CH658459A5

CH658459A5 - Gereinigtes gemisch von human-leukozyten-interferonen.

Info

Publication number: CH658459A5
Application number: CH732/86A
Authority: CH
Inventors: Sidney Pestka; Menachem Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-10-25
Publication date: 1986-11-14
Also published as: MY8500222A; PT70495A; CH654843A5; FR2442054A1; DE2947134A1; IT1127253B; MC1300A1; DK161048C; YU286179A; IN150740B; JPH07224098A; IE48882B1; NL7908516A; KE3347A; FI793649A; US4289690A; FR2442054B1; DOP1979002953A; AU535936B2; DK496779A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch von Hu-man-Leukozyten-Interferonen wie in Anspruch 1 definiert und Arzneimittel enthaltend ein solches Gemisch.

Die erfmdungsgemässen Gemische können entweder durch Vermischen von isolierten Interferon-Spezies erhalten werden oder durch Unterbrechung des Reinigungsverfahrens an einer Stelle, an der mehrere Interferon-Spezies aber keine Interferon-inaktive Proteine vorhanden sind.

Die in den erfmdungsgemässen Gemischen enthaltenen Interferon-Spezies können mit guten Ausbeuten in präparati-vem Massstab dadurch erhalten werden, dass man eine wäss-rige Lösung unreinen Interferons durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Glycerylgrup-

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pen modifizierten porösen Si02-Matrix unter HPLC-Bedin-gungen schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so dass es 5 schliesslich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird. Diese Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen Bedingungen bezüglich pH und organischen Lösungsmitteln verwendet werden können, bieten die Möglichkeit, Interferon, das in natürlichem Material in ex-10 trem geringen Mengen vorkommen, bis zur Homogenität zu reinigen.

Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der im erfmdungsgemässen Gemisch enthaltenen Interferon-Spezies ist dadurch gekennzeichnet, dass man i5 A) eine wässrige Lösung von Interferon in unreinem Zustand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten 2o eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;

B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktionen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis

25 einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Fraktionen des Eluats 30 in reinerer Form erhalten wird;

C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedingun-gen ein- oder mehrmals durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifi-

35 zierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers eluiert wird, so dass man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes 40 Protein erhält.

HPLC-Säulen auf der Basis von durch Octyl- oder Glycerylgruppen modifizierter poröser Si02-Matrix (Partikelgrösse

= 10 u; mittlere Porengrösse = 100 Â), die bei der Gewinnung der im erfmdungsgemässen Gemisch enthaltenen Verbindungen benutzt werden, sind Handelsartikel, erhältlich z.B. von EM Laboratories of Elmsford, N.Y., USA, unter der Markenbezeichnung Lichrosorb RP-8 und Lichrosorb-Diol. Äquivalente Octyl-modifizierte poröse Si02-Säulen (Chrome-gabond C-8 bezeichnet) sind erhältlich von E.S. Industries, 50 Marlton, N.J., USA.

Ein geeignetes HPLC-System, in dem die vorstehend genannten Säulen verwendet werden können, sind in U.S. Patent No. 4116 046 beschrieben.

55 Die Lösung des unreinen Interferons, vorzugsweise in Gegenwart eines wässrigen Puffers wird bei einem geeigneten pH durch die Si02-Säule geschickt. Normalerweise geschieht dies unter Druck, vorzugsweise im Bereich von etwa 50-5000 psi (3,4-340 Atm). Das auf der Säulenfüllung adsorbierte Protein 60 wird dann schrittweise und selektiv unter Verwendung eines Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert. Für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel sind z.B. Alkanole, wie n-Propanol, 2-Propanol, Äthanol, Methanol, tert.-Butanol, oder cyclische Äther, wie Dioxan. Die Fraktio-65 nierung des Eluats erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei der Gehalt der einzelnen Fraktionen an Interferon durch hochempfindliche Monitoren bestimmt wird. Ein für diesen Zweck geeignetes System wird von Bohlen et al., Anal. Bio-

45

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chem. 67,438 (1975), beschrieben. Es ist andererseits empfeh- der in den erfmdungsgemässen Gemischen enthaltenen Inter-

lenswert, die Anwesenheit von Interferon durch einen geeig- feron-Spezies.

neten Bioassay zu überwachen.

Es wurde gefunden, dass im Fall des Human-Leukozyten- Beispiel 1 Interferons die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn man 5 Eine wässrige Lösung, enthaltend 1,5 mg der vereinigten die unreine Interferon-Lösung zunächst durch eine Säule auf in den nachstehenden Beispielen 2 und 3 näher beschriebenen der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Ma- homogenen Human-Leukozyten-Interferon- Spezies a,, a2, trix (Umkehrphasen-Chromatographie) unter Verwendung ß2, y, und y2 (jedes etwa im Verhältnis zu seiner natürlichen eines Puffers mit einem pH von etwa 7,5 (vorzugsweise 1 M Häufigkeit), mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 108 Natriumacetat/Essigsäure) schickt und mit einem steigenden i0 Einheiten/mg, und 100 mg normales Human-Serumalbumin, n-Propanol-Gradienten eluiert, dann die gesammelten akti- wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die Lö-ven Fraktionen durch eine Säule auf der Basis einer mit Gly- sung aseptisch auf 100 Ampullen gleichmässig verteilt. Jede cerylgruppen modifizierten Si02-Matrix in einem 0,1 M Na- Ampulle enthält etwa 3 x 105 Einheiten reines Human-Leu-triumacetat-Puffer schickt und mit einem fallenden n-Propa- kozyten-Interferon und 1 mg Serumalbumin. Die Ampullen, nol-Gradienten eluiert und schliesslich die getrennten Interfe- 15 die für parenterale Applikation geeignetes Interferon enthal-ron-Komponenten auf eine Säule auf der Basis einer mit Oc- ten, werden zweckmässigerweise kühl (—20 °C) gelagert, tylgruppen modifizierten Si02-Matrix unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 4,0, vorzugsweise 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure, aufgibt und mit einem steigenden n- Beispiel 2 Propanol-Gradienten eluiert. Auf diese Weise kann jede der 20 Homogenes Human-Leukozyten-Interferon von normalen drei getrennten Human-Leukozyten-Interferone (a, ß und y) Spendern weiteraufgetrennt werden, wobei im Chromatogramm scharf voneinander getrennte Peaks erhalten werden, die die homo- -<4- Herstellung des Interferons genen Proteine darstellen. Durch das gesamte Reinigungsver- Interferon wurde hergestellt durch 16-stündige Inkuba-fahren, beginnend mit dem Inkubationsmedium bis hin zur 25 tion von Human-Leukozyten aus dem Blut normaler Spender Chromatographie an der zweiten durch Octylgruppen modifi- (107 Zellen/ml) mit Newcastle-Krankheit-Virus (15 Hämaglu-zierten Si02-Matrix wurde eine Steigerung des Reinheitsgra- tinin-Einheiten/ml) in einem serumfreien Minimalmedium, des um den Faktor 60 000 bis 80 000 erreicht. das 10 mg/ml Casein enthielt. Es wurde ein mittlerer Interfein einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens zur ron-Titer von 5000 Einheiten/ml erhalten. Die angewandten Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon werden die in 30 Methoden entsprachen den von Mogensen, K.E. et al., Phar-Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den Hauptpeaks ent- macology and Therapeutics A, 1977,369-381; Wheelock, sprechen, vereinigt, zur Entfernung des n-Propanols mit n- E.F., J. Bacteriol. 92,1415-1421 (1966) und Cantell, K. et al., Hexan extrahiert und von Spuren n-Hexan befreit bevor Appi. Microbiol. 22,625-628 (1971) angegebenen mit einigen Schritt C) durchgeführt wird. geringfügigen Änderungen. Die Interferon-Titer wurden mit Die im erfmdungsgemässen Gemisch enthaltenen Hu- 35 einem Assay auf der Basis der Hemmung des cytopathischen man-Leukozyten-Interferon-Spezies sind gekennzeichnet Effekts, der innerhalb von 16 Stunden durchgeführt werden durch einen scharfen Peak bei der HPLC an einer mit einem konnte, bestimmt. Alle Interferon-Titer sind in Einheiten/ml Puffer äquilibrierten Säule auf der Basis einer durch Cya- angegeben, kalibriert gegen den Referenzstandard für Hu-nopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder man-Leukozyten-Interferon vom National Institute of Glycerylgruppen modifizierten porösen Si02-Matrix sowie 40 Health (USA).

durch eine einzige enge Bande bei der Polyacrylamid-Gelelek-

trophorese an Natriumdodecylsulfat (NaDodS04 bzw. SDS) B. Konzentrierung und erste Fraktionierung von Interferon in Gegenwart von 2-Mercaptoäthanol. Die Extraktion des Sofern nicht anders angegeben, wurde bei einer Tempera-Gels lieferte einen einzigen scharfen Peak antiviraler Aktivi- tur von 0-4 C gearbeitet. Nach beendeter Inkubation wur-tät, der mit der Proteinbande übereinstimmte. Die spezifi- 45 den die Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugieren (15 Mischen Aktivitäten der reinen Interferon-Spezies liegen im Be- nuten, 500 x g) entfernt. Casein wurde durch Ansäuern mit reich von etwa 0,9-4,0 x 108 Einheiten/mg mit MDBK-Zellen HCl auf pH 4,0 präzipitiert. Nach 2 Stunden wurde das Ge-(epitheliale Nierenzellen von Rindern) und im Bereich von misch zentrifugiert (10 Minuten, 12 000 x g) und der Nieder-2 x 106-4 x 108 Einheiten/mg mit der Human-Hellinie AG schlag verworfen. Der Überstand (101) wurde auf einen Ge-1732. Die Molekulargewichte lagen zwischen etwa 16 000 und so halt von 1,5% (w/v) Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 21 000 (vgl. Tabelle 4, Seite 22). Die Ergebnisse der amino- Stunde wurde das Präzipitat abzentrifugiert (10 Minuten, säureanalyse sind in Tabelle 5 zusammengefasst (Seite 24). 12 000 x g) und in 50 ml 0,1 M NaHC03 wieder aufgelöst.

Interferone besitzen antivirale, antitumor-, Wachstums- Nach Zusatz von 0,5 g Triton X-100 und 1,5 ml Essigsäure hemmende- und immunsuppressive Aktivität. Diese Aktivitä- (tropfenweise unter Rühren) wurde das Gemisch 1 Stunde bei ten konnten sogar in klinischem Massstab festgestellt werden ss 0 °C und anschliessend 16 Stunden bei — 20 °C aufbewahrt,

bei Verabreichung von 1-10 x 106 Einheiten/Tag mit relativ Nach Auftauen wurde 10 Minuten mit 17 000 x g zentrifu-

unsauberen Präparaten, die weniger als 1 % Human-Interfe- giert. Der Rückstand wurde verworfen und der Überstand ron enthielten. Die gereinigten Gemische der vorliegenden Er- auf 4% Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde findung können in der gleichen Weise wie die bereits bekann- das Gemisch 10 Minuten mit 12 000 x g zentrifugiert und der ten Interferon-Präparate verwendet werden unter Anpassung 60 Niederschlag in 5 ml 0,5 M NaHC03 aufgelöst, der Dosierung an den erreichten Reinheitsgrad.

Die Induktion der Interferon-Produktion, die Erstkon- C. Gelfiltration zentration und Fraktionierung des Interferons einschliesslich Die erhaltene konzentrierte Interferon-Lösung wurde mit der Gelfiltration können nach an sich bekannten Methoden 1,5 g Harnstoff versetzt und auf eine Säule von Sephadex durchgeführt werden. «s G-100 fein (2,6 x 90 cm), voräquilibriert mit 4 M Harn-

Ein Gemisch gemäss vorliegender Erfindung wird durch stoff/0,1 M Natriumacetatpuffer, aufgebracht. Die Säule das nachstehende Beispiel 1 illustriert. Die Beispiele 2 und 3 wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflussrate von dienen zur Illustration der Isolierung und der Eigenschaften 0,5 ml/Min. mit 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetat, pH

7,5, eluiert. Es wurden Fraktionen von 12,5 ml gesammelt. Interferon-Aktivität wurde in den Fraktionen 19-23 eluiert.

D. HPLC

Die vereinigten Fraktionen 19-23 von der Sephadex G- 5 100-Säule wurden direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb RP-8-Säule(10 (i, 4,6 x 250 mm) gegeben. Die Säule wurde voräquilibriert mit einem 1 M Natriumacetatpuffer (pH 7,5), der 0,01 % (v/v) Thiodiglycol enthielt, und mit einem linearen Gradienten von n-Propanol in dem gleichen Puffer [1 Stunde, io 0-20%; 3 Stunden, 20-40% (v/v)] bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen von 0,75 ml gesammelt. Das Interferon wurde in den Fraktionen 23-40 [25-30% (v/v) n-Propanol] eluiert.

Die Fraktionen 27-33, die den grössten Anteil der Interfe- is ron-Aktivität enthielten, wurden kombiniert, mit n-Propanol bis zu einer Endkonzentration von 80% (v/v) versetzt und direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb-Diol-Säule (10 (x, 4,6 x 250 mm) gegeben, die voräquilibriert wurde mit einer Lösung von 0,1 M Natriumacetat mit einem Gehalt von 80% 20 (v/v) n-Propanol. Die Säule wurde dann während 4 Stunden mit einem linearen Gradienten von 72-50% (v/v) n-Propanol in 0,1 M Natriumacetat bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/ Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,75 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in Form von drei deutlichen 25 Hauptpeaks, die quantitativ von Präparat zu Präparat variierten, eluiert. Diese Peaks wurden in der Reihenfolge ihrer Elution a, ß und y genannt. Die a-Fraktion wurde bei einer Konzentration von 68% n-Propanol eluiert, die ß-Fraktion bei einer Konzentration von 66,5% n-Propanol und die y- 3« Fraktion bei einer Konzentration von 65,5% n-Propanol. Die gesamte Ausbeute an Interferon-Aktivität war grösser als 80%.

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Die zu jedem Peak gehörenden Fraktionen wurden vereinigt und in Folgestufen weitergereinigt. Da der Peak y der bei weitem grösste war und von anderen Komponenten am besten getrennt zu sein schien, wurde er für die weitere Reinigung ausgesucht. Die Fraktionen 54-56 von der Diolsäule, die den Peak y enthielten, wurden vereinigt und das n-Propanol wurde durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisensäure zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung wurde auf einer Lichrosorb RP-8-Säule (10 ja;

4,6 x 250 mm), voräquilibriert mit 1 M Pyridin und 2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgegeben. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen Gradienten von n-Propanol (20-40%) in 1 M Pyridin/Formiat-Puffer bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Der Hauptpeak der Aktivität stimmte überein mit einem Proteinpeak. Die Fraktionen 45 und 46 (32% (v/v) Propanol) die diesem Peak entsprachen, wurden vereinigt und unter gleichen Bedingungen rechroma-tographiert. Interferon wurde in Fraktion 31 eluiert (32% (v/v) Propanol). die spezifische Aktivität dieser Fraktion wurde mit 4 x 108 Einheiten/mg berechnet verglichen mit Rinderserumalbumin. Dieses Material wurde für die weitere Charakterisierung verwendet. Die Fluoreszenzprofile der HPLC waren so gut reproduzierbar, dass sie einen ständigen Finger-print des gesamten Verfahrens lieferten.

Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 1 zusam-mengefasst. Die gesamte Reinigung, ausgehend vom Inkubationsmedium bis zur zweiten RP-8-Säule war 60 000- bis 80 000-fach. Die kumulative Ausbeute von Stufe 1 bis zur Diolstufe lag bei 30-50%. Nach dieser Stufe wurde jeder der drei Interferon-Peaks separat weiter gereinigt.

Tabelle 1. Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon

Einheiten

Protein

Relative

Reinheits

Ausbeu

gefunden gefunden spezifische grad pro Stui

xio-6

[mg]

Aktivität

[%]

[Einh./mg]

1. Inkubationsmedium

50

10 000

5 x 103

1

_

2. pH 4 Überstand

50

2 000

2,5 x 104

5

100

3.1,5% Trichloressigsäure-Niederschlag

40

1 000

4xl04

8

80-100

4. Triton X-100/Essigsäure-Überstand

40

250

1,6 xlO5

32

70-100

5.4% Trichloressigsäure-Niederschlag

35

175

2 x 105

40

80-90

6. Sephadex G-100

32

57

5,6 xlO5

112

70-90

7. Lichrosorb RP-8 (pH 7,5)

28

11

2,5 xlO6

500

80-100

8. Lichrosorb-Diol

Peak a

11

1,1

lxlO7

5 000

Peak ß

2,5

NB

70-90

Peak y

12,5

0,21

6xl07

12 000

9. Lichrosorb RP-8 (pH 4)

1,6

0,0064

3 x 108

60 000

40-60

10. Lichrosorb RP-8 (pH 4)

8,2

0,021

4 xlO8

80 000

40-60

Zur Bestimmung des in dieser Fraktion enthaltenen Proteins wurde Rinderserumalbumin als Standard herangezogen. Die absolute spezifische Aktivität, die durch Aminosäureanalyse des homogenen Peaks von Stufe 10 bestimmt wurde, war 2-4 x 108 Einheiten/mg (siehe Text). Stufe 9 wurde mit Peak y aus Stufe 8 durchgeführt. Stufe 10 wurde mit dem vereinigten Material aus Stufe 9 von verschiedenen Präparaten durchgeführt. NB = nicht bestimmt.

E. Polyacrylamid Gel-Elektrophorese

Interfern-Proben (1,5 x 105 Einheiten) wurden mit NaDodS04 und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde nach Färbung mit Coomassie-Blau eine einzige scharfe Bande er-halten.Das scheinbare Molekulargewicht wurde mit 17 500

(im Vergleich zu Standardproteinen) bestimmt. Das Gel wurde in Streifen von 1 mm geschnitten, jeder Streifen wurde 65 in 0,4 ml 0,5 M NaHC03/0,1 % NaDodS04 homogenisiert und auf Interferon-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein einziger Peak mit antiviraler Aktivität gefunden, der mit der einzigen Proteinbande übereinstimmte.

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F. Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse des homogenen Human-Leuko-zyten-Interferons (Peak y) wurde mit dem Fluorescamin-Aminosäure-Analysator an 0,5 bis 1 jig Proben von nativem und S-carboxymethyliertem Interferon durchgeführt. Zur Bestimmung des Cystein/Cystin-Verhältnisses wurde natives Interferon carboxymethyliert und dann in 6 M HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1 % Thioglycolsäure) hydrolysiert. Unter diesen Bedingungen wird Cystein als S-Carboxyme-thylcystein und Cystin als freies Cystein gemessen. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 2 zusammenge-fasst. Die spezifische Aktivität, berechnet auf den Aminosäuregehalt, wurde mit 2-4 x 108 Einheiten/mg bestimmt.

Tabelle 2

Aminosäurezusammensetzung von Human-Leukozyten-Interferon

Aminosäure Reste

Asx 15,2 ±1,2

Thr* 7,5 ±0,5

Ser* 8,0 ±0,5

Glx 24,0 ±0,6

Pro 6,3 ±0,3

Gly 5,5 ±0,5

Ala 8,2 ±0,2

Cys (T otal) 3,3 ± 0,7

V2Cystin+ 1,8 ±0,2

Cystein+ 1,5 ±0,5

Val 7,8 ±0,2

Met 3,9 ±0,2

Ile 8,9 ±0,4

Leu 21,8 ±1,3

Tyr 5,1 ±0,2

Phe 9,1 ±0,3

His 3,3 ±0,4

Lys 11,6 ±0,5

Arg 7,3 ±0,5

Trp++ 0,7 ±0,1

*Korrigiert auf die Zeit 0.

+Gemessen nach Carboxymethylierung von nativem Interferon.

++Gemessen nach Hydrolyse in 6 M HCl/4% Thioglycolsäure.

Beispiel 3

Homogenes Human-Leukozyten-Interferon aus Leukozyten von leukämischen Patienten

Das Interferon wurde erhalten durch Inkubation von Hu-man-Leukozyten, isoliert aus dem Blut von leukämischen Patienten (chronische myelogene Leukämie, CML) durch Leu-kophoresis mit Newcastle-Krankheit-Virus in einem serumfreien, caseinhaltigen Medium. Die Interferon-Titer lagen bei 5000-40 000 Einheiten/ml.

Das Reinigungsverfahren war das gleiche wie das in Beispiel 1 beschriebene für Interferon aus Blut von normalen Spendern und umfasste die selektive Präzipitation durch

0,5 M Essigsäure in Gegenwart von Triton X-100, Gelfiltration an Sephadex G-100 in 4 M Harnstoff, HPLC bei pH 7,5 an Lichrosorb RP-8, HPLC an Lichrosorb-Diol und HPLC an Lichrosorb RP-8 bei pH 4,0.

5 Die Fraktionen, die den a-, ß- und y-Peaks der Lichro-sorb-Diolsäule entsprachen, wurden zusammengefasst und dann getrennt voneinander in weiteren Schritten gereinigt.

Aus den vereinigten Fraktionen 43-46 (a-Peak) wurde n-Propanol wurch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen n-lo Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisensäure bis zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Losung auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (10 n,4,6 x 250 mm), die voräquilibriert war mit 1 M Pyridin/2 M Amei-is sensäure (pH 4,0), aufgebracht. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen n-Propanol-Gradienten (20-40%, v/v) in 1 M Pyridinformiat-Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in 20 breiten Peaks bei Konzentrationen zwischen 31 und 35% (v/v) n-Propanol eluiert. Diese Fraktionen wurden kombiniert und unter gleichen Bedingungen rechromatographiert. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks (o^ und a2) bei 31 und 32% (v/v) n-Propanol eluiert. Untergeordnete 25 Komponenten wurden bei einer Konzentration von 34% (v/v) n-Propanol eluiert.

Die vereinigten Fraktionen 47-50 (Peak ß) der Lichro-sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet 30 und an Lichrosorb RP-8 Chromatographien wie sie für den Peak a beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks eluiert: ß2 bei 32% (v/v) n-Propanol und ß3 bei 34% (v/v) n-Propanol. Rechromatographie war in diesem Falle nicht nötig. In einigen Präparaten konnte eine Peak ß! 3s bei 31% (v/v) n-Propanol festgestellt werden.

Die vereinigten Fraktionen 52-54 (Peak y) der Lichro-sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den Peak a beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in 40 fünf Hauptpeaks eluiert: y, (bei 31 % n-Propanol, v/v), y2 (bei 32% n-Propanol, v/v), y3 (bei 34% n-Propanol, v/v), y4 (bei 35% n-Propanol, v/v) und y5 (bei 35,5% n-Propanol, v/v). Rechromatographie war in diesem Fall nicht notwendig.

Die Ergebnisse der Reinigung zur Herstellung der einzel-45 nen Interferon-Spezies sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Die Spezies a2 und ß2 können ferner unterschieden werden durch ihre Elutionscharakteristiken an Lichrosorb-Diol: a2 v/ird eluiert mit 68%igem (v/v) n-Propanol und ß mit 66,5%igem (v/v) n-Propanol.

so Proben der Interferon-Spezies ( 1,5 x 105 Einheiten) wurden mit NaDodS04 und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach Elektrophorese lieferten die Peaks di, a2, ß2, yl5 y2 und y4 jeweils eine einzige Bande, während die Peaks ß3, y3 und y5 jeweils zwei Banden lieferten. 55 Die scheinbaren Molekulargewichte lagen zwischen 16 000 und 18 000 mit Ausnahme von ß3, das eine Bande bei 16 500 und eine bei 21 000 aufwies und y4, das eine Bande bei 21 000 lieferte (siehe Tabelle 4).

9

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Tabelle 3. Reinigung von Leukozyten-Interferon aus CML-Zellen

Einheiten

Protein

Spezifische

Reinheits

Aus

gefunden gefunden

Aktivität**)

grad beute

Stufe xlO-6

[mg]

[Einh./mg]

[%]

1. Inkubationsmedium

800

20 x 103

4 xlO4

1

100

2. pH 4-Überstand

800

4 xlO3

2 xlO5

5

100

3. 1.5% Trichloressigsäure-Niederschlag

780

2 xlO3

3,9 x 105

9,8

97

4. Triton X-100/Essigsäure-Überstand

760

510

1,5 xlO6

37,5

95

5. 4% Trichloressigsäure-Niederschlag

810

350

2,3 x 106

57,5

100

6. Sephadex G-100

660

130

5,1 x 106

128

82

7. Lichrosorb RP-8 (pH 7,5)

510

26

2 xlO7

500

64

(2 Ansätze)

8. Lichrosorb-Diol

Peak a

149

5

3 xlO7

750

Peakß

148

3

5 xlO7

1250

Peak y

139

1,7

8 xlO7

2000

Total

436

54

Peak et]*

9

35xl0-3

2,6 x 108

6 500

Peak a2*

26

65 x10~3

4,0 x 108

10 000

Peak ß2

30

75 x10-3

4,0 x 108

10 000

Peak ß3

13

32x10-3

4,0 x 108

10 000

Peak Yi

15

58 x10-3

2,6 x 108

6 500

Peak y2

31

77 x10~3

4 xlO8

10 000

Peak y3

26

74x 10-3

3,5 xlO8

8 750

Peak y4

3,5

lOxlO-3

3,5 x 108

8 750

Peak y5

4,5

50x10-3

0,9 x 108

2 250

158

20

*nach Rechromatographie

**Aktivität bestimmt an MDBK-Zellen (Rind); Protein gemessen mit Serumalbumin als Standard

Tabelle 4

Spez. Akt. an MDBK

Spez. Akt. an Ag 1732

Wachstums-

MWr

(Rinderzellen, Einh./mg)

(Human-Zellen; Einh./mg)

hemmende

±1000

±25%

±50%

Aktivität**

«i

16 500

2,6 x 108

2,6 xlO8

+

<x2

16 200

4 xlO8

3 xlO8

+

ß2

16 500

4 xlO8

2 xlO8

+

ß3*

21 000

4 xlO8

3 xlO8

+

Yi

17 700

2,6 xlO8

2 xlO8

+

72

17 700

4 xlO8

1,5 xlO8

+

73*

17 200

3,5 x 108

1,5 xlO7

+

74

21 000

3,5 x 108

4 xlO8

+

75*

16 500

0,9 xlO8

2 xlO6

+

*2 Banden bei NaDodS04-Polyacrylamidgelelektrophorese; MW der Hauptbande **Methode von Stewart et al., Nature 262,300 (1976)

Die Aminosäureanalyse der gereinigten Human-Leukozyten-Interferon- Fraktionen wurde mit einem Fluorescamin-Aminosäure- Analysator an 0,1-1 ng Proben durchgeführt. Die Hydrolyse wurde in 6N HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1 % Thioglycolsäure) durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

658 459

10

Tabelle 5. Aminosäureanalyse von Human-Leukozyten-Interferon

Species

Cti

«2

ß2

ßs*

Yi

Y2

Y3*

Y4

Ys*

MWr

16 500

16 200

16 500

21 000

17 700

17 200

21 000

16 500

Reste

142

139

142

181

153

148

180

142

Asx

13,8

11,7

11,5

18,2

13,1

13,3

15,0

17,9

13,8

Thr

7,7

8,3

9,0

9,9

8,4

9,6

8,6

7,3

7,6

Ser

9,2

10,0

14,5

10,2

7,8

10,1

13,5

9,0

Glx

20,3

20,5

21,9

28,5

23,9

25,0

22,8

27,0

20,8

Pro

6,1

4,9

5,0

5,9

4,5

4,8

6,5

4,2

Gly

5,1

4,5

5,0

3,6

5,7

5,0

3,2

4,8

4,0

Ala

8,4

8,3

7,9

11,5

8,7

8,1

9,3

10,4

9,3

Val

7,4

6,2

6,7

7,5

7,3

7,0

5,5

7,9

5,1

Met

3,7

3,8

4,4

6,0

4,3

3,9

5,6

4,9

4,7

ILeu

7,4

7,0

7,4

9,5

7,9

8,0

6,8

9,7

6,6

Leu

18,0

18,9

24,4

20,3

20,1

20,5

24,1

19,6

Tyr

4,0

4,4

4,6

5,0

4,8

3,7

5,0

3,6

Phe

6,9

8,0

8,7

9,9

8,6

9,0

7,2

9,1

6,4

His

3,0

2,8

3,0

3,8

3,7

3,3

2,9

3,8

2,8

Lys

10,5

9,0

8,5

9,3

10,1

10,0

7,6

12,3

12,0

Arg

6,2

7,1

8,0

10,8

8,0

8,5

10,1

8,5

9,0

Cys

3,9

4,0

1,8

2,3

3,3

2,9

3,1

4,1

2,3

Genauigkeit ± 1,5 Reste *Gemische beider Banden

Trypsin-Spaltung und HPLC der Fragmente

Jeweils 300 pMol der gereinigten Human-Leukozyten-In-terferon- Spezies wurden in wässrigem Natriumbicarbonat (50 mMol, pH 8,50 jil) gelöst, Nach Zusatz von jeweils 0,1 fig Trypsin in 2 |il HCl (pH 3) wurde 14 Stunden bei 37 °C inkubiert, mit 5 nl Essigsäure versetzt und das Gemisch auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (Teilchengrösse 10 n; 4,6 x 250 mm) aufgebracht. Die Säule wurde während einer Stunde mit einem linearen Gradienten von 0-40% (v/v) n-Propanol in einem 0,1 M Ameisensäure/0,03 M Pyridin-Puffer (pH 3) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min. eluiert.

Die Fragmente wurden nach der Fluorescamin-Methode nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst, wobei die Position der Peaks als % n-Propanol und die relative Grösse der Fragmente angegeben sind (S = klein; M = mittelgross; L = gross):

Tabelle 6

Tryptische Peptide der Human-Leukozyten-Interferone

Spezies

Elution bei % n-Propanol a,

3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S,

18M, 20S, 21S, 22,5S, 29M

a2

3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S,

18M, 27S, 29M

ß2

3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S,

17,5S, 18M, 29M

ß3

3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M,

16S, 18L, 19,5M, 27M, 32M

Yi

3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S,

14,5M, 16S, 17,5M, 18M,29M

Y2

3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 14,5S,

16S, 18L, 29M

Y3

3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M,

16S, 18L, 20S, 32M

so Ys 3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,5S, 1 OS, 11,5L,

12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S,

32S

Die gereinigten Human-Leukozyten-Interferon- Spezies 3s wurden einer Aminozuckeranalyse unterworfen mit der Ami-nozucker im Bereich von 50-100 pMol festgestellt werden können. In allen Fällen wurde weniger als ein Rest Glucos-amin, Galactosamin bzw. Mannosamin pro Molekül gefunden. In den meisten Fällen interferierte eine Anzahl kleiner 40 Peptide, die in der Nähe der Aminozucker eluiert wurden, mit der Analyse. Es ist daher möglich, dass die den Aminozuk-kern zugeordneten Peaks teilweisee oder sogar ganz Peptiden zuzuordnen sind.

45

Schliesslich lieferte ein Versuch, 1 nMol reines y2 Interferon durch einen manuellen Edman-Abbau, der Rückhydro-lyse und Aminosäureanalyse unter Verwendung von Fluo-rescamin beinhaltet, zu sequenzieren, keine Aminosäuren in so den ersten beiden Zyklen. Die Behandlung von 100 pMol reinem y2 Human-Leukozyten-Interferon mit Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M während 20 Stunden bei 37 °C beeinflusste die biologische Aktivität nicht; im Inkubationsmedium konnten keine Aminosäuren festgestellt werden. 55 Durch Behandlung des Überstandes eines Induktionsmediums (Leukozyten und Newcastle-Krankheit-Virus in Minimalmedium) mit Aminopeptidase M konnte ein Verlust an Interferon-Aktivität nicht beobachtet werden. Dies deutet daraufhin, dass das Interferon-Molekül bereits vor dem Rei-6o nigungsverfahren eine blockierte aminoendständige Aminosäure enthält. Zur Kontrolle wurde rohes Interferon, reines Interferon und die ß-Kette von Insulin gemeinsam mit Aminopeptidase M inkubiert. Während Insulin teilweise abgebaut wurde (Aminosäuren nachweisbar) trat kein Verlust an Inter-65 feron-Aktivität auf.

C

Claims

658 459

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Gemisch von Human-Leukozyten-Interferonen frei von Interferon-inaktiven Proteinverunreinigungen.
2. Gemisch von Human-Leukozyten-Interferonen gemäss Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von 0,9-4,0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen und 2 x 106-4,0 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen.
3. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 und 2 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon et], welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 31 % n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,11,5, 12,5,14,5,16,18,20,21,22,5 und 29% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 n Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 16,500± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

0 die folgende Aminosäurezusammensetzung, ± 15%,

berechnet auf ein Molgewicht von 16,500:

Asx

13,8

Ala

8,4

Phe

6,9

Thr

7,7

Val

7,4

His

3,0

Ser

9,2

Met

3,7

Lys

10,5

Glx

20,3

He

7,4

Arg

6,2

Pro

6,1

Leu

18,0

Cys

3,9

Gly

5,1

Tyr

4,0
4. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon a2, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 32% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,11,5, 12,5,14,5,16,18,27 und 29% n-Propanol von einer

4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 n Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden;

(d) durch Gradientenelution mit n-Propanol in wässri-gem, 1 molarem Natriumacetat-Puffer, Gradient 72,5-50% 5 (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,25 ml/min, bei einer Konzentration von 68% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; und das ferner charakterisiert ist durch io (e) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(g) eine spezifische Aktivität von etwa 3 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

i5 (h) ein Molgewicht von etwa 16,200 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(i) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(j) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und 20 (k) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ±15%, berechnet auf ein Molgewicht von 16,200:

Asx

11,7

Ala

8,3

Phe

8,0

Thr

8,3

Val

6,2

His

2,8

25 Ser

10,0

Met

3,8

Lys

9,0

Glx

20,5

Ile

7,0

Arg

7,1

Pro

4,9

Leu

18,0

Cys

4,0

Gly

4,5

Tyr

4,4

30 5. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon ß2, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Amei-

35 sensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur. Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 32% n-Propanol in einem einzigen Peak v on einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

40 (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, ent-

45 haltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,11,5, 12,5,14,5,16,17,5,18 und 29% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 (i Teilchengrösse, auf der Ba-

50 sis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden;

(d) durch Gradientenelution mit n-Propanol in wässri-gem, 1 molarem Natriumacetat-Puffer, Gradient 72,5-50% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,25 ml/min, bei ei-

55 ner Konzentration von 66,5% in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; und das ferner charakterisiert ist durch

(e) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

60 (f) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(g) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(h) ein Molgewicht von etwa 16,500 ± 1000 bei Gelelek-

65 trophoreseaufPolacrylamid;

(i) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(j) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(k) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ±15%, berechnet auf ein Molgewicht von 16,500:

Asx

11,5

Ala

7,9

Phe

8,7

Thr

9,0

Val

6,7

His

3,0

Ser

10,0

Met

4,4

Lys

8,5

Glx

21,9

Ile

7,4

Arg

8,0

Pro

5,0

Leu

18,9

Cys

1,8

Gly

5,0

Tyr

4,6
6. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon ß3, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min,bei einer Konzentration von 34% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,4,5, 10,12,5,14,14,5,16,18,19,5,27 und 32% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 (x Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 3 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 21,000 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung:

Asx

18,2

Ala

11,5

Phe

9,9

Thr

9,9

Val

7,5

His

3,8

Ser

14,5

Met

6,0

Lys

9,3

Glx

28,5

Ile

9,5

Arg

10,8

Pro

5,9

Leu

24,4

Cys

2,3

Gly

3,6

Tyr

5,0
7. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon y1; welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 31 % n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,4,5, 6,5,11,5,12,5,14,5,16,17,5,18 und 29% n-Propanol von ei-

658 459

ner 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 p. Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 17,700 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ±15%, berechnet auf ein Molgewicht von 17,700:

Asx

13,1

Ala

8,7

Phe

8,6

Thr

8,4

Val

7,3

His

3,7

Ser

10,2

Met

4,3

Lys

10,1

Glx

23,9

Ile

7,9

Arg

8,0

Pro

4,5

Leu

20,3

Cys

3,3

Gly

5,7

Tyr

4,8
8. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon y2, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 32% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,4,5, 5, 11,5,12,5,14,5,16,18 und 29% n-Propanol von einer

4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 jx Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizirten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0-108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 1,5 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 17,700 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ± 15%, berechnet auf ein Molgewicht von 17,700:

Asx

13,3

Ala

8,1

Phe

9,0

Thr

9,6

Val

7,0

His

3,3

Ser

7,8

Met

3,9

Lys

10,0

Glx

25,0

Ile

8,0

Arg

8,5

Pro

4,8

Leu

20,1

Cys

2,9

Gly

5,0

Tyr

4,8
9. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon y3, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Amei3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

658 459

4

sensäure pro Liter, Gradient (M0% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 34% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,11,5, 12,5,13,5,14,5,16,18,20 und 32% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 3,5 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 1,5 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 17,200 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung;

Asx

15,0

Ala

9,3

Phe

7,2

Thr

8,6

Val

5,5

His

2,9

Ser

10,1

Met

5,6

Lys

7,6

Glx

22,8

Ile

6,8

Arg

10,1

Pro

4,8

Leu

20,5

Cys

3,1

Gly

3,2

Tyr

3,7
10. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon y4, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 35% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; und das ferner charakterisiert ist durch

(c) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(d) eine spezifische Aktivität von etwa 3,5 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(f) ein Molgewicht von etwa 21,000±1000bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(g) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(h) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(i) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ±15%, berechnet auf ein Molgewicht von 21,000:

Asx

17,9

Ala

10,4

Phe

9,1

Thr

7,3

Val

7,9

His

3,8

Ser

13,5

Met

4,9

Lys

12,2

Glx

27,0

Ile

9,7

Arg

8,5

Pro

6,5

Leu

24,1

Cys

4,1

Gly

4,8

Tyr

5,0
11. Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 enthaltend Human-Leukozyten-Interferon Ys, welches

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 mol Amei-5 sensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 31 % n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

io (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, ent-

ls haltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4,2,4,5,7, 7,5,10,11,5,12,5,14,14,5,16,18,24,5,25,5 und 32% n-Pro-panol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 (x Teilchen-20 grosse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 0,9 x 108 Einhei-25 ten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 106 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g)ein Molgewicht von etwa 16,500± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

30 (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

O die folgende Aminosäurezusammensetzung:

35 ASX

13,8

Ala

9,3

Phe

6,4

Thr

7,6

Val

5,1

His

2,8

Ser

9,0

Met

4,7

Lys

12,0

Glx

20,8

Ile

6,6

Arg

9,0

Pro

4,2

Leu

19,6

Cys

2,3

40 Gly

4,0

Tyr

3,6
12. Arzneimittel enthaltend ein Gemisch gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11 frei von Interferon-inaktiven Proteinverunreinigungen.

45 13. Arzneimittel gemäss Anspruch 12 gekennzeichnet durch antivirale, wachstumshemmende, immunsuppressive oder Antitumor-Aktivität.

50

Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957 hat Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von Forschern in der ganzen Welt es als homogenes Peptid in solchen 55 Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben würden, erfolgreich widerstanden.

Im U.S. Patent 3 699 222, welches die ersten Arbeiten von Isaacs und Lindenmann über das Interferon zum Gegenstand 60 hat, besteht die Reinigung des aktiven Materials lediglich in einer Ammonsulfatfällung und anschliessender Dialyse. Da ein derartiges Verfahren relativ unspezifisch ist, ist das erhaltene Produkt noch ausserordentlich unrein.

Ein Mehrstufenverfahren zur Reinigung von Interferon 65 wird in U.S. Patent 3 414 651 beschrieben, das die folgenden Schritte umfasst: selektive Adsorption an amorphem Alumi-no-silikat, Elution mit Jod- oder Thiocyanat-Lösung, weitere Fällung unerwünschter Proteine mit wässriger HCl und wäss

riger Natronlauge, Fällung des Interferons ^mittels mit Wasser mischbarer Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Aceton und schliesslich Chromatographie des wieder aufgelösten Interferons an einem Ionenaustauschharz wie 2-Diäthylami-noäthyl- cellulose. Durch dieses Reinigungsverfahren konnte die spezifische Aktivität des Interferons um den Faktor 6000 erhöht werden. Als spezifische Interferone wurden in dem U.S. Patent Kücken- und Affen-Interferon genannt.

Eine weitere Reinigungsmethode wird in U.S. Patent 3 975 344 beschrieben, gemäss dem eine Lösung von ungereinigtem Human-Fibrolasten-Interferon durch Dichtegradient-Ultrazentrifugation gereinigt wurde. Es wurde angegeben, dass nach dieser Methode eine höhere Ausbeute und Reinheit erzielt wird als nach der Methode unter Verwendung von Säulenchromatographie an Sephadex G-100.

Die im folgenden aufgeführten Publikationen beschäftigen sich ebenfalls mit der Reinigung und der versuchten Charakterisierung von Interferonen:

Knight, E., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,520-3 (1976);

Törmä, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251,4810-6 (1976);

Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252,6585-7 (1977);

DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271,622-5 (1978);

Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253,598-602 (1978);

Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253,5206-11 (1978);

Jankowski, W.J. et al., J. Virology 16,1124-30 (1975);

Davey M.W. et al., J. Biol. Chem. 251,7620-6 (1976);

Chadha, K.C. et al., Biochemistry 17,196-200 (1978).

Obwohl in zahlreichen der oben genannten Publikationen behauptet wird, dass Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt werden konnten, ist weder einer der klassischen Nachweise der Homogenität von Proteinen angegeben, z.B. Kristallisierbarkeit, Löslichkeitskinetiken, einheitliches Verhalten in der Ultrazentrifuge und/oder in der Elektrophorese, eindeutige Aussagen bei der Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung oder Aminosäuresequenz oder Einheitlichkeit in chromatographischen Verfahren, noch sind die Eigenschaften der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.

Die Anwendung der Hochdruck-Flüssigkeits-Chroma-tographie (HPLC) zur Reinigung von Proteinen ist in der Fachwelt allgemein bekannt, wobei besonders Ionenaustausch und Ausschluss-Chromatographie beschrieben werden [siehe z.B. Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sei. 14,316-20 (1976) und Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48,1839-45 (1976)].

In der Umkehrphasen-Chromatographie wurde z.B. Lichrosorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modi-fiziertem Si02) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie ß-Endorphin, verwendet [siehe z.B. Rubinstein, M. et al., Proc. Nati. Acad. Sei., USA 74,4969-72 (1977)].

Schliesslich wurde die teilweise Charakterisierung von drei Interferon-Spezies aus Ehrlich Ascites-Tumorzellen von Mäusen (MG = 33 000,26 000 und 20 000) durch Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254,3681-4 (1979), beschrieben.