CH678059A5 - - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 059 A5

Descrizione

L'invenzione riguarda tripeptìdi rispondenti alla formula generale:

X-Gly-Y

dove X = L-Arg o D-Arg e Y = L-Asp o D-Asp, e loro sali di acidi organici ed inorganici, come ad esempio acetato, trifluoroacetato, cloridrato, solfato, preparati farmaceutici contenenti tali tripeptidi e procedimento per la loro preparazione.

E' accertato che l'interazione tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare, dovuta o favorita dalla fibronectina, è inibita dalla somministrazione endovenosa di un pentapeptide di sintesi, con sequenza Gly-Arg-Gly-Asp-Ser, che riproduce la sequenza del sito di legame della fibronectina con le cellule (Humphries M.J. et al, Science 233:467,1986).

Ruoslahti e Pierschbacher (Celi 44:517,1986) hanno ipotizzato che l'attività biologica del pentapeptide sia da attribuire alla sequenza tripeptidica Arg-Gly-Asp in esso contenuta, senza tuttavia comprovarne l'attività.

Lam et al (J. Bioi. Chem. 262:947,1987) hanno dimostrato che il tripeptide Arg-Gly-Asp è in grado di legarsi a glicoproteine di superficie delle piastrine, indicando pertanto una possibile attività biologica del peptide come inibitore delle reazioni di adesività piastrinica.

Partendo dalle conoscenze risultanti dallo stato dell'arte sopra descritto, la richiedente ha sintetizzato dei tripeptidi rientranti nella formula generale X-Gly-Y, dove X = L-Arg o D-Arg e Y = L-Asp o D-Asp, valutando poi la loro attività in test sperimentali di attività antimetastatica. I risultati hanno confermato la loro efficacia come antimetastatici, ma hanno anche sorprendentemente rivelato la loro intensa attività ìmmunostimolante, non prevedibile sulla base delle attuali conoscenze.

Tale attività ìmmunostimolante è stata osservata in vitro su modelli sperimentali murini ed umani, e si esplica sia come maturazione di linfociti T immaturi che come incremento della funzionalità di cellule T.

Un analogo comportamento ìmmunostimolante è stato descritto per i tripeptidi Arg-Lys-Glu (Domanda di brevetto USA n. 035 045 del 6/4/1987) ed Arg-Ala-Arg (Domanda di brevetto USA n. 035 044. del 6/4/1987), nonché Arg-Lys-Asp (Domanda dì brevetto europeo n. 67 425 del 22.12.1982).

Inoltre, i tripeptidi oggetto della presente invenzione si sono dimostrati stabilì in ambiente gastrico simulato: sulla base di quanto osservato nel caso dei peptidi Arg-Lys-Glu ed Arg-Ala-Arg, in cui la stabilità in ambiente gastrico simulato sì accompagna ad attività dopo somministrazione orale nell'animale da laboratorio, è possibile attribuire ai tripeptìdi oggetto della presente invenzione una attività ìmmunostimolante dopo somministrazione orale oltre che dopo trattamento parenterale.

Ciò rappresenta un notevole vantaggio nell'uso terapeutico, con particolare riguardo al trattamento dei bambini e di altri pazienti che non tollerano la somministrazione per via parenterale, ed anche in funzione di un migliore adeguamento del paziente alla terapia prescritta.

Sulla base di quanto sopra descritto, tali prodotti risultano essere estremamente utili nella prevenzione della formazione di metastasi in pazienti neoplastici dopo rimozione chirurgica del tumore e nella contemporanea stimolazione del sistema immunitario, depresso sia dai trattamenti radiochemioterapici, che dall'intervento stesso: entrambi questi fattori infatti risultano essere notoriamente immunosoppressori.

La possibilità di disporre inoltre di farmaci somministrabili per via orale rappresenta, per la terapia di questi pazienti, un altro indubbio vantaggio.

Saranno ora descritte la sìntesi e le caratteristiche chimiche e biologiche di una nuova classe di tripeptìdi definita dalla formula generale X-Gly-Y, dove X = L-Arg o D-Arg e Y = L-Asp o D-Asp,

Questi prodotti sono caratterizzati dal fatto di possedere proprietà antimetastatiche, osservate nel test delle metastasi sperimentali da melanoma murino, nonché attività Ìmmunostimolante, come dimostrato in vitro in test di maturazione di linfociti splenici murini (induzione del marcatore di membrana Thy 1.2) ed in test di attivazione delia funzionalità di linfociti umani maturi (produzione di fattori di crescita, sintesi di DNA e di RNA dopo stimolo mitogenico, incremento delle mitosi).

Prove in vitro effettuate in ambiente gastrico simulato hanno inoltre evidenziato la stabilità di tali peptidi, per cui è prevedibile la loro attività anche dopo somministrazione orale.

Pertanto, i prodotti oggetto della presente invenzione possono essere usati, grazie alla loro combinazione unica di attività antimetastatìche e di proprietà immunostimolanti, come farmaci in pazienti sottoposti ad asportazione chirurgica di tumori, allo scopo di prevenire la formazione di metastasi, contribuendo contemporaneamente al miglioramento delle condizioni immunitarie.

L'invenzione potrà essere meglio compresa tramite i seguenti esempi nei quali si utilizzano le seguenti abbreviazioni:

Arg = L-arginina Gly = glicina Asp = acido L-aspartico

Asx = acido L-aspartico, D-aspartico o aspargina D-Asp = acido D-aspartico Boc = butilossicarbonil

N9 = sostituzione effettuata sull'azoto guanosinico dell'Arg

2

CH 678 059 A5

ESEMPI01 : SINTESI Sintesi di Ara-GIv-Asp 5 1. Estere dibenzilico di t-Butilossicarbonil-GIv-Asp t-Butilossicarbonil-glicina (7.1 g) è stata disciolta in etile acetato (50 mi), è stata raffreddata a -10/-15°C sotto agitazione e trattata prima con N-metilmorfolina (5,6 mi), quindi con isobutil clorofor-miato (5,18 mi). La miscela è stata mantenuta sotto agitazione per 10 minuti a-15°C. 10 Nel frattempo, il sale p-tosilato del dibenzil estere dell'acido L-aspartico (20,1 g) è stato sciolto in dime-til formammide (80 mi), raffreddato a-10°C e neutralizzato mediante aggiunta di N-metil morfolina (5,6 mi). Questa soluzione è stata aggiunta alla precedente soluzione dell'anidride mista preformata e la miscela di reazione è stata portata lentamente a temperatura ambiente sotto agitazione nel giro di 3 ore.

La miscela di reazione è stata poi diluita con etile acetato (300 mi) e la soluzione ottenuta è stata lavata 15 prima con soluzione soprassatura di cloruro di sodio (per due volte), poi in successione con soluzione acquosa al 5% di sodio bicarbonato, con acqua, con una soluzione acquosa al 5% di acido citrico ed infine con acqua fino alla neutralità. La fase organica è stata anidrificata (su magnesio solfato) e poi fatta evaporare fino ad ottenere un olio.

Resa: 20 g. Il prodotto è omogeneo all'analisi TLC 20 (Sistema: cloroformio:metanolo:acido acetico,360:32:8; Rf =0,8).

2. Estere dibenzilico di tribenzilossicarbonil-Ara-Glv-Asp

Il prodotto ottenuto dal passaggio precedente (20 g) è stato trattato con una soluzione al 50% di acido 25 trifluoroacetico in cloruro di metilene (125 mi) per 25 minuti a temperatura ambiente.

I solventi sono stati quindi fatti evaporare sotto pressione ridotta. Il resìduo è stato fatto rievaporare da toluene e poi essiccato sotto vuoto.

II risultante sale trifluoroacetato del dipeptide è stato sciolto in dimetil formammide (75 mi), raffreddato a-10°C e neutralizzato mediante trattamento con N-metilmorfolina (5,6 mi). Nel frattempo, della tribenzi-

30 lossicarbonil-L-arginina (23,1 g) è stata convertita nell'anidride mista sciogliendola in tetraidrofurano (100 mi), raffreddando a -10/-15°C e trattando prima con N-metilmorfolina (5,6 mi), poi con isobutil cloro-formiato (5,18 mi) come descritto in precedenza. La soluzione preraffreddata del dipeptide neutralizzato è stata aggiunta all'anidride mista e la miscela è stata tenuta sotto agitazione per 3 ore, portando lentamente a temperatura ambiente. Poiché nel corso della reazione la miscela tendeva a solidificarsi, è stata 35 aggiunta dimetil formammide (50 mi) per facilitare l'agitazione. Il tetraidrofurano è stato fatto, evaporare sotto pressione ridotta ed il residuo è stato ripreso con etile acetato (500 mi). Questa soluzione è stata lavata con soluzione acquosa satura di sodio cloruro, e durante tale operazione è precipitato un solido biancastro. I solido è stato filtrato, lavato con etile acetato ed essiccato per ottenere il tripeptide protetto. Resa: 25 g. La cromatografia su strato sottile (Sistema: cloroformio:metanolo:acido acetico, 40 85:10:5) mostra una lieve contaminazione da tribenzilossicarbonil-arginina che non ha reagito. Il prodotto (14 g) è stato perciò purificato sciogliendolo su una colonna di gel di silice (600 g).

La colonna è stata eluita con concentrazioni progressivamente crescenti di metanolo in cloroformio per ottenere il tripeptide protetto puro. Resa: 10 g.

45 3. Ara-GIv-Asp

Il tripeptide protetto ottenuto nel passaggio precedente (10 g) è stato idrogenato a 50 psi in metano-lo:acido acetico:acqua (60:20:20, 300 mi) con palladio su carbonio (5%, 3 g) per 72 ore, finché la reazione era completa all'analisi TLC. Il catalizzatore veniva filtrato via, il metanolo veniva fatto evaporare 50 sotto prestane ridotta ed il residuo veniva liofilizzato per dare lì tripeptide come polvere bianca. Resa: 3 g. Il prodotto era omogeneo all'analisi TLC (Sistemi: A, isopropanolo:ammoniaca 1:1 B, n-butanolo:acido acetico:acqua:piridina, 60:12:40:48).

55

Sintesi di Ara-GIv-D-Asp

1. Preparazione di resine sostituite con acido Boc-ß-benzil-D-asoartico

Polistirene clorometilato (1% crossiinked; 200-400 mesh) era posto in un pallone e lasciato rigonfiare in dimetilformammide (circa 8-10 mi per grammo di resina), poi veniva trattato con acido Boc-p-benzil-D-60 aspartico (1 mole per grammo di resina), seguito da fluoruro di potassio (2 moli per grammo di resina). Il pallone era dotato dì agitatore meccanico e condensatore e riscaldato sotto vuoto finché una piccola quantità 5-10 mi del solvente era distillata.

La sorgente del vuoto era rimossa e la miscela veniva riscaldata a 80-100°C per 16-18 ore. Durante il raffreddamento, la resina era filtrata, lavata con dimetilformammide, dimetilformammide:acqua (1:1), ac

65

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 059 A5

qua, etanolo, diclorometano e metanolo, e poi essiccata sotto vuoto. Sostituzione (calcolata tramite l'aumento dipeso) = 0.6 moli per grammo.

2. Protocollo di sìntesi

17.6 grammi dì resina sostituita con acido Boc-ß-benzil-D-aspartico erano posti in un pallone di reazione in vetro dotato di agitatore meccanico, base in vetro sinterizzato e sorgente di vuoto per la filtrazione, La resina era trattata sequenzialmente a temperatura ambiente (20-25°C) con i seguenti solventi o reagenti:

a. cloruro di metilene b. 50% acido trìfluoroaceticoxloruro dì metilene (v/v)

c. 50% acido trifluoroaceticorcloruro di metilene per 25'

d. cloruro dì metilene (3 volte)

e. isopropanolo f. 10%trietilammina:cloruro di metilene (v/v) (2 volte)

g. cloruro di metilene h. metanolo (2 volte)

i. cloruro di metilene (2 volte)

l[ tempo dì contatto per ogni trattamento era di 3-5 minuti.

Circa 10-15 mi dì solvente o di miscela solvente-reagente venivano usati per grammo di resina in ogni passaggio.

j. La resina veniva agitata con una soluzione di Boc-glicina (3 equivalenti) in cloruro di metilene, ed a questa veniva aggiunta diGicloesilcarbodiimmide (3 equivalenti) in cloruro di metilene, li tempo di reazione per la sintesi era di almeno 2-4 ore ma poteva prolungarsi per tutta la notte (16-18 ore). La resina cui era legato il peptide veniva filtrata e lavata con cluroro di metilene, metanolo e cloruro di metilene e si controllava il completamento della sintesi mediante reazione alla ninidrina. Se la sintesi risultava incompleta, lo stesso amminoacido veniva riaccoppiato usando la metà dei reagenti.

Il ciclo era ripetuto per Boc-Na -tosil-L-arginina (in dimetilformammide). Dopo rimozione del gruppo Boc N-terminale, la resina cui era legato il peptide veniva accuratamente lavata ed essiccata sotto vuoto.

Resa: 21.0 g

Il peptide veniva staccato dalla resina e contemporaneamente deprotetto mediante trattamento con acido fluoridrico liquido anidro (circa 10 mi per grammo di resina) contenente anisolo (10% v/v) per 1 ora a 0°C.

Dopo evaporazione dell'acido fluoridrico sotto pressione ridotta, il peptide grezzo era estratto lavando la resina con acido acetico acquoso diluito ed il prodotto era isolato mediante liofilizzazione.

Résa del peptide grezzo: 3.9 g

3. Purificazione del peptide grezzo

Il peptide grezzo può essere purificato mediante HPLC preparativa in fase inversa usando silice sila-nizzata con una catena C18 con, per esempio, uno strumento Waters Prep 500. Usando una colonna 5 x 30 cm, equilibrata con l'apposito tampone acquoso, come l'acido trifluoroacetico acquoso allo 0.1%, il peptide grezzo (circa 2 grammi) era applicato alla colonna ed eluito con un gradiente contenente quantità crescenti di acetonitrile. Le frazioni venivano controllate mediante HPLC analitico e quelle contenenti il prodotto al livello desiderato di purezza ( > 97%) venivano riunite e liofilizzate. Infine, il prodotto purificato veniva trasformato nel sale desiderato per trattamento con la forma salina desiderata di una resina a scambio ionico.

Resa del peptide purificato come sale acetato: 2.5 g.

ESEMPIO 2 : CARATTERISTICHE CHIMICHE Ara-GIv-Asp

I dati qui riportati sono riferiti ad un solo lotto del tripeptide e non devono essere considerati in senso limitativo.

Peso molecolare: 346,4

Aspetto: polvere bianca

4

CH 678 059 A5

Analisi amminoacida:

Amminoacido

Previsto

Trovato

Asx

1,00

1,00

Arg

1,00

0,98

Gly

1,00

1,02

10 Contenuto oeptidico: 78.5%

Purezza del peptide: 96%

Umidità: 6,56

TLC: lsopropanolo:NH3 (1:1) 99% di purezza, Rf = 0,75

HPLC: l'analisi è stata effettuata secondo le metodiche di seguito descritte ed il tracciato è riportato in 15 fig. 1 :

Solventi: A = KH2P04 0,05 M B = 60% CH3CN + 40% A Gradiente: da 0 a 10 in 20 minuti Colonna: Ultrasphere ODS (Altex)

20 Sensibilità: 0,2 AUFS

Lunghezza d'onda: 210 nm Flusso: 1,5 ml/minuto Area minima: 10

25 Arq-GIv-D-Asp

I dati qui riportati sono riferiti ad un solo lotto del tripeptide e non devono essere considerati in senso limitativo.

Peso molecolare: 346,4 30 Aspetto: polvere bianca

Analisi amminoacida:

Amminoacido

Previsto

Trovato

Asx

1,00

0,94

Arg

1,00

1,05

Gly

1,00

1,02

40

Contenuto oeptidico: 80,5%

Purezza del peptide: > 98%

HPLC: l'analisi è stata effettuata secondo le metodiche di seguito descritte ed il tracciato è riportato in fig. 2:

45 Solventi: A = 25 nM NaH2P04,50 mM NaCI04, pH 3,0 con H3P04 B = H20:MeCN 1:1

Gradiente: da 0 a 30% B in 15 minuti, linearmente da 30 a 70% B in 10 minuti, linearmente Colonna: Deltapack CI7 (5 jiM, 100 A) 3,9 x 150 mm Sensibilità: 0,2 AUFS 50 Lunghezza d'onda: 220 nm Flusso: 0,7 ml/minuto Area mìnima: 10

ESEMPIO 3 : CARATTERISTICHE BIOLOGICHE

55

Stabilità in ambiente gastrico simulato in vitro

Il tripeptide Arg-Gly-Asp è risultato stabile a 37°C per 3 ore in ambiente gastrico simulato in vitro utilizzando la soluzione di fluido gastrico simulato USP XXI (HCl + pepsina).

60

Attività antimetastatica

E' stata valutata la capacità del tripeptide Arg-Gly-Asp di inibire la colonizzazione polmonare da parte di cellule di melanoma murino B16-BL6 inoculate in topi C57BL/6 femmine del peso medio di 20 g (10 animali 65 per gruppo).

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 678 059 A5

Arg-Gly-Asp è stato somministrato alla dose di 3 mg/topo mediante iniezione intravenosa insieme a 2x105 cellule di melanoma.

Quattordici giorni gopo, gli animali sono stati sacrificati, i polmoni sono stati prelevati ed esaminati dopo fissazione in formalina per la presenza di colonie di melanoma superficiali. Un gruppo di animali controlio ha ricevuto unicamente la sospensione di cellule tumorali. Mentre nei controlli si è ottenuto un numero di metastasi superiore a 500/topo, tale valore si è ridotto nei trattati, dove è sceso a 173/topo.

Somministrando 7x104 cellule tumorali, si è ottenuto un numero medio di metastasi nei controlli di 21,6, ridotto a 6,8 nei trattati con 3 mg/topo i.v. di Arg-Gly-Asp (-69%).

induzione dell'antigene Thv 1.2 in splenociti di topi normali

La capacità del tripetìde Arg-Gly-Asp di incurre in vitro il differenziamento dei precursori delle cellule T del topo in linfociti esprimenti markers T cellulari è stata provata evidenziando l'induzione dell'antigene di membrana Thy 1.2.

PREPARAZIONE DELLE CELLULE:

Splenociti di topi normali sono stati utilizzati come fonte di cellule »null». I topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale e le milze sono state prelevate asetticamente. Queste sono state sminuzzate con le pinze in una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) (Cibco Ltd, Paisiey, Scozia). Si è ottenuta una sospensione di cellule singole mediante filtrazione su setaccio metallico a mesh fini. Cellule mononucleari (MNC) sono state isolate per centrifugazione differenziale su Lymphoprep (Nyegaard, Oslo, Norvegia) con gradiente contìnuo di densità per 20 min. a 450 g.

Dopo tre lavaggi in HBSS, le MNC sono state sospese ad una concentrazione di 5x106 cellule/mi nel mezzo 199 (Gibco Ltd) contenente 1'1% di BSA (Cohn Fr. V, Sigma, St.Louis), L-glutammina 2mM e 10 mcg/ml di gentamìcina solfato (Schering, Kliworth, NJ, USA) (TC 199-BSA). Le cellule sono state utilizzate quando la loro vitalità superava il 95% al test di esclusione con il colorante Trypan Blu.

SAGGIO D'INDUZIONE DELL'ANTIGENE THY 1.2:

200 met della sospensione di MNC spleniche sono stati mescolati con un ugale volume del tripeptide appropriatamente diluito con il mezzo TC 199-BSA. Le cellule usate come controllo sono state trattate con il solo mezzo TC 199-BSA. Tutte le cellule sono state incubate per 18 ore a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di COz, quindi lavate due volte con HBSS contenente il 5% di siero di vitello neonato inattivato dal calore (Gibco) (HBSS-CS) e infine risospese nello stesso mezzo ad una concentrazione di 106cellule/ml,

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA (IF):

L'espressione dell'antigene THy 1.2 veniva rilevata mediante IF usando un anticorpo monoclonale anti-Thy 1.2 coniugato con la fluoresceina (Bio-Yeda, fornito da Technogenetics, S. Mauro Torinese) alla concentrazione di 2 mcg/106 cellule. Le cellule sono state incubate con l'anticorpo per 30 min. a 4aC.

Dopo tre lavaggi in HBSS, le cellule sono state risospese nello stesso mezzo ed osservate con un microscopio Leitz Orthomat equipaggiato con epi-illuminazione.

Per ciascuna valutazione sono state contate almeno 300 cellule.

RISULTATI:

Come riportato in tabella, il tripeptide Arg-Gly-Asp è attivo in vitro nell'induzione dell'antigene Thy 1,2 a concentrazioni comprese tra 1 e 200 mcg/ml, con una concentrazione ottimale di 10 mcg/ml.

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 678 059 A5

Concentrazione del peptide ARG-GLY-ASP (mcg/ml)

Tempo di Incubaz. (ore)

% Cellule Thy 1.2+

Variazione

-

3

22

-

0,1

3

25,3

+3,3

1

3

27,1

+5,1

10

3

31,4

+9,4

100

3

29,4

+7,4

200

3

27,9

+5,9

-

18

17

-

10

18

26,5

+9,5

100

.18

21,7

+4,7

Sintesi di RNA in linfociti T umani stimolati con fitoemoaaalutinina in vitro

Linfociti T umani incubati in vitro per 24 ore, in presenza di fitoemoagglutinina (PHA) 0,5% e di differenti concentrazioni dei tripeptidi in esame, sono stati analizzati per la sintesi di RNA (attivazione) mediante marcatura con 3H-uridina. I risultati, descritti in tabella, mostrano che sia Arg-Gly-Asp che Arg-GLy-D-Asp sono in grado di aumentare l'attivazione dei linfociti T umani indotta

Peptide concentrazione mcg/ml

ARG-GLY-ASP c.p.m.

X+S.E. A %

ARG-GLY-D-ASP c.p.m.

X±S.E. A%

0

3835

-

3835

—

108

108

0,0001

3703

-3

3517

-8

198

242

0.-.001

3741

-2

4129

+8

168

91

0,01

4259

+11

4283

+12

191

114

0,1

4516

+18

4777

+25

127

180

1

4068

+6

4682

+22

278

456

10

4199

+9

4346

+13

241

403

Sintesi di DNA in linfociti T umani stimolati con PHA in vitro

Linfociti T umani incubati in vitro per 72 ore in presenza di PHA 0,5% e di differenti concentrazioni dei tripeptidi in esame sono stati analizzati per la sintesi di DNA (proliferazione) mediante marcatura con 3H-timidina.

I risultati, riportati in tabella, dimostrano l'attività di incremento della proliferazione indotta da PHA dei tripeptidi Arg-Gly-Asp ed Arg-Gly-D-Asp.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 059 A5

Peptide concentrazione mcg/ml

ARG-GLY-ASP c.p.m.

X + S.E. A%

ARG-GLY-D-ASP c.p.m.

X ± S.E. A%

0

22 642

-

22 642

-

3688

3688

0,0001

22 002

-3

21 898

-3

3383

3912

0,001

23 519

+4

23 029

+2

3712

3235

0,01

24 034

+6

24 551

+8

3625

3322

0,1

25 814

+17

26 090

+ 15

3931

3435

1

25163

+11

26170

+16

3805

4600

10

24111

+6

24570

+9

3537

4201

Effetto sul ciclo cellulare

Linfociti T umani sono stati incubati per 72 ore in presenza di PHA e dei tripeptidi in esame (1 ug/ml). Il DNA è stato poi colorato con ioduro di propidio e le cellule sono state analizzate mediante citometro a flusso.

Il risultato, come esposto in tabella, mostra che Arg-Gly-Asp incrementa la percentuale di linfociti ìn mitosi, ad un livello molto vicino a quello del peptide di riferimento Arg-Lys-Glu, e superiore a quello di Arg-Lys-Asp.

FASI CELLULARI

Go-GL

%di cellule

A

S

%di cellule

A

G2+M

%di cellule

A

T+PHA

63,36

-

30,61

-

6,02

—

T + PHA + ARG-GLY-ASP

57,69

-5,67

29,46

-1,15

12,14

+6,12

T + PHA+ARG-LYS-ASP

60,79

-2,57

30,63

+0,02

9,42

+3,40

T + PHA+ARG-LYS-GLU

56,15

-7,21

28,64

-1,97

14,35

+8,33

Go = cellule quiescenti gl = intervallo tra mitosi e sintesi di DNA S = sintesi di DNA

G2 = intervallo tra sintesi di DNA e mitosi M = mitosi

Stimolo alla produzione di [infochine in vitro

Linfociti T umani sono stati incubati con PHA in presenza o in assenza dei peptidi in esame per 24 ore (nel caso di IL-2) o 72 ore (nel caso di BCGF). I sovranatanti sono stati raccolti, filtrati (0,2 um) e saggiati per ia presenza di attività IL-2 o BCGF, mediante aggiunta a diverse concentrazioni a linfociti T freschi o a cellule B provenienti da coltura a lungo termine. L'attività proliferativa di tali cellule, dipendente dalla presenza del rispettivo fattore di crescita, è stata valutata mediante incorporazione di 3H-ti-midina.

I risultati evidenziano un notevole effetto di stimolo alla produzione dei fattori di crescita da parte di Arg-Gly-Asp, leggermente inferiore a quello di Arg-Lys-Glu, ma superiore a quello di Arg-Lys-Asp.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH678 059 A5

Attività BCGF (colpi per minuto) alla percentuale del surnatante:

Surnatante da:

N°.

3,125

6,25

12,5

25

50

dat1

X±

A%

X±

A%

X±

A%

X±

A%

X±

A%

S.E.

S.E.

S.E.

S.E.

S.E.

T+PHA

2

1345

—

2156

—

54Ö2

—

15 030

—

17297

—

627

193

290

2294

1650

T+PHA

2

5377

+300

10125

+370

18143

+236

21 977

+46

22 666

+31

+ ARG-LYS-GLU

2459

4503

3006

2702

3930

T+PHA

2

4800

+257

8611

+299

16550

+206

18 645

+24

20508

+19

+ARG-GLY-ASP

2377

3875

2312

2489

368

T + PHA

2

3624

+169

6455

+199

12219

+126

16 554

+10

16107

-7

+ ARG-LYS-ASP

1706

2328

1346

4076

1629

Attività TCGF

T+PHA

2

1564

—

2622

—

4012

—

7824

—

14086

—

329

643

1136

2657

3241

T+PHA

2

4516

+189

10213

+290

16 609

+314

20 695

+165

18451

+31

+ ARG-LYS-GLU

1320

4526

6126

5001

2176

T+PHA

2

3245

+107

8496

+224

13113

+227

16 609

+105

18167

+29

+ARG-GLY-ASP

470

4359

4249

6126

3231

T+PHA

2

3478

+122

8139

+210

13977

+248

15 911

+103

16476

+17

+ ARG-LYS-ASP

1340

4253

6492

5237

5889

Stimolo alla produzione di linfochine in vitro da parte di linfociti T umani puri, in assenza di macrofagi

Con le stesse metodiche utilizzate nell'esperimento precedente, è stata valutata la produzione di linfochine da parte di linfociti T umani purificati mediante passaggio su colonna di lana di nylon: la purezza delle cellule T era superiore al 95%, con monociti/macrofagi e cellule B < 1%.

Per ovviare alla mancanza dei macrofagi, è stata aggiunta IL-1 ß ricombinante (Genzyme), alla concentrazione di 25 Unità /mi.

I risultati ottenuti, sia per IL-2 che per BCGF, dimostrano che l'effetto di Arg-Gly-Asp è paragonabile a quello degli altri prodotti di confronto, tra i quali è stata utilizzata anche la timosina frazione 5, derivato timico parzialmente purificato a base di oiigopeptidi.

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 059 A5

Attività BCGF alla percentuale di surnatante:

Surnatante da:

3,125

6,25

12,5

25

50

c.p.m.

A %

c.p.m.

A %

c.p.m.

A %

c.p.m.

A %

c.p.m.

A%

T+PHA+IL-1

318

-

582

-

1104

-

2507

-

5056

-

T+PHA+IL-1+ARG-LYS-

349

+10

564

-3

2866

+160

4622

+84

10099

+100

GLU (1 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-LYS-

622

+96

784

+35

3196

+189

7187

+187

13 863

+174

GLU (10 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-ALA-

496

+56

516

-11

2347

+113

3987

+59

7143

+41

ARG (1 mcg/ml)

T+PH A+lL-1 +ARG-ALA-

312

-2

425

-27

2569

+133

4437

+77

9185

+82

ARG (10 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-GLY-

618

+94

634

+9

2663

+141

5172

+106

9837

+95

ASP (1 mcg/ml)

T+PHA+IL-1+ARG-GLY-

784

+147

866

+49

2997

+171

6849

+173

11364

+125

ASP (10 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-LYS-

326

+3

370

-36

1839

+67

3186

+27

8942

+77

ASP (1 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-LYS-

421

+32

462

-21

1847

+67

2946

+18

6802

+35

ASP (10 mcg/ml)

T+PHA+IL-1+THY-

418

+31

921

+58

1796

+63

3127

+25

11529

+128

MOS.F5 (100 mcg/ml)

T+PHA+IL-1+THY-

716

+125

566

-3

1308

+18

2132

-15

6721

+33

MOS.F5 (200 mcg/ml)

Attività TCGF alla percentuale di surnatante:

Surnatante da:

3,125

6,25

12,5

25

50

c.p.m.

A %

c.p.m.

A %

c.p.m.

A%

c.p.m.

A%

c.p.m.

A%

T+PHA+IL-1

1696

-

2817

-

3663

-

4812

-

6297

—

T+PHA+lL-1+ARG-LYS-

2516

+48

8218

+192

14 932

+308

17148

+256

16293

+159

GLU (1 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-LYS-

2873

+69

7192

+155

15 264

+317

16 887

+251

12246

+94

GLU (10 mcg/ml)

T+PH A+lL-1 +ARG-ALA-

2085

+23

5679

+102

11 728

+220

12 692

+164

11 378

+81

ARG (1 mcg/ml)

T+PH A+IL-1+ARG-ALA-

3142

+85

6447

+129

13 629

+272

15143

+215

10 875

+73

ARG (10 mcg/ml)

T+PHA+1L-1+ARG-GLY-

1984

+17

6893

+145

13147

+259

14 862

+209

15 654

+149

ASP (1 mcg/ml)

.

T+PHA+IL-1+ARG-GLY-

1736

+2

6342

+125

13 874

+279

10 968

+128

13 427

+113

ASP (10 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-LYS-

2274

+34

5216

+85

8969

+145

10 421

+117

9887

+57

ASP (1 mcg/ml)

T+PHA+IL-1 +ARG-LYS-

2769

+63

6143

+118

7245

+98

7963

+65

8143

+29

ASP (1Q mcg/ml)

T+PH A+lL-1 +TH Y-

2374

+40

7286

+159

15 637

+327

13142

+173

13 835

+120

MOS.F5 (100 mcg/ml)

T+PHA+IL-1+THY-

2156

+27

5218

+85

12143

+232

10 874

+126

12139

+93

MOS.F5 (200 mcg/ml)

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH678 059A5

ESEMPIO 4 PROVE TOSSICOLOGICHE Ara-GIv-Aso

Il tripeptide Arg-Gly-Asp presenta una DL50 superiore a 1000 mg/kg i.p. nel topo.

ESEMPIO 5: USO CLINICO

Poiché i precedenti esempi 3 e 4 hanno dimostrato che i tripeptidi oggetto della presente invenzione sono attivi in vitro come immunostìmolanti in modelli sperimentali sia animali da laboratorio e sono inoltre privi di tossicità, si può ragionevolmente prevedere il loro uso clinico nella prevenzione della formazione di metastasi in pazienti sottoposti ad asportazione chirurgica di tumori, contemporaneamente migliorando le difese immunitarie dell'organismo grazie alle proprietà immunostìmolanti dei peptidi in oggetto.

SALI DI TRIPEPTIDI

Gli esempi sono riportati si riferiscono al sale acetato dei tripeptidi. Tuttavia è possibile ottenere risultati analoghi con altri sali di acidi organici ed inorganici, come ad esempio trifluoroacetato, cloridrato, solfato.

Claims (10)

Rivendicazioni

1. Tripeptidi rispondenti alla formula generale:

X-Gly-Y

dove X = L-Arg o D-Arg e Y = L-Asp o D-Asp, e loro sali di acidi organici ed inorganici.

2. Tripeptidi in accordo alla rivendicazione 1, aventi le seguenti sequenze:

Arg-Gly-Asp D-Arg-GIy-Asp Arg-Gly-D-Asp D-Arg-Gly-D-Asp

3. Arg Gly-Asp e Arg-Gly-D-Asp e in accordo alla rivendicazione 1.

4. Uso di tripeptidi in accordo alla rivendicazione 1, per la preparazione di preparati dotati di attività antimetastatica per somministrazione parenterale.

5. Uso di tripeptidi in accordo alla rivendicazione 1, per la preparazione di preparati dotati di attività antimetastatica per somministrazione orale.

6. Preparati farmaceutici contenente tripeptidi secondo la rivendicazione 1, per la somministrazione orale.

7. Preparati farmaceutici contenente tripeptidi secondo la rivendicazione 1, per la somministrazione parenterale.

8. Uso dì tripeptidi in accordo alla rivendicazione 1, per la preparazione dì preparati dotati di attività Ìmmunostimolante.

9. Procedimento per la preparazione dei tripeptidi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di prevedere le seguenti fasi:

- preparazione dell'estere dibenzilico di t-butìlossicarbonil-GIv-Aso:

- preparazione, dal composto ottenuto, di estere dibenzilico di tribenzìlossicarbonil-Ara-GIv-Asp.

- successiva idrogenazione catalitica per ottenere il tripeptide Arg-Gly-Asp.

10. Procedimento per la preparazione dei tripeptidi secondo la rivendicazione 1, consistente in una sintesi solida.

11