显著性提高细胞免疫水平。
三、中和抗体检测
用基于流感病毒假病毒的微中和实验检测免疫小鼠血清中的中和抗体水平，携带A/Texas/05/2009(H1N1)血凝素HA的流感假病毒TE09 H1pp由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供，中和实验方法为本领域技术人员熟知，简述如下：第1天，检测人准备MDCK细胞，在96孔细胞培养板上铺MDCK细胞，3×104/孔，过夜孵育。第2天，在96孔板第1列（细胞对照）所有孔中加入150μL DMEM细胞培养基，2-12列所有孔中加入100μL DMEM细胞培养基（第2列将作为病毒对照）。再在H3-H12孔中加入40μL DMEM细胞培养基（按1:20起始稀释度，3倍梯度稀释）。在其余孔加入梯度稀释的血清。然后计算流感假病毒用量，一般以200 TCID50/孔作为感染剂量，用DMEM细胞培养基稀释病毒至相当于约200 TCID50/50μL。2-12列所有孔中加入50μL假病毒稀释液。盖好板子，孵育1小时。吸弃96孔平底细胞培养板MDCK细胞上清，用200μL DMEM细胞培养基洗涤一遍，吸弃，然后转移96孔圆底板体系至96孔细胞培养板相应孔，注意保持一一对应。孵育4-6小时，补加含4%小牛血清的DMEM维持培养基，50μL/孔。孵育48小时。第4天，去除培养基，用约180μL PBS洗涤两遍，吸尽，加入30μL荧光素酶细胞裂解液（普洛麦格，美国），室温裂解30分钟，每孔加入50μL荧光素酶检测底物液（普洛麦格，美国），立即用化学发光检测仪（普洛麦格，美国）检测，记录发光值，即RLU。计算实验孔（含待测样品）RLU均值与细胞对照（只有细胞，列1）RLU均值之间的差，并用病毒对照（含假病毒，列2）均值与细胞对照均值之间的差除，再用1减，然后乘以100，即得到所测样品的抑制率百分数。中和抗体滴度表示为抑制率百分数>50的最高稀释度的倒数。
检测结果如图13，纵坐标表示针对流感假病毒TE09 H1pp的中和抗体滴度的对数值，从图中所知，各免疫组均能活化产生抗TE09 H1的中和抗体，但非融合DNA疫苗免疫（B组）活化产生的中和抗体水平（中和抗体滴度的对数值为3.12±0.24）显著低于pVAX1-HA-CTA（C组）活化的抗体水平（中和抗体滴度的对数值为3.95±0.30）和pVAX1-HA-CTB（D组）所活化的抗体水平（中和抗体滴度的对数值为3.72±0.29，p<0.05）。上述结果表明，CTA和/或CTB与免疫原HA融合后能显著性提高中和抗体应答水平。
统计学方法：数据均以均值±标准差表示，两组间均值的统计比较使用非配对t检验，以p<0.05作为差异有显著性的标准。
实施例5，与目的基因OVA的融合
一、真核表达构建体的构建
本发明所用的OVA基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列是OVA氨基酸序列经哺乳动物密码子优化后并送上海捷瑞生物工程有限公司进行全基因合成所得，其基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO:14。将所述的哺乳动物密码子优化的HA基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列通过本领域技术人员熟知的方法插入pVAX1载体（货号V260-20，英杰）中，构建成HA的真核表达构建体或DNA疫苗pVAX1-OVA。
然后将实施例1中所述的哺乳动物密码子优化的CTA基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列分别插入pVAX1-OVA载体的HA下游，构建成表达融合蛋白OVA-CTA的真核表达构建体或DNA疫苗pVAX1-OVA-CTA。HA-CTA融合基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO:15。构建完成后，经测序鉴定后入库 备用。
二、动物实验
用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗pVAX1-OVA，pVAX1-OVA-CTA。所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中(pH7.2)，调整浓度为1mg/mL。
体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为两组，每组3只。小鼠分别接种pVAX1-OVA、pVAX1-OVA-CTA。分别于第0、4、8周在小鼠右侧胫前肌注射100μg质粒DNA疫苗，于第10周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表5。
表5.实施例5的动物免疫分组及免疫规划
用如实施例1和2中的方法采集小鼠脾细胞和血清。
小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（Cat No.551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN-γ的肽为本领域熟知的OVA表位肽（由上海科肽合成）。上述肽刺激浓度为10μg/mL，阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA）和离子霉素（inomysin）均购自美国Sigma公司，刺激浓度分别为50ng/μL，1μg/μL。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞 应答水平的特异性T细胞频数表述为SFCs/106脾细胞。检测结果见图14中，各免疫组小鼠均能活化产生高水平的细胞免疫应答，其中，OVA组活化的T细胞免疫反应强度分别为17±10 SFCs/106脾细胞，低于pVAX1-OVA-CTA活化的T细胞频数（98±21 SFCs/106脾细胞）。上述结果表明，CTA与免疫原OVA融合后能提高细胞免疫水平。
实施例6，CTA与目的基因TRIVN的融合
在实施例1和2的基础上，我们再进行了一组动物实验，观察疫苗的保护性效果。疫苗制备如实施例1和实施例2中所述。
体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为3组，每组3只。其中，载体对照组Mock小鼠免疫pSV1.0、实验组小鼠分别接种pSV1.0-TRIVN、pSV1.0-TRIVN-CTA。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌注射100μg质粒DNA疫苗，于第6周用表达TRIVN的痘苗病毒rvv-TRIVN（上海市公共卫生临床中心提供），以4×106PFU/只的剂量腹腔攻毒，于攻毒后第三天取卵巢，经组织研磨和匀浆后，用vero细胞进行病毒滴定。
如图15，结果表述为每克组织的病毒滴度（PFUs/g）。与对照组相比，免疫pSV1.0-TRIVN、pSV1.0-TRIVN-CTA疫苗均能有效降低病毒复制水平，其中，pSV1.0-TRIVN-CTA更明显降低了病毒滴度，显著性地增强了疫苗的保护效果，表明了经融合基因后的真核表达构建体能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，有助于提高疫苗的免疫效果。
本发明提供了一种融合基因真核表达构建体，该真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片 段与目的抗原基因相连的融合基因。该融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，该融合基因真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著性提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平，因而，所述融合基因真核表达构建体可以用于基因工程疫苗。此外，CT或其亚单位是细菌的表达产物，尚未有关于其与目的抗原融合的真核表达构建体的研究报道，本发明填补了这一方面的空白。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。
2.如权利要求1所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO:3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
3.如权利要求1～2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述目的抗原基因来源于病原微生物和/或动物细胞的抗原。
4.如权利要求1～2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体为质粒DNA载体、重组病毒载体、慢病毒载体。
5.如权利要求1～2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括TRIVN-CTA和/或TRIVN-CTB融合基因的真核表达构建体。
6.如权利要求1～2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括VP1-CTA和/或VP1-CTB融合基因的真核表达构建体。
7.如权利要求1～2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括HA-CTA和/或HA-CTB融合基因的真核表达构建体。
8.如权利要求1～2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括OVA-CTA融合基因的真核表达构建体。
9.一种融合基因基因工程疫苗，其特征在于，所述基因工程疫苗包括权利要求1至8所述的融合基因真核表达构建体。
10.一种制备融合基因基因工程疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将目的抗原基因编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸相连成融合基因，并克隆至真核表达构建体的步骤。
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| CN104387472A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-03-04 | 广东工业大学 | 一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途 |
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