CH633258A5 - Process for preparing thymosin alpha 1 - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in der Thymosinfraktion 5 vorkommendes saures Polypeptid, das Thymosin cu genannt wurde und dessen Aminosäuresequenz aufgeklärt werden konnte, sowie dessen Isolierung und Reindarstellung aus dieser Thymusfraktion 5. Thymosin ai besitzt in verschiedenen in vitro- und in-vivo-Tests, die ein Mass für die T-Zellen-Differenzierung und -Funktion sind, verglichen mit der Thymosinfraktion 5 die 10-1000fache Aktivität.

Thymosin cu besitzt das Molekulargewicht 3108, ein pl im Bereich von 4,0-4,3 (bestimmt durch isoelektrische Fokussie-rung in einem Gel bei pH 3-5) und die folgende Aminosäuresequenz:

(N-Acetyl)-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.

Die erfindungsgemässe Isolierung und Reindarstellung des Thymosin ai aus der Thymosinfraktion 5 erfolgte durch eine Kombination von Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration in der folgenden Weise:

(a) Die lyophilisierte Thymosinfraktion 5 wurde an einer Säule aus Carboxymethyl-cellulose in einem aus. 10 mM Natriumacetat und 1,0 mM 2-Mercaptoäthanol bestehenden Puffer vom pH 5,0 chromatographiert, wobei die Säule zunächst mit diesem Puffer gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten aus diesem Puffer und einem Gemisch aus diesem Puffer und einer 1,0 M Natriumchloridlösung eluiert wurde.

(b) Der erste gemäss (a) erhaltene Proteinpeak wurde an einer Dextrangel-Säule (Sephadex G-25) fraktioniert unter Verwendung von sterilem Wasser.

(c) Der zweite gemäss (b) erhaltene Proteinpeak wurde auf eine mit 50 mM Tris/1,0 mM 2-Mercaptoäthanol-Puffer vom pH 8,0 äquilibrierte Säule aus 2-Diäthylaminoäthyl-cellulose (DE-32) gebracht. Es wurde zunächst mit diesem Puffer und dann mit einem linearen Gradienten aus 1,31 dieses Puffers und 1,31 dieses Puffers mit einem Gehalt von 0,8 M Natriumchlorid eluiert.

(d) Diejenigen Fraktionen, die das erste Sechstel des gemäss (c) erhaltenen Proteinpeaks enthielten, wurden vereinigt und weiter an einer Dextrangel-Säule (Sephadex G-75) in einem Puffer aus 6,0 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM Tris vom pH 7,5 gereinigt.

(e) Schliesslich wurden die mittleren Fraktionen des gemäss (d) erhaltenen Proteinpeaks an einer Dextrangel-Säule (Sephadex G-10) unter Verwendung von sterilem Wasser entsalzt.

Die so erhaltene, gereinigte Proteinfraktion (Ausbeute 0,6%) wurde als Thymosin ai mit der oben angegebenen Amis

10

15

20

25

30

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£0

65

nosäuresequenz identifiziert. Das Präparat war frei von Kohlenhydraten und Nucleotiden. Die Strukturaufklärung und Bestimmung der Aminosäuresequenz erfolgte nach den allgemeinen üblichen Methoden, d.h. durch enzymatischen Abbau mit Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin oder Subti-lisin, Auftrennung der Bruchstücke durch Papierelektrophorese und/oder Chromatographie und Edman-Abbau der einzelnen Peptidfragmente.

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Die folgende Tabelle zeigt die um den Faktor 10-1000 grössere biologische Aktivität von Thymosin ai verglichen mit der der Thymusfraktion 5 in drei bekannten Bioassays, nämlich dem Mitogen-Test an Mäusen, dem Lymphokin-5 Test (einem in-vitro-Test, mit dem die Produktion des Makrophagenmigrationshemmungsfaktors, MIF, gemessen wird) und dem E-Rosetten-Test mit menschlichen Lymphozyten.

Aktivität ((ig)

Lymphokin- E-Rosetten- Mitogen-Test Test Test

Thymosinfraktion 5 1-5 1-10 1-10

Thymosin ai 0,01-0,1 0,001-0,01 0,01-0,1

20 lösung in Lösung gebracht werden kann.

Thymosin ai kann an Menschen und Säugetiere parenteral und zwar intravenös, subcutan oder intramuskulär verabreicht werden. Bei intravenöser Applikation liegt die tägliche Dosis gewöhnlich im Bereich von 1-100 (ig/kg Körpergewicht. Es ist selbstverständlich, dass sie von Fall zu Fall variiert und abhängt von der Art der Erkrankung, ihrer Stärke und Dauer. Eine zweckmässige pharmazeutische Dosiseinheit ist 1 mg lyophilisiertes Thymosin ai, das kurz vor Gebrauch durch Zusatz von sterilem Wasser oder Kochsalz-

Die Erfindung umfasst auch die physiologisch verträglichen Salze des Thymosins ai, d.h. Salze mit Säuren und Basen. Beispiele derartiger Salze sind das Natrium- oder 2s Kaliumsalz, Salze mit starken organischen Basen wie Gua-nidin oder Säureadditionssalze wie Hydrochlorid, Hydro-bromid, Sulfat, Phosphat, Malat, Maleat, Acetat, Citrat, Suc-cinat, Benzoat und Ascorbat.

B

Claims (5)

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1. Verfahren zur Herstellung von Thymosin cu aus der Thymosinfraktion 5, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) die lyophilisierte Thymosinfraktion 5 an einer Säule aus Carboxymethyl-cellulose in einem Natriumacetat/ 2-Mercaptoäthanol-Puffer vom pH 5,0 chromatographiert, wobei man die Säule zunächst mit diesem Puffer wäscht und dann mit einem linearen Gradienten aus diesem Puffer und einem Gemisch aus diesem Pufferund 1,0 M Natriumchloridlösung eluiert,

(b) den ersten gemäss (a) erhaltenen Proteinpeak an einer Dextrangel-Säule fraktioniert,

(c)' den zweiten gemäss (b) erhaltenen Proteinpeak an einer Säule aus 2-Diäthylaminoäthyl-cellulose in Tris/ 2-Mercaptoäthanol-Puffer vom pH 8,0 chromatographiert, wobei man zunächst mit diesem Puffer und dann mit einem linearen Gradienten aus diesem Puffer und einem Gemisch aus diesem Puffer und 0,8 M Natriumchloridlösung eluiert,

(d) das erste Sechstel des gemäss (c) erhaltenen Protein-peaks über eine Säule eines Dextrangels in einem Guanidin-hydrochlorid/Tris-Puffer vom pH 7,5 gibt, und schliesslich

(e) die mittleren Fraktionen des gemäss (d) erhaltenen Pro-teinpeaks an einer Dextrangel-Säule entsalzt.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der im Verfahrensschritt (a) verwendete Puffer aus 10 mM Natriumacetat und 1,0 mM 2-Mercaptoäthanol besteht.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der im Verfahrensschritt (c) verwendete Puffer aus 50 mM Tris-hydrochlorid und 1,0 mM 2-Mercaptoäthanol besteht.

4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der im Verfahrensschritt (d) verwendete Puffer aus 6,0 M Guanidin-hydrochlorid und 10 mM Tris besteht.

5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte (b) und (e) mit sterilem Wasser ausgeführt werden.

Es ist heutzutage eine allgemein anerkannte Tatsache, dass der Thymusdrüse eine zentrale Bedeutung in der Entwicklung und Alterung des Immunsystems von Mensch und Tier zukommt. Obgleich noch sehr wenig Wissen über die molekularen Vorgänge existiert, durch die die Thymusdrüse die Entwicklung der T-Zellen kontrolliert, scheint es, dass ein wesentlicher Teil dieses Mechanismus' hormonal gesteuert wird. Die Thymusdrüse produziert eine Gruppe von Polypeptiden, Thymosin genannt, und vielleicht eine Anzahl anderer Thymushormone und/oder Thymusfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der Reifung, Differenzierung und Funktion der T-Zellen spielen. Es wurde gefunden, dass das Thymosin die Differenzierung der T-Zellen induziert und immunologische Funktionen verstärkt bei genetisch athymi-schen Mäusen, ausgewachsenen thymektomierten Mäusen, NZB-Mäusen mit starken Autoimmunreaktionen, bei tumor-haltigen Mäusen und Mäusen mit einer Casein-induzierten Amyloidose.

Es ist bekannt, das die Thymusfraktion 5 ein wirksames immunpotenzierendes Präparat ist, das bei der Wiederher-

Stellung von Immunfunktionen bei Individuen ohne Thymusdrüse und/oder ohne Immunsystem wie die Thymusdrüse selbst wirken kann. Andauernde klinische Versuche mit der Thymusfraktion 5 scheinen die Vermutung zu belegen, dass das Thymosin sowohl bei Kindern, die an einem Thymus-abhängigen primären Immundefekt leiden als auch bei Krebskranken mit eingeschränkter Immunabwehr, die Anzahl der T-Zellen erhöht.

Mit analytischen Methoden konnte gezeigt werden, dass die Thymusfraktion 5 aus 10-15 Haupt- und 20 oder mehr Nebenkomponenten mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 15 000 besteht.