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CH636642A5 - Process for the preparation of the antibiotic BL580 delta - Google Patents

Process for the preparation of the antibiotic BL580 delta Download PDF

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Publication number
CH636642A5
CH636642A5 CH800577A CH800577A CH636642A5 CH 636642 A5 CH636642 A5 CH 636642A5 CH 800577 A CH800577 A CH 800577A CH 800577 A CH800577 A CH 800577A CH 636642 A5 CH636642 A5 CH 636642A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
antibiotic
column
liters
mixture
ethyl acetate
Prior art date
Application number
CH800577A
Other languages
English (en)
Inventor
John Henry Edward James Martin
Martin Roy Hertz
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US05/756,659 external-priority patent/US4138481A/en
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of CH636642A5 publication Critical patent/CH636642A5/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis

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Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BL580 A mit der Formel:
o*
und der pharmazeutisch unbedenklichen kationischen Salze hiervon, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität in diesem Medium züchtet, anschliessend aus diesem Medium das Antibiotikum BL580 A gewinnt und gegebenenfalls in ein 65 pharmazeutisch unbedenkliches kationisches Salz überführt.
3
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums der Bezeichnung BL580 A durch Fermentation; die Erfindung umfasst auch die Herstellung der pharmazeutisch unbedenklichen kationischen Salze dieses Antibiotikums. Das Antibiotikum BL580 A kann in einer verdünnten Form sowie als Rohkonzentrat und in reiner kristalliner Form hergestellt werden. Die Wirkungen dieses neuen Antibiotikums als anticoccidiales Mittel sowie seine chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden es von früher beschriebenen Antibiotika.
Erfindungsgemäss wird das Antibiotikum nach dem Verfahren gemäss dem Patentanspruch hergestellt.
Das Antibiotikum BL580 A lässt sich durch die im folgenden angegebene Strukturformel beschreiben. Ein alpha-Substi-5 tuent liegt hiernach hinter der Papierebene und wird durch eine gestrichelte Linie ( Bindung) bezeichnet, während ein
ß-Substituent aus der Papierebene herausragt und durch eine keilartige Bindung (-«-Bindung) bezeichnet wird.
rc rc
T
<\# o
O— &
Sz
636 642 4
Das neue Antibiotikum ist eine organische Carbonsäure siges Wachstum auf Asparagin-Dextrose-Agar, Hickey und und kann daher mit nichttoxischen pharmazeutisch unbedenk- Tresner-Agar, anorganische Salze-Stärke-Agar sowie Bennett-lichen Kationen Salze bilden. Die Herstellung solcher Salze Agar, schwaches Wachstum auf Czapek-Lösung-Agar.
erfolgt zweckmässig durch Vermischen der freien Säure des Antibiotikums mit stöchiometrischen Mengen entsprechender 5 Luftmycel
Kationen, zweckmässigerweise in einem neutralen Lösungsmit- Das Luftmycel ist gelblich und wird in den Sporulàtionszo-tel. Hierzu geeignete Kationen sind die Natrium-, Kalium-, Cal- nen gräulich, wobei seine Farbe von rehfarben (4 ig) zu biber-cium-, Magnesium- oder Ammoniumionen sowie Kationen färben (4 Ii) zu aschfarben (5 fe) reicht. Die Sporulationszonen organischer Amine, wie Tri(niederalkyl)aminkationen (bei- werden bei älteren Kulturen schwarz und hygroskopisch, spielsweise Triäthylamin, Triäthanolamin) oder Procain. Die io kationischen Salze des Antibiotikums BL580 A sind im allge- Lösliche Pigmente meinen kristalline Feststoffe, die sich in Wasser verhältnismäs- Auf den meisten Medien keine löslichen Pigmente, auf sig schlecht lösen, in den meisten üblichen organischen Hefeextrakt-Bennett- und Kartoffel-Dextrose-Agar gelbliche
Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloro- lösliche Pigmente, die nur in geringen Mengen vorhanden sind, form, Heptan, Äther oder Benzol, jedoch löslich sind. 15
Das neue Antibiotikum, dem die Bezeichnung BL580 A Unterseitenfarbe zugeordnet worden ist, entsteht während der Züchtung eines Im allgemeinen gelbliche Schattierungen auf den meisten neuen Stamms von Streptomyces hygroscopicus unter gesteuer- Medien.
ten Bedingungen, und dieser Stamm produziert ferner auch die bekannten Antibiotika BL580alpha und BL580ß (US-PS 20 Verschiedene physiologische Reaktionen
3 812 249). Dieser neue Stamm ist eine durch Behandlung von Nitrate werden zu Nitriten reduziert, vollständige Gelatine-
S. hygroscopicus NRRL 5647 mit N-Methyl-N ' -nitro-N" -nitro- Verflüssigung, keine Bildung melanoider Pigmente auf Pepton-soguanidin abgeleitete Mutante. Eine lebende Kultur des neuen Eisen-Agar, völlige Peptonisierung auf Purpurmilch innerhalb Mikroorganismus wurde bei dem Culture Collection Labora- von 7 Tagen, Natriumchloridtoleranz im Wachstumsmedium tory, Northern Utilization Research and Development Divi- 25 Ïï7%, jedoch < 10%, Kohlenstoffverwertung nach Pridham und sion, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Gottlieb, J. Bacteriol. 56,107-114 (1948) : Gute Verwertung von hinterlegt und in die dortige ständige Kultursammlung aufge- Adonit, d-Galactose, d-Fructose, d-Raffinose, Salicin, d-Xylose nommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungsnummer und Dextrose, schlechte oder keine Verwertung von d-Melezi-
NRRL 8180 frei erhältlich. tose, d-Melibiose, 1-Arabinose, i-Inosit, Lactose, d-Mannit,
Eine Bestimmung der physiologischen, morphologischen 30 1-Rhamnose, Saccharose und d-Trehalose.
und Kulturmerkmale von NRRL 8180 nach Dr. H.D. Tresner,
Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Mikromorphologie
Pearl River, New York, ergibt, dass diese Merkmale im wesent- Aus dem Luftmycel wachsen sporentragende Elemente liehen die gleichen sind wie diejenigen von NRRL 5647. Die heraus, die in enggewickelten Spiralen mit mehreren Windun-allgemeine Beschreibung des Mikroorganismus aufgrund beob- 35 gen enden. Die Sporen sind meistens isodiometrisch, zylin-achteter diagnostischer Eigenschaften ist die gleiche, wie sie für drisch und phalangiform und haben'Abmessungen von den Mikroorganismus NRRL 5647 in US-PS 3 812 249 veröf- 0,6-0,7 x 0,7-0,8 p.m. Die Sporen sind aufgrund einer elektro-fentlicht ist, wobei diese Beschreibung jedoch im folgenden der nenmikroskopischen Untersuchung glatt. Die Sporenscheiden Einfachheit halber wiederholt wird. sind fein gerunzelt.
Die Ermittlung der Kulturmerkmale, physiologischen 40 Auf Basis der beobachteten allgemeinen Eigenschaften han-Merkmale und morphologischen Merkmale des Mikroorganis- delt es sich bei dem Mikroorganismus NRRL 8180 um einen mus NRRL 8180 erfolgt hier nach den Methoden, wie sie von Vertreter aus einer grossen Gruppe von Streptomyceten, dessen Shirling und Gottlieb in Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, charakteristische Merkmale graue Sporen, spiralenförmige 313-340 ( 1966) näher beschrieben sind. Die unterstrichenen Sporenketten, glattwandige Sporen und das Fehlen von Mela-beschreibenden Farbangaben und die Farbplättchenbezeich- 45 ninpigmenten sind. Die hygroskopische Natur der Kultur nungen wurden nach Jacobsen et al. aus Color Harmony zusammen mit allen ihren morphologischen und physiologi-
Manual, 3. Auflage (1948), Container Corp. of America, sehen Eigenschaften macht sie zu einem typischen Stamm von
Chicago, Illinois, ermittelt. Die Beschreibungseinzelheiten fin- Streptomyces hygroscopicus, wie entsprechende Bestimmungen , den sich in den folgenden Tabellen I bis IV. nach H.D. Tresner und E.J. Backus, «A Broadened Concept of so the Characteristics of Streptomyces hygroscopicus», Appi.
Stärke des Wachstums Microbiol. 4,243-250 (1956) und H.D. Tresner, E.J. Backus und
Gutes Wachstum auf Hefeextrakt-, Kuster-Haferflocken-, J. A. Hayes, «Morphological Spore Types in the Streptomyces Tomatenpaste-, Hafermehl- und Kartoffel-Dextrose-Agar, mäs- hygroscopicus-like Complex», Appi. Microbiol. 15,637-639
(1967) zeigen.
Tabelle I
Kulturcharakteristiken von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 Inkubationszeit: 14Tage Temperatur: 28 °C
Medium Ausmassdes Luftmyzel lösliches Unterseiten Bemerkungen
Wachstums und/oderSporen Pigment färbe
Czapek-Lösungs- gering Agar
Spur eines weisslichen Luftmyzels, keine Sporulation keines farblos bis weisslich
5
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Medium
Ausmassdes Luftmyzel Wachstums und/oderSporen lösl iches Pigment
Unterseiten färbe
Bemerkungen
Hefeextrakt-Agar gut
Kuster-Haferf locken- gut Agar
Asparagin-Dextrose- mittelmässig Agar
Hickey- und mittelmässig
Tresner-Agar anorganische mittelmässig
Salze-Stärke-Agar
Tomatenpaste-Hafer- gut mehl-Agar
Bennet-Agar mittelmässig
Kartoffel-Dextrose- gut Agar weissliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation weissliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation weissliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen aschfarben (5 fe) bis rehfarben (4 ig) wird ; mittelmässige Sporulation weissliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation weissliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation weissliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; sehr starke Sporulation weissliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation weissliches bis gelbliches Luftmycel, das in Sporulationszonen aschfarben (5 fe) bis rehfarben (4 ig) wird; mittelmässige Sporulation gelblich, gering keines keines keines keines keines gelblich, gering gelblich, gering bambusfarben (2 fb)
hellsenffarben bambusfarben (2fb)
bambusfarben (2 fb)
pastellgelb (1 db)
gelb-
ahornfarben (3ng)
bambusfarben (2 fb)
gelb-
ahornfarben (3ng)
schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen; gelbliches Exudat in Randzonen schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen ausgedehnte hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen ausgedehnte hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen, gelbliches Exudat in Randzonen schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen
Tabelle II
Mikromorphologie von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180
Medium Luftmyzel und/oder Sporenstrukturen Sporenaussehen Sporengrösse Sporenoberfläche
Kuster-Hafer- aus dem Luftmyzel wachsen Sporen die Sporen sind grossteils 0,6 bis 0,7 (im x aufgrund einer flocken-Agar heraus, die Verzweigungen tragen, isodiametrisch, 0,7 bis 0,8 p.m elektronenmikroskopi-
welche in dicht gewundenen Spiralen zylindrisch, phalanxartig sehen Bestimmungen glatt;
mit mehreren Gängen enden die Sporenscheiden sind fein gerunzelt
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Tabelle III
Verschiedene physiologische Reaktionen von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180
Medium
Inkubation (28 °C) Wachstumsmenge physiologische Reaktionen organische Nitrat-Brühe organische Nitrat-Brühe Gelatine
Pepton-Eisen-Agar Purpurmilch
Hefeextrakt-Agar plus (4,7,10 und 13%) NaCl
7 Tage gut
14 Tage gut
7 Tage gut
24 bis 48 Stunden gut
7 Tage gut
10 Tage gut
Nitrate werden zu Nitriten reduziert
Nitrate werden zu Nitriten reduziert vollständige Verflüssigung es werden keine melanoide Pigmente gebildet vollständige Peptonisierung
NaCl-Toleranz gleich oder über 7%, jedoch unter
10%
Tabelle IV
Kohlenstoffverwertungsverhalten von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 Inkubation: 10 Tage Temperatur: 28 '
Kohlenstoffquelle
Verwertung*
Adonit
1-Arabinose
Dextran d-Fruktose i-Inosit
Lactose d-Mannit d-Melezitose d-Melibiose d-Raffinose
1-Rhamnose
Salicin
Sacharose d-Trehalose d-Xylose
Dextrose
Negative Kontrolle
3 0 3 3 0 0
0
1 1 3 0 3 0 0 3 3 0
*3 = gute Verwertung 2 = ausreichende Verwertung 1 = schlechte Verwertung 0 = keine Verwertung
Die Produktion des Antibiotikums BL580 A ist selbstverständlich nicht auf diesen besonderen Mikroorganismus oder die Organismen beschränkt, die völlig dem oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften für NRRL 8180 genügen. Zur Erfindung gehört daher auch der Einsatz von Mutanten, die aus dem Mikroorganismus NRRL 8180 durch verschiedene Mittel gebildet werden, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Aktinophage oder dergleichen.
Das Antibiotikum BL580 A ist ein äusserst wirksamer Wirkstoff zur Bekämpfung von Coccidieninfektionen bei warmblütigen Tieren. Das Antibiotikum BL580 A ist darüber hinaus auch wesentlich weniger toxisch als das Antibiotikum BL580al-pha (dessen Struktur in NL-PS 74 02 938 angegeben ist. Die Wirksamkeit des Antibiotikums BL580 A als Mittel gegen Coc-cidiosis wird anhand der folgenden In-vivo-Untersuchungen gezeigt, für die das im folgenden genannte Geflügelfutter verwendet wird:
Dicalciumphosphat
1,2%
gemahlener Kalkstein
0,5%
stabilisiertes Fett
4,0%
entwässerte Luzerne (17% Protein)
2,0%
20 Maisglutenmehl (41% Protein)
5,0%
Menhadenfischmehl (60% Protein)
5,0%
Sojabohnenmehl (44% Protein)
30,0%
gemahlener gelber Mais, Feinstoffe auf 100%
25 Das in obiger Geflügelfuttermischung angegebene Vitamin-
Aminosäure-Vorgemisch wird aus folgender Formulierung her gestellt. Die Mengenangaben beziehen sich auf Einheiten pro
Kilogramm Geflügelfutter.
30 Butyliertes Hydroxytoluol
125 mg dl-Methionin
500 mg
Vitamin A
3300 I.E.
Vitamin D3
11001.C.E.
Riboflavin
4,4 mg
35 Vitamin E
2,2 I.E.
Niacin
27,5 mg
Pantothensäure
8,8 mg
Cholinchlorid
500 mg
Folsäure
1,43 mg
40 Menadionnatriumbisulfat
1,1 mg
Vitamin B12
11 mcg
50
55
Vitamin-Aminosäure-Vorgemisch
Spurenmineralien
Natriumchlorid
0,5% 0,1% 0,3%
gemahlener gelber Mais, Feinstoffe auf 5 gm
Mischcoccidieninfektionen von Eimeria tenella und Eimeria acervulina
Ein Mischinokulum aus 5000 sprulierten Oozyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oozyten von Eimeria tenella, so dass sich bei unbehandelten Kontrollen eine Mortalität von 85 bis 100% ergibt, gibt man Gruppen aus sieben Tage alten Küken durch direkte Inokulation in den Kropf. Während der gesamten Versuchsdauer können die Küken nach Belieben Geflügelfutter fressen und Wasser trinken. 2 Tage nach erfolgter Inokulation bietet man den verschiedenen Kükengruppen des Versuchs ein wirkstoffhaltiges Futter an, das aus dem Geflügelfutter und mehreren Dosen des Antibiotikums BL580 A zusammengesetzt ist. 10 Tage nach erfolgter Inokulation werden die Untersuchungen beendet. Die Tiere werden gewogen und getötet, worauf man ihren Intestinaltrakt auf Schädigungen untersucht. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle V hervor. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung von 125 ppm oder 250 ppm Antitiotikum BL580 A zusammen mit dem Futter an infizierte Küken ein lOOprozentiges Überleben dieser infizierten Küken ergibt. Ferner geht aus den Versuchsdaten hervor, dass man durch Verabreichung von 30 ppm oder 60 ppm Antibiotikum BL580 A an infizierte Küken zusammen mit dem Futter eine ganz starke Unterdrückung der durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina hervorgerufenen Schädigungen erhält.
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Tabelle V
Konzentration an Anzahl der % überlebende % Tiere mit verringerten Schädigungen
BL580 A im Futter, ppm Versuchstiere Tiere Eimeria tenella Eimeria acervulina
0 60 17 0 0
250 5 100 100 100
125 5 100 100 100
60 24 91,6 46 100
30 25 60 0 64
Tabelle VI
Konzentration an BL580 A im Futter, ppm
Anzahl der Versuchstiere
% überlebende Tiere
% Tiere mit verringerten Schädigungen tenella acervulina necatrix brunetti maxima
0
15
0
0
0
60
0
20
120
15
100
100
100
100
100
100
60
15
100
40
93
100
48
80
30
15
100
7
7
86
0
21
Mischcoccidieninfektion von Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti und Eimeria maxima
Ein handelsübliches Vaccin (Coccivac D, Sterwin Laboratories, Opalika, Alabama), das ein Gemisch aus wenigstens fünf Arten von Eimeria coccidia enthält, verabreicht man Küken in einer gegenüber der normalen Immunisierungsdosis 70fachen Menge. Das Vaccin gibt man Gruppen aus sieben Tage alten Küken durch direkte Inokulation in den Kropf aller Tiere. Die Tiere haben während der gesamten Versuchsdauer freien Zugang zu Wasser und dem oben genannten Geflügelfutter. Zwei Tage nach erfolgter Inokulation bietet man den verschiedenen Kükengruppen des Versuchs wirkstoffhaltiges Futter an, das aus dem Geflügelfutter und mehreren Dosen Antibiotikum BL580 A besteht. 10 Tage nach Inokulation werden die Untersuchungen beendet, wobei man die Tiere wiegt, tötet und ihre Intestinaltrakte auf Schädigungen bzw. Verletzungen hin untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Verabreichung von 120 ppm Antibiotikum BL580 A an infizierte Küken zusammen mit dem Futter zu einem lOOprozentigen Überleben der infizierten Küken führt. Ferner ergibt sich bei dieser Wirkstoffkonzentration auch eine zimlich starke Unterdrückung von Schädigungen oder Verletzungen, die durch Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti und Eimeria maxima hervorgerufen werden.
Fermentationsverfahren
Die Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 kann in einer grossen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Zur Bildung dieses Antibiotikums BL580 A geeignete Medien enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z.B. Stärke, Zucker, Melasse oder Glycerin, eine assimilierbare Stickstoffquelle, z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser, sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Ammoniumsulfat, Carbonat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän und Kupfer, liegen als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vor. Die Belüftung in Tanks und Kolben erfolgt durch Durchleiten steriler Luft durch das gärende Medium oder Aufblasen von steriler Luft auf die Oberfläche des Mediums. Ausserdem wird in Tanks durch mechanische Mittel für Bewegung gesorgt. Je nach Bedarf kann ein Entschäumer zugesetzt werden, beispielsweise 1% Octadecanol in Lardöl.
Inokulumherstellung
Ein Schüttelkolbeninokulum von Streptomyces hygroscopi-
25
30
eus NRRL 8180 wird durch Beimpfen von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 500 ml Kolben mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen einer Schrägagarkultur hergestellt. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise folgendes:
Sojabohnenmehl Glucose
Maisquellwasser
CaCOa
Wasser
1,0% 2,0% 0,5% 0,3% auf 100%
45
50
Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 °C, vorzugsweise 28 °C, unter kräftiger Bewegung auf einem Rotationsschüttler 48 bis 96 Stunden inkubiert.
Zwei Mengen von jeweils 100 ml dieses Inokulums verwendet man dann zur Beimpfung von 12 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem 20 Liter fassenden Kolben. Dieses Inoku-lum wird unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 °C, vorzugsweise 28 °C, inkubiert.
Mit dem in dieser Weise erhaltenen Inokulum beimpft man dann 300 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem Fermentationstank. Dieses Inokulum inkubiert man unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 °C, vorzugsweise 28 °C.
Mit dem dabei erhaltenen Inokulum beimpft man dann einen 4000 Liter fassenden Fermentationstank, der 3000 Liter eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthält:
Maisquellwasser
Sojabohnenmehl
Maisstärke
CaCÛ3
Wasser
0,5% 1,0% 4,0% 0,1% auf 100%
55 Das obige Medium fermentiert man 100 bis 200 Stunden bei einer Temperatur von 27 bis 32 °C unter Bewegung mit einem Rührer und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 0,8 Liter Luft pro Liter Medium pro Minute. Normalerweise setzt man auch einen Entschäumer zu, beispielsweise Hodag 60 FD82, und zwar in einer Menge von etwa 1,3 Liter pro 1000 Liter Medium.
Reinigungsverfahren
Nach beendeter Fermentation vereinigt man die das Anti-65 biotikum BL580 A enthaltende Fermentationsmaische mit etwa der Hälfte ihres Volumens an Äthylacetat und rührt das Ganze dann 2 bis 3 Stunden. Sodann gibt man etwa 8% Diatomeenerde zu und filtriert das Gemisch durch eine Platten- und Rahmen-
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8
Filterpresse. Der Filterkuchen wird auf der Presse mit Äthyl-acetat gewaschen. Die Äthylacetatextrakte werden gesammelt und in einer Destillationsvorrichtung zu einem Sirup konzentriert.
Der auf diese Weise erhaltene Sirup wird mit einer gegenüber seinem Volumen zweifachen Menge Heptan gewaschen und dann über Nacht bei 4 °C aufgehoben. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und zu einem gummiartigen Rückstand eingeengt.
Das gummiartige Konzentrat behandelt man mit 10 Liter Methanol, worauf man das Ganze mehrere Stunden unter Verwendung von Trockeneis kühlt. Anschliessend filtriert man das Gemisch durch eine Sinterglasnutsche, auf der sich eine Schicht Diatomeenerde befindet, wobei man mit kaltem Methanol wäscht. Die Methanollösung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft.
Sodann bereitet man eine Chromatographiesäule vor, die Aktivkohle in einer Menge von etwa 1 Liter Kohle pro 50 g Beschickung enthält. Der getrocknete Rückstand wird in Methylenchlorid in einer Menge von 40 g pro Liter gelöst und auf die Säule gegeben. Das Methylenchlorideluat wird als eine einzige Fraktion gesammelt und zur Trockne eingedampft. Den dabei erhaltenen Rückstand vermischt man dann mit Methanol und lagert das Ganze anschliessend in einem Kühlraum mit Trockeneis, um dieTemperatur 15 Minuten auf —10 °Czu reduzieren. Nach 15 Minuten filtriert man das verfestigte Öl ab und engt das methanollösliche Material unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man zu einem Öl gelangt.
Dieses Öl löst man dann in einer minimalen Menge Methylenchlorid, worauf man Silicagel zugibt, das Ganze zur Trockne einengt und schliesslich auf eineTrockensilicagelsäule aufgibt. Die Entwicklung der Säule erfolgt zuerst mit 10% Äthylacetat in Benzol und anschliessend mit 20% Äthylacetat in Benzol. Anschliessend lässt man die Säule ablaufen. Die Säule wird in 10 gleiche Teile (einschliesslich der Beschickung) eingeteilt. Kernproben werden über die Länge der gesamten Säule bei Rf-Werten von 0,05, 0,15, 0,25,0,35 usw. entfernt und mit einem entsprechenden Volumen eines Gemisches aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) eluiert. An Stellen, an denen das Antibiotikum überlappt, sammelt man an jedem Vs einer Rf-Einheit eine Kernprobe. Die Stelle, an der das Antibiotikum kommt, ermittelt man durch dünnschichtchromatogra-phische Untersuchung der Kerneluate unter Verwendung handelsüblicher Dünnschichtchromatogrammplatten (Silplate-22 von Brinkmann Instrument Co., Westbury, New York 11590). Die Detektion der jeweiligen Zonen erfolgt durch Verkohlung in Gegenwart von Schwefelsäure.
Diejenige Sektion der Säule, die ein Material mit Rf-Werten von 0,11 bis 0,35 enthält, wird aus der Säule herausgeschnitten und in einem Gemisch aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1, auf Volumen bezogen) aufgeschlämmt. Das dabei erhaltene Gemisch wird filtriert, mit weiterem Lösungsmittelgemisch gewaschen und dann unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Der hierbei anfallende Rückstand wird in tert.-Buta-nol gelöst, worauf man das Ganze filtriert und gefriertrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu einem flockigen Feststoff.
Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:75:37, auf Volumen bezogen) stellt man ein Zweiphasensystem her. Mit der unteren Phase dieses Systems vermischt man dann eine bestimmte Sorte Diatomeenerde (Celatom von Eagle-Picher Industries, Cincinnati, Ohio) in einer Menge von 800 g auf 600 ml untere Phase und bepackt mit diesem Gemisch anschliessend in gewissen Anteilen eine Säule (Durchmesser 7,5 cm). Als Säulenbeschickung verwendet man ein Gemisch aus Diatomeenerde, unterer Phase und lyophilisiertem Produkt (40 g : 30 ml : 13,8 g). Die Entwicklung der beschickten Säule erfolgt unter Verwendung von unterer Phase, wobei man Fraktionen von 25 ml auffängt. Zur Detektion der wirkstoffhaltigen Fraktionen unterzieht man ausgewählte Fraktionen einer dünnschichtchromatograhischen Untersuchung unter Verwendung von Gelplatten, wobei man mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat (1:1) als Entwicklungsmittel arbeitet und die eigentliche Detektion durch verkohlung vornimmt. Die Fraktionen 90 bis 150 werden vereinigt und eingedampft, wodurch man das Antibiotikum BL580 A erhält.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Herstellung des Inokulums
Ein beispielhaftes Medium, das zur Züchtung des Inokulums der ersten Stufe verwendet wird, wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:
Sojabohnenmehl 1,0 g
Glucose 2,0 g
Maisquellwasser 0,5 g
CaCOs 0,3 g
Wasser auf 100 ml
Unter Verwendung abgewaschener oder abgekratzter Sporen aus einer Agarschräge von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 beimpft man dann zwei 500 ml Kolben, die jeweils 100 ml des obigen Mediums in sterilisierter Form enthalten. Die Kolben werden anschliessend auf einen Rotationsschüttler gegeben und kräftig 72 Stunden bei einer Temperatur von 28 °C durchmischt.
Das in obiger Weise gebildete Kolbeninokulum überträgt man dann in einen 19 Liter Glaskolben, der 12 Liter des gleichen sterilen Mediums enthält. Dieses zweite Inokulum wird mit steriler Luft belüftet, während man es 48 Stunden bei einer Temperatur von 28 °C wachsen lässt.
Das in obiger Weise hergestellte zweite Inokulum überträgt man hierauf in einen 380 Liter fassenden Fermentationstank, der 300 Liter des gleichen sterilen Mediums enthält. Die Belüftung dieses dritten Inokulums erfolgt mit steriler Luft in einer Menge von 1 Liter Luft pro Liter Medium pro Minute, wobei man das Ganze mit einem Rührer unter einer Geschwindigkeit von 173 Umdrehungen pro Minute rührt. Man lässt den Ansatz 48 Stunden bei 28 °C wachsen. Der pH-Wert beträgt zu dieser Zeit 6,9 bis 7,0.
Beispiel 2 Fermentation
Zur Herstellung eines Fermentationsmediums geht man von folgenden Bestandteilen aus:
Maisquellwasser 0,5 g
Soj abohnenmehl 1,0g
Maisstärke 4,0 g
CaCOî 0,1g
Wasser auf 100 ml
3000 Liter eines Fermentationsmediums der obigen Formulierung sterilisiert man in einem 4000 Liter fassenden Tank 60 Minuten bei 120 °C. Nach erfolgter Sterilisation hat das Medium einen pH-Wert von 6,4bis 6,5. Im Anschluss daran inokuliert man dieses Medium mit 300 Liter des nach Beispiel 1 hergestellten dritten Inokulums. Die Fermentation wird bei 28 bis 30 °C durchgeführt, wobei man als Entschäumer 4,0 Liter Hodag FD82 verwendet. Der Ansatz wird mit 0,6 Liter steriler Luft pro Liter Maische und pro Minute belüftet. Die Maische rührt man mit einem unter einer Geschwindigkeit von 150 Umdrehungen pro Minuten laufenden Rührer. Nach insgesamt 138,5 Stunden langer Fermentation wird die Maische geerntet.
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Beispiel 3
Isolierung und Reinigung
2550 Liter der nach Beispiel 2 hergestellten fermentierten Maische, die einen pH-Wert von 7,4 hat, vereinigt man mit 1275 Liter Äthylacetat und rührt das Ganze dann 2,5 Stunden. Im Anschluss daran gibt man 8 Gewichtsprozent Diatomeenerde zu. Das so erhaltene Gemisch filtriert man hierauf in mehreren Anteilen unter Rühren durch ein paar Rahmenpressen. Die Wasser-Äthylacetat-Filtrate werden vereinigt, wodurch man insgesamt 3250 Liter Material erhält, das man dann zur Schichtentrennung stehen lässt. Auf diese Weise ergeben sich 1000 Liter Äthylacetatextrakt. Nach Filtrieren einer jeden Teilmenge des Gemisches aus Maische, Äthylacetat und Diatomeenerde durch die entsprechende Presse wäscht man den auf der Presse vorhandenen Filterkuchen jeweils mit Äthylacetat. Die Äthylacetatwaschflüssigkeiten werden vereinigt und abgetrennt, wodurch man zu 535 Liter Äthylacetatwaschflüssigkeit gelangt. Die obigen 1000 Liter Äthylacetatextrakt und 535 Liter Äthylacetatwaschflüssigkeit werden vereinigt und dann in einer 1515 Liter fassenden Destilliervorrichtung auf 225 Liter konzentriert. Diese 225 Liter Material konzentriert man dann in einer 190 Liter fassenden Destilliervorrichtung weiter auf ein Volumen von 20 Liter. Im Anschluss daran konzentriert man diese 20 Liter Material in einer Glasdestilliervorrichtung weiter, wodurch man zu einem Sirup gelangt.
Der in obiger Weise erhaltene Sirup wird 48 Stunden bei 4 °C aufgehoben und anschliessend mit der zweifachen Volumenmenge Heptan gerührt. Das Gemisch lässt man hierauf über Nacht bei 4 °C stehen. Die überstehende Flüssigkeit wird sodann dekantiert und anschliessend zu einem gummiartigen Rückstand konzentriert.
Den gummiartigen Rückstand versetzt man mit 10 Liter Methanol, worauf man das Gemisch unter Verwendung von Trok-keneis mehrere Stunden kühlt. Anschliessend wird das Gemisch durch eine Sinterglasnutsche, die eine Schicht aus Diatomeenerde enthält, filtriert, wobei man mit kaltem Methanol nachwäscht. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 1353,5 g Rückstand gelangt.
Den in obiger Weise erhaltenen Rückstand (1353,5 g) löst man derart in Methylenchlorid, dass sich eine Konzentration von 40 g pro Liter ergibt. Im Anschluss daran bepackt man eine Chromatographiersäule mit 27,07 Liter Kohlegranulat mit einer Korngrösse von 0,83 x 0,44. Sodann führt man die obige Methylenchloridlösung unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 375 bis 400 ml pro Minute durch diese Säule. Das Methy-lenchlorideluat wird in Form einer einzigen Fraktion aufgefangen und zur Trockne eingedampft, wodurch man 153 g Rückstand erhält. Den Rückstand vermischt man gründlich mit 8 bis 9 Liter Methanol. Das dabei erhaltene Gemisch kühlt man dann in einem Kühlraum unter Verwendung von Trockeneis auf -10 "Cab und hält es 15 Minuten bei —10 °C. Das hierbei anfallende verfestigte Öl wird abfiltriert, und das Methanolfil-trat konzentriert man unter Vakuum zur Trockne, wodurch man zu 781,4 g eines Öls gelangt.
Zur Herstellung einer trocken bepackten Chromatographiersäule gibt man 4 kg Silicagel in eine Kunststoffsäule mit einem Umfang von 30,5 cm. 200 g des obigen Öls löst man anschliessend in einer minimalen Menge Methylenchlorid. Sodann gibt man hierzu 300 g Silicagel, vermischt das Ganze gründlich und engt das so erhaltene Gemisch hierauf unter Vakuum zur Trockne ein. Das dabei erhaltene getrocknete Gemisch wird auf die Säule aufgegeben, wobei man das obere Ende der Säule mit einer bestimmten Menge Seesand versieht, um so eine Durchmischung des Betts während der Elution zu unterbinden. Die Kunststoffsäule stellt man in eine Glasschale als Träger und Unterlage. Die Säule wird mit 12 Liter lOprozen-tigem Äthylacetat in Benzol eluiert. Man lässt die Säule trok-
kenlaufen, worauf man sie mit 7,6 Liter 20prozentigem Äthylacetat in Benzol eluiert. Nach Auffangen entsprechender Fraktionen lässt man die Säule trockenlaufen. Die Säule wird dann mit Stickstoff gespült. Die Ermittlung der antibiotischen Aktivität erfolgt durch Untersuchung entsprechender Fraktionen unter Verwendung von Streptococcus pyogenes NY5. Die Säule wird in 10 gleiche Teile (unter Einschluss der Säulenbeschik-kung) unterteilt. Über die Länge der gesamten Säule werden Kernproben bei Rf-Werten von 0,05,0,15,0,25,0,35 ... usw. entnommen. An denjenigen Stellen, an denen sich die antibiotischen Banden überlappen, werden Proben bei jedem Vs einer Rf-Einheit gesammelt. Jede Kernprobe verdünnt man mit 10 ml eines Gemischs aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) und untersucht die Proben dünnschichtchroma-tographisch unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat und Chloroform (1:1), wobei man jeweils Proben mit 30 ml verwendet und die Detektion unter Verkohlung mit Schwefelsäure durchführt. Die Sektion der Säule mit Rf-Werten von 0,11 bis 0,35 wird entfernt und in einem Gemisch aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) aufgeschlämmt. Das Gemisch wird filtriert und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gewaschen, worauf man das erhaltene Material unter Vakuum zur Trockne eindampft. Der Rückstand wird in tert.-Butanol gelöst, und durch anschliessendes Filtrieren und Lyo-philisieren des dabei erhaltenen Materials gelangt man zu 26,7 g Produkt. Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:75:37, auf Volumen bezogen) stellt man ein Zweiphasensystem her. Mit 600 ml der unteren Phase dieses Lösungsmittelsystems vermischt man hierauf 800 g säuregewaschene Diatomeenerde und bepackt mit diesem Gemisch anschliessend in Teilmengen eine 125 cm3 Glassäule. Die Beschickung, die 40 g Diatomeenerde, 30 ml untere Phase und 13,8 g des obigen lyophilisierten Materials enthält, wird in Form eines Gemisches aufgegeben. Die beschickte Säule entwickelt man mit der oberen Phase des Lösungsmittelsystems, und es werden 25 ml Fraktionen gesammelt. Die Ermittlung der Lage der gewünschten Verbindung erfolgt durch Untersuchung entsprechender Fraktionsproben in der oben beschriebenen Weise durch Dünnschichtchromatographie. Die Fraktionen 90 bis 150 werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man als Produkt 2,75 g Antibiotikum BL580 A erhält, das vorwiegend als Natriumsalz vorliegt.
Beispiel 4
Herstellung und Isolierung des Antibiotikums BL580 A in Form der freien Säure
Nach den in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren wird das Natriumteilsalz des Antibiotikums BL580 A hergestellt und isoliert. Durch Vermischen von Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:80:40 Volumenteile) stellt man dann ein Zweiphasensystem her. Anschliessend bepackt man eine Glassäule mit einem Gemisch aus 800 g Diatomen-erde und 600 ml der unteren Phase des obigen Systems. Die Aufgabe der Beschickung erfolgt in Form eines Gemisches aus 28 g Diatomeenerde, 21 ml unterer Phase und 10,9 g Natriumteilsalz des Antibiotikums BL580 A. Die Säule wird unter Verwendung der oberen Phase entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 90 ml gesammelt. Ausgewählte Fraktionen weden über Silplate® F-22 chromatographiert,
wobei man als Entwicklungsmittel ein Gemisch aus Äthylacetat und Chloroform verwendet und die eigentliche Detektion des Antibiotikums BL580 A durch Verkohlung durchführt. Die Fraktionen 29 bis 39, die das Antibiotikum BL580 A enthalten, werden vereinigt und zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Durch Lösen des dabei erhaltenen Rückstandes in tert.-Butanol und nachfolgendes Lyophilisieren der auf diese Weise gewonnenen Lösung gelangt man zu 4,79 g Material.
800 mg dieses lyophilisierten Materials rührt man in 300 ml
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eines Zweiphasensystems aus Wasser, Äther und Petroläther (2:1:1). Der pH-Wert der Lösung wird unter Rühren unter Verwendung von 1 normaler Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt und dreimal mit einem gleichen Volumen Wasser gewaschen. Der Lösungmittelextrakt wird dann unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt. Durch anschliessendes Lösen des Rückstands in tert.-Butanol und nachfolgendes Lyophilisieren der dabei erhaltenen Lösung gelangt man zu 657 mg Antibiotikum BL580 A in Form der freien Säure.
Die freie Säure des Antibiotikums BL580 A ergibt in einer mikroanalytischen Untersuchung folgende Analysenwerte: C = 61,10, H = 8,9, Asche = 0. Die freie Säure hat einen spezifischen Drehwert [alpha]o5 = +21° ± 1° (c = 0,9 in Methanol).
Die freie Säure des Antibiotikums BL580 A zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen : 2,95 ; 5,88 ; 8,35 ; 8,60 ; 9,00 ; 9,12 ; 9,43 ; 10,05 und 10,47 p..
Ein Infrarotabsorptionsspektrum der freien Säure des Antibiotikums BL580 A in Form eines KBr-Presslings geht aus Fig. 4 der Zeichnung hervor.
Ein PMR-Spektrum der freien Säure des Antibiotikums B1580 A wird in Fig. 5 der Zeichnung gezeigt.
Ein 13C-NMR-Spektrum der freien Säure des Antibiotikums BL580 A ist in Fig. 6 der Zeichnung angegeben.
Beispiel 5
Herstellung des Natriumsalzes des Antibiotikums BL580 A
Die freie Säure von BL580 A (1 g) löst man in 300 ml eines Gemisches aus Äther und Petroläther (1:1). Diese Lösung gibt man dann zur Bildung eines Zweiphasensystems zu 200 ml Wasser. Anschliessend stellt man den pH-Wert der Lösung unter Rühren durch Zusatz von 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf 10,0 ein, worauf man die organische Phase abtrennt und unter Vakuum zu einem Rückstand eindampft. Der Rückstand wird in 10 ml Äther gelöst, und die Lösung versetzt man mit 20 ml Petroläther (Siedebereich 30 bis 70 °C). Sodann impft man die erhaltene Lösung mit einem Kristall des Natriumsalzes von BL580 A an und lässt sie hierauf langsam bei einer Temperatur von 4 °C verdampfen, bis sich ein kristalliner Feststoff bildet. Die Kristalle werden auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet, wodurch man zu 323 mg Natriumsalz von BL580 A gelangt.
Dieses Natriumsalz des Antibiotikums BL580 A schmilzt bei 157 bis 161 °C und hat folgende Elementaranalyse: C = 60,99; H = 8,47;Na = 1,95:[alphaß5 = +6° ± l°(c= 1,153 in Methanol). Das Natriumsalz von BL580 A zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen: 6,27,7,28,9,0,9,13,9,23,9,48 und 10,60 p..
Ein Infrarotabsorptionsspektrum des Natriumsalzes von BL580 A in Form eines KBr-Presslings geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor.
Ein 13C-NMR-Spektrum des Natriumsalzes von BL580 A ist in Fig. 2 der Zeichnung angegeben.
Ein PMR-Spektrum des Natriumsalzes von BL580 A ist in Fig. 3 der Zeichnung gezeigt.
Beispiel 6
Herstellung und Isolierung des p-Bromphenacylesters von BL580A
Das Natriumteilsalz des Antibiotikums BL580 A wird nach dem Verfahren der Beispiele 1 bis 3 hergestellt und isoliert. 1 g dieses Natriumsalzes von BL580 A, 834 mg p-Bromphenacyl-bromid, 600 mg Lithiumcarbonat und 20 ml trockenes Dime-thylformamid gibt man in einen Kolben und lässt das Ganze darin 16 Stunden bei einer Temperatur von 37 °C reagieren. Sodann gibt man 4 Volumina Chloroform zu und filtriert die hierdurch entstandene Suspension. Das Filtrat wird zur Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu einem sirupartigen Rückstand gelangt. Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Heptan, Äthylacetat, Methanol und Wasser (2000:25:1000:17) stellt man hierauf eine Verteilungssäule mit Diatomeenerde her. Es wird mit 120 g Diatomeenerde und 90 ml unterer Phase des obigen Lösungsmittelsystems für die Säule gearbeitet. Auf die Säule gibt man dann ein Gemisch aus dem obigen sirupartigen Rückstand, 12 g Diatomeenerde und 9 ml unterer Phase. Die Säule wird mit der oberen Phase entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml gesammelt. Die Ermittlung der Lage der Aktivität in den Fraktionen erfolgt durch Dünnschichtchromatographie. Die Fraktionen 22 bis 41 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Methanol gelöst, worauf man die Lösung filtriert. Das Filtrat wird auf einem Dampfbad erwärmt und mit 10 ml Wasser versetzt, worauf man das Gemisch langsam auf 4 °C abkühlen lässt. Die dabei anfallenden Kristalle werden gesammelt, wodurch man zu 566 mg p-Bromphenacylester von BL580 A gelangt.
Eine mikroanalytische Untersuchung des p-Bromphenacyl-esters von BL580 A ergibt folgende Analysenwerte: C = 58,80; H = 7,80; Br = 8,64. Der Ester hat einen spezifischen Drehwert [alpha]d = +63° ± 2° (CHCL bei 0,51%).
Der p-Bromphenacylester von BL580 A zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen : 2,95 ; 5,88 ; 6,30 ; 8,20 ; 8,45 ; 8,60 ; 9,00 ; 9,15 (breit); 9,37 (breit);9,62; 10,06 und 10,37.
Der p-Bromphenacylester von BL580 A-Monohydrat hat einer Bestimmung durch Röntgenbeugung zufolge ein Molekulargewicht von 1114 + 0,3%.
Ein Inrarotabsorptionsspektrum des p-Bromphenacylesters von BL805 A in Form eines KBr-Presslings geht aus Fig. 7 der Zeichnung hervor.
Ein Ultraviolettabsorptionsspektrum des p-Bromphenacylesters von BL580 A in Form einer Lösung in Methanol mit •
einer Konzentration von 33,84 Mikrogramm pro Milliliter Lösungsmittel ist in Fig. 8 der Zeichnung gezeigt.
Ein PMR-Spektrum des p-Bromphenacylesters von BL580 A ist in Fig. 9 der Zeichnung angegeben.
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9 Blatt Zeichnungen
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